JP2001190285A

JP2001190285A - レプトスピラ症の予防のためのレプトスピラワクチン抗原

Info

Publication number: JP2001190285A
Application number: JP2000342552A
Authority: JP
Inventors: Alan Diauesutaa Don; アランディアウェスタードン; Andrew Wott Eric; アンドリューウットエリック; Steven Willy Michael; スティーブンウィリーマイケル
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 2000-11-09
Publication date: 2001-07-17
Also published as: JP2001190284A; US6482924B1; ZA997265B; NZ501213A; BR9905780A; US6800734B2; CA2290219A1; EP1020516A3; EP1020516A2; AU6527299A; JP2000189179A; AR020852A1; JP2001204479A; US20040043391A1; CN1257872A

Abstract

(57)【要約】【課題】レプトスピラ症の新規な治療手段の提供。【解決手段】各々がレプトスピラからの異なるタンパ
ク質を含有し、この生物体により引き起こされるレプト
スピラ症のためのワクチンに免疫学的に用い得る４種類
の抗原製剤が提供される。さらに本発明では、レプトス
ピラ症の診断に用いるための、これら４種類のタンパク
質およびタンパク質を結合する抗体をコードするポリヌ
クレオチドが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は一般に、抗原調製物
に、特に動物における防御免疫応答に用いられる４種類
のレプトスピラ（Leptospira）膜タンパク質、即ちキナ
ーゼ（Kinase）、パーミアーゼ（permease）、マンノシ
ルトランスフェラーゼ（mannosyltransferase ）および
エンドフラゲリン（endoflagellin ）に関する。このよ
うなタンパク質は、この生物体により引き起こされるレ
プトスピラ症のためのワクチンとして免疫学的に用い得
る。あるいは、レプトスピラ症の診断は、これらのタン
パク質、タンパク質に対する抗体またはタンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドの存在を検出することにより
実行し得る。

【０００２】

【従来の技術】レプトスピラ（Leptospira）属の病原性
種は、世界的に重要な人獣共通伝染病であるレプトスピ
ラ症の作因である。本細菌は、好気性条件下で繁殖する
グラム陰性スピロヘータである。これらの細菌は偏好性
（fastidious) 栄養要求を有し、長鎖脂肪酸を唯一の炭
素源として利用できる。レプトスピラは自発運動能力を
有し、その迅速な、螺旋状に進む運動性は、この生物体
の顕著な同定特徴として役立つ。レプトスピラは、メト
ロニダゾールおよび５−フルオロウラシルの両方に耐性
であり、in vitroで１０〜１２時間の世代時間を示す。

【０００３】病原性レプトスピラはすべて、以前はレプ
トスピラ・インテロガンス（Leptospira interrogans）
として分類されていた。近年、DNA 相同性研究により、
レプトスピラ・インテロガンス（Leptospira interroga
ns）は数種の病原性レプトスピラ種、即ちレプトスピラ
・ボルクペトルセニｓｖハードジョボビス（L. borgpet
ersenii sv hardjobovis）、レプトスピラ・イナダイ
（L. inadai ）、レプトスピラ・インテロガンス（L. i
nterrogans）、レプトスピラ・キリシュネリ（L.kirshn
eri）、レプトスピラ・ノグチ（L. noguchii ）、レプ
トスピラ・サンタロサイ（L. santarosai ）およびレプ
トスピラ・ウエイリ（L. Weilli ）に再分類された。レ
プトスピラ症に関与する病原性レプトスピラ種の血清学
的知見は、２３の血清群内に２００より多い血清型亜型
（serovars）（「ｓｖ」）が存在することを示している
（Farr, R.W. Clin. Infect. Dis. 21:1-8（1995））。

【０００４】全世界にはレプトスピラ症に関与する多数
の血清型亜型が存在する。レプトスピラ・インテロガン
スｓｖポモナ（Leptospira interrogans sv pomona）は
感染ブタからの一般的単離物であって、この場合、それ
は発熱、黄疸、血色素尿および腎不全を引き起こす。レ
プトスピラ・インテロガンスｓｖハードジョボビス（Le
ptospira interrogans sv hardjobovis ）は、ウシ疾患
の重要な病因であって、この場合、それは流産およびア
ガラクシアを引き起こし、感染した畜牛に長期間身を曝
した後、ヒトに人獣共通伝染病性脅威をもたらす。多く
の感染動物が無症候性である。しかしながら、これらの
動物はキャリアとして作用し、尿を介してレプトスピラ
を流出し得る。

【０００５】牛におけるレプトスピラ感染は１６％の感
染率を示し、その率は乳牛より肉牛の方が高い。感染率
はさらに、雌牛より雄牛の方が高い。ウシレプトスピラ
症を引き起こす一定の血清型亜型の顕著な有病率も認め
られる。米国の４８の州における牛の最近の調査では、
レプトスピラに対して陽性である動物のうち、８４％が
血清型亜型ハードジョボビス（sv hardjobovis）に、１
２％が血清型亜型ポモナ（sv pomona ）に、そして４％
が血清型亜型グリプトチホサ（sv griptotyphosa）に感
染していた（Miller, D.A.et al., Am. J. Vet. Res.52
（11）:1761-1765（1991））。

【０００６】レプトスピラ感染の病因に関しては、ほと
んど分かっていない。感染は、通常は感染動物からの尿
に接触することにより伝染される。感染尿で汚染されて
いた土壌および水も感染を伝達し得るが、しかしこれら
の条件下でのレプトスピラの長期生存可能性は疑問であ
る。宿主の外でのレプトスピラの生存は、２２℃または
それ以上の温度、水分および中性〜弱アルカリ性環境に
より助長される。

【０００７】レプトスピラは、６０℃より高い温度、洗
剤、乾燥および酸性により容易に殺される。レプトスピ
ラが一旦宿主を侵襲すると、粘膜上皮細胞の細胞間接合
部への付着および浸透は、感染の重大な段階である。菌
血症は、通常は、レプトスピラ症に関連した最初の病状
を引き起こし、そして最初の症状である。ひとたび循環
系に入ると、細菌は腎臓に集落形成して、そこでそれら
は急性または慢性感染を引き起こし得る。レプトスピラ
の病因に関与すると考えられるいくつかの毒力因子は、
ヒアルロニダーゼ、ウレアーゼ、ヘモリシンおよびホス
ホリパーゼである。

【０００８】レプトスピラ症は、ほとんどの哺乳類主を
感染し得るレプトスピラの病因株により引き起こされ
る。病原性レプトスピラの主な天然貯蔵所は野生哺乳類
であるが、しかしその他の脊椎動物は時折感染される。
さらに、数種のレプトスピラは海洋哺乳類、例えばゴマ
アザラシの既知の病因である（Stampler, M.A.et al.,
J.Wild. Dis.34 （2 ）:407-410（1989））。家畜動
物、例えばイヌ、畜牛、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウマ
も、ヒト感染の主要供給源であり得る。感染は、感染動
物との直接接触により、または汚染された土壌または水
との間接的接触によって起こる。家畜類では、疾患は、
流産、死産、不妊、乳汁生産の低減および死亡のために
経済的損失を生じる。

【０００９】ヒトレプトスピラ症の重症度は大いに変動
し、大部分、感染菌株により、そして宿主の全身健康状
態により確定される。レプトスピラを分類する地方の研
究所の能力の改良は、米国内の多数の血清型亜型固有
種、ならびに種々の動物種における感染範囲を認識させ
た。それでも、ヒトの疾患が高頻度に診断される。米国
内で年間約１００例が報告されている。

【００１０】齧歯類および家畜動物におけるその有病率
のために、レプトスピラ症は、下水道従業者、養豚従業
者、獣医、屠殺場従業者および農業従事者のような、動
物および動物生成物に重度に曝露される仕事に従事する
人の主要疾患である（Vinetz, J.M., Cur. Opin. Infec
t. Dis.10:357-361 （1997））。さらに、都市スラムの
ような齧歯類が出没する住居に住んでいる人達およびイ
ヌを飼っている人達も、危機に直面している。男性の方
が発生率が高い。現在、症例の大多数が夏季に、そして
十代の若者や青年に発症している。職業的曝露は、目
下、益々頻発している。

【００１１】汚染された池や淀みがちな流れによる共通
の供給源突発が多い。高発生率、夏季、若年齢群、そし
て動物の水への接近が、これらの突発のほとんどを予表
する。世界のいくつかの地域では、洪水の際の流出も非
常に影響を及ぼす。散発性疾患は、感染動物との直接接
触により獲得され得る。臨床的疾患を予防する家畜動物
のワクチン接種は、レプトスピラの流出を防止し得な
い。ペットのイヌは、散発性のヒトの症例の顕著な供給
源であった。動物保菌宿主の屈曲した尿細管は生存可能
なレプトスピラを保有し、これが尿中に出る。無症候性
尿中の継続期間は、動物種によって変化し、ヒトでは、
２〜３ヶ月間以上レプトスピラを流出することは滅多に
ない。

【００１２】汚染された尿との直接および間接的接触以
外の伝染形態は、まれである。授乳中の動物は乳汁中に
レプトスピラを放出するが、しかし全乳汁が２〜３時間
後には殺レプトスピラ性となり、この経路でのヒトの症
例は知られていない。レプトスピラは唾液中には放出さ
れず、したがって、動物に咬まれても感染の直接原因に
はならない。

【００１３】レプトスピラ症の病因は、その他のスピロ
へーター症、例えば梅毒〔トレポネマ・パリダム（Trep
onema pallidum）によって引き起こされる〕およびライ
ムボレリア症〔ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia b
urgdoferi ）によって引き起こされる〕の場合と非常に
よく似ている。梅毒およびライムボレリア症はともに、
疾患の経過の初期における、中枢神経系の侵襲を含めた
広範な播種を特徴とする。レプトスピラは、髄膜炎がレ
プトスピラ症の一般的症状発現であるように、その他の
病原性スピロへーターとこの能力を享有する。スピロへ
ーター感染の別の特徴は、三期梅毒および慢性ライム関
節炎の場合に発現されるように、宿主中に慢性的に残存
する能力である（包括的検討に関しては、Baranton, G.
and Old, I.G., Bull. Inst. Pasteur 93:63-95（199
5）参照）。

【００１４】有毒レプトスピラは環境中での長期間生存
ならびに持続性感染そして野生生物および家畜類による
放出の可能性を有するために、レプトスピラ症を制御す
るための努力は妨げられてきた。レプトスピラ膜タンパ
ク質は、それらが細菌性病因において重要な役割を演じ
るために、多大な重要性を有する。レプトスピラ病因に
関与する膜タンパク質の同定は、レプトスピラ膜タンパ
ク質およびそれらの病因における関与を理解するだけで
なく、その他のスピロへーター膜タンパク質およびそれ
らの病因における役割をりかいするためにも意義があ
る。

【００１５】今日入手可能なレプトスピラワクチンは短
期免疫を生成し、病原性レプトスピラの１７０の血清型
亜型の多数に対する交差防御を提供しない（Thiermann,
etal., J. Am. Vet. Med. Assoc.184:722 （198
4））。これらのワクチンは、無傷生物体の顕微鏡的凝
集反応により確定した場合に血清反応性を生じる不活性
化全生物体または外側膜製剤から成る。これらのワクチ
ン製剤中の防御性免疫原の性質は、決定的に明らかにさ
れてはいないが、しかし証拠のいくつかの方向は、脂質
多糖様物質（liposuccharide like substance ）（ＬＬ
Ｓ）がある程度の防御を付与し得るということを示唆す
る。

【００１６】活動性感染の治療に関しては、オキシテト
ラサイクリンが選定薬であり、感染および保菌を治癒す
るための分野で日常的に用いられる。バクテリンまたは
脂質多糖の構成成分を用いるいくつかのワクチン製剤が
用いられてきたが、成否は様々であった。現在のワクチ
ンによる防御は、血清型亜型特異的であり、再現可能な
程度の防御を生じる能力を欠く。

【００１７】

【発明の要約】本発明は、レプトスピラの病原性菌株に
関連した４種類のレプトスピラ膜タンパク質、即ちキナ
ーゼ、パーミアーゼ、マンノシルトランスフェラーゼお
よびエンドフラゲリンの同定に基づいている。スピロへ
ーター膜の脆弱性、ならびに膜タンパク質が少量で存在
するという事実のために、本発明まで、スピロへーター
膜タンパク質に及ぶ膜についての明確な報告が制限され
てきた。ｍＲＮＡ差し引き（subtractive ）ハイブリダ
イゼーションは、毒性関連遺伝子（viralence-related
gene）を同定するための強力な手段である。

【００１８】本発明は、感染したゴールデンハムスター
の肝臓のコロニー形成中に発現される３つのレプトスピ
ラ・インテロガンスｓｖポモナ（Leptospira interroga
ns sv pomona）遺伝子の同定を記載する。本発明は、ZA
P 発現ライブラリーを用いてレプトスピラ・ハードジョ
ボビス（L. hardjobovis）から同定された４番目の遺伝
子も記載する。本発明はさらに、免疫原性であり、病原
性レプトスピラに対する免疫応答を誘発するために、な
らびにレプトスピラ症に対する診断標的を提供するため
に有用であるレプトスピラからの４種類の膜タンパク質
を記載する。

【００１９】

【詳細な説明】本発明は、病原性レプトスピラ種の膜か
らの４種類の免疫原性タンパク質を提供する。これらの
膜タンパク質は、キナーゼ、パーミアーゼ、マンノシル
トランスフェラーゼおよびエンドフラゲリンである。こ
れらのタンパク質をコードする４種類のポリヌクレオチ
ド配列も含まれる。本発明の４種類の免疫原性タンパク
質は、病原性レプトスピラに対する免疫応答を誘導する
ための製剤組成物に有用である。

【００２０】本発明は、組換えDNA 技術を用いたレプト
スピラのこれらの膜タンパク質の製造方法を含む。４種
類の膜タンパク質に対する遺伝子をプラスミドベクター
中でクローニングし、次にこれを用いて大腸菌を形質転
換する。これら４種類の膜タンパク質に関する細菌遺伝
子は、病原性レプトスピラの任意の菌株に由来すると考
えられる。好ましくは、タンパク質はレプトスピラ・イ
ンテロガンスｓｖポマオナ（Leptospira interrogans s
v pomaona ）またはレプトスピラ・ボルグペテルセニｓ
ｖハードジョボビス（Leptospira borgpetersenii sv h
ardjobovis）からである。これらのレプトスピラ生物体
は、例えばATCC（Rockville, Md.）を通して公的に入手
可能である。

【００２１】本発明は、４種類のレプトスピラ膜タンパ
ク質、即ちキナーゼ、パーミアーゼ、マンノシルトラン
スフェラーゼおよびエンドフラゲリンをコードするポリ
ヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドと
しては、これら４種類のタンパク質をコードするDNA お
よびRNA 配列が挙げられる。これら４種類のタンパク質
のすべてまたは一部をコードするすべてのポリヌクレオ
チドは、これらのポリヌクレオチドが抗体を誘導するか
または結合する能力といったような元のタンパク質また
は全長タンパク質の機能を示すポリペプチドをコードす
る限りは、本明細書中に含まれる、と理解される。この
ようなポリヌクレオチドとしては、天然のおよび意図的
に操作されたポリヌクレオチド、例えば突然変異誘発ポ
リヌクレオチドが挙げられる。

【００２２】本発明のDNA 配列は、いくつかの方法によ
り得られる。例えば、DNA は、当業界で周知のハイブリ
ダイゼーション法を用いて単離し得る。これらの例とし
ては、１）共有ヌクレオチド配列を検出するためのプロ
ーブとゲノムライブラリーとのハイブリダイゼーショ
ン、および２）共有構造的特徴を検出するための発現ラ
イブラリーの抗体スクリーニングが挙げられるが、これ
らに限定されない。

【００２３】ハイブリダイゼーション法は標識化混合合
成オリゴヌクレオチドプローブを用いた組換え体クロー
ンのスクリーニングに有用であり、この場合、各プロー
ブは、可能性として、変性二本鎖DNA の異種混合物を含
むハイブリダイゼーション標本中の特定のDNA 配列の完
全相補体である。このようなスクリーニングに関して
は、ハイブリダイゼーションは、好ましくは一本鎖DNA
または変性二本鎖DNA で実行される。非特異結合を避け
るために向けられる緊縮ハイブリダイゼーション条件を
用いることにより、例えば、完全相補体である混合物中
のその単一プローブに対する標的DNA のハイブリダイゼ
ーションによる特定のDNA クローンのオートラジオグラ
フィー的視覚化を可能にし得る（Wallace, et al., Nuc
leic AcidResearch, 9:879 （1981））。

【００２４】あるいは、これらのタンパク質に対する抗
体を用いて、タンパク質当たり少なくとも１つのエピト
ープを有する本発明の４種類の膜タンパク質に関して間
接的に、発現ライブラリーをスクリーニングし得る。こ
のような抗体はポリクローナル的またはモノクローナル
的に誘導され、これを用いてレプトスピラキナーゼ、パ
ーミアーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびエン
ドフラゲリンDNA の存在を示す発現生成物を検出し得
る。一般に、ラムダgt11ライブラリーが構築され、Huyn
h 等の方法（DNA Cloning: A Practical Approach, D.
M. Glover, ed.,1:49（1985））により免疫学的にスク
リーニングされる。

【００２５】キナーゼ、パーミアーゼ、マンノシルトラ
ンスフェラーゼおよびエンドフラゲリン膜タンパク質の
各々をコードする特定のDNA 配列の開発は、（１）ゲノ
ムDNA からの二本鎖DNA 配列の単離、および（２）当該
タンパク質に必要なコドンを提供するためのDNA 配列の
化学的製造によっても得られる。

【００２６】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）技術を利用
して、これら４種類のタンパク質をコードするcDNAのそ
の後のクローニングおよび発現のためのレプトスピラの
任意の菌株からの４種類の個々のレプトスピラ膜タンパ
ク質を獲得し、または増幅し得る（例えば、米国特許第
4,683,202 号、第4,683,195 号、第4,889,818 号；Gyll
ensten et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 85:7652-
7656（1988）；Ochmanet al., Genetics, 120:621-623
（1988）；Triglia et al., Nucl. Acids. Res., 16:81
56（1988）；Frohman et al., Proc. Natl Acad. Sci.
USA, 85:8998-9002 （1988）；Loh et al.,Science, 24
3:217-220 （1989）参照）。同様に、本発明の４種類の
レプトスピラ膜タンパク質のいずれかの部分をコードす
るポリヌクレオチド断片を生成するために、PCR 技術が
当業者にルーチンに用いられる。

【００２７】当業者に周知の方法を用いて、４種類のレ
プトスピラ膜タンパク質またはその断片コード配列およ
び適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクタ
ーを構築し得る。これらの方法としては、in vitro組換
えDNA 法、合成法およびin vivo 組換え／遺伝子組換え
が挙げられる（例えば、Maniatis, et al., Molecular
Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La
boratory, N.Y., Chapter12 （1982）に記載された技術
を参照）。

【００２８】種々の宿主発現ベクター系を用いて、４種
類のレプトスピラ膜タンパク質またはその断片を発現し
得る。これらの例としては、微生物、例えばレプトスピ
ラ膜タンパク質のコード配列またはその断片を含有する
組換えバクテリオファージDNA 、プラスミドDNA または
コスミドDNA 発現ベクターで形質転換される細菌；レプ
トスピラ膜タンパク質のためのコード配列またはその断
片を含有する組換え酵母菌発現ベクターで形質転換され
る酵母菌；レプトスピラ膜タンパク質のためのコード配
列またはその断片を含有する組換えウイルス発現ベクタ
ー（例えば、バキュウロウイルス）に感染させた昆虫細
胞系；あるいはレプトスピラ膜タンパク質のためのコー
ド配列またはその断片を含有する組換えウイルス発現ベ
クター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイル
ス）に感染させた動物細胞系が挙げられるが、これらに
限定されない。

【００２９】これらのベクターの発現要素は、その強度
および特異性を変える。用いられる宿主／ベクター系に
よって、多数の適切な転写および翻訳要素のいずれか、
例えば構成的および誘導的プロモーターを、発現ベクタ
ー中に用い得る。例えば、細菌系中でクローニングする
場合、誘導性プロモーター、例えばバクテリオファージ
λのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロ
モーター）等を用いうる；昆虫細胞系でクローニングす
る場合には、バキュウロウイルスポリヘドリンプロモー
ターのようなプロモーターを用い得る；哺乳類細胞系で
クローニングする場合、アデノウイルス後期プロモータ
ーまたはワクシニアウイルス7.5Kプロモーターを用い得
る。組換えDNA または合成技術により産生されるプロモ
ーターも、レプトスピラ膜タンパク質のための挿入コー
ド配列またはその断片の翻訳を提供するために用い得
る。

【００３０】酵母菌では、構成または誘導プロモーター
を含有する多数のベクターを用い得る。総説として、Cu
rrent Protocols in Molecular Biology, Vol.2, Ed. A
usubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Inte
rscience Ch. 13 （1988）;Grant et al., Expression
and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enz
ymology, Eds. Wu & Grossman, Acad. Press, N.Y., Vo
l. 153, pp.516-544（1987）;Glover, DNA Cloning, Vo
l.II, IRL Press, Wash., D.C. Ch.3 （1986）; および
Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast, Met
hods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Pr
ess, N.Y., Vol. 152, pp.673-684 （1987）; ならびに
The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces,
Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, V
ols.IandII（1982）を参照。

【００３１】酵母菌における相補性検定に関しては、レ
プトスピラ膜タンパク質に関するcDNAまたはその断片
を、酵母菌2mu サークルの存在のために酵母菌中で自律
的に複製する酵母エピソームプラスミド（YEp ）中にク
ローニングし得る。レプトスピラ膜タンパク質配列また
はその断片配列のいずれかを、構成酵母菌プロモータ
ー、例えばADH またはLEU2、あるいは誘導プロモータ
ー、例えばGAL の後ろにクローニングし得る（Cloning
in Yeast, Ch.3, R. Rothstein In:DNA Cloning Vol.1
1, A Practical Approach, Ed. DM Glover, IRL Press,
Wash., D.C. （1986））。

【００３２】構築物は、コグネイトレプトスピラ膜タン
パク質mRNAの５‘および３’非翻訳領域、または酵母菌
遺伝子に対応するものを含有し得る。YEp プラスミドは
高効率で形質転換し、そしてプラスミドは非常に安定し
ている。あるいは、外来DNA配列の酵母菌染色体への組
込みを促すベクターを用い得る。

【００３３】４種類のレプトスピラ膜タンパク質または
その断片の１つを発現するために用いうる特に良好な発
現系は、昆虫系である。このような一系では、オートグ
ラファ・カリホルニカ（Autographa californica）核多
角体病ウイルス（AcNPV ）が、外来遺伝子を発現するた
めのベクターとして用いられる。ウイルスは、スポドフ
テラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda ）細胞中
で増殖する。

【００３４】レプトスピラ膜タンパク質またはその断片
のコード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリ
ヘドリン遺伝子）中でクローニングされて、AcNPV プロ
モーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下
に置かれ得る。ポリヘドリン遺伝子が首尾良く挿入され
ると、非閉塞性組換えウイルス（即ち、ポリヘドリン遺
伝子によりコードされるタンパク質様被膜を欠くウイル
ス）が産生される。次にこれらの組換えウイルスを用い
て、挿入遺伝子が発現されるスプドプテラ・フルギペル
ダ（Spodoptera frugiperda ）細胞を感染させる（例え
ば、Smith et al.,J.Biol., 46:586（1983）; 米国特許
第4,215,051 号参照）。

【００３５】発現ベクターとしてアデノウイルスを用い
る場合、レプトスピラ膜タンパク質またはその断片のコ
ード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例え
ば後期プロモーターおよび三部構成リーダー配列連結し
得る。次にこのキメラ遺伝子を、in vivo またはin vit
ro組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入し得る。
ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１または
Ｅ３）に挿入すると、感染宿主中で生存可能で且つレプ
トスピラ膜タンパク質またはその断片を発現し得る組換
えウイルスが生じる（例えば、Logan & Shenk, Proc. N
atl. Acad. Sci.,（USA ）81:3655-3659（1984）参
照）。あるいは、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを用
い得る（例えば、Mackett et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., （USA）79:7415-7419（1982）;Mackett et al.,
J. Virol., 49:857-864 （1984）;Panicali et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci., 79:4927-4931（1982）参照）。

【００３６】挿入されたレプトスピラ膜タンパク質また
はその断片のコード配列の効率的翻訳のためには、特定
の開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルに
は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。それ
自体の開始コドンおよび隣接配列を含めた全レプトスピ
ラ膜タンパク質ゲノムが適切な発現ベクターに挿入され
る場合、付加的翻訳制御シグナルは必要でない。

【００３７】しかしながら、レプトスピラ膜タンパク質
コード配列の一部だけが挿入される場合、ATG 開始コド
ンを含めた外生的翻訳制御シグナルが提供されねばなら
ない。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を保証す
るためにレプトスピラ膜タンパク質またはその断片のコ
ード配列のリーディングフレームと一致しなければなら
ない。これらの外生的翻訳制御シグナルおよび開始コド
ンは、天然および合成の両方の種々の起点を有し得る。
発現の有効性は、適切な転写増強素子、転写ターミネー
ター等の含入により増強し得る（Bitter et al., Metho
ds in Enzymol., 153:516-544 （1987）参照）。

【００３８】さらに、挿入配列の発現を調節し、または
所望の特定の様式で遺伝子生成物を修飾し、プロセッシ
ングし得る宿主細胞株を選択し得る。ある種のプロモー
ターにより駆動される発現は、ある種の誘導物質（例え
ば、メタロチオネインプロモーターのための亜鉛および
カドミウムイオン）の存在下で増大し得る。したがっ
て、遺伝子工学処理したレプトスピラ膜タンパク質また
はその断片の発現を、制御し得る。

【００３９】クローン化外来遺伝子のタンパク質物質が
宿主細胞に対して致死性である場合、これは重要であ
る。さらに、タンパク質物質の修飾（例えばグリコシル
化）およびプロセッシング（例えば開裂）は、タンパク
質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、
タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾に関する
特徴的および特異的メカニズムを有する。適切な細胞株
または宿主系を選定して、発現される外来タンパク質の
的確な修飾およびプロセッシングを確保し得る。

【００４０】レプトスピラ膜タンパク質またはその断片
のコード配列を含有する、そして生物学的に活性なレプ
トスピラ膜タンパク質またはその断片の遺伝子生成物を
発現する宿主細胞は、少なくとも４種類の一般的アプロ
ーチにより同定し得る：即ち、（ａ）DNA-DNA ハイブリ
ダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存
否；（ｃ）宿主細胞中のレプトスピラ膜タンパク質mRNA
転写物の発現により測定した場合の転写レベルの査定；
そして（ｄ）イムノアッセイにより、またはその生物学
的活性により測定した場合のレプトスピラ膜タンパク質
遺伝子生成物の検出。

【００４１】第一のアプローチでは、発現ベクター中に
挿入されたレプトスピラ膜タンパク質またはその断片の
コード配列の存在は、近年記載されたように、レプトス
ピラタンパク質コード配列または実質的に近年記載され
たような（Goeddert et al.,1988, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85:4051-4055）その特別な部分と相同である
ヌクレオチド配列を包含するプローブを用いたDNA-DNA
ハイブリダイゼーションにより検出し得る。

【００４２】第二のアプローチでは、ある種の「マーカ
ー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗体
に対する耐性、メトトレキセートに対する耐性、形質転
換表現型、バキュウロウイルス中での閉塞体形成等）の
存否を基礎にして、組換え発現ベクター／宿主系を同定
し、選択し得る。例えば、レプトスピラ膜タンパク質ま
たはその断片の；コード配列をベクターのマーカー遺伝
子配列内に挿入した場合、レプトスピラ膜タンパク質ま
たはその断片のコード配列を含有する組換え体を、マー
カー遺伝子機能の非存在により同定し得る。あるいは、
マーカー遺伝子を用いられる同一または異なるプロモー
ターの制御下でレプトスピラ膜タンパク質またはその断
片のコード配列と縦列に配置して、レプトスピラ膜タン
パク質コード配列の発現を制御し得る。導入または選択
に対するマーカーの発現は、レプトスピラ膜タンパク質
コード配列の発現を示す。

【００４３】第三のアプローチでは、レプトスピラ膜タ
ンパク質またはその断片のコード領域に関する転写活性
を、ハイブリダイゼーション検定により査定し得る。例
えば、ＲＮＡを単離し、レプトスピラ膜タンパク質また
はその断片のコード配列、または実質的に記載されてい
る（Goeddert et al.,1988, Proc. Natl. Acad. Sci.US
A, 85:4051-4055）ようなその特定の部分と相同名プロ
ーブを用いて、ノーザンブロットにより分析し得る。あ
るいは、宿主細胞の総核酸を抽出し、このようなプロー
ブとのハイブリダイゼーションに関して検定し得る。

【００４４】第四のアプローチでは、例えばウエスタン
ブロット、イムノアッセイ、例えば放射性免疫沈降法、
酵素結合免疫検定等により、免疫学的に、レプトスピラ
膜タンパク質またはその断片生成物の発現を査定し得
る。レプトスピラ膜タンパク質またはその断片を発現す
る組換え体が一旦同定されれば、遺伝子生成物を分析す
べきである。これは、生成物の物理的、免疫学的または
機能的特性に基づいた検定により成し遂げ得る。

【００４５】レプトスピラ膜タンパク質またはその断片
は、それが、全遺伝子配列、遺伝子配列の一部、あるい
は連結されてキメラタンパク質の生成に向けられる２ま
たはそれ以上の遺伝子配列の発現のいずれによるもので
あっても、免疫反応性であるべきである。この反応性
は、標準免疫学的技法、例えば放射性免疫沈降法、放射
性免疫競合法またはイムノブロットにより実証し得る。

【００４６】本発明の４種類の膜タンパク質をコードす
るDNA 配列は、DNA 転移により適切な宿主細胞中でin v
itroに発現され得る。「組換え宿主細胞」または「宿主
細胞」とは、その中でベクターを増殖させ、そしてその
DNA を発現させ得る細胞である。その用語には、目的の
宿主細胞の任意の子孫も含まれる。複製時に生じる突然
変異が存在し得るために、すべての子孫が親細胞と同一
であるというわけではない、と理解される。しかしなが
ら、前記の用語が用いられる場合、このような子孫が含
まれる。

【００４７】「宿主細胞」という用語は、本発明におい
て用いられる場合、原核生物だけでなく、真核生物、例
えば酵母菌、糸状真菌、ならびに植物および動物細胞も
含むことを意味する。「原核生物」という用語は、本発
明の４種類のレプトスピラ膜タンパク質の発現のための
遺伝子で形質転換され得るすべての細菌を含むことを意
味する。原核生物宿主としては、グラム陰性ならびにグ
ラム陽性細菌、例えば大腸菌、ネズミチフス菌および枯
草菌が挙げられる。

【００４８】本発明の４種類のレプトスピラ膜タンパク
質をコードする組換えDNA 分子は、当業者に一般的に知
られた技法を用いて、宿主を形質転換するために用いら
れる。特に好ましいのは、原核生物形質転換のための４
種類のレプトスピラ膜タンパク質コード配列のいずれか
を含有するプラスミドの使用である。宿主が原核生物、
例えば大腸菌である場合、DNA を取り込み得るコンピテ
ント細胞は、指数成長期後に収穫され、その後当業者に
周知の手法によりCaCl₂法によって処理される細胞から
調製し得る。あるいは、MgCl₂またはRbClを用い得る。
形質転換は、宿主細胞の原形質形成後にも実行し得る。

【００４９】本発明においては、４種類のレプトスピラ
膜タンパク質コード配列のいずれかを組換え発現ベクタ
ーに挿入し得る。「組換え発現ベクター」という用語
は、４種類のレプトスピラ膜タンパク質遺伝子配列のい
ずれかの挿入または組み入れにより操作された当業界で
既知のプラスミド、ウイルスまたはその他のビヒクルを
指す。このような発現ベクターは、宿主中での挿入遺伝
子配列の効率的転写を促すプロモーター配列を含有す
る。

【００５０】発現ベクターは、典型的には、複製起点、
プロモーター、ならびに形質転換細胞の表現型選択を可
能にする特定の遺伝子を含有する。形質転換原核生物宿
主を当業界で既知の手段により培養して、最適細胞増殖
を成し遂げ得る。酵母菌中での外来遺伝子の発現のため
の種々のシャトルベクターが報告されている（Heineman
n, et al.,Nature, 340:205 （1989）;Rose, et al., G
ene, 60:237 （1987））。宿主中で発現および複製可能
な生物学的機能性DNA ベクターが、当業界で知られてい
る。このようなベクターは、方法あのDNA 配列を組み入
れるために用いられる。

【００５１】融合され、作用可能に結合された遺伝子を
調製し、それらを細菌中で発現するための方法が知られ
ており、例えば、米国特許第4,366,246 号（この記載内
容は、引用により本明細書中に含まれる）に示されてい
る。そこに記載された遺伝子構築物および方法は、原核
生物宿主中での４種類のレプトスピラ膜タンパク質のい
ずれかの発現に利用可能である。本発明に用い得るプロ
モーターの例を以下に示す：rec A 、trp 、lac 、tac
およびバクテリオファージλp[R]またはp[L]。本発明に
用い得るプラスミドの例は、Maniatis et al.,Molecula
r Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories,1982 に
列挙されている。

【００５２】本発明で提供される抗体は、４種類のレプ
トスピラ膜タンパク質のいずれかと免疫反応性である。
本質的に異なるエピトープ特異性を有するプール化モノ
クローナル抗体から成る抗体、ならびに別個のモノクロ
ーナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体
は、当業界で周知の方法により、タンパク質の断片を含
有する抗原から作製される（Kohler, et al., Nature,
256:495 （1975）; Current Protocols in Molecular B
iology, Ausubel, et al., ed., （1989））。

【００５３】「抗体」という用語は、本発明で用いる場
合、エピトープ決定因子を結合し得る無傷分子ならびに
その断片、例えばFab 、F(ab‘)₂およびＦｖを含む。こ
れらの抗体断片は、その抗原または受容体と選択的に結
合する何らかの能力を保持し、以下のように定義され
る：（１）Fab ：抗体分子の一価の抗原結合断片を含有する
断片は、全抗体を酵素パパインで消化して無傷Ｌ鎖およ
び一Ｈ鎖の一部を得ることにより産生し得る；

【００５４】（２）Fab ‘：抗体分子の断片は、全抗体
をペプシンで処理し、その後還元して、無傷Ｌ鎖および
Ｈ鎖の一部を生成することにより得られる。抗体１分子
当たり２つのFab'断片が得られる；（３）（Fab ‘)₂：全抗体を酵素ペプシンで処理し、そ
の後還元せずに得られる抗体の断片。（Fab ‘)₂は２つ
のジスルフィド結合により一緒に保持される２つのFab'
断片の二量体である；（４）Fv：２つの鎖として発現されるＬ鎖の可変部およ
びＨ鎖の可変部を含有する遺伝子工学処理断片と定義さ
れる；そして（５）一本鎖抗体（「SCA 」）：遺伝子融合一本鎖分子
として適切なポリペプチドリンカーにより結合されるＬ
鎖の可変部、Ｈ鎖の可変部を含有する遺伝子工学処理分
子と定義される。

【００５５】これらの断片の製造方法は、当業界で既知
である（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A La
boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ne
w York（1988）参照）（この記載内容は、参照により本
明細書中に含まれる）。本発明で用いる場合、「エピト
ープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原
上の任意の抗原決定因子を意味する。エピトープ決定因
子は、通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学
的活性表面グループから成り、通常は特異的三次元構造
特徴、ならびに特異的荷電特徴を有する。免疫感作抗原
として無傷ポリペプチドまたは当該の小ペプチドを含有
する断片を用いて、本発明の４種類のレプトスピラ膜タ
ンパク質のいずれかと結合する抗体を調製し得る。

【００５６】配列番号：１〜４のいずれかのタンパク質
またはその断片も、４種類のレプトスピラ膜タンパク質
のいずれかをコードするcDNAのクローニングおよびシー
ケンシングから予測されるように、これら４種類のタン
パク質のいずれかのアミノ酸配列の化学合成（Goeddert
et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4051-4055
（1988））により産生し得る。４種類のレプトスピラ膜
タンパク質は、当業界で既知の標準ペプチド合成法を用
いて、化学的に合成し得る。これらの方法としては、R.
Bruce Merrifield,（Erickson and Merrifield, "Soli
d-Phase PeptideSynthesis", in The Proteins, Volume
2, H. Neurath & R. Hill （eds.）Academic Press, I
nc., New York pp.255-257;Merrifield, "Solid phase
synthesis", Science, 242:341-347 （1986））により
考え出された固相法が挙げられる。

【００５７】固相法では、アミノ酸を、不溶性マトリッ
クス、例えばポリスチレンビーズに連結される成長中の
ペプチド鎖に段階的に付加する。この方法の大きい利点
は、各段階での所望の生成物が容易に充填され得るビー
ズに結合され、洗浄されて、したがって、中間生成物を
精製する必要がなくなる。反応はすべて、単一容器内で
実行され、これにより、生成物の反復移動のための損失
が排除される。化学的ペプチド合成のこの固相法は、自
動化が容易で、良好な収率および純度で灼く５０残基を
含有するペプチドをルーチンに合成することを実行可能
にする（Stewart and Young, Solid Phase Peptide Syn
thesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co.（1984）; Tam
et al., J. Am. Chem. Soc., 105:6442 （1983））。

【００５８】動物を免疫感作するために用いられる配列
番号：１〜４のいずれかのタンパク質または断片は、翻
訳cDNAまたは化学合成により得られ、これは、所望によ
り担体タンパク質に接合され得る。ペプチドに化学的に
結合されるこのような一般的に用いられる担体として
は、マドアキカサガイヘモシアニン（KLH ）、チログロ
ブリン、ウシ血清アルブミン（BSA ）および破傷風毒素
が挙げられる。次に対合ペプチドを用いて、動物（例え
ば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫感作する。

【００５９】所望により、例えば抗体が生じたいずれか
の４種類のタンパク質またはいずれかの４種類のタンパ
ク質の断片が結合されるマトリックスに結合させ、それ
から溶離することにより、ポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体をさらに精製し得る。ポリクローナルなら
びにモノクローナルの精製および／または濃縮のための
免疫業界で一般的な種々の技術について、当業者は知る
ようになる（例えば、Coligan, et al., Unit 9, Curre
nt Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 19
91参照）（この記載内容は、参照により本明細書中に含
まれる）。

【００６０】エピトープに似せたモノクローナル抗体を
産生するために抗イディオタイプ技法を用いることもで
きる。例えば、一次モノクローナル抗体に対して作られ
る抗イディオタイプモノクローナル抗体は、一次モノク
ローナル抗体により結合されるエピトープの「イメー
ジ」である超可変部に結合ドメインを有する。本発明の
４種類のタンパク質のいずれかの第一アミノ酸配列の小
修飾は、本明細書に記載した元のレプトスピラタンパク
質と比較して実質的に等価の機能を有するタンパク質を
生じ得る。このような修飾は、特定部位の突然変異誘発
によると考えられるか、または自発性であり得る。これ
らの修飾により産生されるタンパク質はすべて、元の機
能が存在する、即ち４種類のレプトスピラ膜タンパク質
のいずれかに対して特異的な抗体と結合する限り、本明
細書中に含まれる。

【００６１】４種類の膜タンパク質のいずれかの一次ア
ミノ酸配列の修飾は、保存的変化も含む。「保存的変
化」という用語は、本明細書中で用いる場合、生物学的
に同様の別の残基によるアミノ酸残基の置換を意味す
る。保存的変化の例としては、一疎水性残基、例えばイ
ソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンの別の
残基に対する置換、あるいは一極性残基の別の残基に対
する置換、例えばリシンの代わりにアルギニンを、アス
パラギン酸の代わりにグルタミン酸を、またはアスパラ
ギンの代わりにグルタミンを等といった置換を含む。
「保存的変化」には、非置換親アミノ酸の代わりに置換
アミノ酸を使用することが含まれるが、但し、置換タン
パク質またはその断片に対して生じた抗体は非置換タン
パク質またはその断片とも免疫反応する。

【００６２】本発明により提供される微生物発現タンパ
ク質またはその断片の単離および精製は、従来の手段、
例えば分離用クロマトグラフィー、ならびにモノクロー
ナルまたはポリクローナル抗体を包含する免疫学的分離
により実行し得る。本発明は、記載された方法により修
飾される、または当業者に一般に既知のその他のあらゆ
る方法により、例えば溶原性ファージを用いた遺伝物質
の転移により修飾される任意の宿主に及び、これにより
播くタンパク質キナーゼ、パーミアーゼ、マンノシルト
ランスフェラーゼまたはエンドフラゲリンに対する４種
類のレプトスピラ遺伝子のいずれかを発現する原核生物
をもたらす。本発明の４種類の膜タンパク質をコードす
る４種類のレプトスピラ遺伝子のいずれかで形質転換さ
れる原核生物は、動物（例えばウサギ）の免疫感作に用
い得るポリペプチドの産生に特に有用である。

【００６３】一実施態様では、本発明は、製薬的に許容
可能な担体中の４種類のレプトスピラ膜タンパク質の免
疫原的有効量のいずれか一つを含んで成る動物中の病原
性レプトスピラに対する免疫応答を誘導するのに有用な
製剤組成物を提供する。「免疫原的有効量」とは、本発
明での記載に用いる場合、レプトスピラに対する免疫応
答の生成を動物において誘導するのに必要なレプトスピ
ラ抗原の量を示すことを意味する。本発明の４種類のレ
プトスピラ膜タンパク質は、一結果として、レプトスピ
ラ感染の作用を改善する免疫応答が生成されるように、
動物の免疫系を感作するのに特に有用である。

【００６４】本発明の４種類のレプトスピラ膜タンパク
質のいずれかを、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸
収により非経口的に、および経口的に投与し得る。非経
口投与のための製薬上許容可能な担体調製物としては、
滅菌、あるいは水性または非水性の溶液、懸濁液および
乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレング
リコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオ
リーブ油、注射可能有機エステル、例えばエチルオレエ
ートである。閉塞性包帯用の担体は、皮膚透過性を増大
し、抗原吸収を増強するために用い得る。経口投与のた
めの液体投薬形態は一般に、液体投薬形態を含有するリ
ポソーム溶液を包含し得る。リポソームを懸濁するため
の適切な形態としては、当業界で一般に用いられる不活
性希釈剤、例えば精製水を含有する乳濁液、懸濁液、溶
液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。不活性希
釈剤の他に、このような組成物は、アジュバント、湿潤
剤、乳化剤および沈殿防止剤、ならびに甘味剤、風味剤
および香料も含有し得る。

【００６５】本発明の４種類のレプトスピラ膜タンパク
質のいずれかを含有する抗原製剤がアジュバントを含有
することも可能である。アジュバントは、特異的免疫応
答を非特異的に増大するために用い得る物質である。普
通は、アジュバントおよび抗原は、免疫系への提示の前
に混合されるか、あるいは別々に、しかし免疫感作され
る動物（ヒトを含む）の同一部位に提示される。アジュ
バントは、それらの粗製に基づいて、大まかにいくつか
の群に分けられる。

【００６６】これらの群としては、油アジュバント（例
えば、フロイントの完全および不完全アジュバント）、
無機塩（例えば、AlK(SO₄)₂、AlNH₄(SO₄)、シリカ、ミ
ョウバン、Al(OH)₃、Ca₃(PO₄)₂、カオリンおよび炭
素）、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリ
ＡＵ酸）、ならびにある種の天然物質（例えば、結核菌
Mycobacterium tuberculosisからの蝋Ｄ、ならびにCory
nebacterium parvum、百日咳菌Bordetella pertussisお
よびブルセラ族の成員に見出される物質）が挙げられ
る。

【００６７】別の実施態様では、動物（ヒトを含む）に
おける病原性レプトスピラに対する免疫応答を誘導する
方法が提供される。多数の免疫感作レジメンが用いられ
る場合、免疫感作のタイミングに関して、多数の異なる
技法が存在する。免疫感作動物の免疫応答の発現のレベ
ルおよび多様性を増大するために、１回より多く本発明
の抗原製剤を用い得る。典型的には、多数回免疫感作を
施す場合、それらは２〜４週間間を置くべきである。レ
プトスピラに対する免疫応答が望ましい被験者として
は、ブタ、畜牛およびヒトが挙げられる。

【００６８】一般に、動物（ヒトを含む）に投与される
本発明の４種類のレプトスピラ膜タンパク質のいずれか
の投与量は、年齢、健康状態、性別および存在する場合
には疾病の程度、ならびに当業者に調整可能なその他の
変数によって、変化する。本発明の抗原製剤は、１回ま
たは多数回投薬として投与し得るし、そして４種類のレ
プトスピラ膜タンパク質抗原のいずれかに関して約10ug
〜約1,000ug 、さらに好ましくは約50ug〜約700ug 抗原
／用量、最も好ましくは約50ug〜約300ug抗原／用量と
変わり得る。免疫療法のために用いる場合、本発明のモ
ノクローナル抗体は、治療薬で標識されないこともあり
得る。

【００６９】これらの薬剤は、本発明のモノクローナル
工程に直接または間接的に結合され得る。間接的結合の
一例は、スペーサー部分の使用による。これらのスペー
サー部分は、順次、不溶性または可溶性であり（Diene
r, et al., Science,231:148（1986））、標的部位のモ
ノクローナル抗体分子からの薬剤放出を可能にするため
に選択され得る。免疫療法のために本発明のモノクロー
ナル抗体と結合され得る治療薬の例は、薬物、放射性同
位元素、レクチンおよび毒素である。本発明の標識化ま
たは非標識化モノクローナル抗体は、前記のような治療
薬と組合せても用い得る。

【００７０】特に好ましいのは、本発明のモノクローナ
ル抗体および免疫調節剤、ならびにその他の生物学的反
応改質剤を包含する治療的組合せである。本発明のモノ
クローナル抗体を、本明細書中に記載したような種々の
治療薬と組合せて用いる場合、モノクローナル抗体と治
療薬の投与は通常は実質的に同時期に行う。「実質的同
時期」という用語は、モノクローナル抗体および治療薬
が、時間に関して合理的に接近して一緒に投与されるこ
とを意味する。通常は、モノクローナル抗体の前に治療
薬を投与するのが好ましい。例えば、治療薬は、モノク
ローナル抗体の１〜６日前に投与し得る。治療薬の投与
は、例えば疾患の性質、患者の健康状態および薬剤の半
減期といった因子によって、毎日でも、または任意の別
の間隔でもよい。

【００７１】本発明のモノクローナル抗体の投与のため
の投薬量範囲は、レプトスピラ症の開始症候が改善され
る所望の効果を生じるに十分多い量である。投薬量は、
副作用、例えば望ましくない交差反応、アナフィラキシ
ー反応等を引き起こすほど多量であるべきでない。一般
に、投薬量は、被験者の年齢、健康状態、性別および疾
病程度に伴って変わり、当業者により確定され得る。投
薬量は、任意の合併症の場合には、個々の医師により調
整され得る。投薬量は、１回または多数回投与で、１ま
たは数日間、約0.1mg/kg〜約2000mg/kg 、好ましくは約
0.1mg/kg〜約500mg/kgの範囲で変わり得る。一般に、本
発明のモノクローナル抗体が治療薬と接合されて投与さ
れる場合、in vivo 診断画像形成に用いられる場合に匹
敵する低用量が用いられる。

【００７２】注射により、または時間をかけた漸進的還
流により、非傾向的に、本発明のモノクローナル抗体を
投与し得る。本発明のモノクローナル抗体は、静脈内
に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、腔内に、または経皮
的に、単独で、またはエフェクター細胞と組合せて投与
し得る。非経口投与用の製剤としては、滅菌水性または
非水性の溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられる。非水
性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレング
リコール、植物油、例えばオリーブ油、注射可能有機エ
ステル、例えばエチルオレエートである。水性担体とし
ては、水、アルコール／水性溶液、乳濁液または懸濁
液、例えば食塩水および緩衝化媒質が挙げられる。

【００７３】非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム
溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび
塩化ナトリウムが挙げられ、乳酸化リンガー静脈内ビヒ
クルとしては、流体および栄養補充液、電解質補充液
（例えば、リンガーデキストロースを基礎にしたもの）
等が挙げられる。例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレー
ト化剤および不活性ガス等といった防腐剤およびその他
の添加剤も存在し得る。

【００７４】さらに別の実施態様では、本発明は、動物
（ヒトを含む）における病原性レプトスピラ関連疾患の
検出方法であって、細胞構成成分を細胞構成成分と結合
する試薬と接触させる工程を包含する方法を提供する。
細胞構成成分は、核酸、例えばDNA またはRNA であり、
あるいはそれはタンパク質であり得る。構成成分が核酸
である場合、試薬は核酸プローブまたはPCR プライマー
である。細胞構成成分がタンパク質である場合、試薬は
抗体プローブである。

【００７５】プローブは、例えば放射性同位元素、蛍光
化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレー
ト化剤または酵素で検出可能的に標識される。当業者
は、抗体と結合するのに適したその他の標識について既
知であり、ルーチンの実験を用いてこのように確かめ得
る。本発明の目的のために、本発明の４種類のレプトス
ピラ膜タンパク質のいずれかに特異的な抗体または核酸
プローブを用いて、生物学的流体または組織中のタンパ
ク質（抗体を用いる）またはポリヌクレオチド（核酸プ
ローブを用いる）の存在を検出し得る。検出可能量の４
種類のレプトスピラ膜タンパク質抗原またはポリヌクレ
オチドのいずれかを含有する任意の検体を用い得る。本
発明の好ましい検体は、血液、尿、能脊髄液または内皮
起源の組織である。

【００７６】細胞構成成分が核酸である場合、レプトス
ピラ特異的プローブを用いて結合する前に核酸を増幅す
る必要がある。好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R ）が用いられるが、しかしながらその他の核酸増幅
法、例えばリガーゼ連鎖反応（LCR ）、結紮活性化転写
（LAT ）および核酸配列ベースの増幅（NASBA ）を用い
てもよい。より大きい感度を生じ得る別の技法は、抗体
を低分子量ハプテンとカップリングさせることから成
る。これらのハプテンは、次に、二次反応によって特異
的に検出され得る。例えば、アビジンと反応するビオチ
ン、または特異的抗ハプテン抗体と反応し得るジニトロ
フェニル、ピリドキサルおよびフルオレセインのような
ハプテンを用いることは一般的である。

【００７７】あるいは、本発明の４種類のレプトスピラ
膜タンパク質のいずれかを用いて、検体中の４種類のタ
ンパク質のいずれかに対する抗体を検出し得る。本発明
の４種類のレプトスピラ膜タンパク質は、それが液総中
で利用され、または固相担体に結合され得るイムノアッ
セイに用いるのに特に適している。さらに、これらの検
定に用いられる４種類のレプトスピラ膜タンパク質のい
ずれかは、種々の方法で検出可能的に標識され得る。

【００７８】本発明の４種類のレプトスピラ膜タンパク
質のいずれかを利用し得るイムノアッセイの例は、直接
または間接的フォーマットでの競合的および非競合的イ
ムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例
は、放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノ
ソルベント検定、サンドイッチ（免疫測定）検定、プレ
シピチン反応、ゲル免疫拡散検定、凝集検定、蛍光イム
ノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイおよび免疫電
気泳動検定、ならびにウエスタンブロット検定である。

【００７９】本発明の４種類のレプトスピラ膜タンパク
質のいずれかと結合する抗体の検出は、前方、逆または
同時モードで実行するイムノアッセイ、例えば生理学的
標本に関する免疫組織化学検定を用いて成し得る。使用
されるレプトスピラ膜タンパク質の濃度は、イムノアッ
セイの種類および使用される検出可能標識の性質によっ
て変わる。しかしながら、使用されるイムノアッセイの
種類とは関係なく、利用されるレプトスピラ膜タンパク
質濃度は、ルーチン実験を用いて当業者は容易に確定し
得る。

【００８０】本発明の４種類のレプトスピラ膜タンパク
質のいずれかは多数の異なる担体に結合され、そしてタ
ンパク質と特異的に反応する抗体の存在を検出するため
に用いられる。周知の担体の例としては、ガラス、ポリ
スチレン、ポリビニルクロリド、ポリプロピレン、ポリ
エチレン、ポリカルボネート、デキストラン、ナイロ
ン、アミロース、天然および改質セルロース、ポリアク
リルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が挙げられる。担
体の性質は、本発明の目的のために可溶性または不溶性
である。当業者は、本発明の４種類のレプトスピラ膜タ
ンパク質のいずれかを結合するためのその他の適切な担
体について分かる化、あるいはルーチンの実験を用いて
このようなことを確認し得る。

【００８１】当業者に既知の多数の異なる標識および標
識方法がある。本発明に用い得る標識の種類の例として
は、酵素、放射性同位元素、コロイド金属、蛍光化合
物、化学発光化合物および生物発光化合物が挙げられ
る。本発明の目的のために、本発明の４種類のレプトス
ピラ膜タンパク質のいずれかと結合する抗体は、種々の
生物学的流体および組織中に存在し得る。４種類のレプ
トスピラ膜タンパク質のいずれかに対する検出可能量の
抗体を含有する任意の標本が用いられる。

【００８２】普通は、標本は液体、例えば尿、唾液、能
脊髄液、血液、血清等であるか、あるいは固体または半
固体、例えば組織、糞便等である。本発明の４種類のレ
プトスピラ膜タンパク質のいずれかに向けられる本発明
のモノクローナル抗体は、抗原のin vivo 検出にも有用
である。検出可能的標識化モノクローナル抗体は、診断
的に有効な用量で与えられる。「診断的に有効」という
用語は、検出可能的標識化モノクローナル抗体の量が、
モノクローナル抗体が特異的である４種類のレプトスピ
ラ膜タンパク質抗原のいずれかの検出を可能にするのに
十分な量で投与されることを意味する。

【００８３】投与される検出可能的標識化モノクローナ
ル抗体の濃度は、４種類のレプトスピラ膜タンパク質の
いずれかを有する細胞、体液または組織との結合がバッ
クグラウンドに比して検出可能であるのに十分である必
要がある。さらに、検出可能的標識化モノクローナル抗
体が、最良の標識対バックグラウンドシグナル比を生じ
るために、循環系から迅速に掃去されることが望まし
い。

【００８４】その結果、in vivo 診断のための検出可能
的標識化モノクローナル抗体の用量は、動物（ヒトを含
む）の年齢、性別および疾病程度といった因子によって
変わる。モノクローナル抗体の用量は、約0.001mg/m²〜
約500mg/m²、好ましくは0.1mg/m²〜約200mg/m²、最も好
ましくは約0.1mg/m²〜約10mg/m²である。このような用
量は、例えば多数回注射が施されるか否か、そして当業
者に既知のその他の因子によって変わり得る。

【００８５】in vivo 診断画像形成に関しては、利用可
能な検出計器の種類は、所定の放射性同位元素を選択す
る場合の主な因子である。選択される放射性同位元素
は、所定の種類の計器に関して検出可能である自然崩壊
型を有さねばならない。in vivo 診断のための放射性同
位元素の選択に際してのさらに別の重要な因子は、放射
性同位元素の半減期が、標的による最大取込みの時間に
依然として検出可能である用十分長いが、しかし宿主に
関して有害な放射線が最小限にされるよう十分短いとい
うことである。理想的には、in vivo 画像形成に用いら
れる放射性同位元素は粒子発光を欠くが、しかし１４０
〜２５０重要な範囲で多数の光子を生じ、これは、従来
のガンマカメラで容易に検出し得る。

【００８６】in vivo 診断に関しては、放射性同位元素
は、中間体官能基を用いることにより、直接または間接
的にイムノグロブリンと結合し得る。イムノグロブリン
に対する金属イオンとして存在する放射性同位元素を結
合するためにしばしば用いられる中間体官能基は、二官
能価キレート化剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸
（DTPA）およびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、なら
びに同様の分子である。本発明のモノクローナル抗体に
結合され得る金属イオンの典型例は、¹¹¹In、 ⁹⁷Ru、⁶⁷
Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zrおよび²⁰¹TIである。

【００８７】本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴
画像（MRI ）法または電子スピン共鳴（ESR ）法の場合
のように、in vivo 診断のための常磁性同位元素を用い
ても標識し得る。概して、診断画像を視覚化するための
任意の慣用的方法が用いられる。通常は、MRI のための
カメライメージングおよび常磁性同位元素として、ガン
マおよび陽電子放射放射性同位元素が用いられる。この
ような技法に特に有用な元素としては、¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、
¹⁶²Dy、⁵²Crおよび⁵⁶Feが挙げられる。

【００８８】本発明のモノクローナル抗体は、レプトス
ピラ関連疾患の改善の経過をモニタリングするために用
い得る。したがって、本発明の４種類のレプトスピラ膜
タンパク質のいずれか、あるいは種々の体液または組織
中に存在する４種類のレプトスピラ膜タンパク質のいず
れかに対する抗体の増大または低減を測定することによ
り、疾患の改善を目指す特定の治療レジメンが有効であ
るか否かを確定し得る。

【００８９】本発明の方法に用いるための物質は、理想
的には、キットの調製に適している。このようなキット
は、１つ又はそれ以上の容器手段、例えばバイアル、管
等を厳重に監禁して受容するために区分化されるキャリ
ア手段を包含し、各々の容器手段はその方法に用いられ
る別個の素子の１つを包含する。例えば、容器手段の１
つは、４種類のレプトスピラ膜タンパク質のいずれかに
対する結合試薬、例えば抗体を包含し得る。第二の容器
は、このような抗体により認識される４種類のレプトス
ピラ膜タンパク質のいずれかをさらに包含し得る。構成
要素は、所望により、液体または凍結乾燥形態で存在し
得る。以下の実施例は本発明を説明するためであって、
本発明を限定するものではない。それらは使用し得るも
のの典型であるが、当業者に既知のその他の手法も代替
的に用い得る。

【００９０】

【実施例】以下の実施例は、動物の活動的レプトスピラ
感染中に産生される重要なレプトスピラタンパク質とし
ての４種類のレプトスピラ膜タンパク質、即ちキナー
ゼ、パーミアーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよ
びエンドフラゲリンの同定を説明する。これらの遺伝子
がクローン化され、そしてシーケンシングされた方法を
記載する。配列分析および相同性試験を示して、これら
のタンパク質が病原性レプトスピラの膜タンパク質であ
り、したがって優れたワクチン候補であることをさらに
示す。

【００９１】実施例１．細菌株および増殖条件レプトスピラ属のレプトスピラ・インテロガンスｓｖポ
モナ（Leptospira interrogans sv pomona）2966株およ
びレプトスピラ・ボルグペトルセニｓｖハードジョボビ
ス（Leptospira borgpetersenii sv hardjobovis）Hb19
7 を、元のウシ野外単離体の凍結器ストックから得た。
レプトスピラin vitro培養はすべて、PLM-5 ブロス中で
３０℃で増殖させた。大腸菌DH5a株を、ルリア−ベルタ
ニ（Luria-Bertani ）培地中で、 100μg/mlのアンピシ
リンまたは50μg/mlのカナマイシンを含有する場合と含
有しない場合とで、増殖させた。大腸菌LE392 株は、ゲ
ノムミニバンクライブラリーの構築および増幅に用い
た。

【００９２】大腸菌培養はすべて、３７℃で増殖させ
た。いくつかの場合（pDFX210,ORF1）、大腸菌宿主中で
の異種クローン化タンパク質の発現は、ｐＬ熱ショック
プロモーターを用いて実施した。これらの環境下では、
菌株は最初は、光学密度（695nm ）が０．５に達するま
で、２ｘ酵母菌トリプトン培地中で３０℃で増殖させ
た。培養を４２℃に移行させて、タンパク質発現を誘導
した。

【００９３】レプトスピラ・インテロガンスｓｖポモナ
（L.interrogans sv pomona ）およびレプトスピラ・ボ
ルグペテルセニｓｖハードジョボビス（L. borgpeterse
ni i sv hardjobovis）Hb197 の動物継代毒性培養の動物継代を、その後の継代のための接種物と
して感染動物の肝臓ホモジェネートを用いて、ゴールデ
ンハムスターで実行した。スチュアート（Stuart）培地
または０．１％アガロースを補充したPLM-5 中の感染肝
臓ホモジェネートの１０^-1希釈液総計０．２ｃｃを用い
て、皮下（L. pomona ）および腹腔内（L. hardjobovi
s）投与により、継代のためにハムスターに接種した。
肝臓ホモジェネート塗抹の顕微鏡検査を実行して、スピ
ロへーターの存在を確証した。

【００９４】感染ハムスター肝臓からの細菌mRNAの抽出および精製レプトスピラ感染ハムスターを、CO₂により、その後頸
部脱臼により安楽死させた。剖検により肝臓を採取し、
氷冷PBS で２回洗浄した。５０ｍＭのクエン酸ナトリウ
ム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中の４Ｍのグアニ
ジンイソチオシアネートを等容量付加した１０ｍｌのPB
S （室温）中に肝臓を再懸濁した。この懸濁液を、組織
が視覚的に分離されるまで断続的に攪拌しながら、氷上
でインキュベートした。水飽和フェノール（pH5.2 ）を
直ちに付加して、DNA の除去を促した。この混合物を１
分間攪拌し、次に室温で３０分間、10,000xgで遠心分離
した。

【００９５】核酸を含有する水性相をトリス緩衝化フェ
ノール（pH8.0 ）：クロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２５：２４：１）で２回抽出した。この主にＲＮＡ
を含有する水性相を、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム
（pH4.5 ）および２．５容量の９５％エタノールを付加
することにより沈殿させて、−２０℃で一夜インキュベ
ートした。沈殿した核酸をペレット化し、洗浄した。残
りのDNA の除去をさらに促すために、ペレットを５ｍｌ
の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH6.0 ）中で抽出した。核酸ペ
レットが透明になるまで、抽出を反復した。254nm/280n
m 、および260nm/230nm での吸光度比を調べることによ
り、RNA の質および量を分光測光的に確定した。

【００９６】メーカーの使用説明書に修正を加えたFast
Track mRNA単離キット（InvitrogenCorporation）を用
いて、オリゴｄＴセルロースカラムによる調製から、真
核生物mRNAを取り出した。手短に言えば、5M NaCl を用
いて、RNA 調製物のNaCl濃度を０．５Ｍに調整した。次
に、１ｍｌのきっと結合緩衝液で予備平衡させた５０ｍ
ｇのオリゴｄＴセルロースに調製物を付加した。頻繁に
静かに混合しながら、混合物を室温で６０分間インキュ
ベートした。

【００９７】インキュベーション後、オリゴｄＴセルロ
ースを室温で１０分間、2,000xg で遠心分離することに
よりペレット化した。細菌mRNAを含有する上清を取り出
し、０．１容量の酢酸ナトリウム（pH4.5 ）、２．５容
量の９５％エタノールの付加により沈殿させて、−２０
℃で一夜インキュベートした。必要になるまで、この様
式で、細菌mRNAを保存した。３０℃で９６時間インキュ
ベーション後に、PLM-5 増殖株から、総細菌RNA を単離
した。掻き落とすことにより寒天から細菌細胞を取り出
し、氷冷PBS 中で４回洗浄し、オリゴｄＴセルロース抽
出はせずに、前記と同様に、RNA を単離した。

【００９８】cDNA合成感染肝臓またはPLM-5 増殖培養から単離した細菌mRNA
を、メーカーの使用説明書にしたがって、鳥類新生組
織形成ウイルス（AMV ）逆転写酵素およびRiboClone cD
NA合成系（Promega Corporation, Madison, WI, USA ）
を用いて、二本差cDNAの合成のための鋳型として用い
た。新規合成cDNAをＤＮアーゼ無含有ＲＮアーゼで３７
℃で３０分間処理し、フェノール：クロロホルム：イソ
アミルアルコールで１回抽出し、沈殿させた。メーカー
の使用説明書にしたがって、第一鎖合成直後に、第二の
鎖を合成した。

【００９９】PLM-5 増殖細菌から得られたcDNAを、メー
カーの使用説明書にしたがって、BioNick 標識系（BRL
Life technologies, Gaithersburg, MD ）を用いてビオ
チニル化した。差し引き（subtraction ）ハイブリッド
形成のための調製において、９５℃で５分間インキュベ
ートし、その後氷浴中で急冷して、ds cDNA 調製物を変
性させた。

【０１００】差し引きハイブリッド形成差し引きハイブリッド形成の技術を用いて、本発明の４
種類のレプトスピラ遺伝子を単離した（Utt, E.A., et
al., Can. J. Microbiol. 41:152-156（1955））。この
技術は特定のmRNAを単離するために用いられるが、２つ
の細胞型が存在する場合、この一方はRNA を発現し、他
方は発現しない。本発明では、ハムスターモデルにおけ
るこの微生物の活発な感染中に、ある種のレプトスピラ
遺伝子が作動され、発現される、ということが確定され
た。これら４種類の遺伝子は、レプトスピラが培地中で
増殖されているときは発現されない。

【０１０１】レプトスピラ感染ハムスターの肝臓（「標
的またはVir ⁺」細胞）からのmRNAを基質として用い
て、すべての発現遺伝子に対応する一組のcDNA分子を調
製する。標的細胞に特異的でない配列を除去するため
に、cDNA調製物を、培地中で増殖したレプトスピラ
（「Vir ^-細胞」）のmRNAと完全にハイブリダイズさせ
る。この工程は、２つの細胞型に共通のcDNA調製物から
すべての配列を除去する。他のmRNAとハイブリダイズす
るすべてのcDNA配列を捨てた後、残ったものを標的細胞
からのmRNAとハイブリダイズさせて、それらがコード配
列を示すことを確証する。これらのクローンは、Vir ⁺
細胞のmRNA集団に特異的な配列を含有する。

【０１０２】差し引きハイブリッド形成のために、肝臓
抽出物（Vir ⁺）からの変性in vivo 細菌cDNA 総計50
μg を、20mMのトリス、0.6MのNaCl、2mM のEDTAおよび
０．２％のドデシル硫酸ナトリウム（最終濃度）を含有
するハイブリダイゼーション緩衝液で増殖させたPLM-5
からの変性ビオチニル化cDNA（Vir ^-） 250μg とハイ
ブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、７０℃
の一定温度で４８時間進行した。１：４の割合の２つの
cDNA集団は、すべての共通の転写種に関してcDNAハイブ
リッドの形成を確保するのに役立った。

【０１０３】ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Dy
nal, Inc. ）とともにハイブリダイゼーション混合物を
インキュベートすることにより、すべての二本鎖ビオチ
ニル化cDNAハイブリッドの選択的除去を実行した。総計
２００μｌのDynal ストレプトアビジンビーズを１．５
ｍｌのエッペンドルフ管中に入れて、２ｘDynal 結合緩
衝液（１０ｍＭのトリス（pH7.5 ）、1mM のEDTA、2.0M
のNaCl）で３回洗浄した。最終洗浄後、ビーズを 200μ
l の２ｘ結合緩衝液中に再懸濁し、これに等容量の差し
引きハイブリッド形成混合物を付加した。

【０１０４】これを、プラットホーム回転器で、85rpm
で、室温で１５分間インキュベートした。インキュベー
ション後、常磁性ビーズ結合ビオチニル化cDNAハイブリ
ッドを、Dynal の使用説明書にしたがって、磁気抽出に
より除去した。０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.
3 ）および０．８容量のイソプロピルアルコールを付加
して、残りの上清中の核酸を沈殿させた。上清中に残留
したcDNA生成物は、肝臓増殖L. interrogansとPLM-5 増
殖L. interrogansとの間の遺伝子発現の鎖を表すと推定
される。

【０１０５】差し引きハイブリッド形成生成物の増幅二本鎖cDNA差し引き生成物は、Sau3A で消化される制限
エンドヌクレアーゼであった。次にこれを縦列21-merPC
R プライマーアダプターに結紮した。アダプターAUS 1
（5'GATCGGACGGTGAATTCTCGAGAGTG3'）およびAUS 2 （5'
GACACTCTCGAGAATTCACCGTCC3'）はともに、Ｓａｕ３ＡＶ
を有し、リン酸化され、そして９４℃に加熱することに
より互いにアニーリングさせ、室温（２５℃）に冷却後
に、差し引き生成物に結紮させた。

【０１０６】ＡＵＳ２相補的プライマーを、その後のPC
R 増幅工程に用いた。PCR 反応条件は、１０ｍＭのトリ
ス（pH8.0 ）、50mMのKCl 、2.5mM のMgCl、10mMの各dN
TP、1pmoleのAUS2および１０単位のTaq DNA ポリメラー
ゼ（最終濃度）であった。総反応容量は100ml であっ
た。下記のプログラム：急速温度ランピング：９４℃、
６０秒；３７℃、３０秒；５５℃、６０秒で型５サイク
ル：を使用して、Perkin-Elmer Cetus 9600 型サーモサ
イクラーを用いた。

【０１０７】示差的発現ゲノム座の単離および同定プラスミドpUC18 およびpGEMT EASYを、大腸菌DH5a中で
のクローニングのためのベクターとして用いた。ミニバ
ンクライブラリー構築、トランスフェクション、電気穿
孔、プラスミド単離、制限エンドヌクレアーゼ消化およ
びその他の遺伝子操作はすべて、標準的方法にしたがっ
て実行した（Mamiatis, et al.,1982 ）。

【０１０８】PCR 差し引き生成物を市販のpGEMT −イー
ジーベクター（Promega ）中で直接クローニングした。
陽性クローンをX-Gal アンピシリンLuria-Bertani プレ
ート上でスクリーニングし、クローン化挿入物をDNA シ
ーケンシングにより分析した（Advanced Genetics Anal
ysis Corporation, Minneapolis, MN ）。BLAST 算法を
用いて、配列データベース探索により、DNA 配列を同定
した。一クローンpHLE001 は、数個の細菌膜結合ヒスチ
ジンキナーゼ遺伝子との相同を示した。差し引き生成物
が部分遺伝子を示したため、このクローンを、メーカー
の使用説明書にしたがってＧｅｎｉｕｓシステム（Boeh
reinger Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, U
SA）を用いてジゴキシゲニン（DIG ）で標識した。

【０１０９】次に、差し引き生成物をＥｃｏＲＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ消化Leptospira interrogans sv pomo
na（Leptospira pomona ）ゲノムDNA のサザーンハイブ
リダイゼーションに、プローブとして用いた。pHLE001
プローブは、1200bp断片とハイブリダイズした。800bp
〜2,500bp サイズ範囲のEcoRI ゲノムミニバンクを生成
し、1,200bp 断片を回収するために用いた。この断片を
プラスミドpUC18 中でクローン化し、pHLE011 と名付け
た。このクローンは後に、ORF1およびORF2の両方の素子
を含有することが立証された。

【０１１０】別個のタンパク質発現ベクターを用いて、
小規模タンパク質精製およびワクチン防御試験に十分な
レベルに同定ORF を発現させた。Vectorette戦略（Geno
sys, Woodlands, TX）を用いて、さらなるクローニング
を成し遂げた。EcoRI Vectoretteゲノムライブラリー全
体をウォークし、遺伝子の残りの部分を見出すために、
この戦略を用いた。要するに、元のPCR 生成物の上流お
よび下流の両方をウォークするために、特異的プライマ
ーを既知の配列部分から設計した。この戦略は、いくつ
かの差し引き誘導PCR プライマーからの断片の増幅をも
たらした。これらのクローンおよびその推定上の同一性
を表１に要約する。

【０１１１】Applied Biosystems自動DNA シーケンサー
を使用し、Sangerのチェインターミネーター法を用い
て、クローン化1200bp挿入物のDNA 配列分析を成し遂げ
た。DNASTAR プログラムを用いたpHLE011 クローンのDN
A 配列分析は、２つの開放読取枠（ORF ）を明示した。
ORF1、ORF2およびORF3と銘々した枠は、それぞれ603bp
、1131bpおよび618bp から成る。

【０１１２】

【表１】

【０１１３】Vectoretteライブラリー構築およびスクリーニングメーカーの使用説明書にしたがってVectorette PCR（Ge
nesys Inc.）を、両ORF の残りの部分を単離するための
試験に用いた。要するに、上流に延長するために、PCR
プライマーをORF1の５‘末端に対して設計した。ORF2に
関しては、ORF2の３’末端に対してプライマーを設計し
て、下流に延長させた。メーカーの指示にしたがって、
L.interrogans ゲノムDNA のPvuII 、HindIII 、HpaI、
Rsa1、EcoR1 、Ssp1、Dra1またはMfeI制限消化と、末端
でのその後の特異的Vectoretteプライマー結合部位との
結紮を用いて、 Vectorette ライブラリーを生成した。
前記のライブラリーを用いたVectorette PCRは、種々の
長さのいくつかの生成物を生成させた。特定の生成物の
DNA 配列分析を用いて、配列を一列に並べ、ORF2および
ORF1の切頭型バージョンを完結させた。差し引きクロー
ンを表１に要約する。

【０１１４】λＺＡＰファージゲノムライブラリー構築
およびスクリーニング ZAP Express ベクターを用いて、Stratagene（La Joll
a, CA, USA ）により、L.borgpetersenii sv hardjobov
is の完全BmHIゲノムライブラリーを、カスタムライブ
ラリーパッケージとして構築した。エンドフラゲリンタ
ンパク質が同定されたのはこのライブラリーからであっ
た。大腸菌XL1-Blue MRFを用いて、メーカーの指示にし
たがって、ライブラリーを滴定し、増幅した。プラーク
出現後、 5μM のIPTG中に予備浸漬しておいたドライナ
イロンフィルター（Nytran）をプレート上に置き、３７
℃で一夜、逆インキュベートした。

【０１１５】一夜インキュベーション後、プレートを４
℃で１時間冷却した。次にフィルターを持ち上げて、PB
ST中で３回洗浄した。次に、PBST/3% 脱脂粉乳中で室温
で１時間のインキュベーションにより、フィルターをブ
ロックした。ブロック化フィルターをPBST中で３回洗浄
後、免疫ウサギ抗血清をPBST中の1:5,000 希釈液で各フ
ィルターに付加した。一次抗体をフィルターとともに３
７℃で３時間インキュベートした。次にフィルターをＰ
ＢＳＴを用いて各々５分間を３回洗浄し、二次抗ウサギ
アルカリホスファターゼ複合抗体を１：５，０００希釈
液で付加した。フィルターを３７℃で２時間インキュベ
ートした。二次抗体とともにインキュベーション後、フ
ィルターを一度PBSTで５分間、その後PBS 中で２、５分
間洗浄した。フィルターをBCIP溶液中に室温で１分間浸
漬することにより、陽性プラークを可視化した。

【０１１６】λZAP ファージライブラリークローンの単離および同定合計１４のプラークが免疫ウサギ抗血清と強度に反応し
た。これらの陽性ファージの各々をファージミドに変換
して、プラスミド単離および増幅のために大腸菌XLOR細
胞中で形質転換した。これらのクローンおよびその挿入
物サイズの各々を表２に略記する。陽性プラークを切り
出して、メーカーから供給された方法を用いてin vivo
でファージミドに変換した。

【０１１７】

【表２】

【０１１８】プローブとしてpHLE011 からの³²Ｐ−標識
化３．２ｋｂクローン化断片を用いて、ノーザンハイブ
リダイゼーションで、細菌RNA の標本を分析した。ノー
ザンハイブリダイゼーションのために、メーカーの使用
説明書にしたがって、多プライムDNA 標識キット（Amer
sham International Pic. Amersham, UK）を用いて、 ³²
Ｐで全プローブを標識した。ハイブリダイゼーション条
件は：5xSSC 、50% ホルムアミド、0.02%SDS、0.1%N-ラ
ウロイルサルコシン、２％剪断サケ静止DNA および20mM
のマレイン酸ナトリウム（pH7.5 ）であった。ハイブリ
ダイゼーションは、４２℃で１６時間進行した。緊縮洗
浄は、2xSSC 、0.1%SDS を室温で５分間を２回、そして
0.5xSSC 、0.1%SDS 55℃で１５分間を２回であった。オ
ートラジオグラフィーによりシグナルを可視化した。

【０１１９】DNA 配列分析選定クローンに関する二本鎖二方向DNA 配列分析を、LA
RK（The Woodlands, Texas, USA ）によるABI200PRISM
系（染料ターミネーター）を用いて実施した。

【０１２０】DNA および一次配列分析３つの差し引きハイブリッド形成クローンのDNA 配列分
析は、３つの大きい開放読取枠（ORF ）を同定した。元
の差し引きクローンpHLE011 は、ORF1およびORF2と呼ば
れる２つの部分ORF を含有した。これらの部分配列を用
いて、Vectorette PCRを用いてORF1およびORF2配列の両
方を完結し、その後これらをpFLEX10 中でサブクローニ
ングして、それぞれpMW43 （図１）およびpMW310（図
２）を得た。別個の差し引きクローン、pHLE004 のDNA
配列分析は、ORF3と呼ばれる別の大型ORF を同定した。
この部分配列を用いて、Vectorette PCRのためのPCR プ
ライマーを設計した。これは、ORF3配列を完結した（図
３）。３つのORF すべてに関する第一配列を、DNA STAR
ソフトウエアパッケージを用いて推定した。３つのORF
に関する推定一次配列は、それぞれ、41,000Da、43.000
Daおよび25,000Daの分子量を有する推定上のタンパク質
を同定した。エンドフラゲリンの全ORF は、849bp の長
さであることを立証した。推定一次配列は、算出分子量
32,000を有する283 個のアミノ酸のタンパク質であっ
た。

【０１２１】配列データベース分析これら４種類のレプトスピラ配列の同様の探索を、Nati
onal Center for Biotechnology （NCBI）BLAST Ｅメー
ルサーバーを介して配列データベースに対して実施し
た。DNA および一次配列相同関係を同定するための試験
に、BLASTnおよびBLASTx配列分析算法を用いた。推定上
遺伝子同一性を、表３に略記する。

【０１２２】

【表３】

【０１２３】実施例２．ゴールデンハムスターレプトス
ピラ症試験モデルすべての細菌継代および誘導試験に、１〜４月齢のはに
の雌ゴールデンハムスターを用いる。sv pomona 試験モ
デルに関しては、位相差顕微鏡により確定した場合に生
存可能な細菌を含有する肝臓ホモジェネート０．２ｍｌ
を用いて、ハムスターに皮下投与して感染させる。細菌
の希釈率は、1:1000（4x10⁵細菌／ｍｌ）〜1:10（4x10
⁷細菌／ｍｌ）の範囲である。

【０１２４】hardjobovis 試験に関しては、位相差顕微
鏡により確定した場合に生存可能な細菌を含有する肝臓
ホモジェネート０．５ｍｌを用いて、ハムスターに腹腔
内投与して感染させる。細菌の希釈率は、1:1000（4x10
⁵細菌／ｍｌ）〜1:10（4x10 ⁷細菌／ｍｌ）の範囲であ
る。生存可能レプトスピラを含有するハムスター肝組織
を、剖検後、外科的に切り出して、以下のように処理す
る。約１ｇの組織をガラス製ダウンスホモジナイザー中
に入れる。次に、０．１％アガロースを補充した総計９
ｍｌのPLM-5 を組織に付加する。次に組織を均質化し
て、均一コンシステンシーとする。これは、細菌の１０
−１希釈液を示す。その後の希釈液はすべて、PLM-5 希
釈物を用いて作る。

【０１２５】組換え体タンパク質発現使用する発現ベクターによって、ＰＬプロモータープラ
スミドに関して熱ショックを用いてタンパク質を誘導
し、あるいはIPTGに関してはlacZプロモータープラスミ
ドを用いた。タンパク質発現はすべて、大腸菌 DH5α
（lacZ）または大腸菌LE392 （PL）中で実施したが、一
方増殖は２ｘ酵母菌トリプトンブロス（2xYTブロス）中
で実行した。要するに、lacZ発現を用いる培養を、光学
密度（＠695nm ）が０．４〜０．５に達するまで、３７
℃で増殖させた。１ｍＭのIPTG（イソプロピルチオ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド）の付加により、組換え体タ
ンパク質を誘導した。予測タンパク質収率によって、お
よそ２〜１２時間、インキュベーションを継続した。

【０１２６】ＰＬプロモーター系を用いる構築物を、光
学密度（＠695nm ）が０．４〜０．５に達するまで、３
０℃で増殖させた。培養温度を４２℃に移行させて、組
換え体タンパク質を誘導しし、インキュベーションを２
〜４時間継続した。４℃で１５分間、8,000xG での遠心
分離により細菌細胞を採取した。20,000psi でフレンチ
プレスセルに２回通して、細胞を溶解させた。20,000xG
での遠心分離により細胞破砕屑を除去し、必要になるま
で、上清を−２０℃で保存した。標準的方法（参考文
献）にしたがって、SDS-PAGEによりタンパク質抽出物を
検定した。

【０１２７】ハムスターレプトスピラ症モデルにおける
実験ワクチン抗原の防御効力データ pHLE011 を含有する組換え体クローンからのタンパク質
抽出物は、４／６のハムスター（６７％）をsv pomona
感染モデルにおける致死感染から防御した。pMW43 から
の精製組換えタンパク質は、pHLE011 からのORF1のみを
含有し、２／６のハムスター（３３％）をsv pomona 感
染モデルにおける致死感染から防御した。

【０１２８】pDFX210 からの精製組換えタンパク質は、
sv pomona感染に対していかなる防御も提供しなかっ
た。sv hardjobovisモデルにおけるこれらの抗原の各々
の防御能力は、進行中である。表４は、試験したすべて
の抗原に関するワクチン試験結果を要約する。実験的ワ
クチン接種に関しては、２週間の間隔を置いて、約５μ
ｇの実験タンパク質を２回、動物に接種する。最終ワク
チン接種後２週間目に、前記の手法を用いて血清型亜型
のいずれかで動物を試験する。

【０１２９】

【表４】

【０１３０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Products Inc. <120> Leptospira Vaccine Antigens for the Prevention of Leptospirosis <130> PC10463 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 201 <212> PRT <213> Amino Acids <400> 1 Met Arg Ser Val Gln Glu Lys Asn Glu Leu Ile Gln Glu Ile His His 1 5 10 15 Arg Val Arg Asn Asn Leu Gln Val Ile Ser Gly Leu Val Glu Met His 20 25 30 Ser Gly Ser Gly Lys Glu Asn Leu Gln Ile Ile Leu Ser Asp Phe Gln 35 40 45 Asn Arg Ile Leu Ala Ile Ser Glu Val His Asn Tyr Leu Tyr Lys Ser 50 55 60 Glu Asn Tyr Phe Glu Ile Asp Phe Val Glu Val Met Asp Lys Ile Ile 65 70 75 80 Leu Asn Leu Ser Tyr Arg Leu Gly Lys Arg Ser Ile Lys Ile Glu Thr 85 90 95 Glu Ala Glu Ser Thr Phe Leu Arg Ile Glu Asn Ala Ile Pro Cys Ala 100 105 110 Met Ile Phe Asn Glu Leu Leu Ser Asn Ser Leu Lys His Ala Phe Arg 115 120 125 Ser Glu Lys Gly Thr Val Gln Ile Ser Phe Arg Lys Lys Gly Asp Lys 130 135 140 Tyr Tyr Leu Gln Val Ser Asp Asn Gly Ser Gly Ile Lys Asp Phe Lys 145 150 155 160 Ile Trp Ser Lys Pro Lys Thr Ala Gly Phe Thr Leu Ile Gln Ile Leu 165 170 175 Thr Lys Gln Ile Lys Gly Arg Phe Gln Ile Phe Ser Glu Gly Gly Phe 180 185 190 Thr Ala Val Leu Glu Phe Asn Ser Ile 195 200

【０１３１】 <210> 2 <211> 377 <212> PRT <213> Amino Acids <400> 2 Met Lys Phe Ser Gly Leu Thr Asn His Ile Tyr Lys Asp Arg Asp Tyr 1 5 10 15 Leu Thr Arg Asn Arg Ala Phe His Leu Phe Ile Phe Asn Val Val Ser 20 25 30 Leu Leu Leu Gly Leu Ser Val Asn Phe Tyr Val Trp Phe Val Lys Gly 35 40 45 Asp Leu Leu Arg Pro Gly Phe Leu Ile Ile Met Leu Ala Ser Ala Val 50 55 60 Ser Leu Phe Phe Leu Leu Arg Lys Lys Phe Glu Leu Ala Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ile Leu Ile Ala Ser Val Ile Ala Val Ser Val Gly Trp Phe Phe Gly 85 90 95 Leu Ser Gln Gly Asn Ser Pro Leu Asp Glu Gly Asn Lys Asn Ile Val 100 105 110 Leu Ala Ile Phe Ile Met Ile Phe Leu Tyr Phe Ala Asn Val Lys Arg 115 120 125 Thr Leu Leu Ile Ala Val Tyr Cys Phe Val Leu Ile Phe Met Glu Glu 130 135 140 Leu Leu Met Gln Gln Ile His Glu Ser Ile His Met Ala Asp Arg Ile 145 150 155 160 Ala Leu Phe Phe Met Phe Ser Val Ile Ser Ile Ile Ala Val Arg Thr 165 170 175 Leu His Gly Ser Ile Glu Glu Lys Asn Glu Leu Ile Gln Glu Ile His 180 185 190 His Arg Val Arg Asn Asn Leu Gln Val Leu Ser Gly Leu Val Glu Met 195 200 205 His Ser Asp Ser Asp Gln Gly Asn Leu Arg Asn Ile Leu Ser Asp Phe 210 215 220 Gln Asn Arg Ile Leu Ala Ile Ser Glu Val His Asn Tyr Leu Tyr Lys 225 230 235 240 Ser Glu Asn Tyr Phe Asp Ile Asp Phe Ser Glu Val Ile Glu Arg Ile 245 250 255 Ile Ala Asn Leu Ile His Lys Phe Gly Lys Gln Ser Val Lys Ile Glu 260 265 270 Asn Leu Thr Glu Gln Ile Phe Leu Arg Ile Glu Tyr Ala Ile Pro Cys 275 280 285 Ala Met Ile Phe Ser Glu Leu Leu Ser Asn Ser Leu Lys His Ala Phe 290 295 300 Ser Ser Asp Met Gly Lys Ile Val Ile Arg Phe His Lys Glu Gly Asn 305 310 315 320 Lys Tyr Arg Leu Gln Ile Glu Asp Asn Gly Ser Gly Ile Ser Asp Ser 325 330 335 Lys Thr Trp Leu Lys Pro Lys Thr Ser Gly Phe Lys Leu Ile Gln Leu 340 345 350 Leu Thr Arg Gln Ile Lys Gly Asp Phe Gln Ile Leu Ser Asp Ser Gly 355 360 365 Ser Ile Ala Val Leu Glu Phe Tyr Thr 370 375

【０１３２】 <210> 3 <211> 205 <212> PRT <213> Amino Acids <400> 3 Met Phe Asn Phe Ser Gln Tyr Leu Thr Asn Gly Phe Glu Arg Phe Pro 1 5 10 15 Lys Ile Glu Lys Ser Lys Ser Lys Ile Lys Lys Ile Ile Phe Val Gly 20 25 30 Arg Ile Thr Pro Asn Lys lys Gln Asp Asp Leu Ile Arg Leu Ala Phe 35 40 45 Ala Tyr Lys Ser Ile Ile Ser Asp Gln Phe Gln Phe Tyr Leu Ala Gly 50 55 60 Phe Ser Ser Lys Glu Leu Tyr Leu Tyr Arg Glu Glu Leu Glu Arg Met 65 70 75 80 Leu Asp Phe Tyr Asp Leu Arg Lys Asn Val Leu Ile Thr Gly Phe Leu 85 90 95 Ser Asp Leu Glu Leu Asn Ser Leu Tyr Gln Glu Ala Asp Ala Phe Val 100 105 110 Ser Met Ser Glu His Glu Gly Phe Cys Val Pro Leu Ile Glu Ala Met 115 120 125 Ile Tyr Arg Ile Pro Ile Leu Ala Phe Ser Gly Gly Ala Val Ser Glu 130 135 140 Thr Leu Asn Gly Ala Gly Val Leu Phe Lys Glu Lys Asn Phe Pro Asn 145 150 155 160 Leu Ala Ile Leu Leu Asn Lys Ile Leu Thr Asp Val Ser Phe Gln Asn 165 170 175 Gln Ile Leu Thr Gly Gln Asp Leu Arg Leu Asn Glu Phe Lys Lys Thr 180 185 190 Asp Tyr Lys Ser Val Leu Arg Lys Ala Leu Glu Ile Ile 195 200 205

【０１３３】 <210> 4 <211> 283 <212> PRT <213> Amino Acids <400> 4 Met Ile Ile Asn His Asn Leu Ser Ala Val Asn Ser His Arg Ser Leu 1 5 10 15 Lys Phe Asn Glu Leu Ala Val Asp Lys Thr Met Lys Ala Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Met Arg Ile Asn Ser Val Ala Asp Asp Ala Phe Gly Leu Ala Val 35 40 45 Ser Glu Lys Leu Arg Thr Gln Ile Asn Gly Leu Arg Gln Ala Glu Arg 50 55 60 Asn Thr Glu Asp Gly Met Ser Phe Ile Gln Thr Ala Glu Gly Phe Leu 65 70 75 80 Glu Gln Thr Ser Asn Ile Ile Gln Arg Ile Arg Val Leu Ala Ser Arg 85 90 95 Pro Arg Met Val Ser Gln Gln Arg Lys Ile Ala Ser Leu Gly Arg Trp 100 105 110 Glu Val Leu Cys Ala Gly Gly Pro Lys Ser His Arg Ile Ala Ser Gln 115 120 125 Ala Glu Phe Ile Ser Ser Ser Phe Leu Gly Ala Ile Arg Lys Arg Phe 130 135 140 Thr Gly Arg Val His Val Val Ser Tyr Gly Ala Glu Arg Lys Ser Ala 145 150 155 160 Arg Glu Ile Leu Gln Arg Pro Glu Cys Phe Glu Ser Pro Glu Ala Cys 165 170 175 Lys Ala Asp Gly Arg Pro Ile Ala Ile Ser Ser Pro Glu Glu Ala Asn 180 185 190 Asp Val Ile Gly Leu Ala Asp Ala Ala Leu Thr Arg Ile Met Lys Gln 195 200 205 Arg Ala Asp Met Gly Ala Tyr Tyr Asn Arg Leu Glu Tyr Thr Ala Lys 210 215 220 Gly Val Met Gly Ala Tyr Glu Asn Met Gln Ala Ser Glu Ser Arg Ile 225 230 235 240 Arg Asp Ala Asp Met Ala Glu Glu Val Val Ser Leu Thr Thr Lys Gln 245 250 255 Ile Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met Leu Ala Gln Ala Asn Met Lys 260 265 270 Pro Asn Ser Val Leu Lys Leu Leu Gln His Ile 275 280

【０１３４】 <210> 5 <211> 603 <212> DNA <213> Nucleotides <400> 5 ATGCGATCCG TTCAAGAAAA GAACGAATTG ATACAAGAAA TTCATCATAG AGTTAGAAAT 60 AATCTTCAGG TAATTTCCGG TTTAGTGGAA ATGCATAGTG GGTCTGGTAA AGAGAATCTG 120 CAAATCATAT TATCCGATTT TCAAAATCGT ATATTAGCAA TATCTGAAGT TCATAATTAT 180 TTATATAAGT CCGAAAATTA TTTCGAAATC GATTTTGTCG AGGTGATGGA TAAGATTATT 240 CTAAATCTTT CTTATAGATT GGGAAAACGT TCGATCAAGA TAGAAACTGA AGCTGAGTCT 300 ACTTTTTTAA GAATCGAAAA TGCGATTCCT TGTGCTATGA TTTTCAACGA ATTGTTATCC 360 AATTCTTTAA AACACGCTTT TCGTTCGGAA AAAGGAACCG TTCAAATTTC GTTTCGAAAA 420 AAAGGAGATA AATATTACCT TCAAGTTTCT GACAATGGTT CAGGAATCAA GGATTTTAAA 480 ATTTGGTCCA AACCGAAAAC GGCTGGTTTC ACTTTGATAC AAATATTAAC AAAACAGATT 540 AAAGGTCGTT TTCAAATTTT CTCTGAAGGC GGTTTTACTG CGGTTTTAGA GTTCAACTCA 600 ATC 603

【０１３５】 <210> 6 <211> 1131 <212> DNA <213> Nucleotides <400> 6 ATGAAATTTT CAGGATTAAC CAATCATATT TATAAAGACA GGGATTATCT TACTCGAAAT 60 AGGGCGTTCC ATCTTTTCAT TTTTAATGTG GTGTCGCTTT TATTGGGTTT ATCTGTGAAT 120 TTTTATGTTT GGTTTGTGAA AGGTGATCTA TTACGTCCTG GTTTTTTAAT CATCATGCTT 180 GCATCTGCAG TCTCTCTGTT TTTTTTATTG AGAAAAAAAT TTGAATTGGC TCTCAGAATT 240 ATTTTGATCG CAAGTGTAAT TGCTGTTAGC GTTGGTTGGT TTTTTGGACT TTCTCAGGGA 300 AATTCTCCTT TGGACGAAGG GAATAAAAAT ATTGTTTTAG CTATATTTAT TATGATTTTC 360 TTATATTTTG CAAATGTAAA GCGAACTCTT CTAATTGCGG TTTACTGTTT TGTTTTGATT 420 TTTATGGAAG AGCTTTTAAT GCAACAAATT CATGAATCTA TTCACATGGC TGATCGAATC 480 GCTCTATTTT TCATGTTTTC TGTAATTTCG ATTATCGCCG TAAGAACTCT TCATGGATCG 540 ATTGAAGAAA AGAACGAATT GATACAAGAA ATTCATCATA GAGTTAGAAA TAATCTTCAG 600 GTTCTTTCCG GTTTAGTAGA AATGCATAGT GATTCTGATC AAGGGAATCT TAGGAATATA 660 TTATCTGATT TTCAAAATCG TATATTAGCA ATATCTGAAG TTCATAATTA TTTATATAAG 720 TCCGAAAATT ATTTCGACAT AGATTTTTCA GAAGTGATTG AAAGAATCAT TGCAAATCTC 780 ATTCATAAAT TTGGTAAACA ATCTGTAAAA ATAGAAAATT TAACGGAACA GATTTTTTTA 840 AGAATCGAAT ATGCGATTCC TTGTGCTATG ATTTTTAGTG AACTTTTATC TAATTCTTTA 900 AAACATGCGT TTTCTTCGGA TATGGGGAAA ATTGTCATTC GGTTTCATAA AGAAGGAAAT 960 AAGTATCGTC TTCAAATTGA AGATAATGGT TCTGGAATAT CTGATTCTAA AACTTGGTTG 1020 AAACCAAAAA CTTCTGGTTT TAAATTGATT CAACTTTTGA CCAGACAAAT AAAAGGTGAT 1080 TTTCAAATTC TTTCGGATTC TGGTTCCATT GCTGTACTTG AATTTTACAC T 1131

【０１３６】 <210> 7 <211> 618 <212> DNA <213> Nucleotides <400> 7 ATGTTTAATT TTTCCCAATA CCTAACCAAT GGTTTTGAAC GTTTTCCTAA AATCGAAAAA 60 TCAAAATCTA AAATTAAAAA AATTATTTTT GTAGGTAGGA TCACTCCCAA TAAAAAACAG 120 GACGATTTGA TCCGCCTTGC ATTCGCGTAT AAGTCTATAA TTTCCGATCA GTTTCAGTTT 180 TATCTCGCAG GTTTTAGTTC TAAAGAATTA TATCTTTATC GGGAAGAATT AGAAAGGATG 240 TTGGACTTTT ATGATCTCAG AAAAAACGTT TTGATCACAG GTTTTCTCTC CGACTTAGAA 300 CTAAATTCCC TTTATCAAGA AGCGGATGCT TTCGTTTCCA TGAGTGAACA CGAAGGTTTC 360 TGTGTTCCTC TGATCGAAGC CATGATTTAT AGAATTCCGA TCCTCGCTTT TTCAGGCGGC 420 GCGGTTTCCG AAACTTTAAA CGGAGCCGGT GTTCTTTTTA AAGAAAAAAA TTTTCCGAAC 480 TTGGCTATTT TACTCAATAA AATTTTGACT GATGTTTCTT TCCAAAATCA AATTTTAACA 540 GGCCAAGATC TACGTCTGAA CGAATTTAAA AAAACGGATT ATAAATCCGT CCTTAGGAAG 600 GCACTTGAAA TCATCTCT 618

【０１３７】 <210> 8 <211> 849 <212> DNA <213> Nucleotides <400> 8 ATGATTATCA ATCACAACCT GAGCGCGGTG AATTCTCACC GTTCTCTAAA GTTCAACGAG 60 CTTGCTGTGG ACAAGACGAT GAAGGCTTTG TCTTCCGGTA TGCGGATCAA TTCCGTGGCG 120 GACGACGCTT TCGGACTCGC GGTTTCTGAA AAGCTAAGAA CGCAGATCAA CGGTCTGCGT 180 CAGGCCGAAA GAAACACCGA AGACGGGATG AGCTTCATTC AAACTGCCGA GGGTTTCCTC 240 GAACAGACGT CGAACATCAT TCAGAGAATC CGGGTGCTTG CATCCAGACC TCGAATGGTT 300 TCTCAGCAAC GAAAGATTGC ATCTTTGGGC AGGTGGGAAG TATTGTGCGC TGGTGGACCA 360 AAGTCCCACC GAATCGCTTC TCAAGCTGAA TTTATAAGTT CAAGCTTTTT AGGGGCAATT 420 CGCAAAAGGT TCACGGGTCG GGTCCATGTG GTTTCATATG GGGCCGAACG AAAATCAGCG 480 AGAGAGATTT TACAGCGGCC CGAATGCTTC GAAAGCCCTG AAGCTTGTAA AGCGGACGGG 540 AGACCGATCG CGATTTCTTC TCCGGAAGAA GCCAACGATG TTATCGGTTT AGCGGATGCG 600 GCTCTTACGA GGATCATGAA GCAGAGAGCG GATATGGGGG CTTATTACAA TAGGCTCGAG 660 TATACCGCAA AAGGGGTGAT GGGTGCATAT GAAAATATGC AAGCATCGGA ATCCAGAATT 720 CGGGACGCCG ATATGGCGGA GGAAGTTGTC TCGCTGACCA CAAAACAAAT ACTCGTTCAG 780 AGTGGTACGG CAATGTTAGC GCAGGCAAAT ATGAAACCGA ATTCGGTTCT CAAGCTTCTG 840 CAGCATATC 849

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、pHLE011 およびpMW43 からのレプトス
ピラ膜タンパク質キナーゼの完全ヌクレオチド（Ａ）お
よび推定アミノ酸配列（Ｂ）（ORF1）である。開始およ
び終止コドンには太下線を施す。

【図２】図２は、pHLE011 およびpMW310からのレプトス
ピラ膜タンパク質パーミアーゼの完全ヌクレオチド
（Ａ）および推定アミノ酸配列（Ｂ）（ORF1）である。
開始および終止コドンには太下線を施す。

【図３】図３は、pMW50 からのレプトスピラ膜タンパク
質マンノシルトランスフェラーゼの完全ヌクレオチド
（Ａ）および推定アミノ酸配列（Ｂ）（ORF3）である。
開始および終止コドンには太下線を施す。

【図４】図４は、pDFX210 からのレプトスピラ膜タンパ
ク質エンドフラゲリンの完全ヌクレオチド（Ａ）および
推定アミノ酸配列（Ｂ）である。開始および終止コドン
には太下線を施す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１１月１５日（２０００．１１．
１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項３

【補正方法】変更

【補正内容】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/20 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＦＧ０１Ｎ 33/569 Ｃ０７Ｋ 16/12 // Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者エリックアンドリューウットアメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタンポイントロード，セントラルリサーチディビジョン (72)発明者マイケルスティーブンウィリーアメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースタンポイントロード，セントラルリサーチディビジョン

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：３のアミノ酸配列を有しレプ
トスピラ（Leptospira）の抗原性を有するタンパク質、
又は前記の抗原性を有する、前記タンパク質の断片もし
くは保存性変異体。
【請求項２】請求項１に記載のタンパク質、又はその
断片もしくは保存性変異体をコードするポリヌクレオチ
ド。
【請求項３】配列番号：３のアミノ酸配列をコードす
るヌクレオチド配列が配列番号：５のヌクレオチド配列
である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】レプトスピラの任意の病原性菌株からの
レプトスピラ膜タンパク質をコードするポリヌクレオチ
ド配列の検出のための少なくとも１２ヌクレオチドの長
さの一対の一本鎖DNA プライマーであって、プライマー
の対が配列番号：７のヌクレオチド１〜３０９内および
３１０〜６１８内から成る群から選択されるプライマー
で、ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーの使用が
レプトスピラの任意の病原性菌株からのレプトスピラ膜
タンパク質をコードする遺伝子のすべてまたは少なくと
も１２連続ヌクレオチドを含んで成るDNA の合成をもた
らすプライマー。
【請求項５】プレストピラ病原体の検出方法におい
て、（ａ）病原体に感染した動物から、または病原体それ自
体からDNA を単離し；（ｂ）本質的に配列番号：７のヌクレオチドの配列の少
なくとも１２個の連続するヌクレオチドとの配列同一性
を有する少なくとも１つのプライマーを用いてDNA にポ
リメラーゼ連鎖反応を施し；（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅の１または複数の生成
物を可視化することによりレプトスピラ病原体を検出す
る；工程を含んで成る方法。
【請求項６】レプトスピラ病原体からのレプトスピラ
膜タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の単離
方法において、（ａ）病原体に感染した動物から、または病原体それ自
体からDNA を単離し；（ｂ）本質的に配列番号：７のヌクレオチドの配列の少
なくとも１２個の連続するヌクレオチドどの配列同一性
を有する少なくとも１つのプライマーを用いてDNA にポ
リメラーゼ連鎖反応を施し；（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅による１または複数の
生成物を単離する；工程を含んで成る方法。
【請求項７】製薬上許容可能な担体中に免疫原的有効
量の請求項１に記載のタンパク質又はその断片もしくは
保存性変異体を含んで成る、動物における病原性レプト
スピラに対する免疫応答を誘導するために有用な製剤組
成物。
【請求項８】動物の生物学的流体または組織中のレプ
トスピラ膜タンパク質またはその断片の存在を検出する
方法であって、動物から得られた生物学的流体または組
織の標本を、請求項１に記載のタンパク質又はその断片
もしくは保存性変異体に特異的に結合する抗体と、ある
いは該抗体のＦａｂ断片と接触させることを含んで成る
方法。
【請求項９】前記検出がラジオイムノアッセイ、酵素
結合イムノソルベントアッセイ、サンドイッチ検定、プ
レシピチン反応、ゲル免疫拡散検定、凝集検定、蛍光イ
ムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、免疫電気
泳動検定およびウエスタンブロット検定から成る群から
選択される検定を含んで成る請求項８に記載の方法。