NO302622B1

NO302622B1 - Rekombinant vektor, vertsorganisme, fremgangsmåte for fremstilling av et fullengde PIA protein fra Neisseria gonorrhoeae

Info

Publication number: NO302622B1
Application number: NO902251A
Authority: NO
Inventors: Nicholas H Carbonetti; P Frederick Sparling
Original assignee: Univ North Carolina
Priority date: 1987-11-24
Filing date: 1990-05-22
Publication date: 1998-03-30
Also published as: WO1989004873A1; DK128490A; CA1340506C; US5736361A; US6068992A; FI902569A0; DK128490D0; KR890701750A; JP3388171B2; EP0395706A1; JP2803058B2; DK175831B1; FI102189B1; JPH10234388A; DE3856240D1; KR970011309B1; NO902251L; JPH03502881A; ATE169958T1; DE3856240T2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinant vektor, vertsorganisme, fremgangsmåte for fremstilling av et full-lengde PIA protein fra Neisseria gonorrhoeae, eventuelt fra stammen MS11.

1. INTRODUKSJON

Gonoré er for tiden en av den mest utbredte veneriske sykdommen i verden, med flere millioner tilfeller i USA hvert år. Det forårsakende midlet til sykdommen er gonococcus Neisseria gonorrhoeae. en bakterie som i løpet av historien har utviklet resistens overfor tradisjonell antibiotika-behandling, og i en viss grad overfor bakterisidisk aktivitet i normalt humant serum. Den manglende evnen til å kontrollere infeksjonen ved hjelp av tradisjonelle midler har gjort utviklingen av en vaksine som på en effektiv måte kan forhindre infeksjonen, meget viktig. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en DNA-sekvens kodende for et spesifikt N.<g>onorrhoeae-protein fra ytre membran; og det klonede produktet ifølge denne spesielle DNA-sekvensen tilveiebringer et egnet grunnlag for en slik vaksine. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også artsspesifikke oligonukleotidsekvenser nyttige som diagnostiske prober for påvisning av gonoréisk infeksjon.

2. BAKGRUNN IFØLGE OPPFINNELSEN

2.1. VAKSINER

Produksjon av en beskyttende immunrespons overfor et hvilket som helst gitt infeksjonsmiddel i virveldyr avhenger for det første av tilveiebringing av hensiktsmessig stimuli overfor vertens immunsystem. Den infiserte organismen tilveiebringer vanligvis flerfoldige stimulatoriske forbindelser, eller antigener, pga. selve naturen til cellemembransammensetningen derav, eller ved de metaboliske produktene som den frigjør i vertens kropp. Disse forbindelsene, vanligvis større molekyler så som proteiner, 1ipopolysakkarider eller glykoproteiner, blir gjenkjent av immunsystemet som fremmed, og vekker en eller flere forskjellige typer av reaksjon fra verten i et forsøk på å fjerne eller hindre den invaderende organismen. Antigenet kan forårsake produksjon av sensibiliserte lymfo-cytter (T-celler) som tilveiebringer en celle-formidlet immunitet. Alternativt kan et antigen stimulere syntesen og frigjøringen av fritt antistoff inn i blodet og andre kroppsvæsker (humoral immunitet). Utvikling av kroppens beskyttende immunrespons avhenger av oppnåelse av en terskel-verdi på stimuleringen av en eller begge av disse systemene.

En midlertidig immunitet overfor infeksjon kan i mange tilfeller bli tilveiebrakt ved å administrere til et individ på forhånd dannede antistoffer fra et annet individ av samme eller annen art. Dette er kjent som passiv immunitet. Et eksempel på en slik immunitet er beskyttelsen som fosteret har og nyfødte ved morkakeoverføring av antistoffer fra moren, samt overføring av antistoffer gjennom melken. Et annet eksempel er sammenslått voksent gammaglobulin som ofte blir anvendt for å forhindre eller modifisere virkningene av utsetting for meslinger, vannkopper, hepatitt, røde hunder og tetanus. Disse oppnådde antistoffene blir derimot gradvis anvendt ved interaksjon mellom antigenet eller katabolisert av kroppen, og beskyttelsen blir derfor med tiden tapt.

En mer permanent form for beskyttelse blir tilveiebrakt ved aktiv immunisering. Vaksinering tilveiebringer en aktiv beskyttende immunitet ved anvendelse av en ikke skadelig eller ikke-virulent form av antigenet (f.eks. en drept eller genetisk endret bakterie, eller et isolert glykoprotein fra celleveggen) som en primær stimuli for immunsystemet. Dette vekker en heller sakte respons av antistoffproduksjon som topper seg og deretter blir redusert. Kroppen har derimot blitt gjort klar over eksistensen av antigenet, og neste gang en utsetting oppstår, med levende, virulent organisme, blir en sekundær respons, med en mye hurtigere og sterkere produksjon av antistoffer observert. Denne sekundære re-sponsen vil vanligvis være tilstrekkelig for å forhindre at mikroorganismen etablerer seg tilstrekkelig slik at den forårsaker en fullstendig infeksjon.

En vaksine kan ha forskjellige former, og noen er mere effektive enn andre når det gjelder tilveiebringing av den ønskede beskyttende virkningen. Historisk er mange vaksiner blitt fremstilt ved dreping eller inaktivering av mikroorganismen som forårsaker sykdommen av interesse og anvendelse av de drepte cellene som aktivt immunogent middel. Vaksiner av denne typen er blitt anvendt overfor tyfoid, kolera og poliomyelitt (Salk-vaksine). Problemet med denne typen av vaksine er at behandlingen som er nødvendig for å drepe mikroorganismene, så som formaldehyd, ofte kan endre eller ødelegge mikrobens nyttige antigener, og derfor kan dårlig eller ufullstendig immunitet bli oppnådd.

En alternativ form for vaksine er den som anvender attenuerte mikroorganismer. En attenuert mikroorganisme er en som enda er levende, og som kan formeres i kroppen etter administra-sjon, men som enten er blitt modifisert på en eller annen måte for å gjøre den uvirulent, eller som forøvrig er en stamme som er virulent i en annen mikroorganisme, men uvirulent i mennesket. Fordelen som blir tilveiebrakt ved anvendelse av en attenuert organisme er at attenueringen vanligvis ikke påvirker dens antigenisitet, og som derfor tilveiebringer en mere effektivt stimuli overfor immunsystemet. Attenuerte vaksiner for meslinger, røde hunder og poliomyelitt (Sabin-vaksine) har oppnådd vidstrakt anvendelse. Attenuering blir vanligvis oppnådd ved endring av vekstbetingelsene til mikroorganismen, eller som i den senere tiden, genetisk modifisering av organismens virulens. Til tross for at dette vanligvis er mere effektivt enn drepte vaksiner, eksisterer det derimot en fare for at de levende organismene blir omdannet til virulens som dermed forårsaker sykdomssymptomer.

På grunn av problemene knyttet til helorganismevaksiner er det i den senere tid blitt mere vanlig å anvende individuelle beskyttende antigener som det aktive midlet i vaksinesammen-setningene. Til tross for at isolering og identifisering av bestemte antigener til en organisme som stimulerer en beskyttende respons ikke alltid er enkel, tilveiebringer denne fremgangsmåten når den først er kjent et effektivt alternativ til helorganismevaksiner, uten medfølgende ulemper.

Eksempler på typer av antigener som vanligvis er nyttige for denne hensikten er rensede celle- eller kapsidkomponenter, så som bakterielle toksiner (som må bli detoksifisert for å utgjøre et toksoid), bakterielle eller virale toksinsub-enheter, celleveggpolysakkarider eller kapsidglykoproteiner. Disse komponentene er ofte meget effektive når det gjelder dannelse av immunitet, men vanskeligheter oppstår ved selve rensingen. Det er kritisk at antigenet av interesse blir isolert mer eller mindre fullstendig fra ytre cellulære materialer, idet nærværet derav ofte kan forårsake negativ immunologisk eller metabolsk respons sammen med den ønskede reaksjonen som produserer immunitet. Rensningsmetodene som er nødvendig er ofte innviklede, arbeidskrevende og altfor dyre og resultatene er ikke alltid fullstendig forutsigbare. Dette problemet kan i noen tilfeller unngås ved syntetisk preparering av små peptidsekvenser som korresponderer med epitopene på et mikrobielt antigen. Det er i noen tilfeller ulemper forbundet med denne teknikken pga. at til tross for at aminosyresekvensen korresponderer med den naturlige epitopsekvensen, kan det hende at konformasjonen ikke er tilstrekkelig lik den til foreldreantigenet for å utøve den hensiktsmessige immunresponsen.

Mange av ulempene forbundet med disse ovenfornevnte vaksine-typene kan unngås ved anvendelse av rekombinant DNA-teknolo-gi. Muligheten av kloning av gener som koder for hele eller deler av et viktig mikrobielt antigen tilveiebringer en relativt økonomisk og hensiktsmessig kilde med store mengder av det nødvendige immunogene materialet, vesentlig fri for forurensende proteinholdig eller genetisk materiale. I korte trekk omfatter denne fremgangsmåten for fremstilling av rensede antigener innskudd av den spesifikke DNA-sekvensen kodende for antigenet inn i en DNA-vektor for å danne et rekombinant DNA-molekyl som kan bli replikert av en vertscelle. Det eksisterer nå mange metoder hvorved rekombinante DNA-molekyler kan bli fremstilt. En av de bedre kjente teknikkene er den som er beskrevet av Cohen og Boyer i TJS-patent nr. 4 237 224 og dette er inkorporert heri som referanse. I denne fremgangsmåten blir rekombinante plasmider produsert ved anvendelse av restriksjonsenzymer og ligering; og resulterende plasmider blir deretter plassert inn i en encellet vertscelle som derved blir transformert, og begynner replikasjonen av fremmed DNA: En annen fremgangsmåte anvender bakteriofagvektorer, og er beskrevet i US-patent nr. 4 304 863, som også er inkorporert heri som referanse. Kloningsmetoden tilveiebringer det største potensialet for dannelse av hensiktsmessige, økonomiske kilder for vaksine-fremstilling som for tiden er tilgjengelig, men er ikke uten vanskeligheter pga. at det hensiktsmessige genet for et antigen som er kjent for å være immunogent først må bli isolert og sekvensert, satt inn i et plasmid på en slik måte at riktig replikasjon, transkripsjon og translasjon foregår, og deretter skutt inn i en kompatibel vertscelle.

Potensialet for svikt av ekspresjon av det ønskede genproduktet er formidabelt dersom transkripsjonen av genet, translasjon av RNA eller posttranslasjonsprosessering og fordelingen av polypeptidet ikke blir utført riktig. For at et klonet innskudd skal bli transkribert er det nødvendig at en promoter er tilstede som verts-RNA-polymerasen kan gjenkjenne. Riktig translasjon krever at RNA har et ribosombindingssete. Post-translasjonell modifikasjon av proteiner omfatter ofte spaltning av en signalsekvens som virker ved å lede proteinet ut gjennom cellemembranen. Degradering av fremmed protein produsert av vertsmikroorganismen kan også oppstå dersom konfigurasjonen eller aminosyresekvensen ikke beskytter dem fra virkningen av vertens intracellulære proteaser. Til tross for at det er den mest ideelle måten å konstruere en Neisserla-vaksine. er disse teknikkene ikke tidligere blitt anvendt for fremstilling av vaksine for gonoré.

2.2. GONOKOKKISKE ANTIGENER

Noen antigener fra Neisseria gonorrhoeae er blitt omfattende studert og klassifisert. Pili fra gonokokker er f.eks. blitt funnet å være antigenet (Buchanan et. al. , J. Clin. Invest. 52:2896-2909, 1973), bestående hovedsakelig av en protein-subenhet på omtrent 20 000 M.W. En syntetisk form av dette materialet er blitt formulert til et vaksinepreparat (Schoolnik et al., Prog. Aller<gy>33:314-331, 1983). Lipopoly-sakkaridet til N.<g>onorrhea er også antigent, idet3-1, 4-bundne galaktose-glukoseresiduer er hoveddeterminanten. Den største konsentrasjonen av studier Innenfor dette området i de senere år, har derimot sannsynligvis vært fokusert på proteiner fra den ytre membranen, et kompleks av proteiner og disse proteinenes rolle i immunogenisiteten er ikke ennå fullstendig forståelig. Sammensetningen av proteinene i ytre membranen er kjent for å variere noe fra stamme til stamme, og på dette grunnlaget er minst 16 forskjellige serotyper blitt identifisert (Johnston et al., J. Exp. Med. 143:741-758, 1976). Et antall vaksinesammensetninger som anvender deler av den gonokokkiske membranen er tidligere blitt beskrevet, f.eks. i US-patent nr. 4 203 971, US-patent nr. 4 288 557 og US-patent nr. 4 681 761. De fleste av disse sammensetningene inneholder derimot en blanding av protein og annet materiale, og alle krever nokså arbeidskrevende rensningsprosedyrer for isolering og separering av de aktive komponentene fra den bakterielle cellen. Disse vaksinene behøver derimot ikke ha den ønskede immunspesifisiteten, og krever også en betraktelig mengde mikrobielt kildemateriale for å frembringe kommersielle kvantiteter av produktet.

2.2.1. GONOKOKKISK PROTEIN I

Også foreslått som en mulig kandidat for basis til en vaksinesammensetning er det spesifikke ytre membranproteinet kjent som protein I,* eller PI. PI er det viktigste ytre membranproteinet til N. gonorrhoeae. som virker som et porin (Douglas et al., FEMS Microbiology Letters 12:305-309, 1981), et protein som antas å virke i cellen ved å føre forbindelser med lav molekylvekt over den hydrofobe ytre lipidmembranen. Det er et antall trekk som gjør PI til et interessant fokuseringsobjekt: for det første er det idet minste delvis ansvarlig for serotypespesifisitet i Neisseria. og det er et relativt lite antall antigene serotyper av Protein I. Et antall gonokokker med bestemte PI-serotyper er også blitt assosiert med kompliserte gonokokkinfeksjoner. Det ser også ut til å være eksponert i overflaten i dets native tilstand, og ser også ut til å stimulere produksjonen av opsoniner (Sarafian et al., J. Infect. Dis. 148:1025-1032. 1983). Opsoniner er antistoffer som bindes til overflaten av en infeksiøs organisme og letter opptak av organismen ved fagocytter. Dets immunogene potensial er allerede blitt demonstrert i vaksinerte mus (Jiskoot et al., Infect. Immun. 54:333-338, 1986). ;To forskjellige hovedtyper av PI-molekyler er blitt demonstrert i gonokokker, PIA og PIB (Barrera et al., Infect. Immun..44:565-568, 1984), basert på peptidkartlekking og mottakelighet for proteolyse (Blake et al. , Infect. Immun. 33:212-222, 1981). Denne oppdelingen er blitt funnet å være i samsvar med serogruppemønsteret (Sandstrum et al. , Infect. Immun. 35:229-239, 1982; Sandstrum et al., Infect. Immun. 38:462-470, 1982) og patogenesen. Gonokokker som uttrykker protein IA er knyttet til systemiske infeksjoner, mens de med protein IB er knyttet til lokalisert infeksjon (Buchanan et al., Infect. Immun. 32:985-994, 1981; Hildebrandt et al., Infect. Immun. 20:267-273, 1978). ;Til tross for all oppmerksomhet som er blitt viet utviklingen av PI som en potensiell vaksinekandidat, er det enda ikke blitt produsert en effektiv vaksine basert på PI. Gensekvensen som kontrollerer dets produksjon er enda ikke blitt bestemt og lite er kjent når det gjelder proteinets struktur. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer den første beskrivelsen av en fullstendig PI-gensekvens, den til PIA-strukturelle genet, samt et klonet genprodukt. Også beskrevet er en ny PIB-gensekvens, samt unike PIA-PIB-chimerer avledet fra disse sekvensene. Sistnevnte chimerer er nyttige for epitopekartlegging samt at de utgjør et grunnlag for utvikling av vaksine. ;2.3. DIAGNOSTISKE PROBER ;Et annet aspekt av den utbredte naturen til denne sykdommen er viktigheten av tidlig påvisning og diagnose. Det eksisterer selvfølgelig standardbakteriologiske tester for diagnostikk av gonoré, men slike tester er basert på veksten av bakterier i kultur og dette kan være tidkrevende, og er også generelt uspesifikt. Neisseria gonorrhoeae er kjent for å ha forskjellige serotyper og kan være tegn på meget bestemte sykdomsmønstre, som angitt i tidligere seksjon. For å tilveiebringe hensiktsmessig behandling for sykdommen, er det kritisk at diagnoseringen ikke bare er hurtig, men også så nøyaktig som mulig. ;Utvikling av DNA- og RNA-probeteknologi har tilveiebrakt en løsning på mange slike problemer ved diagnostikk. En probe er vanligvis en radioaktivt merket enkelttråd av DNA eller RNA som er komplementær til hele eller en del av et spesielt gen av interesse, og vil derfor, når utsatt for en enkelttråd av komplementær nukleinsyre, hybridisere til denne. Prober blir anvendt i en teknikk betegnet Southern blotting, hvori DNA-fragmenter fra en prøve antatt å inneholde gen av Interesse blir separert i agarosegeler, denaturert for å danne enkelt-tråder, og deretter overført til nitrocellulosefiltre. Her blir disse inkubert med merkede, pre-selekterte prober, som vil hybridlsere til en komplementær tråd og dermed identifisere, ved dets markør, tilstedeværelse av det ønskede genet. Slike prober kan også bli anvendt for identifikasjon av en bestemt klon som inneholder et gen av interesse fra et genomisk bibliotek oppnådd ved kloning av DNA-fragmenter av et helt genom i vertsceller. ;Det har ikke før vært utviklet et hensiktsmessig og meget nøyaktig probesystem i sammenheng med Neisseria<g>onorrhoeae. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derimot den første utviklingen av flere oligonukleotidprober for N.<g>onorrhoeae. noen av disse vil generelt hybridlsere til Protein I av N. gonorrhoeae. men ikke til andre bakterier, og andre som er spesifikke for N. gonorrhoeae-serotyper som bare uttrykker PIA-antigenet. Det er derfor tilveiebrakt en pålitelig diagnostisk metode for påvisning av gonokokkinfeksjon, samt identifikasjon av den bestemte kategorien av serotype hvori et individ kan bli infisert. ;3. OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN ;Den fullstendige nukleotidsekvensen for Protein IA, og for Protein IB, fra Neisseria gonorrhoeae er beskrevet, samt antatt aminosyresekvenser. Fremgangsmåter og sammensetninger for kloning og ekspresjon av PIA- og PIB-genet i en enkel cellevertsorganisme, samt kloning og ekspresjon av PIA-PIB-chimeriske proteinprodukter, er også beskrevet. Fremgangsmåter for dyrking av den nye vertsorganismen for å produsere genproduktene er også beskrevet. Produktene til de anvendte rekombinante DNA-metodene er egnede for anvendelse i sin helhet eller i en antigenisk del, som immunogener i vaksinesammensetninger for å forhindre gonoré. ;PIA- og PIB-genene ble isolert fra det bakterielle genomet ved hybridisering av DNA-fragmenter med nye oligonukleotidprober. Når de ble lokalisert i et spesifikt DNA-segment ble nukleotidsekvensen bestemt og aminosyresekvensen foreslått. Hvert gen ble deretter skutt inn i en plasmidkloningsvektor som virker som replikasjonsenhet til genet. Det rekombinante plasmidet ble deretter anvendt for å transformere en kompatibel vertscelle hvorved genproduktet blir uttrykt. Fremgangsmåter som muliggjør isolasjon av de uttrykte produktene og formulering av hver inn i en vaksinesammensetning, er også beskrevet. Vaksinesammensetninger omfattende et hybrid PIA/PIB-protein er også foreslått. Basert på bestemmelse av nukleotidsekvensene til PIA- og PIB-genet tilveiebringer oppfinnelsen også sekvensen til oligonukleotidprober som er nyttige til påvisning og diagnostikk av gonokokkisk infeksjon. I dette henseende betrakter oppfinnelsen også diagnostiske test-kits omfattende en eller flere av oligo-nukleotidprobene beskrevet heri. ;4. BESKRIVELSE AV FIGURER ;Fig. 1 Aminosyresekvens til residuene 1 til og med 12 til PI-stamme RIO, kodende mRNA-sekvens inkludert degenererte baser og syntetiserte oligonukleotider. Der hvor degenerasjon oppstod ble sekvenser valgt basert på codonanvendelsesdata fra andre sekvenserte gonokokkiske gener. Fig. 2 Sau3AI- og Tagl-fragmenter av FA19-genomisk DNA inkludert deler av PI-genet. Fragmenter ble klonet inn i vektorplasmid pGEM-2, resulterende i rekombinante plasmider med betegnelsene vist her. Den relative posisjonen til PI-kodende region på genomet er angitt med den åpne boksen ovenfor (den skraverte boksen tilsvarer den N-terminale signalsekvensen) og den relative posisjonen til oligonukleotidprober er vist under fragmentene. Fig. 3 DNA-sekvensen til PI-genet til FA19. Den antatte aminosyresekvensen er vist over DNA-sekvensene (-35 og -10) og ribosombindingssetet (RBS) er vist, samt Tagl- og Sau3AI-seter og Haelll-setet anvendt for konstruksjon av pUNC7. Siste basetall i hver linje er vist til høyre. Fig. 4 Hydropatimønsteret til hovedytremembranproteinene til N.<g>onorrhoeae. PI, Pil og PHI og E. coll-porinene OmpF og OmpC; sp - signalpeptid; a.a.-aminosyreresiduer. Fig. 5 Skjema for konstruksjon av pUNC7. Et hensiktsmessig Haelll-sete mellom -35- og -10-regionene til PI-genpromoteren muliggjorde fjerning av -35-regionen og oppstrømssekvensen, etterfulgt av rekonstruksjon av PI-genet under kontroll av fag-T7-promoteren på vektorplasmid pGEM-2. Den tykke linjen representerer pGEM-2-DNA og den tynne linjen FA19-DNA. PI<*->delen av PI-genet (stiplede linjen angir retningen til det manglende segmentet av genet); P-py - fag-T7-promoter; MCS - multippelt kloningssete; restriksjonsenzymseter: S - Sau3AI, H - Eaelll, B - BamHI, (H)-Haelll/ HlncII grense (ikke noe sete), T - Tagl. Fig. 6 Ekspresjon av PI-genet på pUNC7 i B121 (DE3). A.

NaDodS04-polyakrylamidgelelektroforese av hele cellelysater på en 15 % gel, farget med coomassie blå. Markørproteinstørrelser er vist til venstre. PI er angitt, og pilen i midten angir et protein som mangler i kolonne 4. B. Autoradiograf av et Western blot av gelen 1 A probet med 6 PIA MAbs. Kolonnene er: 1. FA19; 2. BL21 (DE3 )pUNC7 dyrket 16 t uten IPTG; 3. BL21(DE3)pUNC7 dyrket 3 t med IPTG; 4. BL21 (DE3)pUNC7 dyrket 16 t med IPTG; 5. BL21(DE3)pGEM-2 dyrket 16 t uten IPTG; 6. BL21(DE3 )pGEM-2 dyrket 16 t med IPTG.

Fig. 7 Innskudd av mTn3-CAT (<CAT>) ved siden av det PI-strukturelle genet til FA19. Den tykke linjen representerer vektoren pHSS6 DNA. mTn3-CAT har en lengde på 1.66 kb og er ikke tegnet i riktig skala. Posisjonen til PI-genet i genomet til FA19 CAT Dl er angitt ved feltet over linjen idet den skraverte boksen angir signalsekvensen. PI': del av PI-genet som er tilstede i klonede konstruksjoner. Restriksjonsenzymseter: N - Noti: B - BamHI; S - Sau3AI.

Fig. 8 Fragmenter av MS11 DNA klonet for sekvensering av PI-genet. Posisjonen til PI-genet er angitt ved feltet over linjen, og den skraverte boksen angir signalsekvensen. Beliggenheten til sekvensene til ol igonukl eo tidene NC1 og NC12 er vist. Det større fragmentet ble klonet inn i vektorplasmid pGEM-3 og det mindre fragmentet inn i Xgtll for å tilveiebringe konstruksjoner med angitte betegnelser. Restriksjonsenzymseter: Hf - HinfI; K - K<p>nl; S-Sau3AI: Hc - Hindi. Fig. 9 DNA-sekvensen til PIB-genet til MS11. Den antatte aminosyresekvensen er vist over DNA-sekvensen, og signalpeptidet er angitt. Antatte promotersekvenser (-35 og -10) og ribosombindingssetet (RBS) er vist, og det samme er relevante restriksjonsenzymseter. Siste baseantallet i hver linje er vist til høyre. For å angi forskjeller i forhold til PIB-sekvensen til RIO (Gotschlich et al., PNAS USA 84:8135-8139, 1987), er baser (bortsett fra de som omfatter et restriksjonsenzymsete) understreket og aminosyrene er i sirkel. Fig. 10 Sammenligning av aminosyresekvensene til FA19 PIA og MS11 PIB og strukturen til hybrid-PI-gener. PIA-gensekvensen er angitt ved det åpne feltet og PIB ved skravert felt. Over og under PI-genene er sammenligninger av aminosyresekvensen angitt, en vertikal linje tilsvarer en enkel forskjell og en skravert blokk tilsvarer en tilstøtende rekke av forskjeller. Antall aminosyreresiduer er vist i skalaen ovenfor og basepartallene på skalaen under. 01igonukleotidene anvendt for å analysere hybridene er vist mellom genene, og den stiplede linjen angir tilsvarende posisjon på det andre genet. Hybrid-genstrukturene (klassene 1-9) er vist nedenfor, og regionene mellom oligonukleotidsekvensene hvor en overkrysning har oppstått er angitt ved skråstilte beliggenheter. PI-omfanget av forskjellige hybrid-klasser er vist i tabell 1.

Fig. 11 Ekspresjon av PIB-genet på pUNCH25 i BL21 (DE3) som påvist ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese av hele cellelysater på en 15 56 gel, farget ved coomassie blå. PI-proteinbåndet er angitt. Kolonnene er: 1. MS11; 2. BL21(DE3) pUNCH25 dyrket uten IPTG; 3-5. BL21(DE3) pUNCH25 dyrket med IPTG. ITPG (50 >jg/ml) ble tilsatt til den voksende kulturen ved følgende celletettheter: 3. 5 x 10<8>celler/ml; 4. IO<9>celler/ml; 5. 2 x IO<9>celler/ml. Ekspresjonen av PI er større når kulturen blir indusert tidligere i vekstsyklusen.

5. BESKRIVELSEN AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig rekombinant vektor, kjennetegnet ved at den omfatter et nukleinsyremolekyl kodende for full-lengde protein PIA fra Neisseria gonorrhoea i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser hvor proteinekspresjonen blir kontrollert av en induserbar promoter, og hvor vektoren blir stabilt opprettholdt i en vertscelle.

Det er videre beskrevet en vertsorganisme kjennetegnet ved at den inneholder vektoren som angitt ovenfor.

Oppfinnelsen vedrører fremgangsmåte for fremstilling av et full-lengde PIA protein fra Neisseria gonorrhoea, kjennetegnet ved å: (a) dyrke i fravær av en induser, en vertscelle i henhold til krav 6 inneholdende en replikerbar rekombinant vektor som har en DNA-sekvens kodende for full-lengde PIA-protein, i det sekvensen er kontrollert av en induserbar promoter og blir stabilt opprettholdt i en vertscelle; og (b) deretter, dyrking av vertscellen i nærvær av induseren slik at full-lengde PIA-proteinet blir selektivt uttrykt.

Det er også beskrevet en rekombinant vektor som er kjennetegnet ved at den omfatter et nukleinsyremolekyl kodende for et full-lengde protein PIB fra Neisseria gonorrhoea stamme MS11 i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser hvor proteinekspresjonen blir kontrollert av en induserbar promoter, og hvor vektoren blir stabilt opprettholdt i en vertscelle.

Oppfinnelsen omfatter også fremgangsmåte for å fremstille et full-lengde PIB protein fra Neisseria gonorrhoea stamme MS11, kjennetegnet ved å

(a) dyrke i fravær av en induser, en vertscelle ifølge krav 17 inneholdende en replikerbar rekombinant vektor som har; en DNA-sekvens kodende for full-lengde PIB-protein, i det sekvensen er kontrollert av en induserbar promoter og blir stabilt opprettholdt i en vertscelle; og (b) deretter, dyrke vertscellen i nærvær av induseren slik at full-lengde PIB-proteinet blir selektivt uttrykt.

N.<g>onorrhoeae PIA, PIB og chimeriske PIA/PIB-proteiner er videre nyttige for fremstilling av en vaksinesammensetning for forhindring av gonoreisk infeksjon. Disse proteinene kan bli produsert ved rekombinante DNA-teknikker eller kjemiske syntetiske teknikker. Til tross for at det tidligere har vært mulig å anvende kjemiske isolasjonsteknikker fra en hensiktsmessig N. gonorrhoeae-stamme. kan sistnevnte resultere i kontaminasjon av visse andre gonokokkiske proteiner som utløser blokkering (anti-beskyttende) antistoffer etter vaksinasjon. Pga. at PI-proteinene er kjent for å stimulere produksjonen av antistoffer, er det mulig å anvende hele proteinene eller en hvilken som helst immunogen del derav, som immunogener som effektivt beskytter mottakeren fra infeksjon med N. gonorrhoeae.

Rekombinante plasmider beskrevet heri muliggjør produksjon i en vertscelle av store mengder PI-proteiner som er stabile og resistente overfor degradering av vertscellen, og dette tilveiebringer dermed en stor kilde for egnet materiale for vaksinesammensetninger. Dette preparatet er fri for kontaminasjon fra andre antibeskyttende gonokokkiske proteiner. For en beskrivelse angis nedenfor følgende trinn som kan utføres: 1) identifikasjon og isolasjon av PIA-genet eller genfragmentet; 2) innskudd av genet eller genfragmentet inn i en egnet kloningsbeholder som blir anvendt for å transformere en kompatibel vertscelle; 3) identifikasjon og vekst av transformerte vertsceller som replikerer og uttrykker genet; og 4) identifikasjon og rensning av genproduktet. I henhold til oppfinnelsen kan PI-proteiner bli produsert ved innskudd av den klonede sekvensen i fig. 3 eller fig. 9, eller hybrider derav inn i en hensiktsmessig klonings/ekspresjonsvektor, transformering av hensiktsmessige vertsceller og identifisering og rensning av genproduktet. Alternativt kan deler av den avledede aminosyresekvensen i fig. 3 eller fig. 9, eller hybrider, bli syntetisert ved anvendelse av kjemiske syntetiske teknikker som er velkjent innenfor fagområdet. Også beskrevet heri er oligonukleotider basert på PIA- og PIB-sekvenser, hvor oligonukleotidene er nyttige for identifikasjon og diagnostikk av N.<g>onorrhoeae-infeks.lon ved hybridisasjonsteknikker så som Southern blot, dot blot, slot blot, osv.

5.1. IDENTIFIKASJON. ISOLASJON OG SEKVENSEN TIL PIA- GENET

Nukleotidkodende sekvensen til PIA-proteinet er angitt i fig. 3. Som tidligere angitt, blir PIA-proteinet ikke produsert av alle N. gonorrhoeae; idet en hvilken som helst stamme vil produsere enten PIA eller PIB, men ikke begge. Tilstedeværelse av PIA er i samsvar med gonokokklsk serogruppe I, serotype 1-3 og derfor kan hvilke som helst av disse stammene knyttet til serotypene 1-3, bli anvendt som kilden for PIA DNA. Blant kjente N. gonorrhoeae-stammer som erkarakterisertav PIA er FA19, FA130, W-Ue, B-2, G-7, 5029, R-ll, E-5, D-4, V-15 (Knapp et al., J. Inf. Dis. 150:44-48, 1984). Ved utførelse av oppfinnelsen kan sekvensen angitt i fig. 3 bli tilveiebrakt på forskjellige måter. Når en egnet PIA-inneholdende stamme er bestemt, er det f.eks. nødvendig å isolere organismens DNA, danne DNA-fragmenter og identifisere fragmentene som inneholder PIA-gensekvensen. Alternativt kan genet eller segmentene av genet bli syntetisert.

N. gonorrhoeae DNA kan bli fragmentert på et antall forskjellige måter; idet den mest foretrukne metoden er ved behandling med restriksjonsenzymer, og hver av disse spalter DNA ved en spesifikk sekvens. Andre metoder omfatter behandling av DNA med DNase i nærvær av magnesium, eller fysisk nedbryting, så som ved sonikering. Når restriksjonsenzymer blir anvendt kan ett enzym eller en kombinasjon av enzymer bli anvendt for å behandle DNA. Det eneste kravet er at spaltingen av nukleinsyren ikke ødelegger regionen kodende for antigensetet eller setene til PIA. Etter fragmentering blir de individuelle fragmentene av lineært DNA separert i størrelse ved en hvilken som helst av antall kjente teknikker, så som polyakrylamidgelelektroforese (PAGE), agarosegeler eller kolonnekromatografi. Isolerte fragmenter tilveiebringer det genetiske materialet for plasmidpreparering og transformasjon.

Identifikasjon av DNA-fragmentene inneholdende gensekvensen av interesse kan oppnås på forskjellige måter. F.eks. kan immunologiske reagenser, så som monoklonale antistoffer, anvendes. Et antall monoklonale antistoffer mot PIA er blitt dannet (Tam et al., Infect. Immuno. 36: 1042-1053, 1982) og disse kan bli anvendt for å undersøke produktene produsert av hver av vertscellene transformert med de forskjellige DNA-fragmentene; et produkt som reagerer med PIA monoklonalt antistoff identifiserer cellen som er blitt transformert med fragmentet inneholdende PI-genet. Alternativt muliggjør sekvensering av DNA-fragmentene bestemmelse av en aminosyresekvens av hver, og sammenligninger kan deretter bli utført med hvilke som helst kjente delvise aminosyresekvenser for å identifisere fragmentet inneholdende den korresponderende DNA-sekvensen. En annen populær teknikk er Southern blotting (Southern, J. Mol. Bio. 78:503, 1975). I denne metoden blir restriksjonsfragmentene denaturert i posisjon på en gel og overført til et fast substrat, vanligvis et nitrocellulosefilter, ved blotting. Filteret blir deretter utsatt for radioaktivt merkede oligonukleotider inneholdende en kjent eller antatt delvis DNA-sekvens for proteinet. Blottet DNA, komplementært med valgte oligonukleotid vil hybridlsere til det, som derved identifiserer størrelsen til DNA-fragmentet inneholdende PI-genet.

I eksemplene angitt nedenfor ble genet kodende for PIA identifisert og isolert ved hybridisering med to nye oligonukleotider. Basert på den kjente sekvensen (Blake et al., Infect. Immun. 36:277-285, 1982; Blake in The Pathogenic Neisseria, G. Schoolnik, ed., 251-258, 1985, ASM) til en liten del av de N-terminale aminosyrene til PIB, og reglene for anvendelse av kodonene innbefattet i forskjellige andre gonokokkiske proteiner med kjente DNA-sekvenser, ble et forsøk utført for å avlede nyttige oligonukleotider.

Spesielt ble to sekvenser, betegnet NC1 og NC2, konstruert som følger:

Anvendt i en Southern blot-hybridisering ble foregående oligomerer anvendt for å screene DNA-restriksjonsfragmentene tilveiebrakt fra gonokokkgenomet; begge probene kunne identifisere DNA-fragmenter inneholdende PIA-genet. Verifi-sering av det identifiserte genet som PIA-genet ble utført ved sammenligning av genproduktets molekylvekt med den til det native proteinet, og ved dets immunreaktivitet med PIA-spesifikke monoklonale antistoffer. I tillegg til denne anvendelsen er det derimot også blitt bestemt at hver av disse oligonukleotidene kan hybridlsere med både PIA- og PIB-stammene til gonokokkene. Disse normale forbindelsene kan derfor også bli anvendt som diagnostiske prober, i en Southern blot-hybridisasjon, for påvisning og identifikasjon av N. gonorrhoeae-infeks.1 on i rammede individer.

Identifikasjon av fragmentene inneholdende PI-genet blir etterfulgt av sekvensering av den relevante delen, ifølge fremgangsmåten til Sanger (PNAS USA 74:5463-5467, 1977). Sanger-metoden anvender enzymatisk syntese av en komplementær tråd av DNA fra et DNA-templat. Syntesen av den komplementære tråden blir avsluttet ved inkorporering av et dideoksy-nukleotid (ddNTP). Fire forskjellige reaksjoner ble utført, hver inneholdende ddATP, ddCTP, ddGTP eller ddTTP, slik at fire sett DNA-f ragmenter blir dannet, og hver av disse innenfor et gitt sett vil terminere med det spesifikke dideoksynukleotidet. DNA-fragmentene blir deretter separert på en polyakrylamidgel; sekvensen bestemt med kjennskap til identiteten til det siste nukleotidet i hvert fragment, og avlesning fra det korteste til det lengste fragmentet.

Enkelttrådet DNA som blir anvendt som templater, kan oppnås ved kjemiske behandlinger av dobbelttrådet DNA med ekso-nukleaser. Det er derimot mere hensiktsmessig å anvende M13mp kloningsvektorer, som utviklet av Messing et. al. ( Nucleic Acids Res. 9:309, 1981) som en kloningsvektor. M13 er en hann-spesifikk filamentøs bakteriofag av E. coli som inneholder enkelt(+)trådet DNA. (+)tråden blir anvendt som en templat for syntesen av den komplementære (-)tråden. Dobbelt-trådformen av DNA er replikasjonsformen, eller RF, som blir amplifisert til omtrent 200 kopier pr. celle. Denne dobbelt-trådede formen kan bli isolert .fra celler og anvendt som en kloningsvektor. Når amplifikasjonen stopper blir bare en av de to trådene fortsatt produsert, og en enkelttråd blir inkorporert inn i fagpartiklene. Fordelene med M13, består i at partiklene har en enkelt DNA-tråd som er homolog med en av de klonede trådene, og kan derfor være nyttig som templat i SAnger-metoden. Opp til 350 baser kan bli sekvensert fra en enkelt klon, og sekvensering av lengre fragmenter kan oppnås ved sekvensering av overlappende fragmenter.

Anvendelse av foregående teknikk har tilveiebrakt nukleotidsekvensen til PIA-genet, som er reprodusert i fig. 3. I fig. 3 er også den antatte aminosyresekvensen tilveiebrakt.

Sekvensering av PIA-genet, som ble oppnådd ved separat sekvensering av overlappende fragmenter, muliggjør også identifikasjon og preparering av to andre oligonukleotidprober. Begge probene har 17 nukleotidoligomerer med følgende sekvenser:

Disse probene er både spesifikke overfor PIA-gener alene, og hybridiserer ikke med PIB-DNA-sekvenser. Hver av disse probene er derfor nyttige i diagnostisk testing for differen-siering mellom infeksjoner med PIA-organismer, og PIB-organismer. Som tidligere angitt viser hver av disse proteinene et spesifikt mønster på gonoréinfeksjon, enten systemisk eller lokalisert, og kan derfor være meget viktig for planlegging av et behandlingsprogram til det påvirkede individet.

Det isolerte genet, eller en kjemisk syntetisert DNA-sekvens, kan bli anvendt for å danne ytterligere kopier av genet ved vekst av transformerte vertscelleorganismer, isolasjon av rekombinant DNA fra transformerte celler, og isolering av det innskutte genet fra isolert rekombinant DNA.

5.2. IDENTIFIKASJON. ISOLASJON OG SEKVENSEN TIL PIB- GENET

En nukleotidsekvens for et PIB-protein er angitt i fig. 9. Den viste sekvensen ble isolert fra N. gonorrhoeae-stamme MS11. Tilstedeværelse av PIB er korrelert med serogruppene 4-9, og hvilke som helst stammer assosiert med disse serogruppene kan bli anvendt som en kilde for PIB DNA. Blant kjente gonoréiske stammer som erkarakterisert vedtilstedeværelse av PIB er MS11, FA6140, F62 og RIO. Teknikkene for preparering, identifikasjon og sekvensering av PIB-proteinet er vesentlig identisk med de til PIA-proteinet beskrevet ovenfor i seksjon 5.1. Spesifikk identifikasjon av PIB-genet ble muliggjort ved anvendelse av NC1- og NC12-prober (5'-GATACGGCGAAGGCATC-3' ) og identifikasjon av et Kpnl-restriksjonssete i PIB-delen av et hybrid PI-protein (Danielsson et al., Infect. Immun. 5_2:529-533, 1986). Kloning av genet, som PIA, ble oppnådd ved separat kloning av overlappende sekvenser i en kloningsvektor.

5.3. PRODUKSJON AV PIA-. PIB- ELLER PIA/ B- HYBRIDER VED

REKOMBINANTE DNA- TEKNIKKER

Den nukleotidkodende sekvensen for PIA er angitt i fig. 3. Den nukleotidkodende sekvensen for PIB er angitt i fig. 9. Ved utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan enten nukleotidsekvensen, eller dets funksjonelle ekvivalent bli dannet inn i rekombinante molekyler som vil lede ekspresjonen av PIA- eller PIB-produktet, respektivt. Hybrid-sekvenser avledet fra både fig. 3 og fig. 9, kan også bli konstruert for produksjon av hybridet PIA/B-proteiner.

På grunn av degenerasjonen av nukleotidkodende sekvenser, er andre DNA-sekvenser som koder for vesentlig den samme aminosyresekvensen som angitt i fig. 3 eller fig. 9 an-vendbare ved utførelse av foreliggende oppfinnelse for kloning og ekspresjon av PIA eller PIB, respektivt. Slike endringer av nukleotidsekvensen til fig. 3 eller fig. 9 omfatter delesjoner, addisjoner eller substitusjoner av forskjellige nukleotidresiduer resulterende i en sekvens som koder for det samme eller et funksjonelt ekvivalent genprodukt. Genproduktet kan inneholde delesjoner, addisjoner eller substitusjoner av aminosyreresiduer. Substitusjoner kan bli utført på basis av likhet i polaritet, ladning, opp-løselighet, hydrofobisitet, hydrofilisitet og/eller den amfipatiske naturen til involverte residuer. F.eks. omfatter negativt ladede aminosyrer asparaginsyre og glutaminsyre; positivt ladede aminosyrer omfatter lysin og arginin; aminosyrer med uladede polare hodegrupper eller upolare hodegrupper har lignende hydrofilisitetsverdier omfattende følgende: leucin, isoleucin, valin; glysin, alanin; aspara-gin, glutamin; serin, treonin; fenylalanin, tyrosin.

5.3.1. PREPARERING AV EN PI- GENKLONINGS-/ EKSPRESJONSVEKTOR

PIA-gensekvensen angitt i fig. 3 eller PIB-sekvensen angitt i fig. 9 samt hybrid-PIA/B-sekvenser, eller funksjonelle ekvivalenter derav, kan bli skutt inn i en egnet klonings-ekspresj onsvektor.

For til slutt å oppnå transkripsjon og translasjon av det innskutte genet, må genet bli plassert under kontroll av en promoter som er kompatibel med den valgte vertscelle. En promoter er et område av DNA hvor RNA-polymerase blir knyttet til og initierer transkripsjonen. Den valgte promoteren kan være en hvilken som helst som er blitt Isolert fra verts-celleorganismen. F.eks. har E. coli. som er et meget anvendt vertssystem, mange promotere så som lac- eller recA-promoter assosiert med den, bakteriofagene eller plasmidene deri. Syntetiske eller rekombinantproduserte promotere, så som X-fag Pl~og P^-promoterene, kan også bli anvendt for å mulig-gjøre produksjon i høyt nivå av DNA-segmentene ved siden av den.

Et initieringssignal er også nødvendig for å oppnå effektiv transkripsjon og translasjon av genet. F.eks. i E. coli. mRNA, omfatter et ribosombindingssete det translasjonene startkodonet (AUG eller GUG) og en annen sekvens komplementær med basene i 3'enden til 16S ribosomalt RNA. Flere av disse sistnevnte sekvensene (Shine-Dalgarno eller S-D) er blitt identifisert i E. coli og andre egnede vertscelletyper. En hvilken som helst SD-ATG-sekvens som er kompatibel med vertscellesystemet, kan bli anvendt. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, cro-genet eller N-genet til kolifag lambda, eller E. coli-tryptofan E-, D-, C-, B- eller A-gener.

Et antall fremgangsmåter eksisterer for innskudd av DNA-fragmenter inn i kloningsvektorer in vitro. DNA-ligase er et enzym som forsegler enkelt-trådede nikker mellom ved siden av liggende nukleotider i en dupleks DNA-kjede; dette enzymet kan derfor bli anvendt for kovalent kobling av sammensmeltede kohesive ender produsert av visse restriksjonsenzymer. Alternativt kan DNA-ligase bli anvendt for å katalysere dannelsen av fosfodiesterbindinger mellom buttendede fragmenter. Til slutt kan enzymet terminaldeoksynukleotidyl-transferase bli anvendt for å danne homopolymeriske 3'-enkelttrådede haler i endene av fragmentene; ved tilsetning av oligo (dÅ)-sekvenser til 3'-enden av en populasjon, og oligo (dT)-blokker til 3'endene av en annen populasjon, kan de to typene av molekyler bli sammensmeltet for å danne dimeriske sirkler. Hvilke som helst av disse fremgangsmåtene kan bli anvendt for å ligere gensegmentpromoteren og andre kontrollelementer inn i spesifikke seter av vektoren. Genet kodende for PI-proteinene blir derfor ligert inn i den valgte vektoren I et bestemt forhold til vektorpromoteren og kontrollelementene, slik at sekvensen er i riktig leseramme med hensyn på vektorens ATG-sekvens. Den anvendte vektoren vil vanligvis ha en markørfunksjon, så som ampicillin-resistens eller tetracyklinresistens, slik at transformerte celler kan bli identifisert. Metoden som anvendes kan være en hvilken som helst av kjente ekspresjonsvektorer eller derivatene derav; og de mest anvendte er plasmidvektorene så som pBR 322, pAC 105, pVA 5, pACYC 177, PKH 47, pACYC 184, pUB 110, pmB9, pBR325, Col El, pSClOl, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl eller RP4; bakteriofagvektorer så som lambda gt-11, lambda gt-WES-lambdaB, Charon 28, Charon 4A, lambda gt-l-lambda BC, lambda-gt-l-lambda B, M13mp7, M13mp8, M13mp9; SV40 og adenovirusvektorer, og gjærvektorer.

5.4. IDENTIFIKASJON OG RENSNING AV PIA- OG PIB- GENPRODUKTENE

Som allerede angitt ble gensegmentene kodende for PIA og PIB opprinnelig identifisert ved hybridisering med nye oligo-nukleotldsekvenser beskrevet ovenfor. Identiteten til det valgte fragmentet som det strukturelle genet kodende for PIA ble verifisert ved både molekylvektssammenligning med nativt PIA, og ved produkter reagerende med alle seks undersøkte PIA-monoklonale antistoffer i en kolonlradioimmunanalyse. Identiteten til PIB-produktet ble også verifisert ved reaksjon med PIB-spesifikke monoklonale antistoffer. E. coli-vertsceller som uttrykker klonet PIA- eller PIB-genet produserer mye Pl-protein som reagerer med hensiktsmessige monoklonale antistoffer. En rensningsprosedyre for PIA- proteinet er i detalj beskrevet i Teerlink et al. (i The Pathogenic Neisseria.G. Schoolnik, ed., 259-264, 1985, ASM).

5.5. PREPARERING AV PIA/ B- HYBRIDER

Også dannet i sammenheng med foreliggende oppfinnelse er et antall hybride PIA/B-gensekvenser og proteiner. Hybride gener ble konstruert ved anvendelse av fremgangsmåten for skyttel mutagenese modifisert etter Seifert et al. ( Genetlc Engineer-ing. Prlnciples and Methods.Vol. 8.s. 123-134, Settin et al., eds., Plenum Press, 1986; PNAS USA 83:735-739. 1986) for å sette inn en selekterbar markør ved siden av PI-genet i en PIA-produserende stamme. I dette tilfellet var den selekter-bare markøren kloramfenikolacetyltransferase(CAT)-genet, som tilveiebringer en selekterbar kloramfenikolresistens (Cm<r>). PIA-stammen inneholdende CAT DNA ble deretter anvendt som en DNA-donor for å transformere en PIB-inneholdende mottaker-stamme. Resiprokal krysning ble også utført. Putative hybrider ble identifisert ved selektering for Cm<r>, og scoring for PI ved immunblotting. Transformanter hvori (i) donor DNA er tilstede, eller (2) mottaker-DNA ble beholdt, eller (3) hvori DNA var forskjellig fra det til foreldrene, ble alle observert. Produksjon av sanne hybride PIA/B-stammer oppstod i begge typer av krysninger ved en tålbar høy frekvens, hvor et antall forskjellige serovarer var identifiserbare. Tilgjengeligheten av disse hybridgenene og proteinene har gjort analyse av beliggenheten av epitoper for kjente monoklonale antistoffer mulig, og også identifikasjon, og syntetisk konstruksjon av PIA/B-hybridproteiner som inneholder epitoper som er kjent for å indusere produksjonen av beskyttelsesanti-stoffer og som derfor er av stor interesse ved utvikling av en nyttig vaksine. Den detaljerte beskrivelsen av konstruksjonen og identlfikasjonen av disse hybridene er angitt i seksjon 7 nedenfor.

5.6. PRODUKSJON AV PIA. PIB 06 HYBRIDE PROTEINER VED

SYNTETISKE TEKNIKKER

I en alternativ utførelsesform er proteinene kodet av gensekvensen som angitt i fig. 3 og 9, samt chimeriske proteiner inneholdende deler av hver, og kan lett bli syntetisert kjemisk, ved hjelp av teknikker som er velkjente ( J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:361, 1986). Ved utførelsen, ved identifikasjon av beskyttelsesepitoper innenfor protein-sekvensen, tilveiebringer peptidsyntesen av isolerte aktive regioner av molekylet, en enkel og relativt billig fremgangsmåte for produsering av hovedmaterialet for vaksinpre-parering. Anvendelse av peptidsyntese tilveiebringer også en hensiktsmessig måte for konstruksjon av et hybrid PIA/PIB-protein, eller fortrinnsvis et syntetisk peptid omfattende beskyttende epitoper av både PIA- og PIB-proteiner. Foreliggende oppfinnelse omfatter derfor både rekombinantproduserte og syntetisk produserte proteiner i henhold til de beskrevne sekvenser. Fragmenter av hele proteinet, spesielt fragmenter som beholder antigenisiteten til foreldreprotein-molekylet, og spesielt fragmenter inneholdende epitoper som gir produksjon av beskyttende antistoffer, er også innbefattet. Det er også å bemerke at det er mulig å utføre substitusjoner innenfor hele proteinet og peptidfragment-sekvenser ved erstatning av en eller flere aminosyreresiduer i sekvensen ved en kjemisk ekvivalent aminosyre; f.eks. kan negativt ladede residuer, så som asparaginsyre og glutaminsyre, bli utvekslet, samt positivt ladede residuer, så som lysin eller arginin. Hydrofobe residuer omfatter tryptofan, fenylalanin, leucin, isoleucin, valin og alanin. Det er også mulig å utføre visse delesjoner fra, eller tilsetninger til, den kjente sekvensen og enda opprettholde ønsket antigen-aktivitet. Med foreliggende informasjon vedrørende sekvensen til de to proteinene, hører det til innenfor fagområdet å utføre hensiktsmessige endringer i molekylet og bestemme om aktiviteten er beholdt. Foreliggende oppfinnelse vedrører derfor også homologer, analoger og fragmenter av krevde proteiner, om de er klonet eller produsert syntetisk, hvori antigenisiteten til foreldremolekylet blir vesentlig beholdt.

5.7. FORMULERING AV EN VAKSINE

Genproduktet i renset form eller det syntetiske PIA-peptidet er nyttig ved preparering av en vaksinesammensetning for forhindring av gonoreisk infeksjon. Enten kan hele PIA-proteinet, eller en hvilken som helst aktiv del derav, bli anvendt som immunogenisk middel i en slik sammensetning. Dersom genproduktet er blitt uttrykt som del av et fusjons-protein, kan proteinet i sin helhet bli anvendt, eller vertscelleproteinet kan bli spaltet for å tilveiebringe ukondensert PIA-protein.

PIA-proteinet tilveiebrakt ved rekombinante DNA-teknikker, kan bli isolert fra vertscellene ved standard protein-isolasjonsteknikker. Renset protein blir deretter kombinert med hvilke som helst av vanlig anvendte farmasøytisk akseptable bærere, så som vann, fysiologisk saltvann, etanol, polyoler, så som glyserol eller propylenglykol, eller vegetabilske oljer, samt hvilke som helst av de kjente adjuvanter for vaksiner. PIA-produktet kan også bli inkorporert inn i liposomer for anvendelse i et vaksinepreparat. Som anvendt heri omfatter "farmasøytisk akseptable bærere" hvilke som helst og alle oppløsningsmidler, dis-persjonsmedia, belegg, antibakterielle og antisoppmidler; isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler og lignende. Anvendelse av slike midler for farmasøytisk aktive forbindelser er kjent innenfor fagområdet. Dersom ikke det konvensjonelle mediet ikke er kompatibelt med den aktive ingrediensen, blir det anvendt i den betraktede terapeutiske sammensetningen. Supplementerende aktive ingredienser kan også bli inkorporert.

En vaksine hvori det aktive immunogene er et hybrid-PIA/PIB-protein kan bli dannet. Eksperimentelt avledede gonokokker uttrykkende epitoper av både PIA og PIB er blitt rapportert i litteraturen (Danielsson, Inf. Immun..52:529-533, 1986), men strukturen til det chimeriske proteinet ble ikke identifisert og det har ikke vært noe forslag for mulig anvendelse av proteinet i en vaksine. En slik vaksine ville tilveiebringe fordelen av å kunne immunisere et individ mot begge typer gonoreisk infeksjon, dvs. systemiske infeksjoner assosiert med protein-IA-inneholdende stammer, og lokaliserte infeksjoner knyttet til protein IA- eller protein IB-inneholdende stammer. Med tilgjengeligheten av spesifikke prober beskrevet i sammenheng med foreliggende oppfinnelse, kan oppnåelse av et slikt hensiktsmessig hybridprotein lett bli oppnådd ved anvendelse teknikken innenfor fagområdet.

I prinsippet kan et chimerisk gen bli konstruert ved å først isolere gener for individuelle proteiner. En fremgangsmåte for isolering av PIA-genet, ved anvendelse av PIA-spesifikke oligonukleotidproteiner er allerede blitt beskrevet ovenfor. Lignende prosedyrer kan følges for isolering og identifisering av PIB-genet. Et antall stammer som bare produserer PIB-protein er blitt identifisert, f.eks. MS11, RIO, FA6140, F62 og mange andre. Ikke-PIA-spesifikke DNA-sekvenser beskrevet ovenfor kan hensiktsmessig bli anvendt for å isolere restriksjonsfragmenter inneholdende en PI-sekvens fra den PIB-spesifIkke stammen, fra et genbibliotek av PIB-stammer. Verifikasjon av ekspresjonen av riktig produkt, kan bli oppnådd ved transformasjon og ekspresjon av putativt PIB-fragment av en vertsmikroorganisme, og identifikasjon av uttrykt produkt ved reaksjon med hvilke som helst av de kjente PIB-spesifikke monoklonale antistoffene (R.C. Nowinski, Knapp, J.S., Tam, M.R. og Sandstrom J. Infect. Dis.. 150:44-48. 1984). Når hver av de individuelle gen-fragmentene er blitt isolert, kan de lett bli klonet og sammenstilt ved hvilke som helst av de kjente metodene innenfor fagområdet. Deler av PIA-sekvensen blir deretter ligert til deler av PIB-sekvensen på en slik måte at et chimerisk protein blir kodet i en transkriberbar og trans-laterbar form, f.eks. uavbrutt av translasjonsterminerende sekvenser. Hele den chimeriske sekvensen kan deretter bli ligert inn i en vektor inneholdende en selekterbar markør og kontrollelementer. Vektoren kan deretter bli anvendt for å transformere en vertsmikroorganisme som kan uttrykke isoler-bare mengder av genproduktet, alternativt kan man selv-følgelig bare anvende som et utgangspunkt en vektor som allerede inneholder PIA-genet, så som plasmidet innbefattet i E. coil NRRL B-18263; PIB-sekvensen blir isolert som beskrevet ovenfor og ligert i sin helhet eller delvis inn i plasmidet, ved siden av eller innenfor PIA-genet for å muliggjøre transkripsjon og translasjon av ønsket chimerisk gen. Konstruksjon av PIA/B-hybrider kan derimot fortrinnsvis bli oppnådd som beskrevet ovenfor i seksjon 5.6, hybridgenet isolert derifra, og anvendt for å danne en vektor for transformasjon. Vektoren konstruert på denne måten blir igjen anvendt for å transformere en vertsmikroorganisme. Ekspresjon av genproduktet tilveiebringer derfor en kilde for chimerisk protein, som lett kan bli inkorporert inn i en vaksine-formulering på samme måte som PIA- eller PIB-proteiner alene.

I en alternativ utførelsesform blir hybridprotein nyttig i vaksineformuleringer derimot fremstilt syntetisk, ved isolasjon og identifikasjon av beskyttende epitoper på nå kjente proteinsekvenser. Som angitt ovenfor har de nå lett tilgjengelige rekombinante chimeriske proteinene gjort det mulig å lettere identifisere epitopene av interesse, og derfor til slutt tillate konstruksjon av et "strømlinjet" hybrid bare inneholdende de delene av hybridproteinet som er nødvendig for produsering av immunitet ved syntetiske metoder.

6. EKSEMPEL I: PIA- GENIDENTIFIKASJON. ISOLASJON OG

EKSPRESJON

PIA-gensekvensen er blitt bestemt ved tilveiebringing av fragmenter av gonokokkisk DNA, separat kloning av individuelle fragmenter, og deretter rekonstruering av genet, med en fremmed induserbar promoter. To presumptive fragmenter inneholdende deler av PIA-gensekvensen ble identifisert ved hybridisering med oligonukleotid NCI, som beskrevet tidligere. Relevante restriksjonsfragmenter ble hver deretter ligert inn i en pGEM-2-plasmidvektor og transformert inn i en hensiktsmessig vert. Transformanter som hybridiserte til oligo NCI ble isolert. Plasmid DNA ble preparert fra disse klonene, fordøyd med hensiktsmessig restriksjonsenzym og igjen probet med NCI. Individuelle fragmenter som hybridiserte til NCI ble deretter separat religert inn i pGEM-2-plasmider, resulterende i to separate plasmider, pUNC3 og pUNCll.

Identiteten til DNA-sekvensen til et 750 bp fragment ble bestemt ved subkloning av mindre restriksjonsfragmenter fra den inn i M13 mpl8RF DNA, og deretter sekvensering ifølge metoden til Sanger (PNAS USA 74, 5463-5467, 1977). Fra denne sekvensen ble et nytt oligonukleotid syntetisert. Det nye oligonukleotidet, betegnet NC8, ble anvendt for å identifisere et 850 bp fragment ved siden av et 900 bp fragment allerede klonet, og dette fragmentet ble klonet inn i pGEM-2 for å tilveiebringe pUNC15, og sekvensert ved metoden til Sanger (ovenfor). Detaljene i prosedyrene som er innbefattet ved plasmidpreparering, sekvensering, hybridisering og transformering er angitt nedenfor.

6.1. GENERELLE PROSEDYRER ANVENDT FOR PREPARERING AV

PLASMIDENE

Følgende seksjoner beskriver den generelle prosedyren anvendt for DNA-isolering, enzymreaksjoner, isolering av fragmenter og ligeringsreaksjoner.

6.1.1 BETINGELSER FOR RESTRIKSJONSENZYM

Restriksjonsenzymene anvendt i foreliggende eksperimenter, er tilveiebrakt fra New England Biolabs, Inc., Beverly, Massa-chusetts dersom ikke annet er angitt. N. gonorrhoeae-kulturer blir dyrket i GC-basemedium (DIFCO) inneholdende Kellogg's suppleringsmidler I og II ( J. Bacteriol. 85:1274-1279, 1963), i en 5 % CC^-atmosfære. DNA som er nødvendig for spaltning ble isolert fra gonokokkstammen FA19, som beskrevet i Maness et al. ( J. Infect. Dis. 128:321-330, 1973) i henhold til metoden til Stern et al. ( Cell 37:447-456, 1984). Denne stammen er kjent for å produsere protein IA.

Alle spaltingene ble utført under følgende betingelser: en DNA-prøve på omtrent 20 pl ble inkubert ved 37° C, i 1-3 timer, i et 2-10 ganger overskudd restriksjonsenzym. Unn-takelsene til disse betingelsene er en temperatur på 65°C for Taql, og 30"C for Smal.

6.1.2. RESTRIKSJONSENZYMBUFFERE

Buffere anvendt for AccI, Mspl og Rsal-spaltninger består av:

50 mM Tris-HCl og 10 mM MgCl2ved pH 8.

Bufferen anvendt for Aval, Haelll, Hindlll og Taql-spaltninger består av: 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2og 50 mM NaCl ved pH 8.

Bufferen anvendt for BamHI, EcoRI og Sall-spaltninger består av: 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2og 100 mM NaCl ved pH 8.

Bufferen anvendt for Hindi, Sau3AI og Smal-spaltninger består av: 20 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2og 50 mM KC1 ved pH 7,4.

Reaksjoner blir stoppet ved tilsetning av 0,5 M EDTA (pH 7,5) til en finalkonsentrasjon på 10 mM.

6.1.3. IDENTIFIKASJON AV RELEVANTE RESTRIKSJONSFRAGMENTER

Innledende forsøk på kloning av PIA i pBR322 på andre vektorplasmider I E. coll-stamme HB101 (Maniatis et al.. , Molecular Clonin<g>. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982), var gjentatte ganger negative. Det ble derfor bestemt å forsøke og identifisere fragmenter inne holdende PIA-genet, eller en del derav ved hybridisering med oligonukleotidprober. To prober ble konstruert basert på den kjente N-terminale aminosyresekvensen til PIB til N. gonorrhoeae- stamme RIO (Blake et. al., Infect. Immun. 36:277-285 , 1982). I sammenheng med en begrenset mengde kodonanvendelses-data tilveiebrakt fra gensekvensene til pilin (Meyer et al. , PNAS USA 81:6110-6114, 1984) og Pil, to andre gonokokkiske proteiner, ble denne informasjonen anvendt for å konstruere et par oligonukleotider, betegnet NCI og NC2, vist i fig. 2. NCI er en unik sekvens og NC2 er en blandet populasjon av nukleotider for å øke sannsynligheten av identifisering av riktig sekvens. I kolonihybridiseringsanalyser hybridiserte begge disse oligonukleotidene til FA19, men hybridiserte ikke til HB101 inneholdende enten pBR322 eller pGEM-2.

Restriksjonsendonuklease-spaltet DNA ble kjørt på agarosegeler, og overført fra gelene til et nitrocellulosefilter ved blott-teknikken til Southern («K Mol. Biol. 98:503-517. 1978). NCI og NC2 oligoprober ble merket med -y-P^ - ATP (ICN Radiochemicals, Irvine, Calif.) ved anvendelse av poly-nukleotidkinase ifølge metoden til Maniatis et al. (ovenfor). Endemerking ble utført i følgende buffer: Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT (ditiotreitol), 0,1 mM spermidin og 0,1 mM EDTA. Hybridisering av merkede oligonukleotider til DNA på nitrocellulosefiltere ble utført over natt i 4 X SSPE (0,18 M NaCl, 10 mM NaH2P04[pH 7,4], 1 mM EDTA), 2 X Denhardfs oppløsning (1 X = 0,02 % bovint serumalbumin, 0,02 1o Ficoll, 0,02 % polyvinylpyrrolidin), 20 mM natriumpyrofosfat, 0,2 % natriumdodecylsulfat og 50 jjg/ml laksesperm DNA, med IO<6>cpm merket oligo pr. ml hybridisering. Filtrene ble vasket i 1 X SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat), 5 mM natriumpyrofosfat og 0,1 % natriumdodecylsulfat. Hybridisering og vasketemperaturer var 46° C og 40° C for NCI og NC2 respektivt. Filtrene ble vasket i 5X SSC, tørket og utsatt for Kodak røntgenfilm. Hybridisering til et enkelt fragment oppstod i hvert tilfelle; relevante fragmenter var: EcoRI- lOkb; SalI-5.5 kb; Sau3Al-900 bp; og TaqI-750 bp. Identiske resultater ble observert med både NCI og NC2.

6.1.4. KLONING AV FRAGMENTER

Når bibliotek av HBlOl-kolonier inneholdende EcoRI- eller Sall-spaltet DNA klonet inn i pBR322 ble probet med oligonukleotid NCI ved kolonihybridisering, ble ingen positive kolonier observert. Dette understøttet tidligere observasjon som foreslo at PI kan være dødelig for E. coli. De mindre fragmenter av FA19 DNA, dvs. Sau3AI- og Taql-spaltninger som hybridiserte med oligonukleotidene, ble antatt ikke å inneholde hele PI-genet, og ble valgt som kandidater for kloning.

Hovedsakelig samme prosedyre ble anvendt for hvert fragment. For Sau3AI-fragmentet ble totalt Fa 19 DNA spaltet fullstendig med Sau3AI. Plasmid pGEM-2 (tilveiebrakt fra Promega Biotec, Madison, Wis.) DNA ble spaltet med BamHI, og ligert med Sau3AI-fragmenter. Ligering av DNA-fragmenter ble utført med T4 DNA-ligase (New England Biolabs, Beverley, Mass.) ved 4°C i 16 timer i følgende buffer: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 5 % (v/v) polyetylenglykol 8000, 1 mM ATP, 1 mM DTT. Rekombinante plasmider blir transformert inn i E. coli HB101 ved kalsiumkloridprosedyren til Mandel og Higa (J. Mol. Biol. 53: 154, 1970); forklart i korte trekk blir bakterielle celler suspendert i en iskald, steril oppløsning av 50 mM CaCl2og 10 mM Tris Cl, pH 8, og deretter blandet med plasmid DNA i ligeringsbuffer.

Omtrent 2 000 transformanter ble isolert; bakterielle kolonier ble overført til nitrocellulosefiltre som ble preparert ved hybridisering ifølge fremgangsmåten til Grunstein og Hogness (PNAS USA 82: 3961-3965, 1975), og hybridisering med oligo NCI ble observert. En enkelt koloni hybridiserte virkelig med oligonukleotidet. Plasmid DNA ble amplifisert, høstet, spaltet med Sau3AI, og probet med oligo NCI ved Southern-hybridlseringsprosedyren som allerede er beskrevet. Et enkelt fragment på 900 bp hybridiserte med oligonukleotidet, samme størrelse som det Sau3AI genomiske fragment av FA19 Identifisert ved tidligere Southern-hybridisering. Dette fragmentet ble spaltet ut og elektroeluert fra en agarosegel, og religert inn i et BamEI-spaltet pGEM-2-plasmid for å danne rekombinant plasmid pUNC3 (fig. 2).

Vesentlig samme prosedyrer som nettopp beskrevet, ble utført med 750 bp Tagl-fragmentet til FA19 som hybridiserte med oligo NCI. Tagl-fragmentet ble derimot ligert inn i AccI-spaltningssetet til pGEM-2, resulterende i rekombinant plasmid pUNCll (fig. 2).

6.1.5. SUBKLONING OG SEKVENSERING AV FRAGMENTENE

Før sekvensering ble 750 bp Taql-fragmentet ytterligere spaltet til mindre restriksjonsfragmenter med mindre enn 300 bp med enzymene Rsal og Mspl. Fragmentendene ble deretter reparert og ligert inn i Smal-setet til M13 mpl8 RF DNA som beskrevet av Norrander et al. ( Gene 26: 101-106, 1983). Enkelttrådet DNA produsert av denne kloningsvektoren ble deretter anvendt som en templat for sekvensering ved fremgangsmåten til Sanger et al. (PNAS USA 74, 5463-5467, 1977).

Dideoksynukleotider kan bli fremstilt i henhold til metodene beskrevet i Sanger ovenfor, og referansene innbefattet deri (BRL, Gaithersburg, Md.). Fire separate brønner blir satt opp for hver DNA-prøve, en for hver av dideoksynukleotidene ddA, ddT, ddC og ddG. Til hver brønn blir det tilsatt 2 pl templat DNA, og 2 pl primerblanding bestående av 11 pl (22 ng) M13 17 baseprimer fra BRL, 11 pl TM (100 mMTris + 50 mM MgCl, pH 8,5) og 66 pl H20 (for 10 kloner). Disse ble spunnet, dekket med plast og inkubert ved 56"C i 50-60 minutter.

Etter inkubasjon blir 2 pl av hensiktsmessig NTP-blanding tilsatt til hver brønn: hver blanding vil inneholde 10-500 pM ddNTP, og 6,25 pM av hver vanlig dNTP. Etter tilsetning av NTP-blandingen, blir 2 pl Klenow-blanding tilsatt til hver brønn; Klenow-blanding består av: 11 pl Klenow (fortynnet til 1 U/pl); 11 pl 0,1 M ditlotreitol, 4,4 pl<35>S-dATP, og 61,6 pl EtøO. Blandingen blir spunnet, dekket med plast og inkubert ved 30° C i 15 minutter. Til hver brønn blir det tilsatt 2 pl chase-blanding (0,25 mM av alle fire dNTP), og spunnet, og inkubert på nytt ved 30°C i 15 minutter. 2 pl formamidfarge ble deretter tilsatt til hver brønn, og blir deretter inkubert ved 80°C i 15 minutter, ikke tildekket.

Ved dette tidspunktet er blandingene klare for applisering på gelene, eller kan bli dekket til og lagret ved -80°C. Gelene anvendt i prosedyren har følgende sammensetning:

Gelene blir kjørt ved 60 watt konstant styrke i 3-4 timer og deretter blandet i 10 % eddiksyre og 10 % metanol i 15 minutter; deretter tørket på papir og utsatt for Kodak røntgenfilm.

Et nytt oligonukleotid, NC8 ble dannet basert på sekvensen bestemt for TaqI-fragmentet. Dette nye oligonukleotidet, med sekvensen 5' GCGTTAAAACCGCTACC 3' ble anvendt i en Southern-hybridisering for å identifisere et 850 bp Sau 3 AI-fragment ved siden av 900 bp fragmentet tidligere klonet, og denne 850 bp ble klonet inn i pGEM-2, for å tilveiebringe plasmid pUNC15 (fig. 2), og sekvensert som nettopp beskrevet. Hele sekvensen til PI-genet er vist i fig. 3. Den eneste store åpne leserammen i denne sekvensen ligger mellom basene 84 og 1062, som tilsvarer et protein med 326 aminosyrer. Fra den publiserte N-terminale aminosyresekvensen til forskjellige PI-proteiner (Blake, ovenfor), var det første residuet til det modne proteinet sannsynligvis asparaginsyre ved base 141, som tilveiebringer et modent protein på 307 aminosyrer og et signalpeptid på 19 aminosyrer. Den antatte størrelsen til proteinet var 33,786 dal ton, som er nære opp til den tilsynelatende molekylvekten på 34 000 for PI i FA19. Signalpeptidet så ut til å ha de vanlige karaktertrekkene assosiert med slike sekvenser (Von Heijne, J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985), med et strekk hydrofobe aminosyrer, mange alanin-residuer og et Ala-X-Ala-spaltningssete. Det var også putative - 35 og - 10 promotersekvenser, som har tilnærmet sekvens og separering til konsensusen for disse sekvensene i E. coli (Harley et al., Nucl. Acid Res. 15: 2343-2361, 1987), og et Shine-Dalgarno ribosomalt bindingssete like oppstrøms for det første residuet til signalsekvensen. Den antatte N-terminale aminosyresekvensen tilsvarer den som ble bestemt ved aminosyresekvensering av et antatt PIA-protein (Blake in The Pathogenic Neisseria.G.K. Schoolnik, ed., Amer. Soc. Microbiol., Wash.) og var meget lik den til PIB-proteinet RIO. Hydropatiprofilen til det foreslåtte proteinet var lik den til et ytre membran porinprotein og var i samsvar med hovedporinene til E. coli. OmpFand OmpC (fig. 4),karakterisert vedlange hydroflle regioner uten noen vesentlige hydrofobe områder. Det var liten korrelasjon med hydropati-profilene til andre sekvenserte gonokokkiske ytre membran-proteiner .

6.2. GENEKSPRESJON

Forsøk på å isolere et intakt PI-gen klonet ved ligering av to deler av genet til Sau3AI-fragmentene til pUNC3 og pUNC15 ble gjentatte ganger mislykket, førende til den konklusjonen at gonokokkisk PI er skadelig for E. coli. Et rekombinant plasmid ble derfor konstruert slik at en del av PI-genpromoteren ble fjernet og PI-genet ble plassert nedstrøms for fag T7-promoteren på pGEM-2. Pga. at E. coll-celler vanligvis ikke inneholder T7-polymerase, som transkriberer gener nedstrøms fra T7-promoterene, blir plasmidet stabilt opprettholdt.

Plasmidet konstruert på denne måten er pUNC7, og ble preparert i henhold til skjema angitt i fig. 5. Et hensiktsmessig Haelll-sete mellom -35 og -10-regionen til PI-genpromoteren muliggjør lett fjerning av -35-regionen, og sekvensen oppstrøms. Den gjenværende delen av genet ble deretter skutt inn i pGEM-2 under kontroll av T7 promoteren. HB101 transformert med pUNC7 uttrykte ikke detekterbar PI i en koloniradloimmunanalyse. Plasmid pUNC7 ble deretter transformert inn i E. coli BL21 (DE3), et lysogen hvori fag-T7-polymerasegenet er tilstede, men under kontroll av lac UV5-promoteren (Studier et al., J. Mol. Biol. 189: 113-130, 1986). Når dyrket på medium uten isopropyl-p-D-tiogalakto-pyranosid (IPTG), BL21 (DE3) inneholdende plasmid pUNC7 produserte ikke påvisbar PI, men når IPTG var tilstede i mediet, indusering av T7-polymeraseproduksjon, ble PI-genproduktet påvist ved PIA-monoklonale antistoffer i en koloniblotradioimmunanalyse.

Det uttrykte proteinet blir sannsynligvis eksportert effektivt gjennom den indre membranen til E. coli-klonen. pga. at produktet var påvisbart ved koloniradloimmunanalyse uten lysering av celler. Proteinet hadde ekvivalent tilsynelatende molekylvekt sammenlignet med FA19 PI som påvist ved SDS-PAGE (fig. 6A) og Western blotting (fig. 6B) og dette er også sannsynligvis det proteinet som blir produsert mest av klonen i løpet av vekst over natt i nærvær av IPTG. Produksjon av proteinet var dødbringende for denne spesielle E. coli-stammen, idet ingen stabile celler ble isolert. Plasmid pUNC7 inneholdende PI-genet kan derimot bli stabilt opprettholdt i denne stammen forutsatt at ingen ekspresjon blir indusert ved vekst på IPTG-inneholdende medium.

En biologisk ren kultur av stammen BL21 (DÉ3) inneholdende plasmid pUNC7 er blitt deponert 13. november 1987 til Northern Regional Research Laboratory (NRRL), under aksesjonsnr. NRRL # B-18263.

7. EKSEMPEL 2: IDENTIFIKASJON. ISOLASJON. SEKVENSERING OG EKSPRESJON AV PIB- GENET OG KONSTRUKSJON OG EKSPRESJON AV PIA/ B-HYBRIDER

Identifikasjon og isolasjon av både PIB-genet og PIA/B-hybridene var resultatet av et forsøk på å vise at nmp-locuset er det PI-strukturelle genet, og at PIA- og PIB-proteinene er alleler. Forløpet av hendelsene omfatter vanligvis innskudd av en selekterbar markør inn i en PIA-inneholdende stamme, etterfulgt av transformering av en PIB-produserende stamme. Disse prosedyrene er angitt i detalj nedenfor.

7.1. INNSKUDD AV EN SELEKTERBAR MARKØR INN I PI- GENET

900 bp Sau3AI-fragmentet til pUNC3, beskrevet ovenfor, inneholdende de første 45 kodonene til PI-genet til FA19 (en PIA-produserende stamme) og oppstrømssekvenser, ble ligert med BamHI-spaltet pHSS6 for å danne plasmid pNCS2 (fig. 7). Dette plasmidet ble deretter utsatt for skyttelmutagenese. Skyttelmutagenese ble utført ved anvendelse av en modifikasjon av metoden til Seifert et al., ovenfor. Mål-DNA ble subklonet inn i pHSS6 og ført inn i E. coli-stamme RDP146 (pTCA) ved transformasjon, etterfulgt av innføring av pOX38: :mTn3Cm-3 (fra E. coli w3110p_olA) ved konjugasjon. Transkonjugater ble dyrket over natt ved 30"C for å mulig-gjøre transposisjon, etterfulgt av vekst i flere timer ved 37°C. En "pool" av transkonjugater (omtrent 1 000 kolonier) ble resuspendert og anvendt som donor i konjugasjon med E. coli NS2114Sm, hvori plasmidet kointegreres, dannet som et intermediat i transposisjonshendelsene Inn i målplasmidet, blir bestemt (Seifert et al., ovenfor). Transposonet skutt inn på denne måten er stabilt pga. at transposasefunksjonen,

som er tilveiebrakt i trans i plasmid pTCA, ikke lenger er tilstede. Mini-transposonet anvendt i dette tilfellet var mTn3Cm-3, hvori bla-genet til Tn3 er erstattet med klor-amfenikolacetyltransferase(CAT)-genet.

Etter kartlegging av mTn3Cm-3-innskuddssetene innenfor 900 bp Sau3AI-fragmentet til pNCS2, ble fem av disse konstruksjonene med mTn3Cm-3 i forskjellige seter spaltet med Noti, som frigjør det totale innskuddet som et lineært fragment, og anvendt for å transformere FA19. Bare ett spaltet plasmid, pNCS32 (fig. 7), transformerte FA19 til Cm<r>, ved en frekvens på omtrent 1 x IO"<7>. Innskuddssetet av mTn3Cm-3 i pNCS32 var omtrent 300 bp oppstrøms for PIA-genpromotersekvensene, mens innskuddssetene i de andre fire plasmidene var alle nærmere, men ikke innenfor, PI-genet. Beliggenheten av mTn3Cm-3 i genomet til transformanten FA19 CAT Dl (fig. 7) ble bekreftet ved Southern-hybridisering.

Tidligere studier (Cannon et al., J. Bacteriol. 143:847-851, 1980; Infect. Immun. 32:547-552, 1981) har vist at nmp-locuset, som påvirker molekylvekten og antigenisiteten til PI, er nærmere bundet på gonokokkgenomet til antibiotika-resistensmarkørene str og spe, i rekkefølgen str- spc- nmp, med kotransformasjonsfrekvenser på 5 # for str og nmp. og omtrent 23 % for spe og nm<p.>For å bestemme om CAT-markøren i FA19 CAT Dl, ved siden av det PI-strukturelle genet, viste det samme bindingsmønsteret som nmp-locuset. ble resiprokale krysninger utført mellom stammene FA130 (Str<r>Spc<r>Cm<s>; Sarubbi et al., J. Bacteriol. 120:1284-1292. 1974) og FA19 CAT Dl (Str<s>Spc<s>Cm<r>). Når FA130 DNA ble anvendt for å transformere FA19 CAT Dl, med selektering for enten Str<r>eller Spc<r>, var kotransformasjonsfrekvenser 26 % (99/383) for spe og CAT, og 7,5 % (40/537) for str og CAT. I den resiprokale krysningen, med selektering for Cm<r>, var kotrans-formasjonsf rekvensene 10 % (11/111) for spe og CAT, og 1 %

(1/111) for str og CAT. Analyser av overkrysningsklasser bekreftet at genrekkefølgen var str... spe...CAT. Disse data

demonstrerte at CAT-genet var koblet til str- og spc-markør-ene på samme måte som nmp-locuset. som tilveiebringer sterke bevis på at nmp-locuset er det strukturelle genet for PI.

I en annen krysning ble FA19 CAT Dl DNA anvendt for å transformere PIB-stammen MS11, selektert for Cm<r>. Blant 45 transformanter krevde 24 donoren PIA, 13 beholdt mottakeren PIB og 8 uttrykte nye hybrid-PIA/PIB-proteiner, som påvist ved koloniimmunblotting. Erstatning av mottaker-PIB med PIA til donoren, ved selektering for nær koblet CAT-gen, bekreftet den alleliske naturen til disse genene, og den hyppige oppstandelsen av hybridproteinene foreslo at sekvens-homologien mellom de to allelene muliggjorde at intragenisk rekombinasjon oppstår. Detaljerte analyser av disse PI-hybridstammene var avhengig av kunnskap om PIB-sekvensen til MS11, som derfor ble klonet og sekvensert.

7.2. KLONING. SEKVENSERING OG EKSPRESJON AV PIB- GENET

Pga. at intakte gonokokkiske PI-gener tilsynelatende ikke kan bli klonet I E. coli. ble strategien beskrevet ovenfor for PIA, kloning av fragmenter som sammen inneholder hele gensekvensen, anvendt for MS11 PI-genet. Et DNA-fragment fra innenfor PI-genet til stammen FA6149, tidligerekarakterisertå inneholde et hybrid PI (Danielson et al., Infect. Immun. 52:529-533, 1986), ble klonet og sekvensert, og viste tilstedeværelse av et Kpnl-sete i PIB-delen av sekvensen, omtrent 300 bp fra begynnelsen av genet. 01igonukleotidene NC12 (fig. 8), avledet fra PIB-gensekvensen nedstrøms for K<p>nl-setet, og NCI (fig. 1), avledet fra gensekvensen korresponderende med den N-terminale enden av proteinet, ble anvendt som prober i JSouthern-hybridisering for å bekrefte tilstedeværelse av Kpnl-setet i MS11 PI-genet. HBlOl-kolonier inneholdende Kp_nl/Hine 11-spaltet MS11 DNA klonet inn i vektorplasmid pGEM-3 ble probet med disse oligonukleotidene, og kolonier hybridiserende med NC12 ble påvist og funnet å inneholde et plasmid med et 1,8 kb Kpnl- HineII-fragment som hybridiserte med NC12. Dette plasmidet ble betegnet pUNCH22

(fig. 8). Til tross for gjentatte forsøk ble ingen kolonier som hybridiserte med NCI påvist. Pga. at NCI hybridiserte med et 750 bp Kpnl- Hine 11-fragment fra MS11 genomisk DNA i Southern-hybridisering, var problemet ikke størrelsen, men sannsynligvis ekspresjon av PI-gendelen til dette fragmentet som, i en høykopiantallvektor, var letalt for HB101. Pga. dette ble den gjenværende delen av MS11 PI-genet isolert som et 540 bp HinfI-fragment i Xgtll, ved anvendelse av oligonukleotid NCI som en probe. Denne klonen ble betegnet Xgtll.NCI (fig. 8). 540 bp HinfI-fragmentet til Xgtll.NCI og 750 bp KpnI- Sau3AI-fragmentet til pUNCH22 ble ytterligere spaltet, subklonet og sekvensert. Sekvensen er vist i fig. 9 og viser et protein med 350 aminosyrer, hvor de første 19 er det antatte signalpeptidet. En sammenligning av PI-gensekvensene til FA19 og MS11, viser 80 # nukleotidsekvens-homologi. En sammenligning av antatte aminosyresekvenser til PIA (FA19) og PIB (MS11) er angitt i fig. 10 og viser et antall regioner med signifikant diversitet avbrutt av lange regioner med homologi. Noen av regionene med diversitet korresponderer sannsynligvis til overflate-eksponerte antigenlsk deler av proteinet, pga. at PI-spesifikke monoklonale antistoffer dannet mot hele gonokokkiske celler aldri er kryss-reaktive mellom PIA og PIB (Knapp et al., J. Infect. Dis. 150: 44-48, 1984).

Ekspresjon av et fullstendig PIB-gen ble oppnådd ved anvendelse av den samme strategien som den for PIA (seksjon 6.2.). Et fragment av Xgtll.NCI Innskutt DNA, fra Ncil-setet mellom -35 og -10-regionene til PIB-genpromoteren til Kpnl-setet innenfor genet, ble ligert med 750 bp Kp_nI-Sau3AI-fragmentet til pUNCH22 inn i vektoren pGEM-2 spaltet med HincII og BamHI. Dette resulterte i en fullstendig PIB-kodende sekvens uten egen promoter, men rett nedstrøms for T7-promoteren på plasmidvektoren. Når denne konstruksjonen (pUNCH25) ble ført inn i BL21 (DE3) og dyrket med IPTG, ble PIB-ekspresjon påvist (fig. 11).

En biologisk ren kultur av E. coli-stamme BL21 (DE3) inneholdende plasmid pUNCH25 er blitt deponert til American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under aksesjonsnr. 67775.

7.3. KONSTRUKSJON OG ANALYSE AV PIA/ B- HYBRIDSTAMMER

Ytterligere PIA/B-hybrider ble konstruert ved transformering (Biswas et al., J. Bacteriol. 129:983-992, 1977) av MS11 med FA19 CAT Dl DNA, selektering Cm<r>og scoring PI ved immunblotting. I en reslprokal krysning ble DNA fra en Cm<r->transformant av MS11 som hadde beholdt PIB anvendt for å transformere FA19, selektering for Cm<r>og scoring av PI som før. Cellene ble inkubert for fenotypisk ekspresjon av antibiotikaresistens i 5 timer enten i GC-basekraft før utsåing eller i GC-baseagar før tilsetning av softagarbelegg inneholdende antibiotika. Når FA19 ble anvendt som mottaker og selektering for Cm<r>, ble 1 pg/ml antibiotika anvendt, mens når MS11 ble anvendt som mottaker, ble 10 jjg/ml anvendt. Bakterielle stammer ble analysert for binding av monoklonale antistoffer ved anvendelse av en modifikasjon av metoden til Cannon et al. En konsentrert suspensjon av celler i GC-basekraft ble overført til nitrocellulose ved anvendelse av filtrerlngsmanlfold og lysert i kloroformdamp. Filteret ble bløtgjort i TBS (10 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl) inneholdende 5 1o tørrmelk, Inkubert i TBS inneholdende hensiktsmessig antistoff, og deretter vasket i TBS. Etter Inkubasjon i antimus-IgG-alkalinfosfatasekonjugert sekundært antistoff (Sigma) og ytterligere vasking, ble filteret utviklet ved anvendelse av nitroblå tetrazolium og 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (Bethesda Research Laboratories) ifølge fremstillerens veiledninger. De monoklonale antistoffene som ble anvendt var 4A12, 4G5, 2F12, 6D9, 5G9, 5D1 (10), 1D3 (26) og SM101 (27) og alle er PIA-spesifikke, og 1F5, 3C8, 2D4 og 2H1 (10) som er PIB-spesif ikke. Alle antistoffene med unntakelse av SM101 ble tilført i ascites av M. Tam (Genetic Systems), og ble anvendt i fortynninger på 1:2 000 til 1:10 000. SM101 ble mottatt av J. Heckels (University of Southampton).

Blant 300 transformanter med FA19 som mottaker, hadde 3 et hybrid PI. Blant 13 hybridstammer ble 5 forskjellige hybrid PI-serovarer identifisert (tabell I). De hybride stammene ble deretter analysert ved kolonlhybridisering ved anvendelse av et antall PIA- og PIB-spesifIkke oligonukleotider (tabell II og fig. 10) for å vurdere hvilke deler av de hybride PI-genene som ble PIA-sekvenser og hvilke som var PIB-sekvenser, og 9 forskjellige klasser ble påvist ved denne metoden (fig.

10). Ved analysering av serovaret av hybrid PI-genene med kjent struktur, kunne den omtrentlige beliggenheten av epitopene for disse monoklonale antistoffene bli bestemt.

Epitopene til PIA-spesifikke monoklonale antistoffer 4G5, 2F12 og SM101, som reagerer med klasse 1-hybrid, må være beliggende nære ved den N-terminale enden til proteinet, innenfor de første 60 residuene. Sammenligning av hybridklassene 1, 5 og 6 foreslår at epitopen for SM101 ligger i hvert fall delvis i regionen mellom residuene 34 og 60. De N-terminale 60 residuene inneholder betraktelig diversitet mellom PIA og PIB (fig. 3, 9, 10) som kan bero på spesifisi-teten til disse antistoffene. Epitopen for 6D9 (PIA-spesifikk), som reagerer med hybridklassene 6-9, ligger i regionen til proteinet mellom residuene 187 og 250, som også omfatter regioner med betraktelig diversitet mellom PIA og PIB. Epitopene for 4A12, 5G9, 5D1 og 1D3 (alle PIA-spesifikke) ble bare påvist i hybridproteinet fra klasse 9, og er derfor sannsynligvis kompleks epitoper omfattende både N-terminale og C-terminale deler av proteinet. Dette er understøttet ved observasjonen omfattende at disse antistoffene ikke reagerer godt med PI i et Western blot, hvor proteinet er relativt denaturert.

Blant de fire antistoffene som reagerer med PIB fra MS11, epitopen for 1F5, som reagerer med hybridklassene 7 og 8, er beliggende innenfor de N-terminale 60 residuene, mens epitopene for 3C8, 2D4 og 2H1 sannsynligvis ligger innenfor en sentral del av proteinet, mellom residuene 150 og 270, som omfatter et langt stykke med divergent sekvens. Epitopen for 3C8 er beliggende noe oppstrøms for de for 2D4 og 2H1, pga. at klasse 9 hybridproteinet bare reagerer med 3C8. Disse epitopene kan derimot være relativt komplekse pga. at 2D4 og 2E1 ikke reagerer med PIB i et Western blot. En biologisk ren kultur av den transformerte mikroorganismen FA6248, som inneholder et hybrid PIA/B-gen og uttrykker et hybrid PIA/B-protein, er blitt deponert til American Type Culture Collection, Rockville, MD, under aksesjonsnr. 53808.

7.4. DISKUSJON

Foreliggende studie, hvori et reportergen ble skutt inn nære ved det PI-strukturelle genet, demonstrerer at PIA- og PIB-strukturelle gener er alleler av samme locus, som tidligere ble identifisert som en nmp (Cannon et al. , J. Bacteriol 143:847-851. 1980). Tilstedeværelse av et enkelt PI-gen på gonokokkgenomet er i samsvar med observasjonen om at naturlig forekommende stammer enten har et PIA- eller PIB-protein, men aldri begge, og at deres PI-serotype blir stabilt opprettholdt. En sammenligning av PIA- og PIB-genet og avledede aminosyresekvenser viste en høy grad av homolog!, men regioner med betraktelig sekvensdivergens ble identifisert. Til tross for at PI-hybrider ikke oppstår naturlig, overlevde Pl-hybridene som ble konstruert heri stabilt in vitro. Den relativt sjeldne dannelsen av et hybrid PI med en PIB N-terminal ende og den overraskende hyppige tilstedeværelse av multiple overkrysninger i PI-genet foreslår at visse klasser av hybrid-PI kan bli favorisert ved dyrking av gonokokker in vitro.

Konstruksjon og analyse av PI-hybrider muliggjorde bestemmelse av omtrentlig beliggenhet av noen av de overflate-eksponerte delene av proteinene og tilveiebrakte en viss innsikt angående mulige sekundære og tertiære strukturer. De N-terminale regionene til både PIA og PIB er tilsynelatende overflateeksponerte, sammen med minst en annen region i den sentrale delen av hvert protein. Foldingen av PIA i den ytre membranen kan være slik at de N-terminale og C-terminale delene er nært knyttet på overflaten, pga. at epitoper for et antall PIA-spesifikke monoklonale antistoffer bare ble identifisert når begge disse delene var tilstede i et hybrid-PI. Disse modellene for konf ormas j onen av PI i den ytre membranen er i samsvar med noen aspekter av tidligere modeller basert på proteolytisk spaltning av PI i intakte gonokokker (Blake et al., Infect. Immun. 33:212-222, 1981; Judd et al. Infect. Immun. 54:408-414, 1986), men er forskjellige fra tidligere forslag pga. at bare den N-terminale enden av PIA og en sentral del av PIB er overflateeksponerte (Blake et al., ovenfor; Teerlink, J. Exp. Med. 166:63-76.1987).

8. DEPONERING AV MIKROORGANISMER

Følgende Neisseria gonorrhoeae-stammer inneholdende angitte plasmider er blitt deponert til the Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL eller the American Type Culture Collection, (ATCC), Rockville, MD og er blitt tildelt angitte aksesjonsnumre.

Det er også å bemerke at alle baseparstørrelser angitt for nukleotider er omtrentlige og skal bare være veiledende.

Claims

1. Rekombinant vektor,karakterisert vedat den omfatter et nukleinsyremolekyl kodende for full-lengde protein PIA fra Neisseria gonorrhoea i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser hvor proteinekspresjonen blir kontrollert av en induserbar promoter, og hvor vektoren blir stabilt opprettholdt i en vertscelle.

2. Rekombinant vektor ifølge krav 1,karakterisertved at den er avledet fra plasmid pGEM-2.

3. Rekombinant vektor ifølge krav 2,karakterisertved at plasmidet er pUNC-3.

4 . Rekombinant vektor ifølge krav 2,karakterisertved at plasmidet er pUNC-7.

5. Rekombinant vektor ifølge krav 2,karakterisertved at plasmidet er pUNC-15.

6. Vertsorganisme,karakterisert vedat den inneholder vektoren ifølge krav 1.

7. Vertsorganisme i henhold til krav 6,karakterisert vedat den inneholder vektoren ifølge krav 4.

8. Vertsorganisme i henhold til krav 6,karakterisert vedat den inneholder vektoren ifølge krav 5.

9. Vertsorganisme ifølge krav 8,karakterisertved at den har de identifiserende karaktertrekkene til NRRL No. B-18263.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et fullengde PIA protein fra Neisseria gonorrhoea,karakterisertv e d å: (a) dyrke i fravær av en induser, en vertscelle i henhold til krav 6 inneholdende en replikerbar rekombinant vektor som har en DNA-sekvens kodende for full-lengde PIA-protein, i det sekvensen er kontrollert av en induserbar promoter og blir stabilt opprettholdt i en vertscelle; og (b) deretter, dyrking av vertscellen i nærvær av induseren slik at full-lengde PIA-proteinet blir selektivt uttrykt.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisertved at plasmidet omfatter sekvensen som angitt i figur 1.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisertved at plasmidet er avledet fra pGEM-2.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisertved at plasmidet er pUNC-7.

14. Rekombinant vektor,karakterisert vedat den omfatter et nukleinsyremolekyl kodende for et full-lengde protein PIB fra Neisseria gonorrhoea stamme MS11 i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser hvor proteinekspresjonen blir kontrollert av en induserbar promoter, og hvor vektoren blir stabilt opprettholdt i en vertscelle.

15. Rekombinant vektor ifølge krav 14,karakterisert vedat den er avledet fra plasmid pGEM-2.

16. Rekombinant vektor ifølge krav 15,karakterisert vedat plasmidet er pUNCH-25.

17. Vertsorganisme,karakterisert vedat den inneholder vektoren Ifølge krav 14.

18. Vertsorganisme ifølge krav 17,karakterisertved at den inneholder vektoren ifølge krav 14.

19. Vertsorganisme ifølge krav 17,karakterisertved at den inneholder vektoren ifølge krav 16.

20. Vertsorganisme ifølge krav 19,karakterisertved at den har de identifiserende karaktertrekkene ifølge ATTC No. 67775.

21. Fremgangsmåte for å fremstille et full-lengde PIB protein fra Neisseria Gonorrhoea stamme MS11,karakterisertved å: (a) dyrke i fravær av en induser, en vertscelle ifølge krav 17 inneholdende en replikerbar rekombinant vektor som har en DNA-sekvens kodende for full-lengde PIB-protein, i det sekvensen er kontrollert av en induserbar promoter og blir stabilt opprettholdt i en vertscelle; og (b) deretter, dyrke vertscellen i nærvær av induseren slik at full-lengde PIB-proteinet blir selektivt uttrykt.

22. Fremgangsmåtee ifølge krav 21,karakterisertved at plasmidet omfatter sekvensen som angitt i figur 9.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisertved at plasmidet er avledet fra pGEM-2.

24 . Fremgangsmåte ifølge krav 23,karakterisertved at plasmidet er pUNCE-25.