JP2000502249A

JP2000502249A - パスツレラ・ヘモリチカのトランスフェリン結合タンパク質およびそれを含有するワクチン

Info

Publication number: JP2000502249A
Application number: JP9520816A
Authority: JP
Inventors: ロウ、レジー・ワイ・シー; シュリバース、アンソニー・バーナード; ポッター、アンドリュー・アラン
Original assignee: ロウ、レジー・ワイ・シー; シュリバース、アンソニー・バーナード; ポッター、アンドリュー・アラン
Priority date: 1995-12-01
Filing date: 1996-11-29
Publication date: 2000-02-29
Also published as: CN1219969A; WO1997020934A1; BR9611851A; EP0863986A1; NZ322415A

Abstract

(57)【要約】パスツレラ・ヘモリチカ由来のトランスフェリン結合性タンパクおよび該タンパクをコードする核酸分子が開示される。当該タンパクに対する抗体が開示される。本発明はまた、本発明のタンパクを含有するワクチンに関する。本発明はまた、トランスフェリンの当該タンパクへの結合に影響する物質を同定する方法、および当該タンパクとトランスフェリンとの結合の作用剤または拮抗剤をスクリーニングする方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】パスツレラ・ヘモリチカのトランスフェリン結合タンパク質およびそれを含有するワクチン〔発明の分野〕本発明は、パスツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella haemolytica）の新規トランスフェリン結合タンパク質、そのトランケート化体、類似体、ホモログおよびイソ型；該タンパク質、そのトランケート化体、類似体およびホモログをコードする核酸分子；該タンパク質を含有するワクチン；該タンパク質に対する抗体；ならびに該タンパク質および核酸分子の用途に関する。〔発明の背景〕パスツレラ（Pasteurella）属のメンバーには、反芻動物の重要な病原体である一群の関連細菌種が含まれる。この一群には、パスツレラ・ヘモリチカ種が含まれ、これは、糖の利用に基づき２個の生物型ＡおよびＴに分類されており、その菌体抗原に基づいて認識される16個の血清型に分類されている(Bibersteln,Ｅ .Ｌ.ら,1960;Fraser ら，1982)。最近、トレハロースの利用により特徴づけられるパスツレラ・ヘモリチカのＴ型株が、新規種パスツレラ・トレハロシ（P.tr ehalosi）として再分類された(Sneath,Ｐ.Ｈ.Ａ.ら,1990)。パスツレラ・ヘモリチカが引き起こす肺パスツレラ症は、ウシ、ヒツジおよびヤギの産業にとって世界的に大きな経済問題となっている。この疾患の変型の１つである船積熱は、北米のウシの産業において大問題となっており、ほとんどの場合、専らこの細菌種のA1型株が引き起こすものである（Babiuk,Ｌ.Ａ.およびＳ.Ｄ.Acres,1984)。血清型A2はヒツジにおいては最も優勢な発病型であるが、他の血清型がヒツジおよびヤギにおいて重要な場合もある（Gilmour およびGilm our,1991)。関連種であるパスツレラ・トレハロシ(Pasteurella trehalosi)（以前はＴ型パスツレラ・ヘモリチカとして公知であった）は、特に英国のヒツジ産業を悩ます問題となっているラムにおける敗血症の原因微生物である。同様に、関連種パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）の株は、特に東南アジアにおいて深刻なウシおよびスイギュウの重篤な感染症である出血性敗血症を引き起こす。反芻動物におけるパスツレラ症を予防する望ましい方法は予防接種であるが、すべての反芻動物に対して有効なワクチンを考慮する場合には特に、すべての発病血清型に対する防御を誘導する免疫製剤がないため、成功は制限されている。死菌全細胞ワクチンは、一貫性のない防御レベルおよび抗体応答を子牛において惹起した(Wilkie,B.N.,1980)。サリチル酸ナトリウム抽出物（SSE）を含有する同種ワクチンは、血清型Al、A6およびA9による疾患に対してヒツジを防御したが (Gilmour ら，1983)、より流行性の血清型A2に対しては防御しなかった(Fraser ら，1982)。反芻動物からの白血球および肺胞マクロファージに対して特に致死的な、パスツレラ・ヘモリチカが産生する外毒素(Bensonら，1978)は、子牛およびヒツジにおける防御実験においてワクチン候補として非常に有望であることが示されているが(13，35)、異種血清型に対する防御が制限される(33)。鉄制限増殖条件下で誘導されるタンパク質をラムのパスツレラ症に対するワクチンに含有させることが、防御の増強に関与することが示唆されている(15)。これまでの研究において、病原性細菌がインビボで鉄を獲得する能力が、病理生物学において決定的に重要な因子であることが確認されている(7，11)。宿主の鉄結合糖タンパク質トランスフェリンから鉄を回収する１つのメカニズムは、細菌上の表面受容体によるトランスフェリンの直接的な結合、およびトランスフェリンからの鉄の取り出し、および細胞内への取込みを含む(21)。Schryvers(19 92)には、アフィニティークロマトグラフィーを用いて種々の細菌病原体からトランスフェリン受容体タンパク質を単離することが記載されている。トランスフェリン受容体は、トランスフェリン結合タンパク質１またはＡ（Tbp1またはTbpA ）およびトランスフェリン結合タンパク質２またはＢ（Tbp2またはTbpB）と称される２個のタンパク質よりなることが示されている。受容体媒介型の鉄の取込みが、パスツレラ・ヘモリチカの血清型Ａウシ株において生じることが示されている(26)。鉄制限条件下でインビトロで増殖するパスツレラ・ヘモリチカの細胞は、パスツレラ症の動物の感染部位からインビボで回収された細胞が産生するものと同一の多数の鉄抑制性外膜タンパク質（IROMP）を発現する(9,10)。これらのタンパク質のうちで特に顕著なのは、分子サイズが100、77 、70および60Kdaのものである(9，10)。その100Kdaのタンパク質は、ウシ分離菌における宿主特異的トランスフェリン受容体の１つとして同定されており(26)、一方、残りのIROMPのいくつかは、鉄獲得受容体複合体中の100Kdaタンパク質とおそらく結合しているであろうと示唆されている(26)。ラムからのパスツレラ・ヘモリチカにより発現されるIROMP（10）が鉄の獲得において果たす役割は依然として不明であり、より小さいタンパク質がヤギ分離菌により発現されるか否かも知られていない。パスツレラ・ヘモリチカは、受容体媒介型メカニズムによりウシ宿主トランスフェリンから鉄を獲得する。この型の鉄獲得メカニズムを有する細菌がインビボでの鉄の獲得に関して専ら表面受容体に依存しているという提案（29）は、該細菌の表面受容体に認識されるトランスフェリンを有する宿主においてのみ、該細菌が疾患を引き起こすことを示唆している。パスツレラ・ヘモリチカは、ウシ、ヒツジおよびヤギにおいて疾患を引き起こすと報告されており、したがって、それらの表面受容体は、これらの宿主のトランスフェリンを認識すると予想されるであろう。したがって、鉄の獲得に関与するトランスフェリン受容体をヒツジおよびヤギの分離菌も有するか否かを判定し、種々の反芻動物トランスフェリンに対するそれらの特異性を評価し、ウシ、ヒツジおよびヤギに肺パスツレラ症を引き起こす種々の株からの表面受容体の間に抗原関連性が存在するか否かを判定することが重要である。〔発明の概要〕ウシ、ヒツジおよびヤギからの種々の血清型および生物型（AおよびT）のパスツレラ・ヘモリチカ（およびパスツレラ・トレハロシ）株のコレクションにおいて、トランスフェリン受容体を同定した。増殖研究、結合研究およびアフィニティー単離実験から、これらの受容体が、ウシ、ヒツジおよびヤギからのトランスフェリンを認識する同一の特異性を有することが示された。このことは、細胞表面上で接近可能な、リガンド結合に関与する受容体タンパク質上に、保存領域があることを示している。パスツレラ・ヘモリチカの血清型A1株からの個々の精製受容体タンパク質（Tb pAおよびTbpB）に対して調製した抗血清は、代表的な選択株からの受容体タンパク質に対してかなりの交差反応性を示した。また、この交差反応性は無傷細胞に対しても認められ、このことは、宿主の免疫エフェクターメカニズムに対する標的として機能しうる保存された免疫エピトープが細胞表面上にあることを示している。本発明者らは、パスツレラ・ヘモリチカAlからのトランスフェリン受容体タンパク質TbpAおよびTbpB（本発明ではそれぞれTbp1およびTbp2とも称する）をコードするtbpAおよびtbpB遺伝子をクローニングし、配列決定し、発現させた。これらの遺伝子は、tbpB−tbpAのオペロン配置で組織されていた。trpB遺伝子の前には推定プロモーターおよび調節配列が位置し、trpB遺伝子の後には、プロモーター領域が全く存在しない 96 塩基対の遺伝子間配列が位置しており、このことは、その２つの遺伝子が同調的に転写されることを示唆している。TbpAおよびTbpB タンパク質の推定アミノ酸配列は、対応するナイヤリア・メニンジティディス(N eisseria meningitidis)、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎ．gonorrhoeae)、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）およびアクチノバシラス・プリウロニュウモニエ（Actinobacilluspleuropneumoniae）のLbpおよびTbpタンパク質と相同な領域を有していた。完全なtbpB遺伝子を T7 発現系で発現させたところ、得られた組換えTbpBタンパク質は機能的ウシトランスフェリン結合特性を保有していた。組換えTbpBを入手することができたおかげで、本発明者らは、反芻動物トランスフェリンに対するその特異性、ウシトランスフェリンのＣおよびＮの両末端ローブに対するその結合能、およびこのタンパク質の鉄担持形態に対するその優先性を示すことができた。また、パスツレラ・ヘモリチカTbpAおよびTbpBを含有する製剤での予防接種が実験的ウシ肺パスツレラ症に対して有意な防御を付与することを本発明者らが見出したことは、意義深いことである。TbpBの２回量の免疫も防御を付与した。大まかに言えば、本発明は、TbpAタンパク質をコードする配列を含んでなる精製され単離された核酸分子、またはTbpBタンパク質をコードする配列を含んでなる精製され単離された核酸分子を提供する。TbpAおよびTbpBタンパク質は、反芻動物トランスフェリンに結合し、その反芻動物宿主におけるパスツレラ・ヘモリチカによる受容体媒介性の鉄の獲得において機能する。TbpAタンパク質は約l0Ok Daのサイズであり、TbpBは約60kDaのサイズである。本発明の１つの実施態様においては、この精製され単離された核酸分子は、図 22 もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列を有するTbpAタンパク質をコードする配列、または図 24 もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列を有するTbpBタンパク質をコードする配列を含む。本発明の好ましい実施態様においては、この精製され単離された核酸分子は、図 21 もしくは配列番号１に示す核酸配列を有する、TbpAタンパク質をコードする配列、または図 23 もしくは配列番号３に示す核酸配列を有する、TbpBタンパク質をコードする配列を含む。また、本発明は、(a)TbpAまたはTbpBに特有の該タンパク質のトランケート化体、TbpAもしくはTbpBの類似体またはホモログまたはそれらのトランケート化体（本発明ではそれぞれ「TbpA関連タンパク質」または「TbpB関連タンパク質」と総称する）をコードする配列を含んでなる核酸分子；(b)図 22 および24に示すアミノ酸配列を有するそれぞれTbpAもしくはTbpB、またはTbpAもしくはTbpA関連タンパク質をコードする完全長核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列を含んでなる核酸分子；(c)図 21 もしくは配列番号１または図 23 もしくは配列番号３に示す配列を有するそれぞれtbpAまたはtbpB遺伝子の完全長核酸配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列を含んでなる核酸分子を意図する。本発明はさらに、相補的な核酸塩基配列と水素結合した本発明の核酸分子を含有する精製され単離された二本鎖核酸分子を意図する。本発明の核酸分子は、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター中に挿入することができる。したがって、本発明の核酸分子ならびに該核酸分子に作動的に結合した１以上の転写および翻訳要素を含む、宿主細胞の形質転換に適合した組換え発現ベクターを構築することができる。該組換え発現ベクターを使用して、TbpAおよび／またはTbpB、あるいはTbpまたはTbpB関連タンパク質を発現する形質転換宿主細胞を生産することができる。したがって、本発明はさらに、本発明の組換え分子を含有する宿主細胞を提供する。本発明はさらに、本発明の精製され単離された核酸分子を使用することによる新規TbpAまたはTbpB、およびTbpAまたはTbpB関連タンパク質の製造法を提供する。１つの実施態様においては、TbpAまたはTbpBの製造法であって、（a）本発明の組換え発現ベクターを宿主細胞中に導入し、(b)未形質転換宿主細胞から形質転換宿主細胞を選択し、(c)TbpAまたはTbpBの発現を許容する条件下で、選択された形質転換宿主細胞を培養し、(d)該組換えTbpAまたはTbpBを単離することを含んでなる製造法を提供する。本発明は、大まかに言ってさらに、好ましくは本発明の組換え発現ベクターを含有する宿主細胞を培養することにより得られた、反芻動物トランスフェリンに結合する精製され単離されたTbpAまたはTbpBを意図する。本発明の１つの実施態様においては、それぞれ図 22 または図 24 に示すアミノ酸配列を有する精製されたTbpAまたはTbpBを提供する。本発明はまた、該タンパク質のトランケート化体、ならびに該タンパク質の類似体、ホモログおよびイソ型およびそれらのトランケート化体（すなわち、「TbpAまたはTbpB関連タンパク質」）を含む。本発明のTbpAおよびTbpB、またはTbpAおよびTbpB関連タンパク質を、タンパク質などの他の分子と結合させて、融合タンパク質を製造することができる。これは、例えば、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質の合成により行なうことができる。本発明はさらに、本発明のTbpAもしくはTbpB、またはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質のエピトープに対する特異性を有する抗体を意図する。検出可能な物質で抗体を標識することができ、該抗体を使用して、サンプル中の本発明のTbpAもしくはTbpB、またはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質を検出することができる。また、本発明の核酸分子に特有の、したがって本発明のTbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に特有のヌクレオチドプローブの構築が、本発明により可能となる。したがって、本発明はまた、TbpAもしくはTbpBまたはTb pAもしくはTbpB関連タンパク質をコードする配列を含んでなるプローブに関する。該プローブは、例えば、検出可能な物質で標識することができ、それを使用して、TbpAまたはTbpBの特性の１以上を示すタンパク質をコードするヌクレオチド配列をヌクレオチド配列混合物から選択することができる。本発明はさらに、TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはそれらの活性化型に対する結合能を有する物質を同定する方法であって、Tb pAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはそれらの活性化型と、TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはそれらの活性化型に潜在的に結合しうる少なくとも１つの物質とを、該物質とTbpAもしくは TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはそれらの活性化型との複合体の形成を許容する条件下で反応させ、複合体に関して、遊離物質に関して、非複合化TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはそれらの活性化型に関してアッセイすることを含んでなる方法を提供する。TbpAもしくはTb pBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に潜在的に結合しうる物質には、トランスフェリン(特に反芻動物トランスフェリン)、トランスフェリンの類似体および誘導体、ならびにTbpAおよびTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に対する抗体が含まれる。さらに、本発明は、TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質と、TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはそれらの活性化型に結合する物質との相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストの存在に関して培地をアッセイする方法を提供する。１つの実施態様において、該方法は、既知濃度のTbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に、TbpA もしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に対する結合能を有する物質および推定アゴニストまたはアンタゴニスト物質を、該物質とTbpAもしくはTb pBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質との複合体の形成を許容する条件下で与え、複合体に関して、遊離物質に関して、非複合化TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に関してアッセイすることを含む。本発明の好ましい実施態様においては、該物質は、反芻動物トランスフェリン、その類似体、誘導体または一部、またはTbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に対する抗体である。また、TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質の発現に影響を及ぼす物質を、該物質の存在下および不存在下で細胞中の本発明のTbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質のパターンおよびレベルを比較することによる本発明の方法を用いて同定することができる。本発明の方法を用いて同定した物質は、パスツレラ・ヘモリチカに感染した動物（特に反芻動物）の治療で使用することができ、パスツレラ・ヘモリチカによる感染症に罹患しているか、またはパスツレラ・ヘモリチカによる感染体にさらされたウシ、ヒツジ、ヤギなどの反芻動物に投与するための医薬組成物に該物質を製剤化することができる。本発明者らは、本発明のTbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質が免疫原性であることを示した。したがって、本発明はまた、本発明のTbpA もしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に対する抗体に関する。１つの実施態様においては、該抗体は、パスツレラ・ヘモリチカの広範囲の血清型からのTbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に対して交差反応性である。該抗体は、パスツレラ・ヘモリチカ感染症の診断および治療に使用することができ、例えば、パスツレラ・ヘモリチカが引き起こす反芻動物における疾患を治療または予防するための受身免疫において使用することができる。本発明はさらに、本発明のTbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質を単独でまたは組合せて含んでなるワクチン組成物を含む。本発明はさらに、そのようなワクチンの治療的に有効な量を投与することにより、パスツレラ・へモリチカによる感染に対して宿主（好ましくは反芻動物宿主）を免疫する方法を含む。本発明者らは、ある範囲の反芻動物からのパスツレラ・ヘモリチカの種々の株が、ある範囲の反芻動物トランスフェリンに結合しそれを利用する能力を有することを示した。したがって、本発明のワクチン組成物は、広範囲のパスツレラ・ヘモリチカの生物型および血清型による感染に対してヒツジ、ウシ、ヤギなどの或る範囲の反芻物を免疫するのに適した広域スペクトルのワクチンとして有用であると考えられる。本発明はまた、パスツレラ・ヘモリチカに対する反芻動物の免疫応答を増強したりパスツレラ・ヘモリチカ感染症を治療するための組換えウイルスベクターワクチン中での、TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質をコードする本発明の核酸分子の使用を意図する。組換えウイルスベクターは、当該技術分野で公知の方法を用いて構築することができる。本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、この詳細な説明から当業者に明らかであるため、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、単に例示として記載されているにすぎないと理解されるべきである。〔図面の簡単な説明〕以下、図面に関して本発明を説明する。図１は、PCR 法(a)、ならびにTbp1プライマーおよび左側プライマーにより増幅された0.8kbのPCR産物（b）の略図である。図２は、tbpプラスミド９、10および 482 の制限エンドヌクレアーゼ地図である。図３は、パスツレラ・ヘモリチカtbpAおよびtbpBの予備ヌクレオチド配列である。図４は、パスツレラ・ヘモリチカtbpB(PHTBPB)のプロモーター領域である。図５は、ClaIで消化しtbpA遺伝子でプローブしたパスツレラ・ヘモリチカケノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのブロットである。図６は、HindIIIおよびBamHIで消化しtpbA遺伝子でプローブしたパスツレラ・ヘモリチカゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのブロットである。図７は、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化しパスツレラ・ヘモリチカtbpA 遺伝子でプローブしたエイ・スイス（A.suis）37114、エイ・プリゥロニュウモニエ（A.pleuropneumoniae） CM5およびショープ4074のゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションのブロットである。図８は、パスツレラ・ヘモリチカ（P.haemolyitca）A1、エイ・プリゥロニュウモニエ（A.pleuropneumoniae）CM5、ショープ（Shope）4074およびエイ・スイス（A.suls）37114におけるtbpA、tbpB領域の制限地図である。図９は、パスツレラ・ヘモリチカ A1のTbp1 （PHTBP）およびエヌ・ゴノレエ（N.gonorrhoeae）およびエヌ・メニンジティディス（N.meningitidis）のTbp1 （それぞれNGTBP1およびNM1）のアミノ酸の整列を示す。図 10 は、パスツレラ・ヘモリチカA1のTbp1 （PHTBP）およびエイ・プリゥロニュウモニエ（A.pleuropneumoniae）血清型１および７TfbAタンパク質（APL、A PL7）のアミノ酸の整列を示す。図 11 は、パスツレラ・ヘモリチカA1のTbp1 (PHTBP)、およびエヌ・ゴノレエ（N．gonorrhoeae）およびエヌ・メニンジティディス（N．meningitidis）のTbp 1（それぞれNGTBP1およびNM1)、およびエイ・プリゥロニュウモニエ（A.pleurop neumoniae）血清型１および７TfbAタンパク質（APL、APL7）の間の遺伝的関連性を示すデンドログラムである。図 12 は、パスツレラ・ヘモリチカA1 Tbp1および大腸菌（E.coli）のTonB依存性外膜受容体のペプチドの整列である。図 13 は、パスツレラ・ヘモリチカTbp1タンパク質のT7分析を示すブロットである。図 14 は、パスツレラ・ヘモリチカA1および大腸菌（E.coli）HB101からの内膜および外膜のウエスタン免疫ブロットである。せた血清を用いるパスツレラ・ヘモリチカA1および大腸菌（E.coli）HB101からの内膜および外膜のウエスタン免疫ブロットである。図 16 は、鉄欠損細菌膜による標識トランスフェリンの結合を示すブロットである。図 17 は、トランスフェリンアフィニティーカラムによる受容体タンパク質の単離を示す免疫ブロットである。図 18 は、ウシ、ヒツジおよびヤギからのパスツレラ・ヘモリチカの種々の血清型からの受容体タンパク質の免疫学的分析を示す免疫ブロットである。パネルＡは抗TbpB血清によるものであり、パネルＢは抗TbpA血清によるものである。図 19 は、無傷細胞による標識トランスフェリンおよび抗受容体抗体の結合を示すブロットである。図 20 は、パスツレラ・ヘモリチカtbpオペロン(Top)およびパスツレラ・ヘモリチカtbpオペロン（Top）の地図および調節配列（下部）である。tbpAおよびtb pBは、それぞれTbpAおよびTbpBをコードする遺伝子である。ｐは、tbpBに先行し下部に−35 および−10 部位と表示されている推定プロモーター領域である。図 21 および配列番号１は、パスツレラ・ヘモリチカ株h196からのtbpA遺伝子のＤＮＡ配列を示す。図 22 および配列番号２は、パスツレラ・ヘモリチカ株h196からのTbpAタンパク質の推定アミノ酸配列を示す。図 23 および配列番号３は、パスツレラ・ヘモリチカ株h196からのtbpB遺伝子のＤＮＡ配列を示す。図 24 および配列番号４は、パスツレラ・ヘモリチカ株h196からのTbpBタンパク質の推定アミノ酸配列を示す。図 25 は、固相HRP-Tf結合アッセイの結果を示すブロットである。図 26 は、銀染色（パネルＡ）およびウエスタンブロット（パネルＢ）研究（パスツレラ・ヘモリチカ血清型A1からの抗TbpAおよび抗TbpB抗血清によるもの）を示すブロットである。図 27 は、パスツレラ・ヘモリチカ血清型A1からの単一特異性抗TbpAおよび抗 TbpB抗血清を用いる無傷細胞に対する交差反応性研究の結果を示すブロットである。図 28 は、パスツレラ・ヘモリチカおよびパスツレラ・トレハロシ株からのPC R増幅されたtbpA（パネルＡ）およびtbpB（パネルＢ）遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ消化パターンを有するゲルを示す。図 29 は、tbpA（パネルＡ）およびtbpB（パネルＢ）遺伝子の可変セグメントのPCR増幅を示すゲルである。〔発明の詳細な説明〕本明細書の全体にわたり、アミノ酸残基に関する以下の標準的な略語を使用する：Ａ、Ala−アラニン；Ｃ、Cys−システイン；Ｄ、Asp−アスパラギン酸；Ｅ、Glu−グルタミン酸；Ｆ、Phe−フェニルアラニン；Ｇ、Gly-グリシン；Ｈ、Hi s−ヒスチジン；Ｉ、Ile−イソロイシン；Ｋ、Lys−リシン；Ｌ、Leu−ロイシン；Ｍ、Met−メチオニン；Ｎ、Asn−アスパラギン；Ｐ、Pro−プロリン；Ｑ、Gln −グルタミン；Ｒ、Arg−アルギニン；Ｓ、Ser−セリン；Ｔ、Thr−トレオニン；Ｖ、Val−バリン；Ｗ、Trp−トリプトファン；Ｙ、Tyr−チロシン；およびｐ. Ｙ.、Ｐ.Tyr−ホスホチロシン。Ｉ．本発明の核酸分子本明細書中で既に説明したとおり、本発明は、TbpAタンパク質をコードする配列を含んでなる精製され単離された核酸分子、またはTbpBタンパク質をコードする配列を含んでなる精製され単離された核酸分子を提供する。「単離され精製された」なる語は、細胞物質または培地（組換えＤＮＡ技術で製造する場合）または化学前駆体もしくは他の化学物質（化学合成する場合）を実質的に含有しない核酸を意味する。また、「単離され精製された」核酸は、該核酸が由来する核酸に天然で隣接する配列（すなわち、該核酸の５'および３'末端に位置する配列）を含有しない。「核酸」なる語は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む意であり、二本鎖または一本鎖のいずれであってもよい。本発明の１つの実施態様においては、図 22 または配列番号２に示すアミノ酸配列を有するTbpAをコードする核酸分子を提供する。もう１つの実施態様においては、図 24 または配列番号４に示すアミノ酸配列を有するTbpBをコードする核酸分子を提供する。本発明の好ましい実施態様においては、核酸分子は、図 21 または配列番号１に示すヌクレオチド配列、あるいは図 23 または配列番号３に示すヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡである。本発明は、以下の核酸と相補的な核酸配列を含む：(a)図 22 または配列番号２に示すアミノ酸配列を有するTbpAをコードする核酸、(b)図 24 または配列番号４に示すアミノ酸配列を有するTbpBをコードする核酸、(c)図 21 もしくは配列番号１または図 23 または配列番号３に示す配列を有する核酸。好ましくは、該配列は、図 21 もしくは配列番号１または図 23 もしくは配列番号３に示す完全長核酸配列と相補的である。本発明はまた、図 21 もしくは配列番号１または図 23 もしくは配列番号３に示す核酸配列と実質的な配列同一性または相同性を有する核酸分子、あるいはそれぞれ図 22 もしくは配列番号２または図 24 もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列と実質的な相同性を有するTbpAまたはTbpBタンパク質をコードする核酸分子を含む。相同性は、配列間の配列類似性を意味し、比較のために整列しうる各配列中の位置を比較することにより決定することができる。比較する配列中の位置が、同じヌクレオチド塩基またはアミノ酸で占められる場合には、該分子はマッチしているか、あるいは該配列により共有される同じ位置を有する。実質的な相同性を有する核酸配列には、(a)図 21 または配列番号１に示す核酸配列と少なくとも40〜60％、好ましくは60〜80％、最も好ましくは80〜90％の同一性を有する核酸配列、および（b）図 23 または配列番号３に示す核酸配列と少なくとも 40〜60％、好ましくは 60〜80％、最も好ましくは 80〜90％の同一性を有する核酸配列が含まれる。本発明のもう１つの態様は、ハイブリダイゼーション条件下、好ましくは厳密なハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子、および少なくとも15ヌクレオチド塩基を有するその断片を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件は、当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, Ｎ.Ｙ.(1989),6.3.1-6.3.6に記載されている。例えば、約 45℃で 6.0×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(SSC)、ついで 50℃で 2.0×SSC の洗浄を行なうことができる。該ストリンジェンシーは、洗浄工程で用いる条件に基づき選択することができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、50℃で約 0.2×SSC の高ストリンジェンシーから選択することができる。また、洗浄工程の温度は、約65℃ の高ストリンジェンシー条件であってもよい。 TbpAまたはTbpBの活性を有するタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重のためにそれぞれ図 21 もしくは配列番号１または図 23 もしくは配列番号３に示す核酸配列と異なる配列を有する単離され精製された核酸分子も、本発明の範囲内に含まれる。そのような核酸は、機能的に等価なTbpAまたはTbpBタンパク質をコードするはずであるが、遺伝暗号の縮重のため、それぞれ図21もしくは配列番号１または図 23 もしくは配列番号３中の配列と異なる配列を有するはずである。ＤＮＡを含んでなる本発明の単離され精製された核酸分子は、図 21 もしくは配列番号１または図 23 もしくは配列番号３に示す核酸配列の全部または一部に基づく標識核酸プローブを調製し、該標識核酸プローブを使用して適当なＤＮＡライブラリー（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー）をスクリーニングすることにより単離することができる。ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより単離した核酸は、標準的な方法により配列決定することができる。また、ＤＮＡである本発明の単離され精製された核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを用いて、TbpAまたはTbpBをコードする核酸を選択的に増幅することにより単離することができる。図 21もしくは配列番号１または図 23 もしくは配列番号３に示す核酸配列から、PCRで使用するための合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計することが可能である。これらのオリゴヌクレオチドプライマーおよび標準的なPCR増幅法を用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから核酸を増幅することができる。このようにして増幅した核酸を、適当なベクター中にクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけることができる。ｃＤＮＡは、種々の方法（例えば、chirgwin ら，Bioch emistry，18，5294-5299(1979)のグアニジニウム−チオシアナート抽出法）を用いて全細胞ｍＲＮＡを単離することによりｍＲＮＡから調製することができると理解される。ついで、逆転写酵素（例えば、Gibco/BRL(Bethesda,MD) から入手可能なモロニーMLV逆転写酵素、またはSeikagaku America,Inc.(St.Pet ersburg，FL）から入手可能なAMV逆転写酵素）を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。ＲＮＡである本発明の単離され精製された核酸分子は、TbpAまたはTbpBをコードするｃＤＮＡを、該ｃＤＮＡの転写を許容する適当なベクター中にクローニングして、それぞれTbpAまたはTbpB活性を示すタンパク質をコードするＲＮＡ分子を産生させることにより単離することができる。また、本発明の核酸分子は、標準的な方法を用いて化学合成することができる。ポリデオキシヌクレオチドを化学合成する種々の方法が公知であり、例えば、ペプチド合成と同様、商業的に入手可能なＤＮＡ合成装置で完全に自動化されている固相合成などが挙げられる(例えば、Itakura ら，米国特許第 4,598,049 号 ;Caruthers ら，米国特許第 4,458,066 号;およびItakura，米国特許第 4,401,7 96号および第 4,373,071 号を参照されたい)。ある特定の核酸分子が、TbpAまたはTbpB活性を有するタンパク質をコードしているか否かの判定は、標準的な方法により適当な宿主細胞中で該ＤＮＡを発現させ、その発現されたタンパク質が反芻動物トランスフェリンに結合する及び／又は鉄の取込みを媒介する能力を試験することにより行なうことができる。そのような活性を有するｃＤＮＡは、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーションまたはマクサム・ギルバート化学配列決定法などの標準的な方法により配列決定して、該核酸配列および該コード化タンパク質の推定アミノ酸配列を決定することができる。 tbpAまたはtbpBの調節要素は、通常の方法を用いて同定することができる。該要素の機能は、これらの要素を使用して、該要素に作動的に結合したレポーター遺伝子を発現させることにより確認することができる。これらの構築物は、標準的な方法を用いて培養細胞中に導入することができる。本発明の核酸分子の配列を、転写のためのその正常の提示に対して逆位とすることにより、アンチセンス核酸分子を得ることができる。アンチセンス核酸分子は、当該技術分野で公知の化学合成および酵素連結反応により構築することができる。 II．組換えTbpAおよびTbpB 本発明はまた、トランスフェリン結合活性を示すパスツレラ・ヘモリチカA1からの精製され単離されたTbpAまたはTbpBタンパク質を意図する。本発明の１つの実施態様においては、図 22 または配列番号２に示すアミノ酸配列を有する精製されたTbpAタンパク質を提供する。本発明のもう１つの実施態様においては、図 24 または配列番号４に示すアミノ酸配列を有する精製されたTbpBタンパク質を提供する。組換えTbpBは、天然の受容体複合体とは異なり、トランスフェリンのＮローブおよびＣローブ上の結合決定基を認識する。本明細書中に記載のとおり、本発明のタンパク質は、完全長TbpAまたはTbpBアミノ酸配列に加えて、TbpAまたはTbpBのトランケート化体、ならびにTbpAまたは TbpBの類似体およびホモログおよびそれらのトランケート化体を含む。トランケート化タンパク質は、少なくとも３アミノ酸残基を有するペプチドを含んでいてもよい。該トランケート化タンパク質は、アミノ基(−NH2)、疎水性基（例えば、カルボベンゾキシル、ダンシルまたはＴ−ブチルオキシカルボニル）、アセチル基、９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（PMOC）基、または巨大分子、例えば脂質−脂肪酸結合体、ボリエチレングリコール、炭水化物など（これらに限定されるものではない）をアミノ末端に有していてもよい。該トランケート化タンパク質は、カルボキシル基、アミノ基、Ｔ−ブチルオキシカルボニル基、または巨大分子、例えば脂質−脂肪酸結合体、ポリエチレングリコール、炭水化物など（これらに限定されるものではない）をカルボキシ末端に有していてもよい。本発明のタンパク質はまた、それぞれ図 22 もしくは配列番号２または図 24 もしくは配列番号４に示すTbpAまたはTbpBの類似体、および／または本明細書中に記載するそれらのトランケート化体を含んでいてもよく、これらは、１以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含有するTbpAまたはTbpB(図22 もしくは配列番号２または図 24 もしくは配列番号４)を含んでいてもよいが、これらに限定されるものではない。アミノ酸の置換は、同類または非同類な性質のものとなることが可能である。同類アミノ酸置換は、TbpAまたはTbpBアミノ酸配列の１以上のアミノ酸を、類似した電荷、サイズおよび／または疎水性特性のアミノ酸で置換することを含む。同類置換だけを行なうと、得られる類似体は、TbpAまたはTbpBと機能的に等価となるはずである。非同類置換は、TbpAまたはTbpBアミノ酸配列の１以上のアミノ酸を、非類似の電荷、サイズおよび／または疎水性特性を有する１以上のアミノ酸で置換することを含む。 TbpAまたはTbpB（図 22 もしくは配列番号２または図 24 もしくは配列番号４）中には、１以上のアミノ酸の挿入を導入することができる。アミノ酸の挿入は、単一のアミノ酸残基または２〜15 アミノ酸長の連続的なアミノ酸よりなるものであってもよい。欠失は、TbpAまたはTbpB（図 22 もしくは配列番号２または図 24 もしくは配列番号４）の配列から１以上のアミノ酸または分離した部分を除去することよりなるものであってもよい。欠失したアミノ酸は、連続的であっても非連続的であってもよい。欠失突然変異を有する得られる類似体の最低限の長さは、約 10アミノ酸、好ましくは100アミノ酸である。本発明のタンパク質はまた、TbpAまたはTbpB（図 22 もしくは配列番号２または図 24 もしくは配列番号４）のホモログ、および／または本明細書中に記載するそのトランケート化体を含む。そのようなTbpAまたはTbpBホモログは、TbpAまたはTbpBを得るのに使用されるプローブと厳密なハイブリダイゼーション条件下（本明細書中の厳密なハイブリダイゼーション条件の考察を参照されたい）でハイブリダイズする他種からのTbpAまたはTbpB領域のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するタンパク質である。実質的な相同性を有するタンパク質配列には、図 22 (または配列番号２)または図 24 (または配列番号４)に示すアミノ酸配列と少なくとも40〜60％、好ましくは60〜80％、最も好ましくは80〜90％の同一性を有するタンパク質配列が含まれる。本発明はまた、本発明のタンパク質のイソ型を意図する。イソ型は、本発明のタンパク質と同じ数および種類のアミノ酸を含有するが、イソ型は、異なる分子構造を有する。本発明で意図するイソ型は、本明細書中に記載する本発明のタンパク質と同じ特性を有するものである。本発明はまた、選択されたタンパク質または選択マーカータンパク質（以下を参照されたい）と結合して融合タンパク質を形成しているTbpA、TbpBまたはTbpA もしくはTbpB関連タンパク質を含む。さらに、TbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTb pB関連タンパク質の免疫原性部分が本発明の範囲内に含まれる。本発明のTbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質は、組換えＤＮＡ法により製造する。したがって、本発明のTbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質をコードする配列を有する本発明の核酸分子を、該タンパク質の優れた発現を保証する適当な発現ベクター中に公知方法で導入することができる。該発現ベクターが「宿主細胞の形質転換に適している」とは、該発現ベクターが、本発明の核酸分子と、発現に使用する宿主細胞に基づき選択され該核酸分子に作動的に結合した調節配列とを含有することを意味する。作動的に結合したとは、該核酸が、該核酸の発現を許容する態様で調節配列に結合していることを意味する。したがって、本発明は、本発明の核酸分子またはその断片と、該挿入タンパク質配列の転写および翻訳に必要な調節配列とを含有する本発明の組換え発現ベクターを意図する。適当な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含む種々の起源に由来するものであってもよい。適当な調節配列の選択は、以下に記載するとおりに選択する宿主細胞に左右され、そのような選択は当業者であれば容易に行なうことができる。本発明の組換え発現ベクターは、本発明の組換え分子で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を促進する選択マーカー遺伝子を含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ある薬物に対する耐性を付与するタンパク質またはβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子が挙げられる。また、組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現を増強したり、組換えタンパク質の溶解性を増強したり、標的組換えタンパク質の精製を援助したりする（アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによる）融合部分をコードする遺伝子を含有していてもよい。組換え発現ベクターを宿主細胞中に導入して、形質転換宿主細胞を得ることができる。「形質転換宿主細胞」なる語は、本発明の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた原核および真核細胞を包含する意である。「形質転換された」、「トランスフェクトされた」、「形質転換」および「トランスフェクション」なる語は、当該技術分野で公知の多数の可能な方法の１つにより細胞中へ核酸（例えば、ベクター）を導入することを包含する意である。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトする適当な方法は、Sambrook ら（Molecul arCloning:Ａ Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor Laboratory pres s(1989)）および他の実験用教科書に記載されている。また、本発明のタンパク質は、固相合成(Merrifield,1964,Ｊ.Am.Chem.Assoc. 85:2149-2154)、均一溶液中での合成（Houbenweyl,1987,Methods of OrganicChe mistry,Ｅ.Wansch編,Vol.IおよびII,Thieme,Stuttgart）などのタンパク質化学でよく知られている方法を用いる化学合成により製造することができる。タンパク質などの他の分子に結合した本発明のTbpA、TbpBまたはTbpAもしくは TbpB関連タンパク質を含むＮ末端またはＣ末端融合タンパク質は、組換え技術により、TbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質のＮ末端またはＣ末端と所望の生物機能を有する選択されたタンパク質または選択マーカータンパク質の配列とを融合させることにより製造することができる。得られた融合タンパク質は、選択されたタンパク質またはマーカータンパク質と融合したTbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質を含有する。 III．本発明の適用本発明の核酸分子を使用すれば、サンプル中の核酸配列の検出で使用するためのヌクレオチドプローブを構築することが当業者において可能となる。適当なプローブには、それぞれ図 22 および配列番号２または図 24 および配列番号４に示すTbpAまたはTbpBタンパク質の領域からの少なくとも６個の連続的なアミノ酸をコードする核酸配列に基づく核酸分子が含まれる。例えば、適当なプローブは、図 21 および配列番号１に示すTbpAの配列のヌクレオチド番号 1741〜2784 から選択されるTbpAの核酸分子を含んでいてもよい。ヌクレオチドプローブは、適当なシグナルを与え十分な半減期を有する放射性標識（例えば、³²Ｐ、³Ｈ、¹⁴ Ｃなど）などの検出可能な物質で標識することができる。使用することができる他の検出可能な物質には、特異的な標識抗体により認識される抗原、蛍光化合物、酵素、標識抗原に特異的な抗体、および発光化合物が含まれる。検出すベきヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションの速度およびプローブの結合およびハイブリダイゼーションに利用可能なヌクレオチドの量を考慮して、適当な標識を選択することができる。標識されたプローブは、Sambrook ら，1989,Mo lecular Cloning:Ａ Laboratory Manual(第２版)に一般的に記載されているニトロセルロースフィルター、ナイロンメンブレンなどの固相支持体上で核酸とハイブリダイズさせることができる。核酸プローブを使用して、TbpA、TbpBまたはTb pAもしくはTbpB関連タンパク質をコードする遺伝子（好ましくはヒト細胞中のもの）を検出することができる。本発明のTbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質を使用して、該タンパク質に特異的な抗体を製造することができる。該抗体の製造には、通常の方法を使用することができる。ポリクローナル抗体を製造するためには、哺乳動物（例えば、ウサギ、マウスまたはラット）を、TbpA、TbpB、それらのタンパク質の断片またはそれらの両者の混合物で免疫することができる。該タンパク質の免疫原性は、該タンパク質混合物にアジュバントを加えたり、あるいは該タンパク質を免疫原性担体に結合させることにより増強することができる。担体には、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびウシ血清アルブミン（B SA）が含まれる。モノクローナル抗体を製造するためには、動物（前記のとおり免疫したもの）から抗体産生細胞（リンパ球）を収穫し、標準的な体細胞融合法により骨髄腫細胞と融合させ、それによりこれらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような方法は当該技術分野でよく知られている［例えば、Ko hlerおよびMilsteinが最初に開発したハイブリドーマ法(Nature 256,495-497(19 75))、および他の方法、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozborら,Immuno l.Today4,72(1983))、ヒトモノクローナル抗体を得るためのEBVハイブリドーマ法(Coleら，Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy(1985)Allen Ｒ.Bliss,I nc.,ｐ.77-96)、組合せ抗体ライブラリーのスクリーニング(Huseら,Science246, 1275(1989))]。該ペプチドと特異的反応性の抗体を製造するために、ハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングすることができ、該モノクローナル抗体を単離することができる。したがって、本発明はまた、本明細書中に記載するTbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に対する特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を意図する。本発明で用いる「抗体」なる語は、TbpAまたはTbpBの活性を有するタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する抗体断片も包含する意である。抗体は、通常の方法を用いて断片化することができ、前記と同様にして有用性に関して該断片をスクリーニングすることができる。例えば、ペプシンで抗体を処理することにより、F(ab')₂断片を得ることができる。得られたF(ab')₂断片を処理してジスルフィド架橋を還元し、Fab'断片を得ることができる。２以上のF(ab')₂またはFab'断片を融合させることにより、多価抗体を製造することができる。例えば、多価抗体は、TbpAに特異的な１個のF(ab')₂断片と、TbpBに特異的な１個のF(a b')₂断片とを含有していてもよい。キメラ抗体誘導体、すなわち、非反芻動物の可変領域と反芻動物の定常領域とを併せ持つ抗体分子も、本発明の範囲内に含まれると意図される。キメラ抗体分子には、例えば、ウシ定常領域を有する、マウス、ラットまたは他の種の抗体からの抗原結合ドメインが含まれることが可能である。通常の方法を用いて、本発明の新規Tbp遺伝子の遺伝子産物を認識する免疫グロブリン可変領域を含有するキメラ抗体を製造することができる(例えば、Morrisonら,Proc.Natl.Acad.Sci.U .S.A.81,6851(1985);Takedaら,Nature 314,452(1985);Cabillyら,米国特許第4,8 16,567号; Bossら，米国特許第4,816,397号;Tanaguchiら，欧州特許公開EP17149 6;欧州特許公開0173494を参照されたい)。 TbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質と特異的反応性の抗体またはその誘導体（例えば、酵素結合体または標識誘導体）をプローブとして使用して、組織、細胞などのサンプル中のTbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質を検出することができる。例えば、TbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質の抗原決定基と該抗体との結合相互作用に基づく公知の任意のイムノアッセイにおいて、それらを使用することができる。そのようなアッセイとしては、例えば、放射線免疫検定法、酵素免疫検定法(例えば、ELISA)、免疫蛍光、免疫沈降、ラテックス凝集、赤血球凝集および組織化学試験が挙げられる。したがって、該抗体を使用して、サンプル中のTbpA、Tb pBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質を検出し定量することができる。１つの実施態様においては、該抗体は、パスツレラ・ヘモリチカの広範囲の血清型からのTbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に対して交差反応性である。該抗体をプローブとして使用する場合には、通常、当該技術分野で公知の方法により該抗体を標識する。また、本発明の抗体は、パスツレラ・ヘモリチカ感染症の診断および治療に使用することができる。１つの実施態様においては、パスツレラ・ヘモリチカが引き起こす反芻動物における疾患を治療または予防するための受身免疫において、該抗体を使用することができる。そのような場合には、抗体または多価抗体の混合物を使用することができる。本発明はさらに、TbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはその活性化型に対する結合能を有する物質を同定する方法であって、TbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはその活性化型と、TbpA、TbpBまたは TbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはその活性化型に潜在的に結合しうる少なくとも１つの物質とを、該物質とTbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはその活性化型との複合体の形成を許容する条件下で反応させ、複合体に関して、遊離物質に関して、非複合化TbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはその活性型に関してアッセイすることを含んでなる方法を提供する。TbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に潜在的に結合しうる物質には、トランスフェリン(特に反芻動物トランスフエリン)、トランスフェリンの類似体および誘導体、ならびにTbpA、TbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に対する抗体が含まれる。さらに、本発明は、TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質と、TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質またはそれらの活性化型に結合する物質との相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストの存在に関して培地をアッセイする方法を提供する。１つの実施態様において、該方法は、既知濃度のTbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に、TbpA もしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に対する結合能を有する物質および推定アゴニストまたはアンタゴニスト物質を、該物質とTbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質との複合体の形成を許容する条件下で与え、複合体に関して、遊離物質に関して、非複合化TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に関してアッセイすることを含む。本発明の好ましい実施態様においては、該物質は、反芻動物トランスフェリン、その類似体、誘導体または一部、またはTbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質に対する抗体である。また、TbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質の発現に影響を及ぼす物質を、該物質の存在下および不存在下で細胞中の本発明のTbpAもしくはTbpBまたはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質のパターンおよびレベルを比較することによる本発明の方法を用いて同定することができる。本発明の方法を用いて同定した物質は、パスツレラ・ヘモリチカに感染した動物（特に反芻動物）の治療で使用することができ、したがって、パスツレラ・ヘモリチカによる感染症に罹患しているか、またはパスツレラ・ヘモリチカによる感染体にさらされたウシ、ヒツジ、ヤギなどの反芻動物に投与するための医薬組成物に該物質を製剤化することができる。インビボでの投与に適した生物学的に適合した形態で対象に投与するための医薬組成物に、該物質を製剤化することができる。「インビボでの投与に適した生物学的に適合した形態」は、治療効果があらゆる毒性効果に勝っている、投与すべき物質の形態を意味する。該物質は、ヒト、動物などの生きた生物に投与することができる。本発明の医薬組成物の治療的に有効な量の投与は、所望の結果を得るのに必要な用量および期間において有効な量と定義される。例えば、物質の治療的に有効な量は、個体の病態、年齢、性別、体重、および該個体内で所望の応答を惹起する抗体の能力などの因子によって異なることがある。最適な治療応答が得られるように投与計画を調整することができる。注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮適用、直腸投与などの簡便な方法で、該活性物質を投与することができる。投与経路に応じて、酵素、酸および該化合物を不活性化しうる他の天然条件の作用から該化合物を保護する物質で該活性物質をコーティングすることができる。本明細書中に記載する組成物は、対象に投与しうる医薬上許容される組成物の製造のための自体公知の方法により製造することができ、該活性物質の有効量を、医薬上許容される担体と一緒にして混合物とすることができる。適当な担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Remington's Pharmaceutica lSciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,USA 1985）に記載されている。これに基づけば、該組成物は、１以上の医薬上許容される担体または希釈剤と一緒になった該物質の溶液であって、適当なｐＨおよび生理的流体と等しい浸透圧を有する緩衝溶液中に該物質が含有されている溶液を含むが、これらに限定されるものではない。 TbpAもしくはTbpBおよび／またはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質を、動物における種々の感染症の予防および治療のためのワクチンとして使用することができる。本発明で意図する感染症としては、パスツレラ・ヘモリチカが引き起こす感染症、例えば、ウシにおけるウシ肺炎ならびにヒツジにおける全身疾患および肺炎などが挙げられる。さらに、本発明のワクチンを、他のパスツレラ種が引き起こす感染症の予防または治療に使用することができる。一例として、ウシ、ブタおよび家禽における、呼吸器および全身性感染症（例えば、出血性敗血症およびウシ乳腺炎）を含むパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）の予防および治療が挙げられる。該ワクチンを種々の動物、好ましくは反芻動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギなど）へ投与することを意図することができる。本発明者らは、ある範囲の反芻動物からのパスツレラ・ヘモリチカの種々の株が、ある範囲の反芻動物トランスフェリンに結合しそれを利用する能力を有することを示した。したがって、本発明のワクチン組成物は、広範囲のパスツレラ・ヘモリチカの生物型および血清型による感染に対してヒツジ、ウシ、ヤギなどの或る範囲の反芻動物を免疫するのに適した広域スペクトルのワクチンとして有用であると考えられる。該ワクチン組成物は、TbpA、TbpBおよび／またはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質を単独でまたは組合せて含む。該ワクチン組成物は、記載されているタンパク質またはその免疫原性断片の任意の組合せを含有していてもよい。さらに、該組成物は、パスツレラ・ヘモリチカまたは他の微生物の１以上の生物型または血清型からのTbpタンパク質を含有していてもよい。TbpA、TbpBおよび／またはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質を含む組換えタンパク質を本発明のワクチン組成物中で使用するのが好ましい。好ましい実施態様においては、本発明の組換えTbpA、TbpBおよび／またはTbpAもしくはTbpB関連タンパク質の１以上を該ワクチン組成物中で使用する。本発明のもう１つの実施態様においては、該ワクチン組成物は、精製され単離されたTbpAおよびTbpB、好ましくは、組換えTbpAおよびTbpBよりなる。本発明のワクチンは、１以上のTbpA、TbpB、TbpA関連タンパク質およびTbpB関連タンパク質の免疫学的に有効な量を含有する。該タンパク質の最適量は、防御が要求される感染の性質、防御すべき動物の特徴、および当業者に公知の他の因子によって異なる。該ワクチンは、TbpA、TbpB、TbpA関連タンパク質および／またはTbpB関連タンパク質に加えて、当該技術分野で公知の水性希釈剤、懸濁補助剤、緩衝液、賦形剤、１以上のアジュバントなどの免疫学的に許容される担体を含んでいてもよい。適当なアジュバントには、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント（完全または不完全）、細菌、例えばボルデテラ・ペルツッシス（Bordetellapertus sis）または大腸菌（E.coli）または細菌由来物質、免疫刺激複合体(iscom)、油、サプロニン、オリゴペプチド、乳化パラフィン−Emulsigen^TM(MVP Labs,Ralst on,Nebraska)、AL(OH)₃含有L80アジュバント(Reheis,New Jersey)、Quil A(Supe rphos)、または当業者に公知の他のアジュバントが含まれる。好ましくは、該アジュバントはAL(OH)₃含有L80アジュバント（Reheis，NewJersey）およびQuil A （Superphos）である。該ワクチンは、レシピエントにおいてTbpAおよび／またはTbpBタンパク質の徐放を許容するリボソーム系中に導入することができる。また、該ワクチンは、アジ化ナトリウム、チメロサール、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ポリミキシンなどの保存剤を含有していてもよい。該ワクチンは、多価ワクチンであってもよく、さらに、パスツレラ・ヘモリチカのその他の免疫原、または他の疾患に関連した免疫原を予防的または治療的に有効な態様で含有していてもよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、パスツレラ・ヘモリチカロイコトキシンおよびTbpBよりなるものであってもよい。本発明のワクチンは、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内(intranatally) 、経口的などの簡便な方法で投与することができる。用量は、感染の性質、所望の効果および選択した投与経路、および当業者に公知の他の因子によって異なる。本発明はまた、TbpA、TbpB、TbpA関連タンパク質および／またはTbpB関連タンパク質をコードする本発明の核酸分子を含有する組換えウイルスベクターワクチンおよび組換え細菌ベクターワクチンの、パスツレラ・ヘモリチカ感染症の治療および／または予防のための使用を意図する。そのような系では、TbpAまたはTb pBタンパク質が、該ワクチン中の外因性核酸分子からレシピエント内でインビボで合成される。該組換えウイルスまたは細菌ベクターは、当該技術分野で公知の方法および本明細書中に記載の方法を用いて構築することができる。細菌系には、例えば、大腸菌（E.coli）およびサルモネラ（Salmonella）種が含まれる。以下の非制約的な実施例は、本発明を例示するものである。実施例実施例１以下の材料および方法を、本実施例で説明されている実験で用いた。＜材料および方法＞細菌株およびクローニングベクターＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ菌株は、グエルフ大学獣医微生物および免疫学（ＶＭＩ）学科（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＶＭＩ），ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｕｅｌｐｈ）のＰ．Ｓｈｅｗｅｎ博士より提供を受けたが、元来、カリフォルニア大学デイビス校（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｄａｖｉｓ）のＥ．Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎ博士、アイオワ州エイムズ（Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ）の米国農務省（ＵＳＤＡ）のＧ．Ｆｒａｎｋ博士、および、英国エジンバラ、モアダム研究所（ＭｏｒｅｄｕｍＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｕ．Ｋ．）のＷ．Ｄｏｎａｃｈｉｅから入手したものである。Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｉｓ菌株３７１４、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株ＣＭ５およびＳｈｏｐｅ４０７４は、ＶＭＩのＳ．Ｒｏｓｅｎｄａｌ博士によって提供された。大腸菌株ＨＢ１０１およびＴＧ−１は、グエルフ大学微生物学科（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｕｅｌｐｈ）のＲ．Ｌｏによって提供され、クローニング実験のための受容菌株として用いられた。大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）は、グエルフ大学微生物学科(ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｕｅｌｐｈ)のＣ．Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ博士によって提供された。Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ菌株およびＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株は、羊血寒天培地（ｓｈｅｅｐ'ｓｂｌｏｏｄａｇａｒ）上で維持し、脳−心臓輸液培地（ｂｒａｉｎｈｅａｒｔｉｎｆｕｓｉｏｎｂｒｏｔｈ）（ＢＨＩＢ）（ミシガン州デトロイトのディフコ・ラブズ社(ＤｉｆｉｃｏＬａｂｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ )）中で培養した。大腸菌株ＨＢ１０１は、組換えプラスミドを選択するために、１００ｍｇ／Ｌでアンピシリン（ミズーリ州セントルイスのシグマ化学社(ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ. ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ)）を添加したルリア−ベルタイニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｉｎｉ）・プラス・チミジン培地（ＬＴ）上で増殖させた。同様に、大腸菌ＴＧ−１およびＪＭ１０９（ＤＥ３）は、アンピシリン入りデイビス（Ｄａｖｉｓ）最小培地上で増殖させた。鉄キレート剤エチレンジアミン−ジ（ｏ−ヒドロキシフェニル酢）酸（ＥＤＤＡ）（シグマ社(Ｓｉｇｍａ)）を最終濃度１００μＭになるように加えて、鉄分欠乏培地を調製した。鉄分欠乏培地は、ＦｅＣｌ₃を１ｍＭ添加して調製した。プラスミドｐＢＲ３２２、バクテリオファージベクターＭ１３／ｍｐ１８およびＭ１３／ｍｐ１９は、以前に説明された通りに用いた(ＬｏａｎｄＣａｍｅｒｏｎ，１９８６；Ｌｏら，１９８７)。ｐブルースクリプトベクターは、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州ラホヤ (ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ)）から入手した。組換えクローン４８２は、カルガリ大学微生物学科（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ, ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｇａｒｙ）のＡ．Ｓｃｈｒｙｖｅｒｓ博士から提供された。酵素、化学薬品、および坑血清制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素は、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ (ＢＲＬ)） (オンタリオ州バーリントン(Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ))、またはファルマシア化学有限会社（ＰｈａｒｍａｃｉａＣｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）（ケベック州ドーバル (Ｄｏｒｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ)）から購入し、製造業者の説明するところに従って使用した。放射性同位元素は、アイ・シー・エヌ・バイオメディカル社（ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ）（ケベック州ドーバル (Ｄｏｒｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ)）またはアマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（オンタリオ州オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）から購入した。ヤギの坑ウサギ免疫グロブリンＧ−アルカリホスファターゼ結合体と免疫検出試薬は、バイオ−ラド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（オンタリオ州ミシソーガ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）から購入した。ヤギの坑ウシ免疫グロブリンＧ−アルカリホスファターゼ結合体は、ジャクソン・イムノリサーチ社（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）（ペンシルバニア州ウエストグローブ(ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ)）から購入した。ウサギ坑自己血清とウシ坑プレスポンス（Ｐｒｅｓｐｏｎｓｅ）坑血清は、グエルフ大学獣医微生物および免疫学科（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｕｅｌｐｈ）のＰ．Ｓｈｅｗｅｎ博士より入手した。ウサギの「坑自己」坑血清は、ウサギ自身の血清を添加したＲＰＭＩ１６４０中で培養したＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１の可溶性抗原に対して作製されたものである。ＲＰＭＩ１６４０が鉄分窮乏培地であることに留意することが重要である。ＤＮＡ手法ａ）染色体ＤＮＡの単離Ｍａｒｍｅｒ（１９６１）の方法に従って、細菌細胞から染色体ＤＮＡを単離した。細菌は、２５０ｍｌの適当な培地に植菌し、１５０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で一晩培養した。翌日、ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ５−Ｂ冷却遠心分離機（デュポン・インスツルメンツ社(ＤｕｐｏｎｔＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)、オンタリオ州ミシソーガ(Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ)）のＧＳＡローター中、４，０００ｘｇで１０分間遠心分離して、この細胞を沈殿させた。この沈殿物を、０．６Ｍソルビトール、０．０５ｍＭトリス塩酸(ｐＨ８．０)、０．０５ＭＥＤＴＡ溶液、８ｍｌに懸濁した。最終濃度が３ｍｇ／ｍｌになるようにリゾチーム（シグマ社(Ｓｉｇｍａ)）を加えてから、サンプルを３０分間氷上に置いた。溶解用溶液（０．５％ＳＤＳ、０．０５ＭＥＤＴＡ、０．０５ｍＭトリス塩酸(ｐＨ８．０)）２ｍｌと、３ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ（シグマ社(Ｓｉｇｍａ)）溶液をサンプルに加えてから、３７℃の温水中で、４時間インキュベートした後、５６℃ でインキュベートした。この懸濁液を、ＴＥ緩衝液（０．０５Ｍトリス塩酸(ｐＨ７．５)、０．００１ＭＥＤＴＡ）で飽和した等量のフェノール（ギブコ／ビー・アール・エル社(Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ)）で抽出し、３０〜５０ｒｐｍで４５分間振とうした。ＳＳ３４ローター中、５℃、１２，０００ｘｇで１０分間遠心分離してフェノール層と水層を分離した。先が広くなるように切ったパスツールピペットで上清を集め、２〜３倍量の氷冷９５％エタノールでＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ鎖をガラス棒に巻き取って、少量の０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣには、０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムが含まれている）に溶解させた。次に、ＲＮａｓｅの最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにして、ＤＮＡを処理し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮＡを、再び、２〜３倍量の氷冷９５％エタノールでＤＮＡを沈殿させ、ガラス棒に巻き取って、少量の１×ＳＳＣに溶解させた。サンプルは、４℃で保存した。ｂ）制限酵素消化およびライゲーションプラスミドベクターおよびバクテリオファージベクターは、製造業者の指示に従って、適当な制限酵素で消化した。ベクターと挿入ＤＮＡを混合して、最終容量を５μｌとし、０．５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションを行なった。ライゲーション混合液は、大腸菌に形質転換する前に、室温で３〜４時間インキュベートするか、１４℃で一晩インキュベートした。ｃ）大腸菌コンピテント・セルの調製形質転換を用いて、プラスミドＤＮＡおよびバクテリオファージＤＮＡを大腸菌に導入した(ＭａｎｄｅｌａｎｄＨｉｇａ，１９７０；ＬｅｄｅｒｂｅｒｇａｎｄＣｏｈｅｎら、１９７２)。形質転換させる大腸菌株は、ＬＴ培地中、３７℃、１５０ｒｐｍで振とうしながら一晩増殖させた。翌日、同じ培養液２０ｍｌに１／４０量の継代培養液を調製し、７５ｒｐｍで振とうさせながら、さらに６０分間、３７℃で増殖させた。細胞を、ＳＳ３４ローター中、３，０００ｘｇで遠心分離して集めて、１０ｍｌの滅菌氷冷５０ｍＭＣａＣｌ₂に懸濁した。この懸濁液を氷上で３０分間インキュベートしてから、細胞を遠心分離して集め、２ｍｌの滅菌氷冷５０ｍＭＣａＣｌ₂に懸濁した。このコンピテント・セルは、４℃で保存することができ、３日目まで使用することができた。形質転換には、０．２ｍｌのコンピテント・セルをＤＮＡサンプルと混ぜて、氷上で、３０分間インキュベートした。この細胞を４２℃で２分間ヒートショック処理した後、０．２ｍｌのＬＴ培地を加えた。この細胞を３７℃で１５分間インキュベートしてから、適当な抗生物質を含むＬＴ培地上に塗布し、３７℃で一晩培養した。ｄ）プラスミドの大量単離ＣｌｅｗｅｌｌａｎｄＨｅｌｉｎｓｋｉ（１９６９）の処理手順を修正した手順に従って、大量のプラスミド単離を行なった。プラスミドをもつ大腸菌を、アンピシリンを含むＬＴ培地、２５０ｍｌ中に植菌し、１５０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で一晩増殖させた。翌日、クロラムフェニコール（シグマ社(Ｓｉｇｍａ)）を、最終濃度２５ｍｇ／ｌになるように加えて、培養菌を、さらに４〜６時間増殖させた。ＧＳＡローター中、４，０００ｘｇで１０分間遠心分離して集菌した。この細胞沈殿物を、２５％スクロースと０．０５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．）を含む氷冷溶液４ｍｌに再懸濁した後、直前に調製したリゾチーム（シグマ社(Ｓｉｇｍａ)）溶液１ｍｌを加えた。この混合液を、３７℃の温水中で、３０分間インキュベートして、５分間氷上に置き、次に、２ｍｌの０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えた。さらに、氷上で５分間インキュベートした後、５ｍｌの溶解用溶液（０．０５Ｍトリス塩酸(ｐＨ８．０)、０．０６２５ＭＥＤＴＡ、および２％トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００）を加えた。この混合液を３７℃の温水中に戻して、細胞が完全に溶解するまで、５〜１５分間置いた。そして、この混合液を２７，０００ｘｇで３０分間遠心分離して、清澄になった溶解液をきれいな試験管に移し、この溶解液を固体ＣｓＣｌ（ベーリンガー・マンハイム社(ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ)、ケベック州ラバル(Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ)）が、全量４．５ｍｌで、１ｇ／ｍｌになるよう混合した。次に、４．５ｍｌのサンプルに、１００ μｌのエチジウム・ブロマイド(１０ｍｇ／ｍｌ)を加えた。遠心管を加熱密封して、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＶＴｉ６５垂直ローター中１５℃で、最低９時間、２４０，０００ｘｇで、サンプルを遠心分離した。遠心管の上部と下部に穴を開け、２本のバンドの下の方を集めて、プラスミドＤＮＡを回収した。サンプルからエチジウム・ブロマイドを抽出するために、プラスミドＤＮＡ溶液を、等量のＣｓ／Ｃｌ飽和ｎ−ブタノールと混合した。２層に分離するのを待ってから、ｎ−ブタノールを含む上層と、エチジウム・ブロマイドを除去した。この処理を３回繰り返した。エチジウム・ブロマイド抽出の後、下側の水層を透析してＣｓＣｌを除去した。カットオフ分子量１０ｋＤａの透析チューブ（フィッシャー社(Ｆｉｓｈｅｒ)）を、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムの中で、１５分間×２回煮沸し、０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で１５分間×１回煮沸して調製し、５０％エタノールおよび１ｍＭＥＤＴＡの中で４℃で保存した。透析の前に、チューブはｄＨ₂Ｏで濯いでから、プラスミドＤＮＡ溶液を充填した。ＤＮＡを４×１Ｌの透析緩衝液（０．０１Ｍトリス塩酸（４℃でｐＨ７．５）、０．００１ＭＥＤＴＡ）の中で、２４時間、４℃で透析した。このサンプルは、−２０℃で保存した。あるいは、少量のプラスミド調製のためには、ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ケベック州ケベック・シティー（ＱｕｅｂｅｃＣｉｔｙ，Ｑｕｅｂｅｃ）のフレキシ−プレップ（Ｆｌｅｘｉ−ｐｒｅｐ）キットを用いた。この方法には、ＲＮａｓｅ処理とイソプロパノール沈殿を含む、標準的なアルカリ細胞溶解が含まれる(ＢｉｒｎｂｏｉｍａｎｄＤｏｌｙ，１９７９；ＩｓｃｈＨｏｒｗｉｃｚａｎｄＢｕｒｋｅ，１９８１)。プラスミドＤＮＡは、塩酸グアニジン中で、珪酸基質（商標セファグラスＦＰ（ＳｈｅｐｈａｇｌａｓＦＰ^TM）を用いて精製濃縮した。ｅ）ランダムプライミングによる、ＤＮＡプローブの放射性標識ギブコ／ビー・アール・エル社（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）のランダムプライマーＤＮＡ標識システムを用いて、［α−³²Ｐ］ｄＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，アイ・シー・エヌ社(ＩＣＮ)）で、ＤＮＡ断片を標識した。この標識システムは、ＦｅｉｎｂｅｒｇとＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９８３）の方法に基づき、修正したものである(ＦｅｉｎｂｅｒｇとＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９８４)。このサンプル（１０μｌのＨ₂Ｏ中２５ｎｇの)ＤＮＡ）は、５分間煮沸して変性した後、直ちに氷上で冷却した。氷上で、次の試薬を加えた。ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを各２μｌ、ランダムプライマー緩衝液を１５ μｌ、［α−³²Ｐ］ｄＡＴＰを４μｌ、Ｈ₂Ｏを加えて４９μｌにした。サンプルを手早く混合してから、クレノウ断片を３ユニット加えた。この反応混合液を２５℃で１時間インキュベートしてから、５μｌの停止緩衝液を加えて反応を終結させた。ミニ・セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０カラムによるゲル濾過によって、放射標識されたＤＮＡを、取り込まれなかった放射性標識ヌクレオチドから分離した。カラムは、ガラスウールを詰めたパスツールピペットの中で調製し、放射性標識したサンプルを加える前にＴＥ緩衝液で平衡化した。カラムを通過するＤＮＡの動きは、ガイガーカウンター（ミニ・インスツルメンツ有限会社（Ｍｉｎｉ−ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ．）英国エセックス州(Ｅｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ)）を用いて測定した。放射活性の最初のピークは、標識ＤＮＡに対応していたが、２番目のピークは取り込まれなかった放射性標識［³² Ｐ］ｄＡＴＰに対応していた。ＤＮＡプローブは、ハイブリダイゼーション用溶液に入れる前に、５分間煮沸して変性させた。ｆ）アガロースゲル電気泳動とサザンハイブリダイゼーションアガロースゲルは、電気泳動用アガロース粉末（標準または低融点；(シグマ社(Ｓｉｇｍａ)))にＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス[ｐＨ７．９]、１ｍＭＥＤＴＡ）を加えて、最終濃度が０．７％から１％になるよう調製した。アガロースゲルは、水平平板ゲル装置（タイラー・リサーチ社(ＴｙｌｅｒＲｅｓｅａｃｈ)、アルバータ州エドモントン(Ｅｄｏｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ)）で電気泳動した。ＤＮＡサンプルを、１／２量のトラッキング・ダイ（５０％グリセロール、０．１％ラダー(ギブコ／ビー・アール・エル社(Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ))）と混合するか、ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化したラムダＤＮＡ(ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ)）を分子量マーカーとして用いた。１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを添加したＴＡＥ泳動用緩衝液を用いた。サンプルは、まず、１００Ｖで５分間電気泳動した後、一晩中電気泳動するために、電圧を１０〜１２Ｖに減らした。電気泳動後、サンプルを中度紫外線トランスイルミネーターで見て、ポラロイド（Ｐｏｌａｒｏｉｄ）５７型白黒フィルムを用いて写真を撮った( Ｓｈａｒｐら、１９７３；Ｈａｙｗａｒｄ，１９７２)。サザンハイブリダイゼーションでは、アガロースゲルを０．２５ＭＨＣｌに１５分間浸けて、ＤＮＡを脱プリン化した。このゲルを、０．５ＭＮａＯＨと１．５ＭＮａＣｌからなるアルカリ溶液に１５分間移し入れ、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ (ｐＨ７．５)、１．５ＭＮａＣｌ溶液の中で３０分間中和させた。ヤミドライ式ブロッティング装置（タイラー・リサーチ社(ＴｙｌｅｒＲｅｓｅａｃｈ)）において、１５０ｍＭの定常電流で３０分間、２× ＳＳＰＥ緩衝液（３．６ＭＮａＣｌ，０．２ＭＮａ₂ＰＯ₄ [ｐＨ７．０]，０．０２ＭＮａ₂ＥＤＴＡ，０Ｏ．１６ＭＮａＯＨ）の中で、ＤＮＡを電気泳動によって移動させて、ニトロセルロース膜（スライヒャー・アンド・シュエル社（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｈｕｅｌｌ）、オンタリオ州ウイローデール(Ｗｉｌｌｏｗｄａｌｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ)）に転移させた (Ｗａｈｌら、１９７９；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５)。電気泳動で転移させた後、２×ＳＳＰＥ緩衝液でニトロセルロース膜を１０分間洗ってから、ＵＶクロスリンカー（ストララジーン社(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ) ）によって、ＤＮＡをクロスリンクさせた。０．１％グリシン、５×ＢＦＰ(１００×ＢＦＰには、２％ｗ／ｖウシ血清アルブミン、フィコール、およびポリビニルピロリジン−４０が含まれている)、５×ＳＳＰＥ緩衝液、および、超音波破砕し、煮沸したサケ精子キャリアーＤＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌの中に、２５％（低緊密）または５０％（高緊密）ホルムアミド（ギブコ／ビー・アール・エル社(Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ)）を含む溶液が入った密封プラスチックバッグの中で、この膜をプレ・ハイブリダイズさせた。この密封バッグを、４２℃の振とう温水槽の中に置いて、少なくとも１時間、膜をプレ・ハイブリダイズさせた。次に、プレ・ハイブリダイズ用緩衝液を捨てて、煮沸した放射性標識ＤＮＡプローブを含むハイブリダイズ用緩衝液（１０％デキストラン硫酸、５×ＳＳＰＥ、５× ＢＦＰ、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌキャリアーＤＮＡ、および、２５％または５０％ホルムアミド）に置換した。このバッグを、４２℃の振とう温水槽の中に置いて、膜を一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、プラスチックバッグからニトロセルロース膜を取り出して、４２℃の振とう温水槽の中で、高緊密洗浄用緩衝液（５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ）または低緊密洗浄用緩衝液（２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ）のどちちらかで、４×１０分間洗浄した。膜を風乾して、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙の上に置き、プラスチックラップで覆ってから、−２０℃で１０４日間、望ましい露光が得られるまで、Ｘ線フィルム（クロネックス社(Ｃｒｏｎｅｘ)、デラウエア州ウィリングミントン（Ｗｉｌｌｉｎｇｍｉｎｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）に感光させた。露光時間は、放射活性シグナルの強度を、ガイガーカウンターを用いて測定して決定した。オートラジオグラフィーは、コダック(Ｋｏｄａｋ)ＧＢＸ高速現像液(イーストマンコダック社(ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ)、ニューヨーク州ロチェスター(Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ)）の中で２分間現像した。フィルムを２．５％酢酸に１分間浸して、現像反応を停止させ、コダック（Ｋｏｄａｋ）固定液（イーストマンコダック社(ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ)）の中で２分間固定させた。ｇ）サザンコロニーブロットＬＴ＋アンピシリン培地で増殖させた細菌コロニーのマスター・テンプレートを、３７℃で一晩培養した。マスター・プレート上のコロニーを、ＬＴ＋アンピシリン培地の上に載せ、３７℃で２〜３時間増殖させて、ニトロセルロース膜上にコピーした。次に、この膜を、０．５ＭＭａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ溶液に浸したワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙の上に置き、細胞を溶解させるために、室温（ＲＴ）で５分間置いた。そして、ニトロセルロース膜を、０．５Ｍトリス塩酸(ｐＨ７．５)、１．５ＭＮａＣｌ溶液に浸したワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙の上に置き、室温（ＲＴ）に５分間置いて、膜を中和させた。この膜を、９５％エタノールに浸したワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙の上に移し、ＤＮＡを沈殿させるために、９５％エタノールを吹き掛けた。膜上のＤＮＡを、ＵＶクロスリンカー（ストララジーン社(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)）でクロスリンクさせてから、上述したように、プレ・ハイブリダイズとハイブリダイズを行なった。ｈ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）デオキシヌクレオチド三リン酸、ＭｇＣｌ₂、反応用緩衝液、およびアンプリータック（Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー・シータス(Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ)）が入った、パーキン−エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）ＰＣＲコア試薬キットを用いて、パーキン−エルマー・シータス４８０ＤＮＡサーマル・サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ４８０ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ）に入れた、５００μｌの遠心用薄壁チューブの中で、ＰＣＲ反応を行なった。Ｓａｉｋｉら（１９８８）の方法をパーキン−エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）が修正した方法に従って、増幅反応を行なった。１×反応緩衝液(０．５ＭＫＣｌ，０．１Ｍトリス塩酸[ｐＨ９．０])、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭプライマー、５μｇの鋳型、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、および、２．５ユニットのアンプリ− タック（Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑ）酵素を含む１００μｌの混合液の中で、ＰＣＲ反応を行なった。この反応液を９５℃で２分間加熱して、鋳型ＤＮＡを変性させた。そして、変性、アニーリング、および伸長を３０回繰り返した後、それぞれ、９５℃（１分間）、５２℃（１分間）、および７２℃（２分間）という温度と時間で処理した。温度間の遷移は、使用可能なうちで最も速いもの（ランプ時間０．０１秒）を用いた。鋳型ＤＮＡを含まない陰性対照が、各ＰＣＲ実験に含まれていた。増幅させた後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって調べた。低融点アガロースゲルを用いた電気泳動によって分離した後、望ましいＤＮＡ断片を切り出すことによって、ＰＣＲ産物を精製した。このＤＮＡ産物は、ガラスビーズ基質精製キット（ジーンクリーン(ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ)）を用いて、アガロースから精製した。ｉ）アガロースゲルからのＤＮＡ断片精製ＤＮＡ断片は、バイオ／カン・サイエンティフィック社（Ｂｉｏ／ＣａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（オンタリオ州ミシソーガ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）から入手したジーンクリーン・キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ）を用いて、アガロースから精製した。ジーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ）による精製処理は、ＶｏｌｇｅｌｓｔｅｉｎとＧｉｌｌｅｓｐｉｅ（１９７９）による処理手順に基づいている。断片を含むゲル切片を、剃刀の刃を用いてゲルから切り出し、１．５ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心チューブに入れた。等量のＮａｌ保存溶液を加えて、５５℃の温水槽の中で５分間、アガロースが完全に融解するまでインキュベートした。５μｇ以下のＤＮＡに対して、容量５μｌのガラスミルク（ＧＬＡＳＳＭＩＬＫ）（バイオ／カン・サイエンティフィック社(Ｂｉｏ／ＣａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)）をサンプルに加え、混合液を氷上で５分間インキュベートした。そして、１６，０００×ｇで１０秒間遠心して、珪酸基質を集めて、６００μｌのニュー（ＮＥＷ）洗浄用緩衝液（バイオ／カン・サイエンティフィック社(Ｂｉｏ／ＣａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)）に再懸濁した。沈殿物は、ニュー（ＮＥＷ）洗浄用緩衝液で、全部で３回洗浄した。最後の洗浄の後、珪酸基質を１０μ ｌのＴＥ緩衝液に再懸濁して、５５℃で５分間インキュベートした。そして、サンプルを遠心分離し、珪酸基質の沈殿を回避しながらＴＥを回収した。サンプルは、−２０℃で保存した。ｊ）ＤＮＡのジデオキシ・シークエンシング製造業者によって説明されたところに従って、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＴ７−シークエンシング・キットを用いて、ＭＰ１３ｍｐ１８／ｍｐ１９バクテリオファージベクター（一本鎖シークエンシング）にクローニングによるか、または、組換えプラスミドから直接（二本鎖シークエンシング）ＤＮＡ断片を配列決定した。ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＴ７−シークエンシング・キットの処理手順は、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）によって概述された方法に基づいている。一本鎖シークエンシングでは、ＤＮＡ断片を、ＭＰ１３ｍｐ１８／ｍｐ１９バクテリオファージベクターにクローニングして、コンピテント大腸菌ＴＧ−１セルの中に形質転換させた。組換えファージ「プラーク」で、β−ガラクトシダーゼ産物ができないために白く見えるものを選抜した。デイビス（Ｄａｖｉｓ）最小培地で増殖させた大腸菌ＴＧ−１の一晩培養液を０．１ｍｌ植菌し、７５ｒｐｍで振とうさせながら、３７℃で４〜５時間インキュベートした１０ｍｌのＬＴ培地に各プラークを接種した。大腸菌細胞を除去するために、サンプルを１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。２０％ポリエチレングリコール（８，０００ＭＷ；シグマ社(Ｓｉｇｍａ)）と２．５ＭＮａＣｌの１／４量を加えて、培養上清からファージを沈殿させて、３０分間氷上でインキュベートした。１２，０００×ｇで１０分間遠心して、沈殿したファージを回収した。そして、この沈殿物は、０．６ｍｌのファージ緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸[ｐＨ８．０], ０．００１ＭＥＤＴＡ，０．３ＭＮａＣｌ）に再懸濁した。ＴＥ緩衝液で飽和させたフェノール（ギブコ／ビー・アール・エル社(Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ)）０．５ｍｌで、ファージＤＮＡを抽出した。１４，０００× ｇで１０分間遠心して、フェノール層と水層を分離させた。１：１フェノール：クロロフォルムと、最終的には、クロロフォルムで、水層を抽出した。次に、ファージＤＮＡを１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）と２倍容量の氷冷９５％エタノールで沈殿させ、−２０℃で一晩インキュベートした。１４，０００×ｇで１０分間遠心して、沈殿したＤＮＡを集めた。１：１フェノール：クロロフオルムと、最終的には、クロロフォルムで、水層を抽出した。次に、ファージＤＮＡを１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）と２倍容量の氷冷９５％エタノールで沈殿させ、−２０℃で一晩インキュベートした。４℃微量遠心機中、１４，０００×ｇで１０分間遠心して、沈殿したＤＮＡを集めた。沈殿物を風乾して、５０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁して、シークエンシングに用いた。ＤＮＡは、アニーリング用緩衝液（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＴ７−シークエンシング・キット）の中で、ユニバーサルＭ１３プライマー、または特異的プライマーのいずれかと、６５℃で１０分間アニールさせてから、シークエンシング反応前１０分間は室温に置いた。二本鎖シークエンシングでは、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＴ７− シークエンシング・キットのプロトコールで略述されている手順を修正したものを用いて、プラスミドの鋳型を調製した。プラスミドＤＮＡを、１．５〜２．０ μｇ／３２μｌになるよう調整し、１２μｌの２ＭＮａＯＨを加えて１分間変性した。１１μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を加えて変性を終了させた。７μｌのｄＨ₂Ｏと、１２０μｌの氷冷無水エタノールでＤＮＡを沈殿させ、−２０℃で一晩インキュベートした。４℃微量遠心機中、１４，０００×ｇで１０分間遠心して、沈殿したＤＮＡを集めた。沈殿を１００μｌの氷冷７０％エタノールで洗浄し、遠心して、真空下で乾燥させた。サンプルを５μｌのｄＨ₂Ｏに再懸濁し、５μｌのプライマーと２μｌのアニーリング緩衝液とを混合した。この混合液は、シークエンシングの前に、６５℃で５分問、３７℃で１０分間、さらに、ＲＴで５分間インキュベートした。シークエンシング反応には、［³²Ｐ］ｄＡＴＰ、または［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰ（特異的活性は３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）のいずれかを用いた。短時間でオートラジオグラフィーを感光させるときには、［³²Ｐ］ｄＡＴＰを用いた。解像度をよくしたいときには、［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰを用いた。アプライド・バイオシステムズ・インターナショナル３９１ＰＣＲ−メイト（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ３９１ＰＣＲ-Ｍａｔｅ）ＤＮＡ合成機でオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、製造業者の指示に従って精製した。プライマーは、使用前に、２６０ｎｍの光学的濃度を測定して定量した。［³²Ｐ］ｄＡＴＰシークエンシングでは、シークエンシング・ゲルは、１８ｇの尿素（アイ・シー・エヌ社（ＩＣＮ）ケベック州モントリオール (Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ））、３.７５ｍｌの１０×ＴＢＥ緩衝液（１Ｍトリス［ｐＨ８．３］ , ０．０２ＭＥＤＴＡ，０．８６５Ｍホウ酸)、および７．５ｍｌの４０％アクリルアミド（１９：１の割合のアクリルアミド：ビスアクリルアミド、バイオ−ラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））をｄＨ２０で３８ｍｌまでにしたものからできていた。この溶液を、尿素が溶けるまで撹拌して溶解してから、重合させるために、０．２３ｍｌの１０％過硫酸アンモニウム（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））と１０μｌのＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ'Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン；シグマ社（Ｓｉｇｍａ））（最終濃度０．０１％）を加えた。［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰシークエンシングでは、シークエンシング・ゲルは、１６．８ｇの尿素（アイ・シー・エヌ社（ＩＣＮ））、４．８ｍｌの１０×ＴＢＥ緩衝液、および４ｍｌの改変アクリルアミド溶液(「ロング・レンジャー」( ＬｏｎｇＲａｎｇｅｒ)、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州フィリップスバーグ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）からできていた。この溶液を、ｄＨ２０で４０ｍｌにし、２００μｌの過硫酸アンモニウム（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））と２０μｌのＴＥＭＥＤ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を加えて重合させた。泳動用緩衝液は、１×ＴＢＥからなっていた。シークエンシング・ゲルは、４０Ｗ／ゲルの定常電圧で２〜６時間泳動した。［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰシークエンシング・ゲルを１枚のワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙の上に移し、真空下、８０℃で４５分間乾燥させた。どちらのタイプのシークエンシング・ゲルも、−２０℃で１８〜４８時間、クロネックス４Ｘ線フィルム（クロネックス社（Ｃｒｏｎｅｘ））に感光させた。ＩＶ．タンパク質の方法ａ）内膜および外膜の単離ＨａｎｃｏｃｋとＣａｒｅｙ（１９７９）の方法を修正した方法（Ｌｏら、１９９１）によって、大腸菌およびＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１から、内膜および外膜調製物を調製した。細菌は、２５０ｍｌの適当な培地の中で、３７℃で一晩培養した。細胞は、４，０００ｘｇで遠心分離して、０．０１Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）で２回洗浄してから、２０％スクロース、０．０１Ｍトリス塩酸(ｐＨ６．８)、リゾチーム(１ｍｇ／ｍｌ)、ＤＮａｓｅ (５０ μｇ／ｍｌ)、およびＲＮａｓｅ（１００ μｇ／ｍｌ）を含むスクロース−トリス氷冷溶液、７．５ｍｌに再懸濁させた。この細胞を、フレンチプレスによって、４℃、１６，０００〜１８，０００ｐｓｉで３回破砕した。そして、サンプルを１，０８５×ｇで５分間遠心して、破砕されなかった細胞を除去した。この上清を、１４ｍｌの７０％と５２％のスクロースからできていて、５ｍｌのサンプル溶解液と、４〜５ｍｌの１２％スクロースを重ねた、７０：５２％：サンプル：１２％スクロース勾配の上に載せた。この勾配を、スゥイングバケット・ローターの中で、８，０００×ｇで、１６〜１８時間、４℃で遠心分離した。アスピレーションによって、内膜画分および外膜画分を集めた。内膜画分は、１２％スクロースと５２％スクロース領域の間に位置し、黄色っぼい茶色をしていた。外膜画分は、白かったが、７０％スクロース領域近くに位置していた。集められた画分は、遠心用チューブの中に入れて、ｄＨ₂Ｏで上部まで満たし、角度を固定のＴｉ８０ローター中、２２５，０００×ｇで、１時間、４℃で遠心分離した。そして、沈殿物を風乾して、トリス塩酸(ｐＨ６．８)、０．０１Ｍジチオスレイトール緩衝液に再懸濁した。サンプルは、−２０℃で保存した。ｂ）タンパク質濃度のブラッドフォード法による測定内膜画分および外膜画分のタンパク質濃度を、ブラッドフォード法用いて測定した(１９７６)。各膜画分の希釈液を調製し、最終サンプル容量が０．８ｍｌになるよう、ｄＨ₂Ｏを加えた。そして、サンプルを、０．２ｍｌのブラッドフオード試薬(バイオラド社 (Ｂｉｏｒａｄ)、オンタリオ州ミシソーガ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ））と混合し、室温で５分間インキュベートして発色させた。分光光度計における５９５ｎｍの波長のところでの、各サンプルの光学濃度（ＯＤ）を測定した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を１〜２５μｇの範囲で用いて、標準曲線をプロットした。各サンプルのタンパク質濃度は、ＢＳＡの標準曲線から推定した。ｃ）ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動４％（Ｗ／Ｖ）スタッキングゲル、および７．５％（Ｗ／Ｖ）分離用ゲルとを用いた、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ− ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｌｌｉ，１９７０）を用いてタンパク質を分析した。ゲルは、０．１％過硫酸アンモニウム、およびＴＥＭＥＤを０．０１％加えて重合させた。等量の２×サンプル緩衝液を加えて、１００℃で５分間加熱して、サンプルを可溶化させた。高分子量標準液も煮沸してゲルに流した。不連続緩衝液システム（０．１９２Ｍグリシン、０．０２Ｍトリス塩酸[ｐＨ８．４]、０．１％ＳＤＳ）を用いた。ゲルは、サンプルが分離用ゲルに入るまで、１００Ｖで泳動し、その後、１５０Ｖの上昇させた。染色液の先がゲルの下部を通り抜けるまで、サンプルを泳動した。スタッキングケルを除き、分離用ゲルは、クーマシー・ブリリアント・ブルーで染色するか、ウエスタンブロッティングのために、電気泳動によってニトロセルロースに移し取った。ゲルは、クーマシー・ブリリアント・ブルーＲ２５０（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅＲ２５０）（４０％メタノール、１０％酢酸中０．０５％）（イーストマン・コダック社（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ））で一晩染色してから、メタノール：酢酸溶液で脱染した。ｄ）ウエスタン免疫ブロッティングＢｅｒｎｅｔｔｅ（１９８１）の方法にしたがって、アクリルアミドゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移した。このゲルをブロッティング用緩衝液（０．１９２Ｍグリシン、０．０２５Ｍトリス塩酸［ｐＨ８．４］、２０％メタノール）に１０分間浸漬して、ＳＤＳを除去した。ゲルの大きさに合わせて切ったニトロセルロース膜（スライヒャー・アンド・シュエル社(ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｈｕｅｌｌ)、オンタリオ州ウイローデール（Ｗｉｌｌｏｗｄａｌｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ））も１枚、ブロッティング用緩衝液に浸漬した。バイオーラド・トランスブロット（Ｂｉｏ−ＲａｄＴｒａｎｂｌｏｔ）装置の中で、４５０ｍＡで、３時間、タンパク質をニトロセルロース膜に移動させた。過熱とブロッティング用緩衝液の分解を避けるため、水冷装置を用いた。電気泳動による移動後、ニトロセルロース膜を３％ゼラチン入りのＴＴＢＳ緩衝液（０．０２Ｍトリス塩酸［ｐＨ７．５］、０．５ＭＮａＣｌ、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ−２０））に３０分間浸漬して、膜をブロックした。このニトロセルロース膜を、１／５００希釈の一次抗体入りの１％ゼラチン液の中に移し、室温下、緩慢に振とうしながら、一晩インキュベートした。そして、ＴＴＢＳ緩衝液で、この膜を２回洗浄（各洗浄１５分）して、二次抗体溶液（１／２０００希釈）の中に１時間置いた。二次抗体は、ヤギの抗ウサギ、またはヤギの抗ウシＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結合体（バイオーラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を１％ゼラチンに入れたものである。この膜は、ＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄（各洗浄１５分）してから、ＮＢＴ緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸［ｐＨ９．５]、０．１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ₂）で２回洗浄（各洗浄５分）した。次に、この膜を、試薬５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ（ＢＣＩＰ、ジメチルホルムアミド中２５ｍｇ／ｍｌ、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））、およびニトロ−ブルー−テトラゾリウム（ＮＢＴ、７０％ジメチルホルムアミド中、５０ｍｇ／ｍｌ；シグマ社（Ｓｉｇｍａ））、各１００μｌからなる発色用溶液の中に置いた。バンドが望ましい見え方をするまで発色を進行させた。水の中で濯いで、発色反応を停止させた。膜は風乾させた。ｅ）Ｔ７タンパク質発現ＴａｂｏｒとＲｉｃｈａｒｄｓｏｎの方法（１９８５）を用いて、組換えプラスミドにコードされているタンパク質を解析した。プラスミドベクターのピー・ブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）の中に、ｔｂｐＡ遺伝子をクローニングした。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を染色体の中に取り込んで、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子をｌａｃプロモーターの制御下に置いた大腸菌ＪＭ１０９の菌株である(Ｙａｎｉｎｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５)、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）の中に組換えプラスミドを形質転換した。形質転換後、０．１％カザミノ酸、０．４％グルコース、および適当な抗生物質を含むデイビスの最少培地中３７℃で、細胞を一晩増殖させた。５０分の１の継代培養液を、２０ｍｌの同じ培地に入れて調製し、さらに、３〜４時間、ＯＤ₅₅₀＝０．６になるまで、３７℃でインキュベートした。１４，０００× ｇで５分間遠心分離して細胞を集め、０．４％グルコースを含む、デイビスの最少培地に再懸濁した。このサンプルを、３７℃で９０分間インキュベートしてから、１００μｌの５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えた。３７℃で２０分間、細胞をインキュベートした後、リファンピシン（最終濃度４００μｇ／ｍｌ）を加えた。サンプルを３７℃で３０分間インキュベートした後、５μＣｉ［³⁵Ｓ］−メチオニン(「トランスラベル(ＴｒａｎｓＬａｂｅｌ)」、アイ・シー・エヌ・バイオメディカル社(ＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ)、ケベック州）で６０分間標識した。この細胞を氷令したＰＢＳで２回洗浄してから、微量遠心機で１４，０００× ｇで５分間遠心分離して細胞を集めた。沈殿物を、２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で再懸濁した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてタンパク質を分離し、クーマシー・ブルーＲ２５０でゲルを染色した。そして、このゲルを商標登録アンプリファイ（Ａｍｐｌｉｆｙ^TM）（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、オンタリオ州オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ））に３０分間浸漬して、真空下で乾燥させた。オートラジオグラフは、１８〜４８時間感光させた。＜結果＞Ｉ．推定ｔｂｐＡ、ｔｂｐＢ遺伝子の予備クローニングｔｂｐＡ遺伝子をクローニングするときの第一段階は、ポリメラーゼ連鎖反応によりＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることであった。Ｔｂｐ１タンパク質のＮ末端アミノ酸配列に対して特異的なオリゴプライマーが合成された。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１コドン表（Ｌｏ、１９９２年）は、プライマー配列を最適化するのに使用された。Ｔｂｐ１プライマーは、クローニングベクターｐＢＲ３２２の分岐配列に基づくプライマーと接合して使用された(表１)。０．８ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られ（図１）、そしてＭ１３ベクターにクローン化され、そしてシーケンスにかけた。このＰＣＲ産物の配列分析は、第一の２０アミノ酸がＴｂｐ１のＮ末端アミノ酸シーケンシングによって得られる配列に一致することを示した。表１ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドプライマーその後、０．８ｋｂＰＣＲ産物を放射性標識し、そしてサザン・ハイブリダイゼーションにより、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１遺伝子ライブラリーを含む大腸菌クローンをスクリーニングする特異的プローブとして使用された。２つの組換えクローン９および１０は、ｔｂｐＡプローブで強力にハイブリダイズされた。各組換えクローンから得られるプラスミドＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼマッピングによって分析された(図２)。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１を挿入すると、プラスミド９および１０についてはそれぞれ、およそ８．７ｋｂおよび２．３ｋｂであると測定された。プラスミドの当初の配列分析は、両方のプラスミドから得られた挿入ＤＮＡが重なり領域を共有することを確認した。プラスミド９は、全ｔｂｐＡ遺伝子を含有したが、ｔｂｐＡの直接的上流にある領域は、プラスミド１０中の上流領域とは異なった。プラスミド９中の挿入ＤＮＡは、ゲノムの分離領域から得られる２つのＤＮＡ断片から形成されることは可能である。プラスミド１０中で、ｔｂｐＡの直接的上流領域は、ｔｂｐＢ遺伝子に対応する新たな開放読取り枠を含んだ。したがって、このプラスミドは、ｔｂｐＡ遺伝子から直接的上流にｔｂｐＡの５’領域のみならず、ｔｂｐＢ遺伝子の一部も包含した。第三の組換えクローン、４８２は、全ｔｂｐＢ遺伝子を含んだ。このプラスミドは、プラスミド１０と重なり領域を共有する(図２)。プラスミド４８２中の挿入ＤＮＡは、Ｔｂｐ２タンパク質のアミノ酸配列に特異的なプライマーを使用して、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１ゲノムＤＮＡから得られたＰＣＲ産物である。その後、このＰＣＲ産物は、ベクターＰＣＲＩＩにクローン化された。３．０ｋｂｐｔｂｐＡ遺伝子は、（ＢｇＩＩＩ部位から出発して）プラスミド９からシーケンシングされた。２．１ｋｂｐのｔｂｐＢ遺伝子およびｔｂｐＡとｔｂｐＢの間の９１ｂｐ配列が、プラスミド４８２および１０からシーケンシングされた。ＩＩ．配列分析５．２ｋｂｐのＤＮＡは、シーケンシングされ、そしてｔｂｐのｔｂｐＢ上流に前後して配置された２つの開放読取り枠を含むことが示された(図３)。この遺伝子機構は、その遺伝子がしばしばオペロンに配置する他の細菌中の他の鉄摂取系と一致する(Ｐａｙｎｅ、１９８８年)。演繹的に推定されたＴｂｐ１タンパク質の配列解析によって、推定２８アミノ酸リーダーペプチドが観察された。脂質タンパク質についての推定切断配列が、演繹的に推定されたＴｂｐ２タンパク質で観察された。ｔｂｐＡおよびｔｂｐＢの近傍接近およびｔｂｐＡ中のプロモーター領域の不在は、その２つのタンパク質が共同して発現できることを示唆する。ｔｂｐＢのプロモーター領域中のＦｕｒコンセンサス配列は、それらのタンパク質がＦｕｒ様手段で制限されうることを示唆する。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａｔｂｐＢ中のＦｕｒコンセンサス配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびエヌ．メニンジチジス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｔｂｐＢで見られるコンセンサス配列に類似する(図４)。Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２の等電点は、ＰＣＧｅｎｅ（チャージプロ（Ｃｈａｒｇｐｒｏ））によって、それぞれ９．１６および９．７１と計算され、それらは塩基性タンパク質になった。ＩＩＩ．予測タンパク質トポロジー配列分析プログラム・ジーンランナー（ＧｅｎｅＲｕｎｎｅｒ）（ハスティングズ・ソフトウエア（ＨａｓｔｉｎｇｓＳｏｆｔｗａｒｅ））が、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１およびＴｂｐ２タンパク質の物理的特性を分析し、そして二次構造を予測するのに使用された。Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２のハイドロプロパシープロットは、ケイト（Ｋｙｔｅ）およびドーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）の方法を用いて作製された(１９８２年)。Ｔｂｐ１の第一の２８アミノ酸は、疎水性領域を形成し、それは全てシグナル配列の特徴を示す。そのタンパク質には、６つの他の疎水性領域があり、そしてそれはタンパク質の膜内外（膜貫通）ドメインでありうる。そのタンパク質の疎水性領域は、細胞表面に、または周縁質に露出しうる。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのハイドロプロパシープロットも作製された。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ１タンパク質は、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１より疎水性が低いが、いくつかの疎水性領域の位置は、類似であると思われる。例えば、両方のタンパク質は、２００、４００および７８０のアミノ酸残基の周りに疎水領域を有する。疎水領域での類似性は、その２つのタンパク質がかなりの程度の相同性を共有し、類似の構造を有しうることを示唆する。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ２のケイト−ドーリトル・プロットは、タンパク質の中心でいくつかの大きな疎水性領域と、両端で２つの類似の親水性領域を明らかにする。これは、２つのタンパク質が異なる構造を有しうることを示唆するＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのハイドロプロパシープロットより相当に異なっている。Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２の表面露出領域は、エミニの表面可能性方法（Ｅｍｉｎｉｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｂａｂｌｉｌｉｔｙｍｅｔｈｏｄ）（Ｅｎｉｎｉら、１９８５年）を用いて測定された。グラフでのピークは、露出される可能性が最大である領域に対応する。各タンパク質の表面露出領域は、リガンド結合に関与し得、そして抗原性でありうる。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１のエミニのプロットは、そのタンパク質のアミノ酸３３０、４１０、４６０、５６０、６１０および８２０に近い親水性領域が細胞表面に露出していてもよいことを示唆する。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ１のエミニのプロットは、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１と２、３の共通露出領域を示した(３３０、５８０、８１０の領域で)。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ２のエミニのプロットは、アミノ酸１４０、１６０および６２０の親水性領域が、露出される可能性が最も高いことを示唆する。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ２のエミニのプロットは、１６０、３３０の露出領域のみがＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ２の表面領域に類似することを示す。Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２の両方の二次構造は、チュー−ファスマン（Ｃｈｏｕ −Ｆａｓｍａｎ）の方法（１９７８年）を用いて予測された。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１のチュー−ファスマン・プロットは、そのタンパク質が一次のβシートおよびβ回転構造であることを予測する。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ１のチュー−ファスマンのプロットは、類似の構造を予測する。これらの推定は、他の鉄が制御された外側の膜タンパク質のその他のトポロジー予測と一致し、そのタンパク質も両親媒性βシートを包含する(Ｍｏｅｃｋら、１９９４年)。βシートの位置が２つのＴｂｐ１ケイト−ドーリトルグラフの疎水性ドメインの位置に対応することに注目するのも興味深い。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ２のチュー−ファスマンのプロットは、一次のβシートおよびβ回転を含むことも示す。βシートの予測パターンは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ２と異なり、βシート領域も有する。これらの結果は、Ｔｂｐ２タンパク質が異なる構造を示す証拠にも加える。ＩＶ．Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａおよび関連種のｔｂｐＡの分配サザン・ハイブリダイゼーション分析は、全ての１６のセロタイプのＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａがＴｂｐ１タンパク質についての遺伝子を担持するかどうかを決定するために行われた。各セロタイプから得られた染色体ＤＮＡは、制限エンドヌクレオチドで消化され、そしてＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１から得られるｔｙｐＡ遺伝子の５’末端でプローブされた。同様のハイブリダイゼーション実験が、エイ．プレウロニューモニアエ（Ａ．ｐｌｅｕｒｏｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＣＭ％およびショップ４０７４およびエイ．スイス（Ａ．ｓｕｉｓ）３７１４から得られる消化染色体ＤＮＡで行われた。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１ｔｂｐＡプローブを用いた高緊縮サザン・ハイブリダイゼーション（５０％ホルムアミド）は、全１６のセロタイプのＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｌｃａにｔｂｐＡ相同性配列の存在を示した(図５、６)。さらに、ＡおよびＴバイオタイプの間のプローブでハイブリダイズされた断片のサイズで相当な差異がある。図５で、サザン・ハイブリダイゼーションで反応性結合を与えなかったセロタイプ７のＤＮＡの質に問題があったことに注目するのは重要である。このセロタイプの反応は、セロタイプ１のものと同一であるべきだった。同様の問題が図６に見られる。そこでは、セロタイプ１２および１６ＤＮＡは、適切に消化されていなかった。これらのセロタイプの反応は、セロタイプ１のものと同一であるべきだった。ｔｂｐＡプローブを用いた低緊縮サザン・ハイブリダイゼーション（２５％ホルムアミド）は、エイ．スイス３７１４、エイ．プレウロニューモニアエＣＭ５およびショップ４０７４ゲノムＤＮＡがＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａｔｂｐＡプローブでハイブリダイズされたことを示した(図７)。エイ．プレウロニューモニアエの２つの株は、共にセロタイプ１に属し、そして同じ形態でハイブリダイズされた。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１、エイ．スイスおよびエイ．プレウロニューモニアエのｔｂｐＡ、ｔｂｐＢ領域の予備の制限地図は、図８に示される。Ｖ．相同性研究Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１の予測アミノ酸配列は、ナイゼリア・エスピーピー．（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｓｐｐ．）およびエイ．プレウロニューモニアエのトランスフェリン結合タンパク質、並びに数種の大腸菌のＴｏｎＢ依存性受容体タンパク質についての予測配列と比較した。全ての比較は、ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）アルゴリズムによって行われた(ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、１９８８年)。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１の予測アミノ酸配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびエヌ．メニンジチヂス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｔｂｐ１タンパク質の両方と高度の相同性を示すことが分かった（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら、１９９２年；Ｌｅｇｒａｉｎら、１９９３年）(図９)。同一のそして保存されたアミノ酸を含めた相同性は、４１％であることが分かった。この結果は、Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａおよびナイゼリア・エスピーピー．Ｔｂｔ１タンパク質が類似の構造を共有することを示唆したタンパク質相同性研究と一致する。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１およびエイ．プレウロニューモニアエ・セロタイプ７およびセロタイプ１ＴｆｂＡタンパク質の間の相同性比較（Ｇｅｒｌａｃｈら、１９９２年ａ；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９９２年ｂ）は、相同性がほんの低い程度（２２％）であることを明らかにする(図１０)。パステウレラ(Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ)、ナイゼリアおよびアクチノバシルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）のトランスフェリン結合タンパク質の間の遺伝的関連性の程度は、図１１で系統樹の形態で示される。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１は、アクチノバシルスのトランスフェリン結合タンパク質よりナイゼリアＴｂｐ１により親密に関連することに注目することは興味深い。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１は、大腸菌ＴｏｎＢ依存性外側膜受容体との相同性の領域を位置決めもする(図１２)。これらのタンパク質との相同性は、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１もＴｏｎＢ依存性受容体タンパク質であることを意味する。第一の相同なドメインは、ＴｏｎＢボックスを含み、ＴｏｎＢおよび受容体タンパク質の間の直接的相互作用に関係していた(Ｂｅｌｌら、１９９０年)。顕著な他の相同性ドメインは、知られていないが、それらがＴｏｎＢ相互作用にも含まれることは可能である。ＶＩ．Ｔｂｐ１のＴ７発現Ｔ７発現は、ｔｂｐＡによってコードされたタンパク質を発現するために行われた(図１３)。鉄枯渇下でおよび鉄枯渇条件での大腸菌のマキシ（ｍａｘｉ）− 細胞分析によってｔｂｐＡを発現する試みは、成功しなかった(データは示さず) 。Ｔ７発現は、１００ｋＤａでいかなる反応性バンドをも生じなかった。３０ｄＤａの陽性対照がレーン１に示される。ｔｂｐＡを担持するプラスミドおよびｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔベクターのみの間に差異はなかった(図１３、レーン２および３)。ＶＩＩ．ウエスタンイムノブロット分析鉄限定および鉄十分条件下で成長したＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１および大腸菌ＨＢ１０１細胞から得られる内側および外側膜画分が調製され、そしてウエスタンイムノブロッティングで分析された。これらの実験の目的は、鉄制限タンパク質が、Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの可溶性抗原に対して調製された抗血清と抗原的に反応するかどうかを測定することであった。内側および外側膜画分は、（血清タンパク質に抗体が混在するのを避けるために）ウサギ自身の血清で補足されたＲＰＭＩ１６４０中で培養されたＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１の可溶性抗原に対して生じたウサギの「抗−オートローガス」抗血清でイムノブロットされた。抗血清は、大腸菌抗原との反応性を最小限にするために大腸菌ＨＢ１０１細胞に予め吸収される。トランスフェリン結合タンパク質に対応する免疫反応性バンドは、鉄限定条件下で成育したＰ.ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１細胞から得られた外側膜画分に観察されなかった(図１４、レーン３)。内側および外側膜画分も、第一抗体として登録商標プレスボンス（Ｐｒｅｓｐ抗血清を、大腸菌免疫反応性の数を限定する大腸菌ＨＢ１０１細胞で予め吸収した。７１、７７および１００ｋＤａのバンドが、鉄−限定条件下で成育したＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１細胞の外側膜で観察された(図１５、レーン３)。これらのタンパク質バンドが、Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａのトランスフェリン結合タンパク質の寸法に対応する。これらの抗原性バンドは、トランスフェリンタンパク質であれば、そしてこの結果は、これらのペプチドが抗原性であり、そして家畜に免疫抗原性を示すことを示唆する。＜考察＞Ｉ．予備配列分析Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａｔｂｐＡおよびｔｂｐＢの予備ヌクレオチド配列が、図３に示される。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａｔｐｂＢのプロモーター領域は図４に示される。クローン化ＤＮＡの予備配列によって、２つのｔｂｐ遺伝子がｔｂｐＡの直接的上流のｔｂｐＢで連結して発見された。この遺伝子体制は、遺伝子がオペロン中に配列されるナイゼリア・エスピーピーのような他の細菌中の鉄摂取系と一致する(Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９４年)。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１鉄摂取に関係した遺伝子がオペロンでも配列されるようである。ｔｂｐＡ遺伝子は、リボソーム結合配列のみを有する一方で、ｔｂｐＢ遺伝子は、リボソーム結合部位に進行され、そしてそのプロモーター領域中のＦｕｒコンセンサス配列を有する。推定Ｆｕｒコンセンサス配列の存在は、その２つの遺伝子が鉄の濃度に対応して制御でき、そしてＦｕｒ相同性がＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１に存在することを意味する。Ｆｕｒ相同性は、病原性ナイゼリア・エスピーピー．でクローン化されシーケンシングされた(Ｂｅｒｉｓｈら、１９９３年；ＴｈｏｍａｓおよびＳｐａｒｌｉｎｇ)１９９４年)。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡｌＦｕｒ類似体が存在する場合、ロイコトキシンのような他の抗原の抑制に関連しうる。ＳｔｒａｔｈｄｅｅおよびＬｏ（１９８９）は、鉄限定条件下では、産生されるロイコトキシンの量が減少することを報告した。これは、その細胞が鉄限定条件下で育成される場合に毒素産生が増加するディプセリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒性の状況（Ｂｏｙｄら、１９９０年）と対峙する。Ｆｕｒが、Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａのロイコトキシン産生に陽性の抑制剤として作用することが可能である。これは、鉄含有培地中で毒素産生が増加するというＧｅｎｔｒｙら（１９８６年）による初期の観察と一致する。エヌ．メニンジチジスも、エキソタンパク質のＲＴＸファミリーに関連する鉄制限タンパク質を産生する(Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９３年)。ｔｂｐＡ配列中の第一の２８の予測アミノ酸は、推定のシグナル配列を形成する。シグナル配列は、膜を越える転移の工程の間前駆体タンパク質を膜に挿入するのに不可欠である。シグナル配列も、前駆体タンパク質をその成熟形態にたんぱく質分解性切断するための認識部位として作用する(ｖｏｒＨｅｉｊｎｅ、１９８３年；ＢｅｎｓｏｎおよびＳｉｌｈａｖｙ、１９８３年)。シグナル配列の存在は、Ｔｂｐ１が細胞質膜に沿って存在するが、いかなる選別情報も含まないことを確認する。Ｔｂｐ１の予測アミノ酸配列は、タンパク質のカルボン酸末端に、末端フェニルアラニン残渣を有する。フェニルアラニンは、膜内の疎水性環境を分割するのを促進する疎水性の芳香族アミノ酸である。末端フェニルアラニン残渣の存在は、外側膜の局在化に重要であることが示され(Ｓｔｒｕｖｅら、１９９１年)、そしてＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１は、外側膜に存在することを示唆する。ｔｂｐＢの配列分析は、脂質タンパク質のための推定の切断配列を明らかにした。脂質タンパク質は、Ｌｅｕ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓ（ここで、ＸおよびＹは、小さな中性アミノ酸である。）の特徴的な切断配列を有する(Ｗｕ、１９８７年)。これは、Ｔｂｐ２が処理され、そして脂肪は修飾されることを示唆する。Ｔｂｐ２が、外側膜局在化に関係する末端フェニルアラニン残渣を欠くことに注目することは興味深い。類似のトランスフェリン結合脂質タンパク質は、エイチ．インフルエンザエ(Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ)、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびエヌ．メニンジチジス（Ｌｅｇａｉｎら、１９９３年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９４年）で見られた。グリフィズ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）ら（１９９３年）は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびエヌ．メニンジチジスおよびエイチ．インフルエンザエｂ型のＴｂｐ２タンパク質中の共通抗原性ドメインを示した。タンパク質の等電点（ｐＩ）は、そのペプチドが総電荷ゼロを示すｐＨとして定義される。ｐＩ計算は、イオン化状態を干渉する立体構造がないことを呈する。したがって、算定ｐＩ値は、およその値のみであり、実験の結果と異なる可能性がある。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１およびＴｂｐ２のｐＩは、それぞれ９．１６および９．７１と算定された。陽イオンのポリペプチドは、生体内（ｉｎｖｉｖｏ）膜干渉作用を増大することが示唆された。Ｔｂｐ１の塩基的特性が、トランスフェリンタンパク質との干渉作用を増大することは可能である。ナイゼリアのＴｂｐ１（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら、１９９２年）およびＦｂｐ（Ｂｅｒｉｓｈら、１９９０年）タンパク質も塩基性タンパク質である。レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）で、塩基性表面タンパク質は、作用して、食胞融解小体の融合を阻害する( Ｃｉａｎｏｃｉｏｔｔｏら、１９８９年)。ＩＩ．予備予測タンパク質トポロジーＴｂｐ１およびＴｂｐ２のハイドロプロパシープロットは、ケイトおよびドーリトルの方法を用いて行われた(１９８２年)。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１のハイドロプロパシープロットでは、第一のピークは、アミノ酸１から３０までに存在する。これは、全てのシグナル配列に共通する疎水性核を表す(ＨａｙａｓｈｉおよびＷｕ、１９９０年)。他の疎水性領域は、膜内外ドメインであってよい。親水性ドメインは、細胞表面または周縁質に露出されるタンパク質の領域であってよい。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１タンパク質中の膜内外領域の位置は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ１で予測された多くの膜内外領域に類似する。これは、Ｔｂｐ１タンパク質が同様の構造を示しうること、およびアミノ酸レベルで特定の程度の相同性を共有することを示唆する。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ２タンパク質は、タンパク質の中央に疎水性リーダー配列並びに数種の大きな疎水性領域を所有し、そしてＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ２について予測されるハイドロプロパシープロットと相当に異なる。これは、両方のタンパク質が構造的に異なることを意味する。Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２の表面露出領域は、エミニ表面可能性法を用いて予測された。細胞表面に露出されるＴｂｐ１およびＴｂｐ２の領域は、リガンド相互作用に関与でき、抗原性でありうる。チュー−ファスマンの方法は、一般にタンパク質の二次構造を予測するのに使用される。この方法は、α−ヘリックス、β−シートまたはβ−回転であるための各アミノ酸が示す傾向に基づいている。チュー−ファスマンの方法は、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１が多くのβ−シートおよびβ−回転を含むことを予測する。これらのβ−シートは、外側膜を繰返し通過し、そして介在配列が表面または周縁質露出ループを構築することは可能である。チュー−ファスマンの方法は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ１もβ−シートを含むことも予測する。この構造は、すでにＦｅｐＡのような大腸菌の外側膜タンパク質について提案されてきた(Ｍｏｅｃｋら、１９９４年)。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ１タンパク質が、鉄を宿主トランスフェリン分子から除去する類似の機構を有していてもよいことを意味する共通構造を共有する。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ２のチュー−ファスマンのプロツトも、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ２についての予測より相当に異なる優先的β−シートおよびβ−回転構造を予測する。ＩＩＩ．Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａおよびその関連種のｔｂｐＡの分配ｔｂｐＡプローブ用いた１６のＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａセロタイプのゲノムＤＮＡのサザン・ハイブリダイゼーションは、高度に相同な遺伝子がＡバイオタイプ内に存在することを示した。その結果は、遺伝子機構またはｔｂｐＡ遺伝子がＴバイオタイプで相当に異なることも示唆する。これは、ＡおよびＴバイオタイプから得られる鉄制限タンパク質が抗原的に異なることを示すＭｕｒｒａｙら（１９９２年）による観察を支持する。Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ抗原決定基についての先行研究は、シアログリコプロテアーゼ、セロタイプ特異的抗原、３つの脂質タンパク質およびＬＰＳ生合成遺伝子は、Ｔバイオタイプ中の異なる遺伝子機構を欠いているかまたは有していることを示した(Ｂｕｒｒｏｗｓ、博士論文、１９９３年)。ＡおよびＴバイオタイプは、表現型および生化学的形質を共有する（Ｈｏｌｔ、１９７７年）が、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づいてほんのわずかに関連している(Ｂｉｎｇｈａｍら、１９９０年)。ＳｎｅａｔｈおよびＳｔｅｖｅｎｓ（１９９０年）は、バイオタイプＴセロタイプを種Ｐ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉとして再度命名することを提案した。トランスフェリン結合タンパク質の遺伝子体制での多様性は、エイ．プレウロニューモニアエ（Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴｆｂＡ（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、１９９０年；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９９２年ｂ）およびエヌ．メニンジチジスＴｂｐ２（Ｌｅｇｒａｉｎら、１９９３年；Ｒｏｋｂｉ、１９９３年）で例示されてもきた。エイ．プレウロニューモニアエで、セロタイプ１およびセロタイプ７ＴｆｂＡタンパク質は、アミノ酸レベルでほんの５５％ホモロジーを共有する(Ｇｅｒｌａｃｈら、１９９２年ｂ)。エヌ．メニンジチジスＴｂｐ２タンパク質は、それらの分子量、配列類似性および抗原異種性に基づいて２つの綱（クラス）に分けられる(Ｒｏｂｋｉら、１９９３年)。種の範囲内でのトランスフェリン結合タンパク質での多様性は、様々なセロタイプの結合を容易にして、異種株に対する宿主の免疫応答を避ける(Ｇｅｒｌａｃｈら、１９９２年ｂ) 。サザン・ハイブリダイゼーション実験では、エイ．プレウロニューモニアエ株ＣＭ５およびショップ４０７４から得られる染色体ＤＮＡが、低緊縮条件下でのみｔｂｐＡプローブとハイブリダイズすることが示された。これは、Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａおよびエイ．プレウロニューモニアエのトランスフェリン結合タンパク質が程度の低いホモロジーのみを共有することを示唆する。この結果は、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１およびエイ．プレウロニューモニアエＴｆｂＡタンパク質の両方から得られるアミノ酸配列における相同性の研究によって確認された。エイ．スイスのゲノムＤＮＡも、ｔｂｐＡプローブでハイブリダイズし、そしてそれは類似のトランスフェリン結合タンパク質を有しうることを示唆する。その結果も、エイ．スイス・トランスフェリン結合タンパク質が、エイ．プレウロニューモニアエＴｆｂＡよりもＴｂｐ１およびＰ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａにより親密に関連しうることを示唆する。ＩＶ．相同性研究全てのタンパク質配列は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８８年）の方法によって配列を比較するＰＣＧｅｎｅ（クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ））によって配列された。この方法での第一段階は、全対の配列の類似性を計算することである。その後、系統樹が、第一段階で生成された類似のマトリックスから作製される。図１１の系統樹は、パステウレラ(Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ)、アクチノバシルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびナイゼリア・トランスフェリン結合タンパク質のＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ配列によって作製された。ａ）ナイゼリア・エスピーピー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｓｐｐ．）Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａｔｂｐＡの予測アミノ酸配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのｔｂｐＡの予測アミノ酸配列と相同性のある領域を有する。これは、トランスフェリン結合タンパク質が、構造的に類似で、タンパク質のトポロジー研究で行われる観察と一致することを示唆する。ＯｇｕｎｎａｒｉｗｏおよびＳｃｈｒｙｖｅｒｓ(１９９０年)は、Ｐ.ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１Ｔｂｐ１が寸法および特性の点でＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ１タンパク質に類似することを報告した。両方の種は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にトランスフェリンを結合できない１００ｋＤａの受容体タンパク質を産生し、そしてそれは、本来のタンパク質の立体配座が、トランスフェリン結合において重要であることを示唆する。しかし、２つのタンパク質は、それらの結合特異性において異なつている。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ１は、ヒトのトランスフェリンのみを結合する一方で、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１Ｔｂｐ１は、ウシのトランスフェリンのみを結合する。これは、２つのｔｂｐＡ配列の間の差異が鉄源の特異性をコードする領域でありうることを示唆する。ｂ）エイ．プレウロニューモニアエＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１Ｔｂｐ１の予測アミノ酸配列は、エイ．プレウロニューモニアエＴｆｂＡの配列との相同性の程度が低い。この結果は、サザン・ハイブリダイゼーション実験によって確認され、それは、エイ．プレウロニューモニアエ株ＣＭ％およびショップ４０７４から得られた染色体ＤＮＡが、低緊縮条件下でのみｔｂｐＡプローブとハイブリダイズすることを示した。このことは、両方の細菌がパステューレラセアエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）網に属し、そしてしたがって、類似のトランスフェリン結合タンパク質を有することが予測されるので興味深い。先行の研究は、２つのタンパク質が、機能的に類似であるが、構造的に異なっていることを示唆した。エイ．プレウロニューモニアエ中のＴｆｂＡタンパク質は、脂質タンパク質であることが示された（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、１９９０年）が、一方１００ｋＤａのＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１Ｔｂｐ１はそうではない（ＯｇｕｎｎａｒｉｗｏおよびＳｃｈｒｙｖｅｒｓ（１９９０年））。エイ．プレウロニューモニアエは、鉄飽和および鉄枯渇トランスフェリンの間を区別することができる（Ｇｅｒｌａｃｈら、１９９２年ａ）が、一方でエヌ．メニンジチジスは、できない(Ｔｓａｉら、１９８８年)。エイ．プレウロニューモニアエＴｆｂＡは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＴｂｐ２と相同性を示すことに注目することは興味深く、それは、脂質タンパク質でもある。これは、ＴｆｂＡタンパク質が、Ｔｂｐ２と類似性であり、そしてエイ．プレウロニューモニアエのＴｂｐ１はまだ同定されていないことを示唆する。ｃ）ＴｏｎＢ依存性受容体タンパク質Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１配列は、大腸菌ＴｏｎＢ依存性受容体タンパク質の群に共通するアミノ酸も有する。この知見は、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１がこのファミリーに属し、そしてＴｏｎＢの相同性はパステウレラ種に存在することを示唆する。第一の相同なドメインあるいは「ＴｏｎＢボックス」は、受容体タンパク質およびＴｏｎＢの間の直接的相互作用で関与してきた(Ｂｅｌｌら、１９９０年、Ｂｒｅｗｅｒら、１９９０年)。他の相同な領域の重大性は知られていないが、ＴｏｎＢ相互作用について要求されうるか、または外側膜の局在性に必要でありうる。多くの他のＴｏｎＢ依存性タンパク質のようにＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１は、鉄を制御され、そして鉄利用に関与している膜内外タンパク質である(ＭｉｅｔｚｎｅｒおよびＭｏｒｓｅ、１９９４年)。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１は、大腸菌ＦｅｐＡについて提案されてきたのと同じゲートで制御されたチャンネルとして機能することが可能である(Ｒｕｔｚら、１９９２年)。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら、１９９２年）およびエイチ．インフルエンザエ（Ｊａｒｏｓｉｋら、１９９４年）の両方から得られるＴｂｐ１も、ＴｏｎＢ依存性受容体タンパク質のファミリーに属する。Ｖ．Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ鉄摂取のために提案されたモデルナイゼリア、パステウレラおよびヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）中の多くの類似のタンパク質の存在は、共通の機構が鉄の取得に利用されうることを示唆する。鉄の取得の仮説的モデルが、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１についてのモデルとして使用されうるナイゼリア（Ｃｈｅｎら、１９９３年）について提案された。鉄の遮断は、Ｆｕｒ様制御系による鉄制御タンパク質の転写を活性化する。宿主のトランスフェリンは、２つまたはそれ以上のタンパク質を包含する特異的な鉄受容体複合体を介して細菌細胞の表面に結合する。鉄は、トランスフェリンから除去され、そしてＴｏｎＢによって提供されるエネルギーを有する細菌の外側膜を越えて移送される。周縁質では、鉄は、それを細胞膜パーミアーゼに移送する周縁質構成成分Ｆｂｐに一時的に複合化される。鉄は、周縁質結合タンパク質移送系によって細胞膜を越えて移送される。細胞質では、鉄はＦｅ²⁺に還元され、そして細胞によって同化される。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１鉄摂取に特徴的でありうる１つの特徴は、受容体複合体の一部を形成できる第三の鉄制御された外側膜タンパク質（７１ｋＤａ）の存在である(ＯｇｕｎｎａｒｉｗｏおよびＳｃｈｒｙｖｅｒｓ、１９９０年)。さらに、Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびエレクトブロッティング後にトランスフェリンを結合する能力のある受容体タンパク質を有しない一方で、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは有する(ＳｃｈｒｙｖｅｒｓおよびＭｏｒｒｉｓ、１９９０年)。これは、Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ受容体複合体の結合機構がＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅで受容体複合体よりわずかに異なりうることを示唆する。Ｎ.ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＦｂｐに類似するタンパク質は、パステウレラ・ファミリーに同定された。エイチ．インフルエンザエで、４０ｋＤａ周縁質タンパク質が同定され、そしてそのＮ末端配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＦｂｐに８１％相同であることが分かった(Ｈａｒｋｎｅｓｓら、１９９２年)。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ３では、３５ｋＤａ周縁質の鉄制御タンパク質が記述されているが、機能は分かっていない(Ｌａｉｎｓｏｎら、１９９０年)。さらに、３７ｋＤａ鉄制御タンパク質は、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１からアフィニティー手段によって単離された(ＯｇｕｎｎａｒｉｗｏおよびＳｃｈｒｙｖｅｒｓ、１９９０年)。寸法および所在の類似性に基づいて、これらのタンパク質の両方がＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＦｂｐに類似であることは可能である。ＶＩ．Ｔ７タンパク質発現大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）中のＴｂｐ１遺伝子産物のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ依存性産生は成功しなかった（図１３）。１つの可能な説明は、ｔｂｐＡのリボソーム結合部位が不十分であったことでありうる。遺伝子は、おそらく機能的なリボソーム結合部位を担持するベクターにクローン化できた。すなわち、Ｔｂｐ１タンパク質は、不安定であり、そして正確に産生されるためにはその他のタンパク質または因子の存在を必要とする。ヘテロ二量体タンパク質の成分は、単独に合成される場合に、しばしば不安定である。ＶＩＩ．ウエスタン免疫ブロッティング分析ウエスタン免疫ブロッティングは、鉄の十分なまたは鉄限定の条件下で育成されたＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１細胞から得られる内側および外側膜画分で行われた(図１４および１５)。鉄限定条件は、培地中の鉄の利用を限定するのに使用される一般の合成鉄キレート剤である鉄キレート剤ＥＤＤＡを加えることによって模擬実験された。ＥＤＤＡは、鉄に対するその特異性、および細菌に対する毒性の副作用を欠くことのためにこれらの研究に選択された(Ｎｅｉｌａｎｄｓ、１９８１年)。溶解性抗原に対するウサギの抗血清で免疫染色されたＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１膜画分は、鉄制御タンパク質と反応しなかった(図１４)。おそらく（ウサギの過免疫に使用される）元のＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１培養物が鉄制限条件下で育成されなかったので、１００ｋＤａまたは７７ｋＤａ鉄制御タンパク質のいずれも、このイムノブロットでは観察されなかった。使用された培地は、血清タンパク質の抗体の混入を避けるために７％血清を含有した。対照的に、鉄制御タンパク質でありうるペプチドは、登録商標プレスポンス（Ｐｒｅ６４０で後期対数期まで育成されたＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１細胞から製造される(ＳｈｅｗｅｎおよびＷｉｌｋｉｅ、１９８７年；Ｓｈｅｗｅｎ、１９８８年)。この培地の鉄濃度が低いことがトランスフェリン結合タンパク質の産生を誘導することは可能である。その子ウシが、鼻咽頭内の共生生物であるＰ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａによって生成されたトランスフェリン結合タンパク質に応答することも可能である。トランスフェリン結合タンパク質に対する抗体の存在は、これらのタンパク質が免疫原性であることを示唆する。実施例２細菌株：この研究に使用される細菌株は、表２に例示される。Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株ｈ１７３、ｈ１７４およびｈ１７６は、肺炎パスツレラ症に罹った反芻動物から野外で分離され、そしてフランス国リヨン(Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ)、ロン・メリウズ（ＲｈｏｎｅＭｅｒｉｅｕｚ）のＦｒａｎｋＭｉｌｗａｒｄ博士、によって提供された。Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株ｈ４４−ｈ４６は、アルバータ、エアードリエ(Ａｉｒｄｒｉｅ、Ａｌｂｅｒｔａ)、ベターリナリ・アンド・ラボラトリー（ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＳ．Ｌｕｎｄｂｅｒｇ博士から入手したウシ肺炎から得られたウシの臨床タイプＡ１単離物である。ｈ４４は先に記載された(２６)。Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株ｈ９３−ｈ９７は、サスカトーン(Ｓａｓｋａｔｏｏｎ)、ベターリナリ・アンド・インフェクショス・ディジーシズ・オーガニゼーション（ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ブイアイディーオー、ＶＩＤＯ）のＡ．Ｐｏｔｔｅｒ博士から得られたウシ肺炎から得られたウシの臨床タイプＡ１単離物である。株ｈ９８−ｈ１０７も、エイ．ポーター博士から得られたエイティーシーシー（ＡＴＣＣ）Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株（５）である。アクチノバシルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｌｕｓ）（ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ））・エクリ（ｅｑｕｕｌｉ）株ｈ５０は、アルバータ、エアードリエ(Ａｉｒｄｒｉｅ、Ａｌｂｅｒｔａ)、ベターリナリ・アンド・ラボラトリー(ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ)のＪａｎｅＰｒｉｔｃｈａｒｄ博士から入手した。新種Ｐ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉ(３４)。表２この研究に含まれる株のリスト育成条件：全細菌株は、−７０℃で、３０％グリセロールで凍結保存された。凍結保存物から得た分離物をチョコレート色寒天平板に線状接種し、そして５％ＣＯ₂インキュベータ内で３７℃でインキュベートした。鉄制限成長は、２μｇ／ｍｌチアミンモノホスフェートおよび３μｇ／ｍｇニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）で補足され、鉄キレート剤エチレンジアミンジヒドロキシフェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を最終濃度１００μＭで含有するブレインハート融合ブロス（ＢＨＬディフコ・ラボラトリーズ（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））またはオレイリー・ニーブン（Ｏ’ＲｅｉｌｌｙＮｉｖｅｎ）ブロス（２５）中で細菌を育成することによって達成された。鉄源として様々なトランスフェリンを使用することについての成長試験が、先に記載されたとおりに行われた(２６)。トランスフェリンおよび誘導体の製造：ウシのトランスフェリンは、シグマから入手した。ウマ(馬)、ヒツジ（羊）およびヤギ（山羊）トランスフェリン（２）の製造、トランスフェリン３０％または１００％飽和に導く鉄、およびトランスフェリンに対する西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の抱合は、先に基本的に記載されたとおりである。ウシ、ヒツジ、ヤギおよびウマトランスフェリン（ＨＲＰ−ｄＴｆ、ＨＲＰ−ｏＴｆ、ＨＲＰ−ｃＴｆおよびＨＲＰ−ｅＴｆ）の抱合体の製造の際に、ＨＲＰおよびトランスフェリンの混合物を、化学的抱合の後ゲル濾過にかけた。最大の活性を示す画分を貯め、塩析しそして適量を凍結し −７０℃で保存した。固相結合アッセイ：固相結合アッセイは、先に記載された方法から基本的に誘導された(３２)。アリコート量の無傷の細胞懸濁液または粗総膜標品をニトロセルロース／セルロース酢酸膜（ＨＡ紙、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）のミリポア・コーポレーション（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））の上にスポットで加え、そして乾燥後、ＨＡ紙を５％脱脂乳（保護溶液）を含有する緩衝液で保護した。トランスフェリン結合アッセイに関して、その紙を４５０ｎｇ／ｍｌのＨＲＰ抱合トランスフェリンを含有する保護溶液にさらし、基本的に先に記載（３２）したとおり、ＨＲＰ基質混合液で洗浄し、展開させた。無傷の細胞によって抗−受容体抗体の結合の評価として、第一の結合溶液が１／１０００希釈の抗−ＴｂｐＡおよび抗−ＴｂｐＢ抗血清を含有すること以外は同様の手段が利用され、そして洗浄後、膜を、１／３０００希釈のＨＲＰ抱合ヤギ抗ウサギ抗体標品を含有する第二の結合溶液にさらした。トランスフェリン結合タンパク質（ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ）のアフィニティー単離：ウシ、ヒツジ、ヤギおよびウマのトランスフェリンは、製造者の指示に従って、３．５ｍｇ／ｍｌの鉄飽和トランスフェリンを含有する溶液を用いて、個別にＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂに結合させた。エタノールアミンを添加することによって、活性化された基を保護した。１０〜２０カラム量の５０ｍＭトリスＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、６．０Ｍ塩酸グアニジンを含有するｐＨ８．０緩衝液で洗浄することによって、非結合トランスフェリンを除去し、さらなる洗浄後、０．１Ｍクエン酸ナトリウム／０．１ＭＮａＨＣＯ₃ のｐＨ８．６緩衝液を含有する５μｇ／ｍｌのＦｅＣｌ₃を含有する溶液を用いて、結合トランスフェリンを鉄で再負荷した。先に記載（３２）されたとおりに作製されたＰ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａまたはエイ．エクリ（Ａ．ｅｑｕｕｌｉ）から得られた鉄不足の総ての膜（２００ｍｇタンパク質）を、１．０ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中で２ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＥＤＴＡおよびサルコシルを、それぞれ最終濃度１０ｍＭおよび０．７５％まで添加することによって、希釈された膜を可溶化し、室温で、１５−３０分間、穏やかに振盪しながら混合液をインキュベートした。溶液を１０，０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離して、不溶性破片を除去した。可溶化膜を含有する上清を１．５×１０ｃｍトランスフェリンアフィニティーカラムにかけ、そしてその後、１．０ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．７５％サルコシルを含有する５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）で激しく洗浄（少なくとも１０床量）して、非特異的に結合したタンパク質を除去した。低塩洗浄条件を用いた実験で、洗浄緩衝液は、１ＭのＮａＣｌの代わりに１００ｍＭのＮａＣｌを含有した。いくつかの例では、０．２Ｍ塩酸グアニジンを含有する２− ３床量の洗浄緩衝液でのさらなる洗浄が、混入タンパク質を取除くのに必要であった。１．０ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％サルコシルを含有させた５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中の２．０Ｍ塩酸グアニジン２−３床量をかけることによって、トランスフェリン結合タンパク質（ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ）の両者の共溶出達成した。５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に対する迅速な塩析で溶出液を収集した。より高濃度の塩酸グアニジンでさらに処理すると、通常は受容体タンパク質の収量がさらによくはならない。ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢの個々の単離は、それぞれ０．２、０．５、０．７５、１．０．１．５、２．０および３．０の塩酸グアニジンを含有する各緩衝液の２床量で連続溶出することによって達成された。１８時間かけて、３リットルの５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を３回交換して溶出物を塩析し、そして超濾過によって濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後、０．５および０．７５ＭグアニジンＨＣｌ溶出緩衝液から得られた画分を、ＴｂｐＢを製造するために集積し、そして１．５および２ＭグアニジンＨＣｌ溶出緩衝液から得られた画分を、ＴｂｐＡを製造するために集積した。分析的方法：タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、先に記載した（３２）とおり銀染色を行った。ウエスタンブロット分析に関して、鉄欠乏細胞から得られた約１−２．ｍの精製受容体タンパク質または４０．ｍの外側膜タンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲルで分離した。一夜、１５Ｖで、２０ｎＭトリス(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭグリシン、２０％メタノールおよび０．１％ＳＤＳ中で、タンパク質を電気泳動的にニトロセルロース（マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）のミリポア・コーポレーション（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に移行させた。２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）中の０．５％脱脂乳、５００ｍＭのＮａＣｌ（ＴＢＳ）で、３０分間室温でろ紙を保護した。保護溶液中で１／３００希釈の適切な抗体を、１時間、室温で、そのろ紙にかけ、次にＴＢＳで２回１０分間洗浄した。１／３００希釈の二次抗体（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）から入手したヤギの抗−ウサギＩｇＧセイヨウサワビ・ペルオキシダーゼ抱合体）を１時間、室温で結合させた。抱合体を３回、１０分間のＴＢＳ中の洗浄で除去し、ＨＲＰ−基質混合物を用いて展開させた。受容体の特異性の比較：先行の研究は、反稠動物の種々の病原性細菌種から得られるトランスフェリン受容体によって種々の反稠動物トランスフェリン（すなわち、家畜(ウシ)、ヒツジおよびヤギ）に対する特異性に差異を示した(３８)。これは、おそらくリガンド結合に関与する受容体タンパク質の領域の差異に反映され、したがって、これらの領域が、反芻動物の病原についての広範な特性を有するトランスフェリン受容体基剤のワクチンの基礎としての役割を果たすことができないことを示唆する。しかし、種々のパステウレラ種のような関連の反芻動物病原の群が、交差 −保護的応答（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅ）の世代の基礎を提供できる共通のリガンド結合ドメインを有しうる可能性を排除するものではない。したがって、代表的なパステウレラ単離体の集合から得られたトランスフェリン受容体が、反芻動物の病原に対する同じ特異性を有するかどうかを決定することは重要であった。受容体特異性の予備分析として、成長のために鉄源として種々の反芻動物トランスフェリンを利用するそれらの能力について、代表的単離物の集合を評価した (表２)。方法セクションで記述したサンプル平板アッセイを利用した。パステウレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）およびＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉの全ての代表的反芻動物の単離物の成長は、反芻動物（ウシ、ヤギおよびヒツジ）から得られたが、非反芻動物（ウマ）宿主から得られたＦｅ飽和トランスフェリンによって刺激された。ウマ・トランスフェリンによるウマ病原体、アクチノバシルス・エクリ（株ｈ５０）の成長の刺激は、鉄源としてウマのトランスフェリンを使用するＰ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株の無能力は、生成での不足によるものではないことを示した。表３異なったトランスフェリンでの増殖受容体特異性のさらなる評価として、トランスフェリンの西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合体を利用する短結合アッセイによって無傷の細胞または単離膜によってトランスフェリンの結合を評価した。抱合体は、ウシ、ヒツジおよびヤギのトランスフェリンから生成され、そしてその後、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａおよびＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉの数種の代表的株の鉄欠乏細胞から単離された全ての膜に対して結合する能力について試験した。結果は、全ての選択株は、３つの反芻動物トランスフェリン（ウシ、ヤギおよびヒツジ）を結合する能力はあるが、ウマのトランスフェリンを結合しないことを示し(図１６)、これは、成長の研究の結果と一致する(表３)。全ての３種の反芻動物トランスフェリンによって観察された結合が選択種での同じ受容体によることを確認するために、未標識反芻動物トランスフェリンの活性がそれらの標識トランスフェリンの結合を遮断する能力について試験される拮抗結合アッセイを行った。これらの実験で、種々の反芻動物トランスフェリンによる相互阻害は、同等に有効であり、そしてそれらは類似のアフィニティーで同一の受容体に結合することが示された( データは示さず)。成長および結合の研究の結果は、ウシ、ヒツジおよびヤギのトランスフェリンが、Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａでの鉄取得に関係した受容体構成成分と相互作用する能力があることを示唆した。方法セクションに記載されるアフィニティー手段は、ウシ、ヤギまたはヒツジのトランスフェリン−セファロース樹脂を使用して反芻動物のトランスフェリンと相互作用するタンパク質を同定するのに使用された。図１７に示されるとおり、ウシ(レーンＡおよびＢ)、ヒツジ（レーンＣ）またはヤギ（レーンＤ）トランスフェリンアフィニティーカラムを使用する場合、およそ１００，０００分子量の優先的受容体タンパク質をウシ単離物(ｈ４４)、ヤギ単離物（ｈ１７３）またはヒツジ単離物（ｈ１７５）から得られた膜製品で単離した。このタンパク質は、他の細菌病原で見られる同様のサイズの受容体タンパク質に類似し(１８、２７，３０、３１)、それは、従来トランスフェリン結合タンパク質１（Ｔｂｐ１）と呼ばれてきた。代替名ＴｂｐＡは、存在する学名の慣習と一致していることが推奨された(１２)。およそ６０，０００分子量の第二のタンパク質は、ウシ単離物（ｈ４４）から得た膜を用いて、反芻動物のトランスフェリンでアフィニティークロマトグラフィにより単離されたサンプルでも立証された（レーンＢ、ＣおよびＤ）。このタンパク質は、他の病原性細菌種（１８、２７、３０、３１）から単離される低分子量受容体タンパク質であるトランスフェリン結合タンパク質２（Ｔｐｂ２）と比較できる。その理由として、上で言及されたとおり、代替名ＴｂｐＢが推奨されてきた(２１)。この分子量のタンパク質も、ヤギ（ｈ１７３）およびヒツジ（ｈ１７５）単離物で得られたほとんどのサンプルで予測可能であるが、この成分の存在および収量は、単離の条件に敏感であった。これらの種で観察されるＴｂｐＡ（Ｔｂｐ１）に比較して特徴的に低収量のＴｂｐＢ（Ｔｂｐ２）は、細菌受容体タンパク質の一般的な特性ではなく、そして関連の種から得られるＴｂｐＢの共通の特性に反響を及ぼしさえしうる。ウマのトランスフェリン−セファロースがアフィニティー単離手段に使用される場合、いずれのタンパク質も単離されず(レーンＥ)、それらの単離が特に反芻動物のトランスフェリンの存在によることを示す。低緊縮洗浄条件が、アフィニティー単離手段の間に使用され、ウシ(ｈ４４)、ヤギ（ｈ１７３）またはヒツジ（ｈ１７５）が使用される場合、分子量およそ３８，０００および７０，０００の追加のタンパク質は、アフィニティーカラムに保持された（レーンＡ）。分子量およそ７７，０００の追加のタンパク質は、ウシ単離物から得られたサンプルで明らかでもあった。受容体タンパク質の免疫学的特性の比較ウシ、ヤギおよびヒツジのトランスフェリンが同じ受容体に競合する観察は、少なくとも受容体の結合ドメインに保存があることを示唆した。共通の免疫学的エピトープの存在に関して類似性もあるかいなかを決定するために、他の単離物から得られる受容体タンパク質との交差反応性を評価する１つの菌株から得られる精製受容体タンパク質に対して、抗血清が生成された。ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢのアフィニティー精製標品が、菌株ｈ４４から得られ（方法セクション参照）、そしてウサギで単一特異的抗血清の発生のために使用した。その後、これらの抗血清は、ウシ、ヒツジ、ヤギから得られた単離物を含めた異なるセロタイプの代表的菌株から単離された受容体タンパク質に対して試験された。図１８での結果は、パネルＡが、代表的菌株からｂＴｆ−セファロースでアフィニティー単離した全てから得た抗ＴｂｐＢ抗血清が分子量およそ６０，０００のタンパク質（ＴｂｐＢ）と強力に反応したことを示す。同様に、抗−ＴｂｐＡ血清は、全７つの代表的菌株ＴｂｐＡと交差反応した(図１８、パネルＢ)。反芻動物単離物（表２）のさらなるセロタイムについてのこの分析の拡張は、両方の受容体タンパク質との考慮すべき交差活性を示し続けた(データは示さず)。これらのデータは、両方の受容体タンパク質が、ウシ、ヒツジおよびヤギで肺炎パスツレラ症起こす種々のセロタイプのＰ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの間で保存されることを示唆する。図１８に例示される免疫学的交差反応性が、様々の種から得られた受容体タンパク質中の保存エピトープがあること、これらのエピトープのいずれかが細菌表面で露出されるかどうかを示すものがないことを示し、ここでそれらは、宿主の免疫イフェクター機構についての効果的な標的として働くことができた。この問題を解決するために、無傷の細胞によって抗受容体抗体の結合を評価するのに個相結合アッセイが使用された。このアッセイは、ウシのタイプＡ１単離物の選択が試験される場合に、鉄欠乏下であって、鉄十分な条件でない下で細胞の成長による強力な結合があることを示す(データは示さず)。様々のセロタイプのヒツジ単離物の選択が試験される場合、反応性の変動程度があった(図１９)。タイプＡのＰ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株の他のセロタイプ（ｈ９８およびｈ１０５、図１９）は、抗−ＴｂｐＡおよび抗−ＴｂｐＢに対する考慮すべき反応性が示された。対照的に、Ｔタイプ株（Ｐ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉ、ｈ９９、ｈ１００およびｈ１０６）が、抗−受容体抗血清の両方に対してわずかに非常に弱い反応性を示した。しかし、標識化ｂＴｆによる弱い結合もあるという事実は、この実験に使用された鉄欠乏成長条件下で受容体タンパク質を限定的に生成することを示す。したがって、抗−受容体抗血清の反応性の欠如は、これらの種から得られた受容体タンパク質中の表面露出の交差反応性エピトープの欠如に貢献できない。実施例３タイプＡ１株から得られるトランスフェリン受容体遺伝子のクローニング以下の材料および方法が、実施例で記載された研究に使用された。＜材料および方法＞細菌、プラスミド、ファージおよび培養条件：Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａおよび大腸菌株は、発明者の実験室集合体から得た。ｐＢＲ３２２中のＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１ＤＮＡのプラスミドクローン・バンクは、記載されている(Ｌｏら、１９８５年)。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１ＤＮＡを含有する１つのクローン・バンクは、Ｇ．Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋから得た。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１株Ｈ１９６は、ザ・ベターリナリ・アンド・インフェクショス・ディジーシズ・オーガニゼーション（ｔｈｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ブイアイディーオー、ＶＩＤＯ、カナダ国サスカチワン、サスカトーン（Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ、Ｃａｎａｄａ）から得た。全細菌株は、３０％グリセロール中、−７０℃で凍結保存させた。凍結保存から得た単離物を、チョコレート（Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）またはルリア−ベタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）足す抗生物質（大腸菌）寒天平板に線状接種し、そして５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。ＰＣＲ増幅：ＰＣＲのプライマーをアプライド・バイオシステムズ・モデル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ）３９０Ｅ合成機で合成し、製造者の指示に従って精製した。推奨されるとおり、ＰＣＲ共試薬およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用して、パーキン−エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ −ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）４８０サーマル・サイクラー（ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ）内の薄い壁面の５００ｍｌ試験管でＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間、さらに続けて３０サイクルの変性、アニーリングおよび拡張をそれぞれ９５℃（１分間）で、５２℃（１分間）で、そして７２℃（２分間）で行うことを包含する。テンプレートＤＮＡを含有しない陰性対照が、各ＰＣＲ操作に含まれた。ゲノムのｔｂｐ領域のマッピング：Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１から得られたゲノムＤＮＡは、多くの制限酵素で消化され、アガロースゲル電気泳動によって分離され、ニトロセルロース膜にブロットされ、そして記述されたとおりｔｂｐＡまたはｔｂｐＢの様々な領域に特異的なＤＮＡプローブでハイブリダイズした。制限マップは、組換えプラスミド並びにｔｂｐ遺伝子の正確な位置を確定する配列領域から得られたものと比較された。トランスフェリンおよび誘導体の生成：ウシのトランスフェリン（ｂＴｆ）は、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）から得られた。どこか他に記載されている手段に従って、アポ形態のｂＴｆが生成された(ＭａｚｕｒｉｅｒおよびＳｐｉｋ、１９８０年)。簡潔には、ｂＴｆは、０．１Ｍ酢酸Ｎａ、０．１Ｍリン酸Ｎａおよび２５ｍＭのＥＤＴＡ中で０．５−１．０％の濃度に溶解し、そして濃氷酢酸を滴下することによって（ｐＨ５．５）に調整した。その溶液を一夜４℃で平衡化し、そして酢酸Ｎａ／リン酸Ｎａ低ｐＨ緩衝液で平衡化したアクリルアミドゲル・カラムを使用して鉄は除去された。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したアクリルアミドゲル・カラムを使用して低ｐＨ緩衝液を交換した。最終的に、タンパク質をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）濾材を用いて濃縮した。ｂＴｆのＮ −およびＣ−末端誘導体を記載のとおり生成した(ＹｕおよびＳｃｈｒｙｖｅｒｓ、１９９４年)。簡潔には、８０ｍｇのＣｏｎＡ精製ｂＴｆを、４０ｍｌの０．１Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．２)、２５ｍＭのＣａＣｌ₂中で、室温、２０時間２ｍｇプロテイナーゼＫで消化した。反応を中止するために、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を０．１ｍｇ／ｍｌまで添加した。５ｍｌの濃厚製品を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化されたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１００カラムにかけ、Ｎ−片およびＣ−片画分を５０ｍＭ酢酸Ｎａ(ｐＨ６．9)、１ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＭｎＣｌ₂に対して塩析し、そして（ｂＴｆのグリコシル化Ｃ−片を結合するが、Ｎ−片は結合しない）ＣｏｎＡ−セファロース・カラムにかけた。直前に記載された緩衝液で洗浄したカラムからの溶出物は、Ｎ−片含有画分として保持された。Ｃ−片含有画分を、０．２Ｍメチル−ａ−Ｄ−マンノピラノシドを含有する同様の緩衝液を使用して溶出させた。Ｃ−片およびＮ−片画分の両方を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して塩析させ、超濾過によって濃縮し、そしてアリコート量で７０℃で凍結した。組換え受容体タンパク質の発現 :適切な組換えプラスミドを担持する大腸菌株（ＤＨ５αＦ／ＴｂｐＢおよびＤＨ５αＦのためのｐＣＲＩＩＰＨｔｂｐＢ／ＴｂｐＡのためのｐＣＲＩＩＰＨｔｂｐＡ）を、０．２％マルトースおよび１５０ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含有する５０ｍｌＬＢ−ブロス・スターター培養基を接種するのに使用した。数時間、３７℃で育成した後、培養基を、同じ培地１リットルを開始ＯＤ₆₀₀０．０５まで接種するのに使用した。いったんＯＤ₆₀₀が０．４に達したら、グルコースを４ｍｇ／ｍｌまで添加し、そしてＯＤ₆₀₀が０．７ −０．８に達するまで育成した。その時に、ＭｇＳＯ₄を１０ｍＭまで、そしてＣＥ６１ファージの１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌ懸濁液１００ｍｌを添加した。細胞培養基をさらに２時間、３７℃で、インキュベートし、その後遠心分離で回収した。細胞ペレットを、アフィニティー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウエスタン・イムノブロット分析単離用の５ｍｌの氷冷５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１ＭＮａＣｌに再懸濁した。トランスフェリン結合タンパク質のアフィニティー単離および分析的方法：製造者の指示にしたがって、３．５ｍｇ／ｍｌの鉄飽和ｂＴｆを含有する溶液を使用して、ウシのトランスフェリンを、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））と結合させた。活性化された基は、エタノールアミンを添加することによって保護した。１０から２０カラム量の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、６．０Ｍ塩酸グアニジンを含有するｐＨ８．０緩衝液で洗浄することによって、非結合トランスフェリンを除去した。さらに５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した後、結合トランスフェリンに、０．１Ｍクエン酸ナトリウム／０．１ＭＮａＨＣＯ₃（ｐＨ８．６）中に５ｍｇ／ｍｌのＦｅＣｌ₃を含有する溶液を用いて鉄で再負荷した。再度５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した後、アフィニティー実験に使用される前にｂＴｆ−セファローズ樹脂を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１ＭＮａＣｌで予め平衡化し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１ＭＮａＣｌに再懸濁させた組換えプラスミドを含有する大腸菌細胞を、２０ｍＭＥＤＴＡ、２％サルコシル中に可溶化し、そして２時間、室温でインキュベートした。混合液を８０００ｒｐｍ（４℃）で、１５分間遠心し、そして可溶化受容体を含有する上清を注意深く分留した。上清を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１ＭＮａＣｌ緩衝液で４回希釈し、そして同じ緩衝液で希釈した以下のトランスフェリンの各々の過剰量（１ｍｇ／ｍｌ）と一緒に室温で、３０分間予めインキュベートした。鉄負荷ｂＴｆ、山羊またはヤギのトランスフェリン(ｃＴｆ)、羊またはヒツジのトランスフェリン(ｏＴｆ)、およびヒトのトランスフェリン( ｈＴｉ)；アポ−ｂＴｆ；Ｃ−片ｂＴｆ；およびＮ−片ｂＴｆ。緩衝液のみを陽性対照試験に加えた。予備インキュベーション後、上清を、予め５０ｍＭトリス −ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１ＭＮａＣｌで平衡化したｂＴｆセファロースカラムにかけ、そして室温で１５分間インキュベートした。各カラムを、少なくとも１２カラム量の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％サルコシルで激しく洗浄し、さらに０．０５％サルコシルのみを含有するものの１０カラム量で洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、０．５ＭＮａＣｌで、最終洗浄を行った。非還元条件および非結合下で２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の１床量を加えることによって、組換えＴｂｐＢの溶出を達成した。樹脂を含む混合物を、微量遠心機で、１３，０００×ｇで５分間、遠心した後、各溶出剤（上清）を回収した。各上清（溶出剤）のアリコート量をさらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、イムノビロンＰＶＤＦ（ミリポール）膜(一夜、１５Ｖで、２０ｍＭトリス(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭグリシン、２０％メタノールおよび０．１％ＳＤＳで)にエレクトロブロットした。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の０．５％脱脂乳、５００ｍＭＮａＣｌ（ＴＢＳ）で、室温で３０分間、膜を保護した。保護溶液中の１／１０００希釈の抗−ＴｂｐＢ血清を、１時間、３７℃で、その膜にかけ、さらにＴＢＳで２回１０分間洗浄を行った。１／３０００希釈の二次抗体（ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体）を１時間３７℃で、結合させた。ＴＢＳ中で３回、１０分間洗浄によってこの抱合体を除去し、そしてＨＲＰ−基質混合物（クロロ−ナルトール／Ｈ₂Ｏ₂）を用いて展開させた。Ｎ−末端アミノ酸配列分析：アフィニティー精製され、そして順次溶出されたＴｂｐＡおよびＴｂｐＢのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、簡潔にクーマシーブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ）で染色されたＰＶＤＦ（イムノビロン−Ｐ、ミリコアＩＰＶＨ０００１０）膜にエレクトロブロットし、そして個々のタンパク質バンドを含有するストライプを、Ｎ−末端アミノ酸配列分析用の膜から切り取った。抗−ＴｂｐＡおよび抗−ＴｂｐＢ単特異的ウサギ血清の製造：塩析および濃縮後アフィニティー手段での適切な画分から得られたＰ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株Ｈ４４から得られるおよそ５００ｍｇの精製ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢを、フロイント完全アジュバントと混合し、そして２匹の白色ニュージーランド・ウサギにそれぞれ筋内注射した。２回、３週間のインターバルで同量の抗原とフロイント不完全アジュバントでそのウサギに増強した。最終増強後２週間、血液を回収し、ドット−ブロット装置でドットアッセイを用いて、期待される抗原に対する血清力価を測定した。力価が不十分であれば、さらに増強し、力価が十分であれば終了した。Ｈ４４から得られるＴｂｐＡおよびＴｂｐＢに対する血清の特異性は、二次抗体としてＨＲＰに抱合されたヤギ抗−ウサギＩｇＧを使用して、ＳＤＳ −ＰＡＧＥおよびウエスタン・イムノブロットによって試験した。期待どおり、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ抗血清の両方が、株１９６から得たＴｂｐＡおよびＴｂｐＢとそれぞれ交差反応した。ヌクレオチド配列分析 :ｔｂｐ領域をシーケンシングする２つの別々の攻略法が、採用された。１つのアプローチは、第一に組換えプラスミドからＭ１３ベクターに断片をサブクローニングすること、そしてその後ベクタープライマーを用いて、ジデオキシ鎖停止法により製造された実質的に単離された一本鎖ＤＮＡをシーケンシングすること含む。限られた数の場合に、クローン化挿入から生じる配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、クローン化挿入を完了するために使用した。この分析で、ヌクレオチド配列は、許諾され、プステル（Ｐｕｓｔｅｌｌ）プログラム（アイビーアイ（ＩＢＩ））によって分析された。代替アプローチは、第一に染色体ＤＮＡから得られるＰＣＲ増幅によって得られた成功したクローン化挿入の配列決定を含む。オリゴヌクレオチドプライマーは、進行中の配列分析に基づいて合成された。ＰＣＲ増幅産物は、ｐＣＲＩＩクローニングベクター（インビロゲン（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ））にクローン化された。合成オリゴヌクレオチド、蛍光色素標識ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート・ターミネーター、およびＴａｑポリメラーゼでのサイクルシーケンシングを用いたオリゴヌクレオチドプライマー指向性手段によって精製された組換えプラスミドを用いて、二本鎖ＤＮＡシーケンシングが行われた。配列反応産物を、アプライド・バイオシステムズ（ＡＢＩ）モデル３７３Ａ自動蛍光シーケンサーで分析した。連続シーケンシング操作から得られた結果を比較し、そして複合配列を、ＳｅｑＥｄプログラムを用いて、クロマトグラフィの比較によって決定した。この配列を、Ｍａｃ−ＤＮＡＳＩＳプログラムを用い、一本鎖シーケンシングによって得られた配列に連続で比較した。さらに、３つの読取り枠全ての予測タンパク質配列を、数種の異なる種から得られたＴｂｐｓの整列配列と比較して、この配列を分析した。この分析によって同定された不確な任意の領域は、繰返し配列分析を行った。＜結果＞トランスフェリン受容体遺伝子をクローニングする。Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａのトランスフェリン受容体遺伝子のクローニングを増大するために、抗−受容体血清およびＮ−末端アミノ酸配列を得た。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａのセロタイプのＡ１株（Ｈ４４）から得られたアフィニティー精製受容体タンパク質、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢでウサギを免疫化することによって、モノ特異的抗血清を得た。精製された天然Ｈ１９６ＴｂｐＡのエレクトロブロットされた産物のアミノ酸配列分析は、読取り可能な２０のアミノ酸（図２０の頂部）を回収する。精製ＴｂｐＢを用いた類似の分析は、全配列情報を提供するのに失敗し、このタンパク質のＮ−末端が保護されている可能性があることを示唆する。Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの所望のコドン使用表（ｔｂｐＡプライマー０２３、表４）に基づいて、精製ＴｂｐＢの８つのアミノ酸の配列がオリゴヌクレオチドプライマーの設計に使用された。このプライマーは、Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａのプラスミド・バンク（Ｌｏら、１９８５年）から得られるｔｂｐＡ遺伝子の一部のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅用の２つのベクタープライマー（ＲＬ２およびＲＬ３、表４）のいずれかと組合せて使用された。ベクタープライマーＲＬ２および０２３を用いて、８００ｂｐＰＣＲ産物を得て、そして予測アミノ酸配列が、Ｎ−末端アミノ酸配列に一致し、他のＴｂｐＡタンパク質と相同性を示す配列を含んでるので、配列分析によりその確実性を認証した。クローン化ＰＣＲ産物を、エンドヌクレアーゼ消化Ｈ１９６Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ染色体ＤＮＡを限定するサザン分析のための、そしてプラスミドバンクのスクリーニングのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。サザン分析は、プラスミドバンクから得られたクローン化挿入物と比較するためのｔｂｐ領域での染色体ＤＮＡの制限マップを提供した。表４オリゴヌクレオチドプライマー最初に、２つの強力なハイブリダイズコロニーは、大腸菌のクローンから同定された。プラスミドｐ^**（クローン９）は、下流領域に隣接したｔｂｐＡ遺伝子のほとんどを含むが、別の染色体遺伝子座（図２０でｆｉｓ）から得られるＤＮＡと融合された９ｋｂ挿入物を含有した。二次プラスミドｐ^**（クローン１０）は、第一にｔｂｐＡ遺伝子の５末端周囲にある１．２ｋｂ挿入物のみを含んだ。プラスミドｐＲＹＣＬ９中の人工的結合部は、髄膜炎菌性ｔｂｐＢ遺伝子のクローン化を試みながら、同様の人工産物を暗示し、そして遭遇した確実な困難さ（２３）は、Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａｔｂｐＢ領域をクローニングする重要な代替攻略法を迅速する。１つの攻略法は、他の種ｔｂｐＢ遺伝子が、ｔｂｐＡ遺伝子の上流にある（１９、２０、２３）ということと、期待されるＴｂｐＢの予測配列の、短い伸縮物のアミノ酸同定があるという観察に基づいていた。ＴｂｐＢｓのカルボキシル基末端の側の保存アミノ酸配列は、ＴｂｐＡ遺伝子の残り、遺伝子間領域およびｔｂｐＢ遺伝子の３’末端の一部を得るために変性オリゴヌクレオチドプライマー（プライマ−１９２、表４）を設計するのに使用した。このプライマーは、Ｈ１９６染色体ＤＮＡから得られる７００ｂｐ断片を増幅するｔｂｐＡ遺伝子の５末端から配列に基づいたプライマー（プライマー０８８、表４）と組合せて使用した。この挿入物から得られる配列は、ＰＣＲ増幅のための公知ＴｂｐＢｓのリーダーペプチド領域に存在する保存アミノ酸配列に基づいた変性オリゴヌクレオチド（オリゴ１９０、表４）と組合せて使用されるｔｂｐＢ遺伝子の３’末端の確実な配列（プライマー１９９、表４）に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーの設計を可能にした。Ｈ１９６染色体ＤＮＡがテンプレートとして使用される場合に結果として得られた２．４ｋｂＰＣＲ産物は、ｔｂｐＢ遺伝子の確実な３’末端を含んだ。このＰＣＲ断片がｐＣＲＩＩベクターにクローン化され、そしてＴ７プロモーターを利用する発現試験に使用される場合、無傷組換えＴｂｐＢは、リボソーム結合部位およびｔｂｐＢ遺伝子の開始が挿入物の範囲内に含まれることを示しながら、生成される。第二の攻略法は、ＰｓｔＩ消化ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔプラスミドがＰｓｔＩ消化Ｈ１９６染色体ＤＮＡにライゲートされ、ｔｂｐＢ遺伝子の３’末端から得られるプライマー（オリゴ１９９、表４）およびそのベクターから得られるＭ１３逆向プライマーを利用するＰＣＲ反応用のテンプレートとして利用される定着したＰＣＲを利用する。得られた３．５ｋｂ産物を、全ｔｂｐＢ遺伝子および考慮すべき量の隣接の上流領域（図２０でＯＲＦおよびＲＮａｓｅＴ）を含有するプラスミドを産生するＰＣＲＩＩベクターにサブクローン化した。さらに、発現ベクターにｔｂｐ遺伝子をサブクローン化することは、その遺伝子の５および３末端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅および適切な制限部位の混在に関与した。ｔｂｐＡ遺伝子を増幅するための１対のプライマー（プライマー３４９および２５６、表４）は、予測リボソーム結合部位（ｒｂｓ）のすぐ上流にＢａｍＨＩおよびＢｇＩＩＩ部位を導入することに関与し、その結果外因性プロモーターの蓄えが元来のｒｂｓの存在により発現するに違いない。代替５プライマー（２５５、表４）は、開始コドンでのＮｄｅＩ部位の導入に関与し、その結果リボソーム結合部位を適切な位置に供給するｐＴ７−７発現ベクターにクローンすることが可能であった。発現試験がｔｂｐＢ遺伝子の開始の定義的な同定を遂行するので、サブクローン化ｔｂｐＢ遺伝子は、上流シーケンシングプライマー（プライマー３５２、表４）およびＮｃｏＩ部位に隣接した確実な３末端を含むプライマー（プライマー３５０、表４）によるＰＣＲ増幅によって得られた。トランスフェリン受容体遺伝子の特徴：図２０に例示されるとおり、ｔｂｐ遺伝子は、ｔｂｐＡ遺伝子の上流側に位置するｔｂｐＢ遺伝子を伴ったオペロン配列にあるように思われる。配列比較分析では、ｔｂｐＢ遺伝子は、その配列が大腸菌およびエイチ．インフルエンサエから得られるＲＮａｓｅＴに高度に一致するタンパク質をコードする開放読取り枠（ＯＲＦ）によって進行されることを示した。このＯＲＦは、インフルエンサエおよびビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）で同定された仮説的タンパク質に考慮すべき同一性を示すタンパク質をコードする別のＯＲＦによって直に進行された。ｔｂｐＡ遺伝子の下流は、その配列がエイチ．インフルエンザエおよび大腸菌から得られるファクター−フォー−インバージョン（ｆａｃｔｏｒ−ｆｏｒ−ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）刺激（ＦＩＳタンパク質−組換えエンハンサー）タンパク質に７０％同一であるタンパク質をコードするＯＲＦである。これは、トランスフェリン受容体タンパク質遺伝子オペロンの境界を効果的に区別し、そしてこの鉄摂取経路に関連したすぐ隣接する遺伝子がないことを示す。相同なＲＮａｓｅＴをコード化するＯＲＦの末端と、潜在的なリボソーム結合部位を有するｔｂｐＢ遺伝子の開始の間に４２０ｂｐ領域があり、プロモーター部位および制御部位は全て最後の６２塩基対内に存在する（図２０）。残りの３５８ｂｐ介在領域は、おそらくＲＮａｓｅＴ遺伝子の転写停止シグナルおよびｔｂｐオペロンの制御に潜在的に関与した配列を含みうる。推定プロモーター領域は、大腸菌ｓ７０−３５および−１０プロモーター領域の共通塩基のそれぞれ５／６および６／６を含む。先行の研究は、Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａトランスフェリン受容体タンパク質の発現が、培地中で利用できる鉄のレベルによって制御されることを示した（２６）。ｔｂｐＢプロモーターの−１０部位をオーバーラップする推定Ｆｕｒボックスの同定は、鉄による制御がＰ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａでのＦｕｒ相同体の作用によって、転写のレベルにありうることを示唆する。推定Ｆｕｒボックスは、大腸菌Ｆｕｒ結合部位共通配列と同一な１２／１９塩基を有した（ＬｉｔｗｉｎおよびＣａｌｄｅｒｗｏｏｄ、１９９３年）。ｔｂｐＢおよびｔｂｐＡ遺伝子の間に、ｔｂｐＡ遺伝子の上流に推定リボソーム結合部位を含有するが、明らかなプロモーターはない９６ｂｐ遺伝子間領域がある。さらに、この領域に明らかな転写ターミネーターはない。ｔｂｐＡの下流で、遺伝子停止コドンおよびＦＩＳ相同体をコードする遺伝子の停止コドンは、明らかな転写ターミネーターのない９８ｂｐ領域である。セロタイプＡ１のＰ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株Ｈ１９６から得られたｔｂｐＡ遺伝子領域の配列分析は、予測分子量１０６，９２１Ｄａを示すタンパク質をコードする２，７９０ｂｐのＯＲＦを明らかにした（図２２）。残基２８での推定シグナルペプチド切断部位が、成熟タンパク質の公知Ｎ末端アミノ酸配列との比較によって確認された（図２２の頂部）。ＴｂｐＡの予測アミノ酸配列は、エヌ．メニンジチジス（２３）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（８）、エイチ．インフルエンザエ（２０）およびアクチノバシルス・プレウロニウモニアエ（１９）から得たＴｂｐＡの配列と比較された。これらのタンパク質の間の同一のアミノ酸（太宇下線の施されたアミノ酸、図２２）の所在を、Ｔｏｍｍａｓｓｅｎによって予測されたモデル（２８）に基づいたこれらのアミノ酸セグメントの適切なトポロジーと比較した。ほとんどの同一アミノ酸は、短い膜内外βシートに対応する領域に、または膜内外区分にすぐ隣接する内部および外部ループのセグメントに密集していることは明らかである。Ｐ．ＨａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐＡに出た外部ループ４、６および７にシスチンの保存対、そしてループ１０に特徴的なシスチン対があることに注目することは興味深い。これらは、外部ループに構造上の安定性を付与するジスルフィド架橋を示しているようである。セロタイプＡ１のＰ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株Ｈ１９６から得られたｔｂｐＢ遺伝子での配列の分析は、予測分子量６３，４１９Ｄａを示すタンパク質をコードする１，７５２ｂｐのＯＲＦを明らかにした（図２３）。ＴｂｐＢのこの予測タンパク質配列は、エヌ．メニンジチジス（２３）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（１）、エイチ．インフルエンザエ（２０）およびアクチノバシルス・プレウロニウモニアエ（１４）から得たＴｂｐＢの確立された配列と比較された。この予測アミノ酸配列は、１８のアミノ酸リーダーペプチド、成熟タンパク質の予測Ｎ末端アミノ酸としてシスチンを有するシグナルペプチダーゼＩＩ認識配列を包含する。他の種（１４、２４）で脂質化されたと示されたＮ末端シスチンの存在は、このタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を得る能力がないことを説明でき、そして外側膜にそのタンパク質を留める第一の手段としての役割を果たしうる。最近、Ｇｅｒｌａｃｈら（３６）によって同定されたエイ．プレウロニウモニアエＴｂｐＢ（ＴｂｐＡ）の推定結合領域に配列された領域は、二重下線によつて示した。いくつかの短い収縮した同一のアミノ酸を含むアミノ酸配列の全長に見られるいくつかの相同性の領域があることは明らかである（図２４）。より詳しい調査により、そのタンパク質のＮ末端とＣ末端部分にある領域の間にいくらかの相同性があることが明らかになり、トランスフェリンについて観察されたものと類似のそのタンパク質に生じる二葉構造がありうることを示唆した。したがって、配列ＹＫＧＹＷ（ａａ１８５−１８９）およびＹＲＧＴＷ（ａａ４４９−４５３），ＦＴＡＤＦＡＮＫ（ａａ２３７−２４４）およびＦＤＶＤＦＶＮＫ（ａａ４８０ −４８７）、ＧＮＲＦＳＧ（ａａ２７６−２８１）およびＧＮＧＦＧＧ（ａａ５１３−５１８）、およびＬＥＧＧＦＦＧ（ａａ３００−３０６）は、そのタンパク質のＮ末端およびＣ末端の等価な位置に連続した伸縮な相同性のアミノ酸を示す。組換え受容体タンパク質の発現および分析。無傷のｔｂｐＢおよびｔｂｐＡ遺伝子を、Ｈ１９６染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そして組換えタンパク質を生成するための発現ベクターにサブクローン化した。ｔｂｐＢ遺伝子の発現で開始の試みのために、サブクローン化したｔｂｐＢ遺伝子を、上流側プライマー（３５２、表４）およびＮｃｏＩ部位にいって隣接された確実な３末端を含むプライマー（３５０、表４）でＰＣＲ増幅によって得た。ＰＣＲ増幅断片が、ｐＣＲＩＩベクターにサブクローン化されると、全ての５つの得られたクローンは、同じ方向性；Ｔ７プロモーターの下流側およびｌａｃプロモーターの反対方向にある。ｌａｃプロモーターは、多くのコピー数のベクターに固く制御されていないので、この結果は、大腸菌での挿入物の発現が反対に選択できることを示唆する。いったんこの領域の配列が利用可能になれば、プライマー３５２は、ＲＮａｓｅＴのすぐ上流にあるように見えるようになり、そしてしたがって、この遺伝子またはｔｂｐＢ遺伝子のいずれかの発現は、選択的圧力に対応し得た。Ｔ７プロモーターからのＴｂｐＢの発現は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするＣＥ６λファージに感染させることによって完了された。感染の２時間後、ＴｂｐＢについて予期する分子量を有するタンパク質が、明らかであり、このタンパク質は、エレクトロブロティング後抗−ＴｂｐＢ抗血清と反応した。ＴｂｐＢタンパク質を発現する無傷の細胞を免疫化することによって、標識ウシトランスフェリン（ｂＴｆ）の予測可能な結合があり、そしてこのレベルの結合は、先に細胞を超音波処理しても目立った増加をしなかった（データは示されず）。これは、異種起源の大腸菌系で適切な加工として解釈でき、そして細胞表面にＴｂｐＢを引き込むことができるが、外部タンパク質抗原の過発現により外側膜の無欠性の中断は、同等にもっともらしい説明である。予備的結合の研究は、機能のあるＴｂｐＢタンパク質は、産生されるものであることが示唆され、そしてさらなる分析は、そのタンパク質の機能的特性の評価を可能にし、そして天然の受容体複合体の特性を予め特徴づけるのに貢献することを確認するかもしれないことを示していた。したがって、粗膜は、ＴｂｐＢを発現する細胞から作製され、その結合特性を評価するために設計されたアフィニティー単離試験に使用した。これらの試験は、組換えＴｂｐＢが、固定化ｂＴｆによってアフィニティー単離される能力があることを示し、そしてこの単離は、過剰のウシ、ヒツジまたはヤギＴｆによって阻害ｄされる可能性があり、これらの反芻動物Ｔｆｓの３つつベクターＴｂｐ２に効果的に結合する能力を示した。ヒトのトランスフェリンならびにアポ−ｂＴｆは、鉄負荷ｂＴｆを固定化することによって、組換えＴｂｐＢのアフィニティー単離を阻害しなかった。このアッセイは、ｂＴｆのＮ片およびＣ片の両方が、固定化ｂＴｆに対する組換えＴｂｐＢの結合を有効に保護することも示した。ｔｂｐＡ遺伝子を発現するために、予測リボソーム結合部位を維持する１セットのプライマー（オリゴ３４９および２５６、表４）を用いてＰＣＲ増幅を行った（図２１）。ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩベクターにサブクローン化した後、（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする）ＣＥ６ファージで感染させた後は、組換えＴｂｐＡは発現しなかった。クローンのうちの１つの配列分析は、リボソーム結合部位を排除する数種の塩基対の削除を示した。２５５および２５６プライマー（表４参照）を用いたＰＣＲから（最適に位置決めしたリボソーム結合部位を提供する）ｐＴ７−７ベクターのＮｄｅＩ部位へｔｂｐＡ遺伝子をサブクローン化する他の反復試験は、不成功であった。＜考察＞パステウレラ・ヘモリチカ（２６）内のトランスフェリン受容体の存在を示す初期の研究では、単一受容体タンパク質（ＴｂｐＡ）のみが、他の種で２つの受容体タンパク質（ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ）を回収したアフィニティー法によって単離された（３２）。したがって、成長の間にウシのトランスフェリンから鉄を利用する能力（２６）および反芻動物トランスフェリンの特異的結合（３９）は、この受容体タンパク質によっておおいに介在されると当初推定された。ウシのトランスフェリンの反応領域がＣ片（４１）にあることを示した続く研究では、ＴｂｐＡの収量は、ＴｂｐＢのものよりはるかに上回っていたが、２つの受容体タンパク質（ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ）は、修飾アフィニティー法によって単離された。したがって、観察された受容体の結合特性は、いずれの受容体によるもの、そして特にＴｂｐＢにはよらないものと結論的に考える可能性はなかった。ｔｂｐ遺伝子のクローニングおよび組換えＴｂｐＢの発現は、その結合特性を特に評価することができた。これらの研究は、ＴｂｐＢは、それが数種の反芻種から得られたＴｆｓを特異的に結合するとき、天然の受容体複合体（ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ）と同様の宿主特性を有することを示した。対照的に、天然の受容体複合体とは違い、組換えＴｂｐＢは、ｂＴｆのＮ端ならびにＣ端で結合決定基を認識することができ、それは先の研究（ＹｕおよびＳｃｈｒｙｖｅｒｓ、１９９４年）で、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢの間の相互作用は、ｂＴｆのＮ端に結合もするＴｂｐＢの能力に干渉しうることを示唆した。Ｐ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａから得られる固定化膜（ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ）を用いた拮抗的結合アッセイでは、モラクセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）（ＹｕおよびＳｃｈｒｙｖｅｒｓ、１９９３年）を除くほとんどの他の細菌種に見られてきたもの（Ｂｌａｎｔｏｎら、１９９０年；３２；Ｔｓａｉら、１９８８年；３２、３７）と同様の鉄負荷またはアポ形態のｂＴｆ（３０）になんら明らかな優位性はなかった。本研究では、組換えＴｂｐＢは、鉄負荷形態のｂＴｆに強力な優位性を明確に示した。このＴｂｐＢの優位性は、生体内での有効な鉄の摂取を増す上で機能的な関連性を示しうる。実施例４組換えＴｂｐ２および真正Ｔｂｐ１のワクチン能トランスフェリン−結合タンパク質Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２は次の様な理由から魅力的な対象である：ａ）トランスフェリンから鉄を得ることは細菌の生存に必須であるらしいため、、これら抗原に対する抗体反応を防御の獲得を防御すべきである。ｂ）Ｔｂｐ１とＴｂｐ２をコードする遺伝子は各種のＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１単離体で保存されていると思われる。本研究は組換えＴｂｐ２と真正Ｔｂｐ１単独および組み合わせた場合のワクチン能をＰ.ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ摂取実験モデルを用いて試験するものである。＜方法＞Ｔｐｂ１とＴｐｂ２タンパク質はそれぞれＰ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａと組換え大腸菌外膜からここに記載の標準的方法によるアフィニティークロマトグラフイーを用いてアフィニティー精製した。ワクチンは妥当なミネラルオイルをベースとしたアジュバント（ＶＳＡ３）を用いて調製したが、各投与単位容積２ｃｃあたりの各抗原含有量は：Ｔｐｂ２は４５ｍｇ；Ｔｂｐ１は、単独で使用する場合には８５ｍｇ、Ｔｐｂ２と組み合わせた場合には１００ｍｇであった。更に、上記抗原に替えて滅菌希釈液を含むプラセボのワクチンを調製した。試験は、５グループで行われ、接種１０日前にＴｂｐ２で１回免疫した１グループとＴｂｐ２，Ｔｂｐ１＋Ｔｂｐ２、プラセボもしくはＴｂｐ１で２回免疫を受けた各グループが含まれる。初回と２回目の免疫の間隔は３週間であり、ワクチン接種は全てサザンサスキャチェワン（ＳｏｕｔｈｅｒｎＳａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ）の農場で行った。ワクチンは皮下に投与された。接種およそ１０日前に動物をサスカトーン（Ｓａｓｋａｔｏｏｎ）に移しＶＩＤＯ研究施設で飼われた。Ｔｂｐ１投与グループのみ６頭であり、他の全てのグループの動物数は１０頭であった。このＴｂｐ１グループは初めには計画されておらず、Ｔｂｐ１自体の防御能を調べるために後で加えられた。また、Ｔｂｐ２処方で免疫されたウシ１頭がワクチン接種とは無関連の病気の徴候を示したため試験から除外した。ワクチングループの比較を表５にまとめた。表５ワクチン群の組成ワクチン群抗原免疫関作動物数／群 1 Tbp2 １回９ 2 Tbp2 ２回 10 3 Tbp1&Tbp2 ２回 10 4 Placebo ２回 10 5 Tbp1 ２回６まずウシにおよそ２．５×１０⁶ＰＦＵ／ｍｌを含むウシヘルペスウイルス− １株１０８の懸濁液に暴露し呼吸経路を通じて接種し、その４日後におよそ５× １０⁸ＣＦＵ／ｍｌを含むＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａのエアゾールを用いて呼吸経路を通じて接種した。獣医と動物保健技術者が毎日動物を調べ、次のデータを記録した：体重、体温、鼻スコア、元気さ、力強さ、呼吸の具合と病気。これら判定項目の内体重と体温以外のものは０−４のスケールでスコア化した。ワクチン投与に対する血清反応は酵素結合免疫吸着アッセー（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。血清サンプルは第一回と第二回目の免疫化とＢＨＶ−１に暴露した日に採取した。力価はバックグランド値に２倍の標準偏差を加えた値に等しい最適密度が得られた希釈倍率の逆数で表した。Ｔｂｐ１，Ｔｂｐ２およびＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａロイコトキシンに対する反応を測定した。後者の試験は動物が当該生物に自然の状態で暴露しているかを調べる目的の診断試験の意味もある。＜結果＞ａ）ワクチン投与に対する反応：使用したいずれの処方のワクチンの投与についても副作用を示す例はなかった。ワクチン投与に対する血清学的反応はＴｂｐ１、Ｔｂｐ２およびＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａロイコトキシンに対する血清抗体レベルを測定するＥＬＩＳＡを用いて測定した。後者の抗原は該細菌に対する自然暴露によって力価が上昇した動物がいないことを確認するために実施した。各抗原に対する力価は表６に示し、ロイコトキシンに対する力価は第一回のワクチン投与時（採血１）、第二回めのワクチン投与時（採血２）および暴露時（採血３）いずれでも同等であった。３，０００以下の力価を持つ動物は清浄であると考えた。興味深いことに、Ｔｐｂ１抗原に対して有意にセロコンバートとした動物はなかった。別の生物より得たＴｂｐ１を利用している研究者の経験より、期待力価は低くいことが想定されたが、抗体レベルに有意な増加が認められないことは想定外であった。Ｔｐｂ２を投与されたグループは全てワクチン投与に対して良く反応した、そしてＴｂｐ１＋２を投与されたグループの力価はＴｂｐ２グループの力価のはおよそ１／２であるが、その差は有意ではない。表６ワクチンに対する血清学的反応第一回の免疫時（採血１）、第二回めの免疫時（採血２）およびウシヘルペスウイルス−１による暴露時（採血３）に採取した血清サンプルを利用してロイコトキシン、Ｔｂｐ１とＴｂｐ２に対するＥＬＩＳＡ力価を決定した。力価は陰性コントロールに２標準偏差値を加えた値に等しい希釈率の逆数で表した。ｂ）死亡率：実験疾患モデルの通常状態下での死亡率は６０−７０％と計算されている。しかし、本試験での死亡率は上記通常死亡率に比べ高く、それはおそらく暴露後の期間中動物が極端に低い温度に曝されたことによるものと思われる。低温通常は−４０℃域にあり、全ての動物は試験中は野外で飼った。グループ別の死亡率を表７に示し、有意な予防効果を示したグループはＴｂｐ１とＴｂｐ２の両方を投与されたグループだけであった。Ｔｂｐ２単独投与での死亡率は５０％であり、Ｔｂｐ１投与では１００％であったのに比べると有意である。Ｔｂｐ１だけで免疫したものには効果は認められなかった。表７試験の間に観察された群の死亡率ワクチン群死亡率（％） Tbp2(1dose) 78 Tbp2 50 Tbp1&2 10 プラセボ 90 Tbp1 100 ｃ）病気の臨床徴候：グループ別の臨床結果を表８にまとめた。表８には、Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ感染前である４日目の結果も含め、試験全日の臨床結果が含まれている。従って、ワクチンの防御能は４日目から１０日目の結果だけに基づき決めた。本試験期間中の死亡率が高かったことは、測定した全ての臨床パラメータで観察された差が統計的に有意でなくなるほど各グループのサイズを小さくしてしまう効果があった。しかし、明らかにＴｐｂ１とＴｂｐ２の両方を投与されたグループでは、第５日から７日にかけては殆どのカテゴリーのスコアーが低値であった。Ｔｐｂ２で２回免疫化されたグループだけが生存例で病気の臨床徴候に低下が見られたが、併用して免疫化したグループ程では無かつた。Ｔｂｐ１がどれだけ予防に役立つかは、当該抗原に対していずれの抗体反応も見られなかったことから現時点では不明である。ｄ）死亡後の結果：試験中死亡した動物全てについて死体解剖を行った。いずれの死亡例でもＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａが肺から培養され、観察された病理所見はＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａによる繊維素肺炎の病理所見に一致した。＜結果＞Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａＴｂｐ１とＴｂｐ２を含む処方による２種類のワクチン投与が実験的ウシ肺炎感染を有意に予防した。Ｔｂｐ１についてはいずれの血清反応も求められなかったことから、この予防にどれだけ関与しているかは明らかではない。本効果は細胞介在免疫反応によるものだろう。Ｔｐｂ２を２回投与し免疫化すると有る程度の予防効果が得られ、そしてこの抗原量を増やしたり、あるいはアジュバントの種類を変えてワクチン処方を試すことでこの効果をさらに強くすることができるだろう。Ｔｂｐ２に対する免疫反応が併用ワクチンに見られた予防効果の大部分であると考えられる。Ｔｐｂ２の１回投与あるいはＴｂｐ１の２回投与によるワクチン化については、実験感染に対して何らの有益効果も認められなかった。表８群毎の平均臨床スコア。動物に対して、第０日にＢＨＶ−１を抗原投与し、第４日にＰ．ヘモリティカを抗原投与した。実施例５各種反芻動物血清型から得たトランスフェリン受容体の比較ウシ、ヒツジ、およびヤギから単離された様々な血清型のＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｈｅｍｏｌｙｔｉｃａとＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉ株について、反芻動物トランスフェリンとの結合と成長へのトランスフェリン鉄の応用について分析した。本試験の最終目標は、様々な宿主種のトランスフェリン受容体の主要型を決め、様々な反芻動物トランスフェリンに対する特異性について検討し、ウシのシッピング熱やヒツジやヤギの肺炎や子羊の敗血症の原因である株の表面受容体に、抗原性上の関連性があるのかを決めることである。＜材料＞細菌株．本試験に使用した細菌株を表９に示した。Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの臨床型Ａ１単離株（ｈ９３−ｈ９７）（９）およびウシ肺炎の代表的ＡＴＣＣ株（ｈ９８−ｈ１０７）はＤｒ．ＡｎｄｒｅｗＰｏｔｔｅｒ，ＶＩＤＯ、サスカトーン（Ｓａｓｋａｔｏｏｎ）より提供された。肺炎パスツルラ菌感染症に感染したヤギより野外単離されたＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉ株ｈ１７４はＤｒ．ＦｒａｎｋＷｉｌｗａｒｄ，ローヌメリュー社（ＲｈｏｎｅＭｅｒｉｅｕｘ）、リオン（Ｌｙｏｎ），フランスより提供された。ウシ肺炎より単離されたウシ臨床型Ａ１単離体であるＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株ｈ４４は既に記載されている（２６）。ｈ１９６株はＤｒ．Ｌｏ，Ｇｕｅｌｐｈ大学、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ）、カナダ（Ｃａｎａｄａ）より提供された。表９バクテリアの株、血清型及び起源増殖条件．全ての細菌は３０％グリセロール中に−７０℃で保存した。凍結保存からの単離体をチョコレート寒天プレートに線状接種し、５％ＣＯ₂インキュベーター内にて３７℃でインキュベートした。細菌を脳心臓インフュージョンブロス内（ＢＨ１、ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）あるいは３．０ｇ／ｍｌのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を加え、さらに鉄キレート剤であるエチレンジアミンジヒドロオキシフェニル酢酸（ＥＤＤＡ，Ｓｉｇｍａ）を最終濃度１００Ｍ含むＯ’Ｒｅｉｌｌｙ−Ｎｉｖｅｎブルスで増殖して鉄制限培養した。各種トランスフェリンを用いた増殖実験を前記（２６）に従い実施した。トランスフェリンとその誘導体の調製．ウシトランスフェリンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）社より得た。ヒツジ（ヒツジ）およびヤギ（ヤギ）トランスフェリンの調製や３０％もしくは１００％飽和度の鉄を負荷したトランスフェリン（Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら．１９８５）およびトランスフェリンの西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識体（３７）の調製法は前記に同じである。ウシ、ヒツジ、およびヤギトランスフェリン標識体（ＨＲＰ−ｂＴｆ、ＨＲＰ−ｏＴｆおよびＨＲＰ−ｇＴｆ）の調製では、ＨＲＰとトランスフェリン混合液を化学標識してからゲル濾過した。最大活性を示す分画を集め、透析してからその一部を凍結して− ７０℃に保存した。トランスフェリン結合アッセー。トランスフェリンの固相結合アッセーは前記（３２）と同じに実施した。膜もしくは濃縮溶出液をＨＡ紙（ミリポール社（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），マサチューセッツ州ベドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上にスポットしてから０．５％スキムミルクでブロックした後、外紙を４５０ｎｇ／ｍｌのＨＲＰ−標識化トランスフェリンを含むブッロキング液に曝した。洗浄してからＨＲＰ基質混合液で発色させるインキュベーションは前記（３２）に本質的に同じである。トランスフェリン結合タンパク質のアフィニティー単離．ウシ、ヒツジおよびヤギのトランスフェリンをそれぞれ、メーカー取扱説明書の支持に従い３．５ｍｇ／ｍｌの鉄飽和トランスフェリンを含む液を用いてＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂに結合した。未結合のトランスフェリンをカラム容積の１０から２０倍量の６．０Ｍグアニジン塩酸を含む５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝液を用いて取り除き、さらに洗浄した後に結合トランスフェリンに５ｍｇ／ｍｌＦｅＣｌ₃を含む０．１Ｍクエン酸ナトリウム／０．１ＭＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６の緩衝液を含む液を用いて鉄を再負荷した。前記（３２）に従い調製したＰ．ａｅｍｏｌｙｔｉｃａあるいはＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉの鉄欠乏全体膜を１．０ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０で２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。希釈膜はＥＤＴＡとサルコシルをそれぞれ最終濃度が１０ｍＭと０．７５％になるように加え、さらにこの混合液を室温で１５−３０分ゆっくりと振りながら反応させて溶解した。この液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心単離して不溶性の分解物を取り除いた。溶解膜を含む上清を１．５ｃｍ×１０ｃｍのトランスフェリン−アフィニティーカラムにかけ、それから１．０ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．７５％サルコシルを含む５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０でよく洗浄して非特異に結合したタンパク質を除去した。塩濃度を下げた洗浄条件で行った実験の場合、１ＭのＮａＣｌの代わりに洗浄緩衝液には１００ｍＭのＮａＣｌが含まれている。さらに汚染しているタンパク質を除くために０．２Ｍのグアニジン塩酸を含むベッド容積の２ −３倍の洗浄緩衝液での洗浄が必要な場合もあった。２種類のトランスフェリン結合タンパク質（ＴｂｐＡとＴｂｐＢ）は１．０ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％サルコシルを含むベッド容積の２−３倍量の２．０Ｍグアニジン塩酸の５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０溶液を利用することで一緒に溶出することができた。溶出液を集め、直ぐに５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０に対して透析した。上記以上の濃度のグアニジン塩酸処理を行つても通常は受容体タンパク質の収量を上げることはなかった。０．２、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０および３．０グアニジン塩酸をそれぞれ含む、２ベッド容積の各緩衝液を利用して段階的に溶出することで、ＴｂｐＡとＴｂｐＢをそれぞれた単離できた。この溶出液を３リットルの５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０に対し、１８時間中に３回交換しながら透析し、限外濾過により濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、０．５と０．７５Ｍグアニジン塩酸溶出緩衝液の分画にはＴｂｐＢだけが含まれていることが判明し、従ってこれらをＴｂｐＢ調製用として一つに集め、１．５Ｍと２Ｍのグアニジン塩酸溶出緩衝液分画をＴｐｂＡ調製用として一つに集めた。抗ＴｐｂＡおよび抗ＴｐｂＢ単独特異的ウサギ血清の調製．上記に従い調製したＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株ｈ４４より精製したＴｐｂＡあるいはＴｐｂＢおよそ５００μｇをフレンド完全アジュバントと混合してから２匹の雌の白色のニュージランドウサギに筋肉内投与した。ウサギを３週毎に２回当量の抗原をフレンドの完全アジュバントと一緒にして免疫し、最後の免疫から２週後に免疫血清を採取した。ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢに対する血清の特異性はＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に受容体タンパク質とＨＲＰ標識したヤギ抗ウサギＩｇＧを二次抗体に用いたイムノブロッティングにより調べた。分析方法．タンパク質サンプルは既に報告した（３２）通りにＳＤＳ−ＰＡＧＥ後銀染色して解析した。ウエスタンブロット解析を行うために、鉄制限細胞から得たおよそ１−２μｇの精製受容体タンパク質もしくは外膜タンパク質４０μｇを１０％ポリアクリルアミドゲル上で単離した。タンパク質を電気泳動的に２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭグリシン、２０％メタノールと０．１％ＳＤＳ中、１５Ｖで一晩かけてニトロセルロース（ミリポール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州ベドファード（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に写し取った。フィルターを、２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、５００ｍＭＮａＣｌの０．５％スキムミルク液（ＴＢＳ）で室温で３０分ブロックした。膜をブロッキング液で１／１０００に希釈した適当な抗体液に１時間室温で浸し、その後ＴＢＳで２回洗浄してから１／３０００に希釈した二次抗体（ＢｉｏＲａｄ社製西洋ワサビパーオキシダーゼ標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ）に曝した。標識抗体を除いた後にＴＢＳで３回洗浄してからＨＲＰ−基質混合液を用いて発色させた。全細胞アッセーでは、鉄欠損もしくは鉄−添加（対照）細胞を直接ＨＡ紙上にスポットした。ＨＡ紙を乾燥させた後、ブロッキング液で処理してからＴＢＳで洗浄し、それから前述の如くにして抗ＴｂｐＡもしくはＴｂｐＢ抗血清に対する反応性を調べた。スポットされた細胞の対照セットをＨＲＰ−ウシトランスフェリンで１時間処理してからＴＢＳで洗浄し、ＨＲＰ−基質で発色させた。ｔｂｐ遺伝子のＰＣＲ増幅と制限エンドヌクレアーゼ消化分析．Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａおよびＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉ株より得たｔｂｐＡおｙびｔｂｐＢの増幅はＳａｒｉｓらの方法（１９９０）により生細胞を用いて実施した。ｔｂｐＡの増幅はオリゴヌクレオチドｔｐｂＡ５’とｔｂｐＡ３’（表２の＃２５５と＃２５６）を用いて行った。オリゴヌクレオチド＃４０１と＃１９９（表１０）を用いてｔｂｐＢを増幅した。反応条件は９４℃１分、４５℃１分、７４℃２分を３０回繰り返すものである。ＰＣＲ産物は０．５ＸＴＢＥ緩衝液（４５ｍＭＴｒｉｓ−ホウ酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）による１％アガロースゲル電気泳動で単離してから１ｍｌあたり０．５ｍｇのエチジウムブロマイドの入つた上記緩衝液で染色した。Ｓａｕ３Ａ制限エンドヌクレアーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）消化するためにＰＣＲ産物をフェノールクロロフォルムに加えてからエタノールで沈殿させ、それからＳａｕ３Ａで消化した。消化物は０．５×緩衝液中で７．５％アクリルアミドゲルにかけてから上記アガロースゲル例で記載したのと同一方法により染色して分析した。＜結果＞受容体結合の特異性．これまでの研究で、病原性細菌から単離された代表単離体のトランスフェリン受容体は様々な形でヤギ、ヒツジ、およびウシトランスフェリンと相互作用することが示されている（ＹｕとＳｃｈｒｙｖｅｒｓ１９９６）。従ってウシ、ヒツジ、およびヤギから単離したＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａとＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉｓの代表単離体（表９）について各種反芻動物トランスフェリンとの相互作用について調べた。これらの株は全てウシ、ヤギ、あるいはヒツジトランスフェリンを成長の為の鉄源に利用している（データは示さず）。固相結合アッセーでは（図２５）、固定化した鉄欠乏細胞はこれら全てのトランスフェリンと結合し、さらに入れ替え競合結合アッセーではこれら３種類のトランスフェリンの細胞に対する結合阻止効率は等しかった（示されていない）。さらにそれぞれ分子量が１００Ｋｄａと６０ＫｄａであるＴｂｐＡとＴｂｐＢは、ウシ（図２６、パネルＡ）、ヤギあるいはヒツジトランスフェリン（示されていない）を含む固定化したアフィニティー樹脂を利用することで効率的に単離された。これらの結果は、これらの関連した株のグループ内ではトランスフェリン −結合の特異性について差がないことを示している。トランスフェリン受容体タンパク質の免疫学的解析．ウシ、ヤギ、およびヒツジのトランスフェリンが同一受容体を巡って競合するという観察結果は、少なくとも受容体の結合ドメイン内に保存部分があることを示唆している。しかし、異なる血清型から得た個々の受容体タンパク質の間にどれだけ類似性があるのかについては不明であった。この疑問に答えるために、ＴｂｐＡとＴｂｐＢそれぞれについて、そしてその複合体に対する抗体を精製受容体タンパク質（ウシ株ｈ４４から得たＴｂｐＡとＴｂｐＢ）を用いてウサギで作成した。それからこれらの抗血清を、ウシ、ヒツジそしてヤギから得た単離体を含む多様な血清型の代表株の受容体タンパク質に対して試験した。図２６、パネルＢの結果は、Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ血清型Ａ１、株ｈ４４から得た精製したＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ受容体に対して作成した抗血清は同様にして代表株から得た全ての精製受容体と強く反応することを示した。各種株から得た受容体タンパク質の収率には幅があったことから（図２６、パネルＡ）、少数の株について見られた抗血清に対する若干の反応性の違いはこれが原因と考えられた（図２６。パネルＢ）。即ち、これらの結果より両型の受容体タンパク質は、ウシ、ヒツジ、およびヤギのパスツルラ菌感染症の原因であるＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの各種血清型で保存されていることが示唆された。この分析からトランスフェリン受容体タンパク質には交叉反応性エピトープが存在することが示されたが、この交叉反応性エピトープが宿主免疫エフェクター機構が到達可能な細胞表面にあるのか否かについては何らの情報を提供していない。この疑問に答えるための第一段階として、様々な種から得た生きている鉄欠乏細胞の単特異性抗受容体抗血清に対する反応性を調べた（図２７）。これらの実験はＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａのＡ１型株から得たＴｂｐＡおよびＴｂｐＢに対して調製した単特異性抗血清はＡ１型株（ｈ４４とｈ１９６，図２６、パネルＢ）や、その他のＡ血清型株（ｈ９８，ｈ１０３，ｈ１０５とｈ１０７）と反応し、さらに幾つかのＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉ株（ｈ９９，ｈ１００，ｈ１０６）にも弱く反応することを示している。ｈ４４株から得たＴｂｐＡとＴｂｐＢに対して調製した単特異性抗血清は拡大したＡ１型株集団から得た鉄制限完全細胞（データは示さず）と強く反応したが、その内の２株（ｈ９９とｈ１９６）について図２７に示した。その他のＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの血清型（ｈ９８，ｈ１０３，ｈ１０５，とｈ１０７）やＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉ（ｈ９９，ｈ１００およびｈ１０６）との反応性には程度差があった。各種株において、標識したｂＴｆで得られたシグナル（図２７）抗−ＴｂｐＡと抗−ＴｂｐＢ抗血清で得たシグナル（図２７）との間に差が見られることは、生細胞で観察された活性は受容体タンパク質に由来するものであることを示唆している。対照抗血清を用いた時には活性が認められず（データは示さず）鉄欠損細胞では活性が低下している（図２６、パネルＣ）こともこの結論を支持している。トランスフェリン受容体タンパク質遺伝子の遺伝子解析．免疫学的研究を補う目的で、Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａとＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉの各種株のｔｂｐ遺伝子について調べた。血清型Ａ１株（２８）のｔｂｐＡ遺伝子について得られた配列情報を用いて、特異プライマーを当該遺伝子の５と３末について調製した（プライマー＃２５５と＃２５６、表１０）。これらのプライマーを用いることで試験した全ての株の遺伝子から完全なｔｂｐＡ遺伝子が増幅できたが、ｈ１００株についてのみ常に収率が低かった。それから完全な遺伝子（ｈ１００株からのものを除く）をＳａｕ３Ａ制限エンドヌクレアーゼで消化し、得られた断片をポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により解析した。Ａ１株（ｈ４４とｈ１９６、図２８、パネルＡ）に特有で、かつ調べた全てのＡ１型株で同一であるパターンが観察された（データは示さず）。このパターンはその他のＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの血清型の多くにも（ｈ１０５，ｈ１０４，ｈ９８、図２８）存在していた。その他のＡ型株（ｈ１０３とｈ１０７）やＴ株（ｈ１０６とｈ９９）で、一カ所の変化によると思われる１つ以上の断片が関係するパターンの変化が観察された。制限消化分析はＡ１単離体のｔｂｐＡ遺伝子の違いを見つけることはできない。従って、ｔｂｐＡ遺伝子間の変異を素早く、かつ簡便に調べるためには別の方法を採用した。この方法は表面ループであると言われているＴｂｐＡ（とＬｂｏＡ）には、種間によるタンパク質のアミノ酸配列の違いを最も大きく反映している部分があることに基づいている（２１とＬｅｇｒａｉｎら．１９９６）。特にモノクローナル抗体との反応性より表面にあると考えられており（２１）、２株の髄膜炎菌と淋菌とＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株のＴｐｂＡを並べたときに最も大きな違いが観察された（１：Ｌｏｏｓｅｍｏｒｅら．１９９６；ＳｃｈｒｙｖｅｒｓとＧｏｎｚａｌｅｚ１９９６）、大きなループであるとことが想定されている一つの領域がある。Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａＡ１型の当該領域の既知アミノ酸配列（ＶＥＤＴＣＰＴＬＤ）に基づきオリゴヌクレオチドプライマー（＃４５０，表１０）を作成し、５特異的プライマー（＃２５５，表１０）と組み合わせて様々な種類の株についてコロニーＰＣＲ増幅に用いた。図２９のパネルＡに記載の如く、このオリゴヌクレオチドペアーは、一緒に泳動されるバンドが殆ど認められなかったｈ１００株を除く全ての株で、強い緊縮条件下に８００ｂｐのＰＣＲ産物を増幅した。これらの結果は、Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａとＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉの様々な血清型間ではＴｂｐＡの非保存的アミノ酸領域でも有る程度の相同性があることを示している。ｔｐｂＢ遺伝子の多様性を調べるために、まず遺伝子の５と３末端に特異的なプライマー（プライマー＃４０１と＃１９９，表１０）を用いて様々な株から完全な遺伝子を増幅してみた。これらのプライマーは調べた全ての株において完全なｔｂｐＢ遺伝子を容易に増幅した（表１１）。制限酵素消化による分析からは、調べた７種のＡ１株と（図２８，パネルＢのｈ４４とｈ１９６参照)、その他のグループに属する幾つかの株（ｈ１０５，ｈ１０４，ｈ９８）で同一の消化パターンが観察されることが示された。その他の株（ｈ１０３，ｈ１０７，ｈ９９，ｈ１０６，図２８，パネルＢ）では、そのパターンに極めて小さな違いだけが観察された。この様なことから、変動領域に対するオリゴヌクレオヂドプライマーを用いたＰＣＲに基づく方法を利用して、他の研究で発見されている変動領域がＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａでも多様性を示しているか調べるた。リバースオリゴヌクレオチドプライマー（＃３９７，表１０）と５’プライマー（＃４０１，表１０）と組み合わせて、報告されているｔｂｐＢ保存領域の外側を調べた（２６）。同様にしてその他の変動領域から得たフォワードプライマー（＃４００）は３末端オリゴヌクレオチドプライマー（＃１９９）と組み合わせて使用した。Ｔ株の一つｈ９９を除く全ての調べたＡ株およびＴ株について予想通りのｔｂｐＢ部分産物が得られ（図２９Ｂと表１１）、当該遺伝子の５’と３’末端以外だけでなく、その他の種において変動することが知られている多くの領域でも相当の相同性があることが示された。表１０オリゴヌクレオチドプライマー ^*関連遺伝子のコード鎖の向きに対する方向性表１１異なった血清型のパスツレラ・ヘモリティカ由来のｔｂｐＡおよびｔｂｐＢ遺伝子切片のＰＣＲ-増幅キー： +=得られた対照（h196）に匹敵する、予想サイズの生成物 +/-＝予想サイズだが、対照よりも著しく強度が弱い生成物 -=生成物は得られず＜考察＞別の反芻動物より単離されたＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａとＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉでもウシや、ヒツジや、ヤギのトランスフェリンから鉄を獲得できることが知られており（データは示さず）、これは反芻動物のトランスフェリンに特異的に結合する表面受容体によって介在されると考えられている（Ａｌ−ＳｕｌｔａｎとＡｉｔｋｅｎ１９８４）。本研究で用いたＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ（生物型Ａ）とＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉ（生物型Ｔ）株の集団には様々な血清型が存在しており（表９）、このことは受容体介在の鉄獲得機構はこれらの種の中に広く存在していることを示唆している。調べた株間にはトランスフェリン結合活性の発現に関して幅があった。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株でも、標識された宿主トランスフェリンへ（ＨＲＰ−ｈＴｆ）の結合能力について同様の幅があることが知られている（Ｒｏｂｋｉら、１９９３）。異なる株により成長特性が違うことに、このことが部分的に関与しているだろう。しかし、結合アッセーが高い感度と特異性を持つことから、調べた株の受容体活性の有無については明確に示すことができた。競合結合実験とアフィニティー単離実験からは、これら３種類の反芻動物トランスフェリンとの相互作用が同じ受容体タンパク質を介して行われ、調べた株間で相当の類似性があることが示された。この結論はＴｂｐＡとＴｂｐＢに対する単特異的血清を利用した各種Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株から得た受容体タンパク質に関する免疫学的解析によっても支持された（図２６、パネルＢ）。この血清学的解析では対象に生物型ＡとＴに属する異なる血清型株が含まれていたことから、トランスフェリン受容体タンパク質が反芻動物のＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの病原性単離体の間では確かに保存されていると考えられた。異なるＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ株の２種類の受容体タンパク質の間には明らかに免疫学的交叉反応があるが、生体内ではこの交叉反応性には表面のエピトープが関与しているだろう。全細胞／抗体分析を用いた予備的な結果からは（図２７）この様な表面エピトープの存在が示唆されている。いずれの株についても、全細胞／ＨＲＰ−ｂｔｆと全細胞／抗−Ｔｐで、鉄欠損細胞では両反応とも反応性が大きく低下するという共通の反応性パターン（図２７）が観察されたことは、観察された反応性は鉄で制御されたタンパク質に対するものであることを示唆している。細菌種に対する効果的ワクチンを開発する上で、そのワクチンが感染細菌種の多様な血清型／生物型に対してスペクトラムを持つということは重要なことである。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓではＴｂｐＡタンパク質は比較的相同性が高いが、この種に属する２つの科についてはその分子量と抗原特性からＴｂｐＢタンパク質に違いがあることが判明しており（１８）、これら２つの科向けには異なるＴｂｐワクチンを処方しなければならない。Ｐ．ｈｅａｍｏｌｙｔｉｃａ、血清型Ａ１ウシ株（２６）の１００Ｋｄａのトランスフェリン受容体タンパク質（ＴｂｐＡ）はＳｃｈｒｙｖｅｒとＭｏｒｒｉｓ（３２）のアフィニティー精製法を用いて同定した。方法の項に記載した如く行った改良により当該方法によって、Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａでは６０Ｋｄａのタンパク質が多の細菌種に於けるＴｐｂＢ（３２とＲｏｂｋｉら、１９９３）に類似する第二のトランスフェリン結合タンパク質であることを示すことができた。アフィニティー精製法により、調べたＰ．ｈａｅｍｏｋｙｔｉｃａとＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉの株すべてについて同様の分子量を持つＴｐｂＡとＴｐｂＢが単離された（図２６、パネルＡ）。Ｐ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａとＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉについて得た我々の結果は、血清型Ａ１とｈ４４株から得た２種類の精製受容体タンパク質に対する抗血清がその他のＡ１株（ｈ１９６，図２６、パネルＢ）や他のＡ血清型より得た受容体タンパク質を特異的に認識することを示した。その中には鉄制御外膜タンパク質である３５Ｄｄａと７０Ｋｄａのタンパク質に対する回復期血清との反応性において他のＡ型とは異なっていることが知られている（ｈ１０７）血清型も含まれていた。Ｔ株とｈ９９、およびｈ１００から精製された受容体タンパク質の量（図２６，パネルＡ）とその抗血清との反応性（図２６、パネルＢ）は、その他の多くのＡ株と比較した場合低いと思われた。このＴ株に対する抗体活性の低下は全細胞アッセでも観察された（図２７）。しかし、これら株の全細胞−抗体反応性が低下したことと、これらの株のＨＲＰ−ｂＴｆとの反応性が低下したことに一致性が見られた（図２７）。このことは、観察された抗−ＴｂｐＡおよび抗−ＴｂｐＢ抗血清との反応性が低下したことが、実験を行った時の標準増殖条件での受容体タンパク質の発現の差に拠ることを示唆している。ＴｂｐＡとＴｂｐＢタンパク質をコードする遺伝子、ｔｂｐＡとｔｂｐＢは血清型Ａ１（ウシの肺炎性パスツルラ菌感染症の原因となる）では極めて保存性が高く、さらに一般的にはこの高い保存性はＡ型（ヒツジやヤギに肺炎を起こす）までその範囲が拡がっている（図２８）。制限酵素消化解析の範囲をＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉ株まで広げたことによって、その違いが極めて小さいことを発見した（図２８）。特異的５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーと超変異域から得たプライマーを用いたＰＣＲ−増殖実験から（図２９，表１１）、ｔｂｐ遺伝子がＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ種とＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉでは比較的相同であるとう結論が更に支持された。これらの結果はＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅとＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓについて観察された違い（１およびＫｏｏｓｅｍｏｒｅら）とは対照的であるが、さらに多数の血清型の代表株より遺伝子を単離してその配列を解析してこれを確認する必要があるだろう。ｔｂｐ遺伝子に明確な遺伝的異質性が無いことと、様々なＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａとＰ．ｔｒｅｈａｌｏｓｉ株のＴｂｐタンパク質に明確な免疫学的交叉反応性があることは、反芻動物の感染防御の為の広域スペクトラムワクチンの可能性があることを強調している。本発明は好適な実施例と考えられる参考例にて記載されているが、もとより本発明は開示した実施例に限定されるものではない。逆に本発明は添付した請求範囲の精神と展望内にある様々な改良および等価の改変についても包含するものである。本明細書中の刊行物、特許および特許出願の全ては、各刊行物、特許および特許出願の夫々について、その全体が本願に組み込まれることが明示されている場合と同様にして、その全体が本願明細書の一部として本願に組み込まれる。〔明細書中で言及した参照文献の完全な引用〕〔図面の詳細な説明〕図１：ＰＣＲ分析の結果ａ）ＰＣＲ法の模式図。夫々の円は、組換え pBR322プラスミドおよび可能なＰＣＲ反応を表している。Tbp1 プライマー、左側プライマーおよび右側プライマーは、夫々ｔ、ｌおよびｒの文字によって表されている。pBR322プラスミド上のEcoRI部位は、文字Ｅで示されている。上方のプラスミドにおいて、Tbp1プライマーおよび左側プライマーは、太線に対応するＰＣＲ生成物を増幅するであろう。同様に、下方のプラスミドでは、Tbp2 プライマーおよび右側プライマーによって増幅されたＰＣＲ生成物が太線で表されている。ｂ） Tbp1 プライマーおよび左側プライマーにより増幅された 0.8ｋｂのＰＣＲ生成物である。図２： tbpプラスミド9，10および482の制限エンドヌクレアーゼ地図。白抜きのボックスは、リニアに示された pBR322。斜線を付したボックスは、リニアに示されたＰＣＲII。TbpA およびtbpB の位置および向きは、矢印で示した通りである。図３：Ｐ．ヘモリチカ tbpA および tbpB の予備的ヌクレオチド配列。推定のシグナル配列開裂部位を矢印で示した。開始コドン（ＡＴＧ）には下線を付した。図４：Ｐ．ヘモリチカ tbpB（PHTBPB）のプロモータ領域。推定の Fur共通配列は星印で示されている。Ｎ．ゴノロエア（N．gonorrhoeae）のtbpB（NGTB PB）およびＮ．メニンギチジス（N.meningitidis tbpN）の tbpB（NMTBPB）の F ur 共通配列も示されている。図５：Ｐ．ClaIで消化され且つ tbpA 遺伝子でプローブされた、ヘモリチカゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション。レーン１〜１６は、Ｐ．ヘモリチカの血清型１〜１６を表している。レーンＭは、HindIIIで消化され且つ放射能ラベルしたラムダＤＮＡとハイブリダイズされた、分子量マーカーとしてのラムダＤＮＡを表している。図６：Ｐ．HindIII および BamHI で消化され、且つ tbpA 遺伝子でプローブされた、ヘモリチカゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション。レーン１〜１６は、Ｐ．ヘモリチカの血清型１〜１６に対応する。分子サイズは左側に示した通りである。図７：種々の制限エンドヌクレアーゼで消化され、Ｐ．ヘモリチカ tbpA でプローブされた、Ａ．スイス 3714、Ａ．プリューロニューモニエ CM5 およびショープ4074のゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション。レーンＭは、Hi n III で消化され、且つ別に放射能ラベルされたラムダＤＮＡとハイブリダイズされた、分子サイズマーカーとしてのラムダＤＮＡを表している。図８：Ａ．プリューロニューモニエ CM5、ショープ4074およびＡ．スイス 3714における tbaA、tbpB 領域の制限地図。ライン１は、図１５で用いたtbpA プローブを表している。ライン２は、図１６および図１７で用いた tbpAプローブを表している。図９：Ｐ．ヘモリチカ A1 のTbp1（PHTBP）、Ｎ．ゴノローエ（NGTBP1）およびＮ．メニンギチディス（NMI）の（Tbp1）のアミノ酸の整列。右側の数字はアミノ酸の位置を示している。星印は、整列における完全な同一性を示し、ドット印は同様のアミノ酸残基を示す。配列の整列を最大化するためにギャップが導入されており、ダッシュ（−）で示されている。図１０：Ｐ．ヘモリチカ A1 の Tbp1（PHTBPI）とＡ．プリューロニューモニエ血清型１および７のTfb Ａタンパク（APL,APL7）との間のアミノ酸の整列。星印は、整列における完全な同一性を示し、ドット印は同様のアミノ酸残基を示す。配列の整列を最大化するためにギャップが導入されており、ダッシュ（−）で示されている。図１１：Ｐ．ヘモリチカ Tbp1（PHTBP）、Ｎ．ゴノローエ Tbp1（NGTBPI）、Ｎ．メニンギチディスの Tbp1（NMI）、並びにＡ．プリューロニューモニエ血清型１および７のTfb Ａタンパク（APL,APL7）の間の遺伝子的関連性を示す樹状系統図。図１２：Ｐ．ヘモリチカ A1 の Tbp1（PHTBPI）と、大腸菌（E.coli）のTon B依存性外膜レセプターとの間のペプチド整列。星印は、整列における完全な同一性を示し、ドット印は同様のアミノ酸残基を示す。配列の整列を最大化するためにギャップが導入されており、ダッシュ（−）で示されている。図１３：Ｐ．ヘモリチカ Tbp1 タンパクの T7 分析。左側に示すように、分子量は kDa でマークされている。レーン１は、組換えプラスミドの陽性対照。レーン２は、tbpA を含有する組換えプラスミド。レーン３は、ベクタープラスミドの pBluescript(SK)。図１４：Ｐ．ヘモリチカA1 および大腸菌 HB101 由来の内膜および外膜のウエスタンイムノブロット。第一の抗体は、Ｐ．ヘモリチカ A1 の可溶性抗原に対して生じたウサギ抗血清であり、第二の抗体はヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ複合体である。レーンＭは、kDa での分子量マーカーである。レーン１〜４は外膜画分を表し、レーン５〜８は内膜画分を表す。６μｇのタンパクを夫々のレーンに加えた。レーン１および５は、ＬＴ中で増殖した細胞由来の大腸菌タンパク。レーン２および６は、BHIB 中で増殖した細胞由来のタンパク。レーン３および７は、BHIB＋100μM EDTA 中で増殖した細胞由来のタンパク。レーン４および８は、1mM FeSO₄を添加した BHIB＋100μM EDTA 中で増殖した細胞由来のタンパク。図１５：子ウシにプレスポンス(Presponse)^Rをワクチン接種することにより生成された可溶性抗原に対する血清を用いた、ヘモリチカ A1 および大腸菌HB10 1由来の内膜および該膜のウエスタンイムノブロット。第二の抗体は、ヤギ抗ウシアルカリホスファターゼ複合体であった。レーンＭは、kDa での分子量マーカーを表している。レーン１〜４は外膜画分であり、レーン５〜８は内膜画分である。６μｇのタンパクを夫々のレーンに加えた。レーン１および５は、ＬＴ中で増殖した細胞由来の大腸菌タンパク。レーン２および６は、BHIB 中で増殖した細胞由来のタンパク。レーン３および７は、BHIB＋l00μM EDTA 中で増殖した細胞由来のタンパク。レーン４および８は、1ｍM FeSO₄を添加したBHIB＋100μM E DTA 中で増殖した細胞由来のタンパク。図１６：鉄結合バクテリア膜による、ラベルされたトランスフェリンの結合。示されたバクテリア株由来の鉄欠乏細胞から調製した全膜（4μｇタンパク）のアリコートを、ニトロセルロース／酢酸セルロース上にスポットし、ブロッキングした後に、この紙を、示された 450 ng／mlのHRP-複合トランスフェリンを含有する混合物に曝した。続いて、このフィルター洗浄し、方法の部に記載した HRP 基質混合物で現像した。H173、h174、h175、h176 および h44は、血清型および起源が表１に列記されている代表的なＰ．ヘモリチカ株、h50−Ａ．エクリ( A.equuli)である。ウシ、ヒツジ、ヤギおよびウマのトランスフェリンのHRP-bTf 、-oTf、-cTfおよび-eTfH50-Hd）RP複合体。図１７：トランスフェリンのアフィニティーカラムを用いたレセプタータンパクの単離。アフィニティー単離実験は、Ｐ．ヘモリチカ株であるh44（上のパネル)、h173（中間のパネル）および h175（下のパネル）から調製した鉄欠乏全膜を用いて行った。実験は、ウシ・トランスフェリン−セファロース（レーンＡおよびＢ）、ヒツジ・トランスフェリン−セファロース（レーンＣ）、ヤギ・トランスフェリン−セファロース（レーンＤ）またはウマ・トランスフェリン−セファロース（レーンＥ）を用い、方法の部で概説した標準の洗浄条件（レーンＢ〜Ｅ）または低塩洗浄条件（レーンＡ）を用いて行った。2M グアニジン塩酸塩を含有する緩衝液を用いてサンプルを溶出させ、濃縮し、方法の部で説明したようにしてSDS-PAGEおよび銀染色によりアリコートを分析した。図１８：ウシ、ヒツジおよびヤギに由来する異なった血清型のＰ．ヘモリチカ由来のレセプタータンパクの免疫学的分析。代表的な血清型のＰ．ヘモリチカ由来の精製されたレセプタータンパクのアリコートを SDS-PAGE にかけ、電気ブロットし、次いで、方法の部で説明したようにして特異的な抗 TbpB 血清（パネルＡ）または抗 TbpA 血清（パネルＢ）でプローブした。示された血清型をもった以下のＰ.ヘモリチカ株が分析に含められた。即ち、レーン１は株h44(A1)；レーン２は株 h173（タイピング不能）；レーン３は株 h175（A7）、レーン４は株 h176（A9）；レーン５は株 h100（T4）；レーン６は株 h106 （T10）；レーン７は株 h107（A11）である。左側の数字は、標準タンパクの分子量（×1000）を表す。図１９：完全な細胞による、ラベルされたトランスフェリンおよび抗レセプター抗体の結合。示されたバクテリア株を鉄制限条件下で増殖させ、遠心により回収し、50 mM Tris HCl,150 mM NaCl,pH7.5緩衝液中における1-2のＡ₆₀₀に再懸濁させた。この懸濁液の A5μl のアリコートをＨＡ膜に適用し、該膜を乾燥し、ブロックし、次いでラベルされたトランスフェリン（HRP-BtF）または抗レセプター抗体（抗 TbpA、抗 TbpB）を含有するブロック溶液に曝した。基質を用いて現像する前に、後者の膜を洗浄し、続いてラベルされた抗体に曝した。図２０：Ｐ．ヘモリチカの tbp オペロン（上）および調節配列（下）の地図。TbpA および tbpBは、夫々 TbpA および TbpB をコードする遺伝子であり；ｐは tbpB に先行する推定プロモータ領域であり、下の-35部位および-10部位として示した。推定の Fur ボックスは、下の配列に反対向きの二つの矢印で示されている；マスターＴおよびfisは大腸菌およびＨ．インフルエンザRnaseトランスフェラーゼおよび本発明因子のシミュレーションタンパクに対して夫々高度に相同性であるタンパクをコードしているＰ．ヘモリチカ tbp オペロンに隣接した、二つのＯＲＦｓである。加えて、推定のリボゾーム結合部位またはシャイン -ダルガノ（SD）共通配列、転写開始コドン（Met）および停止コドン（SC）も太字で示されている。図２１：Ｐ．ヘモリチカ株H196由来の tbpA 遺伝子のＤＮＡ配列。図２２：パスツレラ・ヘモリチカ株Ｈ196由来のTbpAの推定アミノ酸配列。イタリックで記載したアミノ酸は、実験的に決定された成熟タンパクのＮ末端アミノ酸に対応する。中に引いた線で示される残基は、リーダーペプチド領域を構成している。ナイセリア・メニンギチジス、Ｎ．ゴノローエ、Ｈ．インフルエンザおよびアクチノバチルス・プリューロニューモニエ由来の TbpAs 中のものと同一の残基は太字かつ下線で示されている。また、トマセン（Tommassen）（２８）により提案されたトポロジーモデルに基づいて内部切片（暗い影）、膜間ｂ鎖（明るい影）または外部切片（影ナシ）として提案された領域が示されている。図２３：Ｐ．ヘモリチカ株H196に由来する tbpB 遺伝子のＤＮＡ配列。図２４：Ｐ．ヘモリチカ株H196に由来する TbpB タンパクの予想アミノ酸配列。イタリックで記載したアミノ酸は、成熟タンパクの推定Ｎ末端アミノ酸に対応する。中に引いた線で示される残基は、リーダーペプチド領域を構成している。相同性領域は影を付すことにより示されており、またナイセリア・メニンギチジス、Ｎ．ゴノロー一エ、Ｈ．インフルエンザおよびアクチノバチルス・プリューロニューモニエ由来の TbpAs 中のものと同一の残基は太字かつ下線で示されている。図２５：固相 HRP-TF 結合試験。Ｐ．ヘモリチカおよびＰ．トレハローシの同一の株から調製した全膜を酢酸ニトロセルローススポットし、HPR-bTf、-oTf 、または-gTf と共にインキュベートする前に、スキンミルクでブロックした。方法の部で説明したようにして、クロロナフトール試薬を用いて結合を検出した。左側の文字は株を示し、上の文宇は異なった HTP でラベルされた反芻動物トランスフェリンを示している。図２６：Ｐ．ヘモリチカ血清型 A1 に由来する抗 TbpA および抗 TbpB 抗血清を用いたウエスタンブロット交差反応性の研究。示されたＰ．ヘモリチカおよびＰ．トレハローシ由来のアフィニティー精製したレセプタータンパクを、SDS- PAGE および銀染色によって分離し（パネルＡ）、または方法の部で説明したようにしてウエスタンブロッティングにかけた（パネルＢ）。Tbpタンパクは、方法の部で説明したようにして、抗 TbpB（1/1000）および抗 TbpA（1/1000）ウサギ抗血清の混合物と共にインキュベートすることにより同定された。左側の数字は、キロダルトンでの標準タンパクの分子量（×1000）を表している。図２７：完全な細胞に対するＰ．ヘモリチカ血清型 A1 由来の単一特異的抗 TbpA および抗 TbpB 抗血清を用いた交差反応性の研究。Ｐ．ヘモリチカおよびｐ．トレハローシの示された株由来の鉄制限された完全な細胞のアリコートを、ＨＡニトロセルロース紙にスポットし、ブロッキングした後に、この膜を HRPでラベルされた bTf、抗 TbpA 抗血清または抗 TbpB 抗血清に曝した。続いて、方法の部で説明したようにして、ラベルされた抗ウサギ抗体によって結合した抗体を検出した。鉄が十分な細胞（h44-Fe⁺で示す）下で増殖させた完全なＰ．ヘモリチカ株h44（A1ＧＡＴＡ）細胞の標本を、膜にスポットして対照に用いた。図２８：Ｐ．ヘモリチカおよびｐ．トレハローシ株由来のＰＣＲ増幅された tbpA 遺伝子（パネルＡ）および TbpB 遺伝子（パネルＢ）の制限エンドヌクレアーゼ消化パターン。示された株からコロニーＰＣＲによって増幅された tbp遺伝子を、Sau3A1制限エンドヌクレアーゼで消化した。この得られた消化物を、方法の部で説明したようにして、7.5％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。レーン上の文字は、ＰＣＲで用いた起源株テンプレートＤＮＡを示しているのに対して、左側の文字は、キロベースでの分子量標準を示している。ヒューレット-パッカード社のスキャンジェット Iip で画像化を行った。図２９Ｂにおいては、Ｐ．ヘモリチカ tbpB 遺伝子の非保存領域に由来するプライマー＃397 および＃400 を、それぞれ反対側のプライマー［#401(5')および#199(3')］と組み合わせて用いた。図２９： tbpA および tbpB 遺伝子の可変切片のＰＣＲ増幅。TbaA 遺伝子について、tbpA の超過編領域由来の推定アミノ酸配列から作成されたオリゴヌクレオチドプライマー#450 を５′特異的プライマー（#255）と組み合わせて使用して、種々のＰ．ヘモリチカ株由来の遺伝子切片を増幅した。次いで、生成物を１％アガロースゲル上で分析し、続いて臭化エチジウムで染色した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロウ、レジー・ワイ・シーカナダ国、エヌ１ジー・２エヌ３、オンタリオ、ゲルフ、バーチ・ストリート４ (72)発明者シュリバース、アンソニー・バーナードカナダ国、ティー３エー・３ブイ８、アルバータ、カルガリー、エヌ・ダブリュ、エドフォース・ロード 39 (72)発明者ポッター、アンドリュー・アランカナダ国、エフ７エイチ・３エス５、サスカッチワン、サスカトゥーン、ダルハウジー・クレッセント 521

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｐ．ヘモリチカのトランスフェリン結合性タンパクをコードする配列を含む精製および単離された核酸分子２．請求項１に記載の精製および単離された核酸分子であって、Ｐ．ヘモリチカのTbpAをコードする配列を具備した核酸分子。３．請求項２に記載の精製および単離された核酸分子であって、図２２および配列番号２に示したアミノ酸配列を有するタンパクをコードする核酸分子。４．請求項２に記載の精製および単離された核酸分子であって、（ａ）図２２および配列番号１に示した核酸配列と、（ｂ）核酸配列(a)に対して相補的な核酸配列と、（ｃ）(a)に対して少なくとも 80％相同性である核酸配列または（ｄ）少なくとも15塩基であり且つ厳格なハイブリダイゼーション条件下で(a)または(b)にハイブリダイズする、(a)または(b)のフラグメントとを含む配列を有する核酸分子。５．請求項１に記載の精製および単離された核酸分子であって、Ｐ．ヘモリチカのTbpBをコードする核酸分子。６．請求項５に記載の精製および単離された核酸分子であって、図２４および配列番号４に示したアミノ酸配列を有するタンパクをコードする核酸分子。７．請求項５に記載の精製および単離された核酸分子であって、（ａ）図２３および配列番号３に示した核酸配列と、（ｂ）核酸配列(a)に対して相補的な核酸配列と、（ｃ）(a)に対して少なくとも 80％相同性である核酸配列または（ｄ）少なくとも15塩基であり且つ厳格なハイブリダイゼーション条件下で(a)または(b)にハイブリダイズする、(a)または(b)のフラグメントとを含む配列を有する核酸分子。８．請求項２の精製および単離された核酸分子に、厳格なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力を特徴とする、天然に存在する核酸分子。９．請求項５の精製および単離された核酸分子に、厳格なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力を特徴とする、天然に存在する核酸分子。１０．請求項２の核酸分子の少なくとも 15 の隣接した塩基を含むオリゴヌクレオチドであって、厳格なハイブリダイゼーション条件下で前記核酸分子にハイブリダイズする能力を特徴とするオリゴヌクレオチド。１１．請求項５の核酸分子の少なくとも 15 の隣接した塩基を含むオリゴヌクレオチドであって、厳格なハイブリダイゼーション条件下で前記核酸分子にハイブリダイズする能力を特徴とするオリゴヌクレオチド。１２.ホスト細胞の形質転換のために適用される組換え発現ベクターであって、請求項２に記載の核酸分子と、該核酸分子に対して作動的に連結された１以上の転写要素および翻訳要素とを含む組換え発現ベクター。１３.ホスト細胞の形質転換のために適用される組換え発現ベクターであって、請求項５に記載の核酸分子と、該核酸分子に対して作動的に連結された１以上の転写要素および翻訳要素とを含む組換え発現ベクター。１４．請求項１２の組換え発現ベクターを含むホスト細胞。１５．請求項１３の組換え発現ベクターを含むホスト細胞。１６．精製および単離されたTbpAタンパク。１７．請求項１６に記載の精製および単離されたTbpAタンパクであって、図２２および配列番号２に示したアミノ酸配列またはトランスフェリンに結合できるその断片を有するTbpAタンパク。１８．精製および単離されたTbpBタンパク。１９．請求項１８に記載の精製および単離されたTbpBタンパクであって、図２４および配列番号４に示したアミノ酸配列またはトランスフェリンに結合できるその断片を有するTbpBタンパク。２０．TbpAタンパクを調製する方法であって、（ａ）請求項１２の組換え発現ベクターをホスト細胞に導入することと；（ｂ）非形質転換ホスト細胞から形質転換ホスト細胞を選択することと；（ｃ）形質転換ホスト細胞を、TbpAを発現させる条件下で培養することと；（ｄ）組換えTbpAを単離することとを具備する方法。２１．TbpBタンパクを調製する方法であって、（ａ）請求項１３の組換え発現ベクターをホスト細胞に導入することと；（ｂ）非形質転換ホスト細胞から形質転換ホスト細胞を選択することと；（ｃ）形質転換ホスト細胞を、TbpBを発現させる条件下で培養することと；（ｄ）組換えTbpBを単離することとを具備する方法。２２．TbpAまたはTbpBのエピトープに対する特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体。２３．パスツレラspp.によって生じる感染を予防および治療するためのワクチンであって、免疫学的に有効な量の、Ｐ．ヘモリチカのTbpAおよびTbpBの少なくとも一方と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有するワクチン。２４．請求項２３に記載のワクチンであって、前記感染はパスツレラ・ヘモリチカによって生じるワクチン。２５．パスツレラspp.によって生じる感染を予防および治療するためのワクチンであって、免疫学的に有効な量の、Ｐ．ヘモリチカのTbpAおよびTbpBと、薬学的に許容可能なキャリアとを含有するワクチン。２６．パスツレラspp.によって生じる感染を予防および治療するためのワクチンであって、免疫学的に有効な量の、Ｐ．ヘモリチカのTbpBと、薬学的に許容可能なキャリアとを含有するワクチン。２７．請求項２６に記載のワクチンであって、前記TbpBは図２４および配列番号４に示したアミノ酸配列を有するワクチン。２８．パスツレラspp.によって生じる感染を予防および治療するためのワクチンであって、免疫学的に有効な量の請求項１２の組換え発現ベクターと、薬学的に許容可能なキャリアとを含有するワクチン。２９．パスツレラspp.によって生じる感染を予防および治療するためのワクチンであって、免疫学的に有効な量の請求項１３の組換え発現ベクターと、薬学的に許容可能なキャリアとを含有するワクチン。