CN1257872A

CN1257872A - 用于预防钩端螺旋体病的钩端螺旋体疫苗抗原

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Publication number: CN1257872A
Application number: CN99126504A
Authority: CN
Inventors: D·A·迪尔威斯特; E·A·尤特; M·S·威利
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2000-06-28
Also published as: NZ501213A; US20040043391A1; CA2290219A1; US6800734B2; BR9905780A; AR020852A1; JP2001190285A; EP1020516A2; AU6527299A; ZA997265B; US6482924B1; JP2001204479A; EP1020516A3; JP2001190284A; JP2000189179A

Abstract

提供四种抗原性制备物,每种均包含一种不同的钩端螺旋体蛋白,所述蛋白可免疫学性用于钩端螺旋体所致钩端螺旋体病的疫苗中。本发明还提供编码这四种蛋白质的多核苷酸以及可与这四种蛋白质结合的抗体以及用于诊断钩端螺旋体病。

Description

用于预防钩端螺旋体病的钩端螺旋体疫苗抗原

本发明总体上涉及抗原性制备物，并特别涉及用于在动物体内诱导保护性免疫应答的四种钩端螺旋体膜蛋白，即激酶、通透酶、甘露糖基转移酶(mannosyltransferase)和内鞭毛素(endoflagellin)。这些蛋白质可在免疫学上作为疫苗用于预防由这种微生物所致的钩端螺旋体病。或者，可通过检测这些蛋白质、这些蛋白质的抗体、或编码这些蛋白质的多核苷酸的存在来诊断钩端螺旋体病。

钩端螺旋体属的致病性种均为钩端螺旋体病(一种世界范围内传播的重要的动物传染病)的致病因子。该菌为需氧生长的革兰氏阴性螺旋体。这些细菌有复杂的营养需求并能利用长链脂肪酸作为唯一碳源。钩端螺旋体均可游动，且其快速、螺旋前进的游动性是其区别于其他微生物的鉴别特征。钩端螺旋体均对甲硝唑和5-氟尿嘧啶有抗性，并证实体外增代时间为10-12小时。

所有致病性钩端螺旋体均属于问号钩端螺旋体。最近的DNA同源性研究导致将问号钩端螺旋体重新划分为7个致病性钩端螺旋体种：博氏钩端螺旋体哈德焦牛血清变型(sv hardjobovis)、稻田氏钩端螺旋体、问号钩端螺旋体、L.kirshneri、野口氏钩端螺旋体、圣他罗西亚钩端螺旋体和韦氏钩端螺旋体。引起钩端螺旋体病的致病性钩端螺旋体种的血清学显示，在23个血清型中有超过200个血清变型(“sv”)(Farr，R.W.临床感染性疾病(Clin.Infect.Dis.)21：1-8(1995))。有很多血清变型可引起世界范围的钩端螺旋体病。问号钩端螺旋体波摩那血清变型常见于猪的感染，可引起发烧、黄疸、血红蛋白尿和肾衰竭。问号钩端螺旋体哈德焦牛血清变型是牛患病的重要病因，可引起流产和无乳，并使人在长期暴露于感染的牛后有被牛传染的危险。很多感染动物均无症状表现。但这些动物可成为携带者并通过其尿液排出钩端螺旋体。

经证实牛的钩端螺旋体感染有16％的感染率，且菜牛的感染率高于奶牛。公牛的感染率高于母牛。引起牛钩端螺旋体病的某些血清变型发病率更高。在最近一次对全美48个州的钩端螺旋体阳性牛的调查中发现，84％感染了哈德焦牛血清变型，12％感染了波摩那血清变型，4％感染了流感伤寒血清变型(Miller，D.A.等美国兽医研究杂志(Am.J.Vet.Res.)52(11)：1761-1765(1991))。

有关钩端螺旋体感染的致病原因知之甚少。感染一般通过与感染动物的尿接触而传播。感染尿污染的土地和水也可传播感染，但对钩端螺旋体在这些情况下能否存活很长时间仍有疑问。22℃或以上的温度、一定湿度及中性至稍偏碱性环境有利于钩端螺旋体在宿主体外的存活。钩端螺旋体很易被60℃以上的温度、去污剂、干燥环境和酸灭活。一旦钩端螺旋体侵犯宿主，吸附并穿入黏膜上皮细胞的胞间连接是感染的关键步骤。菌血症(bacteremia)是常见的结果并是与钩端螺旋体病有关的首要病理学状况。一旦进入循环系统，该菌可定居在肾脏，引起肾脏的急性或慢性感染。涉及钩端螺旋体致病机理的一些潜在毒力因子有透明质酸酶、尿素酶、溶血素、和磷脂酶。

钩端螺旋体病由能感染大多数哺乳动物的致病性钩端螺旋体引起。致病性钩端螺旋体的主要天然贮主均为野生哺乳动物，但偶尔也感染其他脊椎动物。此外，已知钩端螺旋体的好几个种是海洋哺乳动物(有太平洋港口海豹(Pacific harbor seals))的病原体(Stampler，M.A.等野生动物疾病杂志(J.Wild.Dis.)34(2)：407-410(1989))。家畜如狗、牛、猪、绵羊、山羊和马也是人类感染的主要来源。感染既可以通过与感染动物直接接触发生，也可以通过与污染的土地或水间接接触而发生。家畜中，由于该病可引起流产、死产、不育、牛奶产量减少和死亡，因而会造成经济损失。

人类钩端螺旋体病的严重性差别很大，主要由感染菌株和宿主的总体健康状况决定。在美国，各地实验室对钩端螺旋体分型能力的提高使得能识别出大量地方性血清变型，以及在不同种动物中的感染范围。但仍然很少能诊断出人类钩端螺旋体病。美国每年报道的病例近100例。

由于钩端螺旋体病在啮齿类动物和家畜中比较普遍，因此得钩端螺旋体病的人主要是工作中严重暴露于动物或动物产品的人，如污水处理工人、养猪者、兽医、屠宰场工人和农民(Vinetz，J.M.，传染病最新观点(Cur.Opin.Infect.Dis.)10：357-361(1997))。易感人群还包括生活在啮齿类动物大批出没的地方如都市贫民区的人，及豢养狗者。男性发病率较高。目前病例主要见于夏秋两季的十几二十岁年轻人。因业余爱好接触而感染的情况越来越常见。

由于污染的池塘或缓缓的溪流引起的社群爆发比较多见。高攻击率、夏季、年轻人群和动物对水源的接近都是这些爆发中的大多数的典型特征。在世界上某些地区，洪水爆发期间的径流也有高传染性。

偶发病例可能是因直接与感染动物接触而获得的。可预防临床病兆的家畜疫苗不能阻止钩端螺旋体的排出。宠物狗是人类偶发病例的主要病源。动物的肾曲小管贮存有活性钩端螺旋体，这些钩端螺旋体可在尿中传送。无症状性尿液排出的持续时间在不同种动物之间各不相同；人类排出钩端螺旋体的时间很少超出数月。

除了与污染的尿发生直接和间接接触，其他传播形式很少见。泌乳动物在乳汁中排放钩端螺旋体，但几个小时后，全奶中的钩端螺旋体即被杀死，已知的人类病例中没有一例是经这种方式发生的。钩端螺旋体不排在唾液中，故动物叮咬不是感染的直接来源。

钩端螺旋体病的发病机理与其他螺旋体疾病(包括由梅毒密螺旋体引起的梅毒和由布氏疏螺旋体引起的Lyme氏疏螺旋体病(Lymeborreliosis))的十分相似。梅毒和Lyme氏疏螺旋体病均以发病早期广泛播散，包括侵犯中枢神经系统为特征。钩端螺旋体由于也有这些致病性螺旋体的这种能力，故脑膜炎是钩端螺旋体病的常见表现。螺旋体感染的另一个特点是在宿主体内持续性感染的能力，就象第三期梅毒和慢性Lyme氏关节炎的表现那样。(深入回顾请参见Baranton，G.和Old，I.G.，巴斯德研究所公告(Bull.Inst.Pasteur)93：63-95(1995))。

由于有毒力的钩端螺旋体既能在环境中长期存活又能持续性感染，并可由野生动物和家畜排出，这使得控制钩端螺旋体病的努力受到阻碍。

钩端螺旋体膜蛋白因其在细菌性发病机理中有重要作用而显得十分重要。对钩端螺旋体致病机理中涉及的膜蛋白的鉴定不仅对于了解钩端螺旋体膜蛋白及其与致病机理的关系有重要意义，而且对于了解其他螺旋体膜蛋白及其在致病机理中的作用也有重要意义。

目前可用的钩端螺旋体疫苗只产生短期免疫力，且不能针对致病性钩端螺旋体170个血清变型中的多数产生交叉保护(Thiermann，等，美国兽医协会杂志(J.Am.Vet.Med.Assoc.)184：722(1984))。这些疫苗由灭活的全钩端螺旋体或经完整钩端螺旋体的显微镜凝集测得将产生血清反应性的外膜制备物组成。尽管数个证据暗示脂多糖样物质(LLS)可能赋予一定程度的保护作用，但这些疫苗制备物中保护性免疫原的天然特征尚未得到结论性阐述。

就有效感染的治疗而言，氧四环素(土霉素)为首选药物，并已常规用于治愈感染和携带状态。使用菌苗或脂多糖样成分的多种疫苗制备物经应用有不同程度的成功。当前疫苗的保护作用倾向于为血清变型特异性并缺乏产生可重复保护的能力。

本发明建立在对与钩端螺旋体致病株相关的四种钩端螺旋体膜蛋白(即激酶、通透酶、甘露糖基转移酶和内鞭毛素)的鉴定基础上。由于螺旋体膜的脆性以及膜蛋白只少量存在的事实，本发明之前对囊括螺旋体膜蛋白在内的膜的报道十分有限。用mRNA扣除杂交法对体内表达的基因进行鉴定是鉴别毒力相关基因的有效方法。本发明描述了对问号钩端螺旋体波摩那血清变型在感染的Syrian仓鼠体内定居于肝脏期间表达的三种基因的鉴定。本发明还描述了用ZAP表达文库从哈德焦牛钩端螺旋体中鉴别出的第四种基因。本发明还描述了具有免疫原性、可用于诱导对致病性钩端螺旋体的免疫应答、可作为钩端螺旋体病诊断指标的四种钩端螺旋体膜蛋白。

图1。钩端螺旋体膜蛋白激酶的全部核苷酸(A)和由此推出的氨基酸序列(B)，为pHLE011和pMW43的ORF1。起始密码子和终止密码子均表示为黑体下划线。

图2。钩端螺旋体膜蛋白通透酶的全部核苷酸(A)和由此推出的氨基酸序列(B)，为pHLE011和pMW310的ORF2。起始密码子和终止密码子均表示为黑体下划线。

图3。钩端螺旋体膜蛋白甘露糖基转移酶的全部核苷酸(A)和由此推出的氨基酸序列(B)，为pMW50的ORF3。起始密码子和终止密码子均表示为黑体下划线。

图4。来自pDFX210的钩端螺旋体膜蛋白内鞭毛素全部核苷酸(A)和由此推出的氨基酸序列(B)。起始密码子和终止密码子均表示为黑体下划线。

本发明提供来自钩端螺旋体致病株的膜的四种免疫原性蛋白质。这些膜蛋白为激酶、通透酶、甘露糖基转移酶和内鞭毛素。本发明还包括编码这些蛋白质的四种多核苷酸序列。

本发明的四种免疫原性蛋白质可应用于诱导对致病性钩端螺旋体的免疫应答的药物组合物中。

本发明包括用重组DNA技术生产这些钩端螺旋体膜蛋白的方法。四种膜蛋白的基因已克隆在随后将用于转化大肠杆菌的质粒载体中。

这四种膜蛋白的细菌性基因很可能衍生自致病性钩端螺旋体的任意菌株。优选蛋白质来自问号钩端螺旋体波摩那血清变型或博氏钩端螺旋体哈德焦牛血清变型。这些钩端螺旋体菌株可从例如ATCC(Rockville，Md.)这样的机构获得。

本发明提供编码四种钩端螺旋体膜蛋白即激酶、通透酶、甘露糖苷转移酶和内鞭毛素的多核苷酸。这些多核苷酸包括编码这四种蛋白质的DNA和RNA序列。当然编码这四种蛋白质之全部或部分的所有多核苷酸，只要它所编码的多肽表现出天然或全长蛋白质的功能，例如诱导抗体或与抗体结合的能力，就也包括在此。这类多核苷酸包括天然的和有目的改造(如诱变)的多核苷酸。

本发明的DNA序列可通过多种方法获得。如，此DNA可用本领域内熟知的杂交操作而得。这些操作包括但不限于：1)用探针与基因组文库杂交以检测共有的核苷酸序列，和2)用抗体筛选表达文库以检测共有的结构特征。

用标记并混合的合成寡核苷酸探针进行杂交程序对于筛选重组克隆十分有用，其中每个探针都可能是包含变性双链DNA异源混合物的杂交样品中一段特定DNA序列的完全互补体。在这样的筛选中，杂交优选针对单链DNA或变性双链DNA进行。通过应用严谨杂交条件以避免非特异性结合，有可能通过例如使靶DNA与混合物中与其完全互补的单个探针杂交而使特定DNA克隆放射自显影(Wallace，等，核酸研究，9：879(1981))。

或者，可用针对诸蛋白质的抗体筛选某表达文库而间接得到这四种本发明的膜蛋白(每种蛋白至少有一个表位)。这些抗体既可以是多克隆也可以是单克隆，它们可用来检测指示钩端螺旋体激酶、通透酶、甘露糖苷转移酶和内鞭毛素DNA存在的表达产物。通常按Huynh，等的方法构建一个λgt11文库并进行免疫学筛选(见分子克隆：实践方案，D.M.Glover编，1：49(1985))。

也可采用以下方法获得编码激酶、通透酶、甘露糖苷转移酶和内鞭毛素的特异性DNA序列：1)从基因组DNA中分离一段双链DNA序列，和2)化学制备DNA序列以提供目的蛋白的必需密码子。

可用聚合酶链式反应(PCR)技术从钩端螺旋体的任意菌株分别获得或扩增这四种钩端螺旋体膜蛋白以便随后克隆并表达编码这四种蛋白质的cDNA(如见美国专利第4,683,202；4,683,195；4,889,818号；Gyllensten等，美国国家科学院学报，85：7652-7656(1988)；Ochman等，遗传学，120：621-623(1988)；Triglia等，核酸研究，16：8156(1988)；Frohman等，美国国家科学院学报，85：8998-9002(1988)；Loh等，科学，243：217-220(1989))。相似地，PCR技术可由本领域的技术人员常规应用，以产生本发明编码四种钩端螺旋体膜蛋白中任意一种的部分的多核苷酸片段。

本领域内技术人员熟知的方法可用于构建含四种钩端螺旋体膜蛋白或其片段的编码序列及相应转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。见如，由Maniatis等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，N.Y.，第12章(1982)所述。

多种宿主表达载体系统可用于表达这四种钩端螺旋体膜蛋白或其片段。这些系统包括但不限于以含有钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物如细菌；以含有钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列的重组酵母菌表达载体转化的酵母菌；以含有钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；或以含有钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列的重组病毒表达载体(如腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞系统。

这些载体的表达因子的长度和特异性各不相同。根据所用宿主/载体系统的不同，任意数量的合适转录和翻译因子(包括组成型和诱导型启动子)可应用在表达载体中。如，当在细菌系统中克隆时，可用诸如λ噬菌体的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合在启动子)之类的启动子；当在昆虫细胞系统中克隆时，可应用如杆状病毒多角体蛋白启动子；当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可应用如腺病毒晚期启动子或痘苗病毒7.5K启动子之类的启动子。也可应用经重组DNA技术或合成技术产生的启动子，以转录插入的钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列。

在酵母菌中，很多含组成型或诱导型启动子的载体可以使用。此方面的回顾见分子生物学最新方案，2卷，Ausubel等编，GreenePublish.Assoc.& Wiley Interscience第13章(1988)；Grant等，酵母菌的表达和分泌载体，酶学方法，Wu & Grossman编，Acad.出版社，N.Y.，153卷，516-544页(1987)；Glover，DNA克隆，2卷，IRL出版社，华盛顿特区Ch.3(1986)；Bitter，外源基因在酵母菌中的表达，酶学方法，Berger & Kimmel等编，Acad.出版社，N.Y.，卷152，673-684页(1987)；酵母属的分子生物学，Strathern等编，冷泉港出版社，卷1和2(1982)。酵母菌互补试验中，可将钩端螺旋体膜蛋白或其片段的cDNA克隆进入因酵母2μ环的存在而在酵母中自主复制的酵母附加体质粒(YEp)。钩端螺旋体膜蛋白或其片段中任一个都既可以克隆在组成型酵母菌启动子如ADH或LEU2之后也可以在诱导型启动子如GAL之后(酵母菌克隆，第3章，R.Rothstein In；DNA克隆，卷11，实践方案，DM Glover编，IRL出版社，华盛顿特区(1986))。构建体可包含同源钩端螺旋体膜蛋白mRNA的或酵母菌基因相应的5’和3’非翻译区。Yep能以高效率转化并且该质粒极其稳定。或可用能促进外源DNA序列整合在酵母菌染色体中的载体。

可用于表达四种钩端螺旋体膜蛋白或其片段之一的一个特别好的表达系统是昆虫系统。在这样的一个系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为载体表达外源基因。该病毒生活在草地夜蛾细胞中。可将钩端螺旋体膜蛋白或其片段的编码序列克隆进该病毒的非必需区(如多角体蛋白基因)中并置于AcNPV启动子(如多角体蛋白启动子)的控制之下。多角体蛋白基因的成功插入将导致产生非包含型重组病毒(即缺乏由多角体蛋白基因编码的蛋白质衣壳的病毒)。这些重组病毒随后可用于感染草地夜蛾细胞，在其中将表达所插入的基因(如，见Smith等，生物学杂志，46：586(1983)；美国专利第4,215,051号)。

如果用腺病毒做表达载体，则可将钩端螺旋体膜蛋白或其片段的编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合体如晚期启动子和三联前导序列进行连接。随后可通过体内或体外重组插入将这一嵌合基因腺病毒基因组。在病毒基因组的非必需区(如E1或E3区)插入将产生在感染宿主体内有活性并能表达钩端螺旋体膜蛋白或其片段的重组病毒。(如，见Logan & Shenk，美国国家科学院学报81：3655-3659(1984))。或者可用痘苗病毒7.5K启动子(如，见Mackett等，美国国家科学院学报，79：7415-7419(1982)；Mackett等，病毒学杂志，49：857-864(1984)；Panicali等，美国国家科学院学报，79：4927-4931(1982))。

为了有效翻译插入的钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列，可能还需要特殊的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子及其邻近序列。如果完整的钩端螺旋体膜蛋白基因组，包括其起始密码子及邻近序列都已插入适当的表达载体中，则可能不再需要另外的翻译控制信号。然而，如果只插入了钩端螺旋体膜蛋白编码序列的一部分，则必需提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。而且，起始密码子必须与钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列的读码框一致，以确保对完整插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的，既可以是天然的也可以是合成的。表达效率可因包含适当的转录提高因子，转录终止子等而增加(参见Bitter等，酶学方法，153：516-544(1987))。

此外，宿主细胞株可选择能以所希望的特殊形式调节插入序列的表达，或对基因产物进行修饰和加工的细胞株。某些启动子驱动的表达在有特定诱导物(如，对金属硫蛋白启动子而言是锌和镉)存在时可增强。因此，可以控制基因工程化钩端螺旋体膜蛋白或其片段的表达。这一点在所克隆的外源基因蛋白产物对宿主细胞有致死性时将十分重要。而且，对蛋白产物的修饰(如糖基化)和加工(如切割)可能对蛋白质的功能十分重要。不同宿主细胞有其特征性的并且是特异性的蛋白质翻译后加工和修饰机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以确保正确修饰和加工所表达的外源蛋白。

含有钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列并能表达具有生物学活性的钩端螺旋体膜蛋白或其片段基因产物的宿主细胞可用至少四种常用方法鉴别：(a)DNA-DNA杂交；(b)“标记”基因功能的有或无；(c)测量钩端螺旋体膜蛋白mRNA转录子在宿主细胞中的表达以评估转录水平；以及(d)用免疫学试验检测钩端螺旋体膜蛋白基因产物或直接测其生物学活性。

在第一种方法中，插入表达载体中的钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列是否存在，可用包含与如近期所述钩端螺旋体膜蛋白编码序列(Goeddert等，1988，美国国家科学院学报，85：4051-4055)或其特殊部分基本同源的核苷酸序列的探针进行DNA-DNA杂交而检测。

在第二种方法中，重组表达载体/宿主系统可根据特定“标记”基因功能(如，胸苷激酶活性、抗生素抗性、氨甲碟呤抗性、转化表型、杆状病毒包含体的形成等)的存在与否进行鉴别和选择。例如，若钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列插入在载体的标记基因序列之中，则含若钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列的重组体可通过标记基因功能的丧失而鉴别。或者，可将标记基因与钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列串联，其启动子与用于控制钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列表达的启动子相同或不同。因诱导或选择而有标记物的表达指示钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列有表达。

在第三种方法中，钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码区的转录活性可用杂交试验评价。例如，可分离RNA，并用与所述钩端螺旋体膜蛋白或其片段编码序列或其特殊部分(Goeddert等，1988，美国国家科学院学报，85：4051-4055)基本同源的探针经Northern杂交进行分析。或者，可抽提宿主细胞的全部核酸并与这样的探针杂交进行分析。

在第四种方法中，可对钩端螺旋体膜蛋白或其片段产物的表达进行免疫学评价，如用蛋白印迹、或诸如放射免疫沉淀、酶联免疫分析之类的免疫试验评价。

一旦鉴别出表达钩端螺旋体膜蛋白或其片段的重组体，就可以对基因产物进行分析。这一点可借助对产物物理特点、免疫学特点或功能性特点的分析进行。

不管钩端螺旋体膜蛋白或其片段是由完整基因序列，或基因序列的一部分，还是由两个或多个连接在一起指导嵌合蛋白生产的基因序列所产生，它们都应具有免疫反应性。这种反应性可用标准的免疫学技术如放射免疫沉淀、放射免疫竞争或免疫印迹来证实。

编码本发明四种膜蛋白的DNA序列可通过使DNA转染适当的宿主细胞而在体外表达。“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是载体可在其中增殖并表达其DNA的细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何子代。应理解不是所有子代都与亲代细胞相同，因为复制时有可能发生突变。但当用到上述术语时，这类子代都包括在内。

本发明所用术语“宿主细胞”不仅包括原核细胞，还包括酵母、丝状真菌这样的真核细胞，以及植物细胞和动物细胞。术语“原核”包括可用本发明四种钩端螺旋体膜蛋白的基因转化的所有细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌，如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和枯草芽孢杆菌。

编码本发明四种钩端螺旋体膜蛋白的重组DNA分子可用本领域一般技术人员所知的任何技术转化宿主细胞。尤其优选用含四种钩端螺旋体膜蛋白编码序列之任一种的质粒进行原核转化。若宿主为原核细胞，如大肠杆菌，则能摄入DNA的感受态细胞可通过收获指数生长期细胞并随后用本领域熟知的CaCl₂法处理而制备。或可用MgCl₂或RbCl。转化也可在形成了宿主细胞的原生质体后进行。

在本发明中，可将四种钩端螺旋体膜蛋白编码序列之任一种插入重组表达载体。术语“重组表达载体”指已经插入或掺入四种钩端螺旋体膜蛋白基因序列中任一种的本领域所知质粒、病毒或其它载体。这类表达载体包含可促进所插入基因序列在宿主中有效转录的启动子序列。表达载体一般包含复制起点、启动子、以及能对转化细胞进行表型选择的特定基因。转化的原核宿主可按本领域所知的方法进行培养以获得细胞的最佳生长。在酵母中表达外源基因的各种穿梭质粒已有报道(Heinemann等，自然，340：205(1989)；Rose等，基因，60：237(1987))。能在宿主中表达并复制的生物学功能性DNA载体为本领域已知。这类载体可用于插入本发明DNA序列。

已有制备融合的、可操作连接的基因并在细菌中使之表达的方法，如参见已引入本文做参考的美国专利第4,366,246号。该专利中所述的基因构建体及方法可用于在原核宿主中表达四种钩端螺旋体膜蛋白之任一种。

可用于本发明的启动子实例有：rec A，trp，lac，tac，和λ噬菌体p[R]或p[L]。可用于本发明的质粒实例如Maniatis等(分子克隆，冷泉港实验室，1982)所列。

本发明提供的抗体对四种钩端螺旋体膜蛋白之任一种有免疫反应性。基本上由针对不同表位的汇合单克隆抗体组成的抗体，以及各个单克隆抗体制备物均有提供。单克隆抗体是由含蛋白质片段的抗原经本领域已知的方法制备而成(Kohler等，自然，256：495(1975)；分子生物学最新方案，Ausubel等编，(1989))。

本发明所用术语“抗体”包括完整分子及其片段，如Fab，F(ab’)2和能结合表位决定簇的Fv。这些抗体片段保留了一些与其抗原或受体选择性结合的能力，对它们可作如下解释：(1)Fab这种包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，是用木瓜蛋白酶对完整抗体进行消化而产生的完整轻链和一条重链的一部分；(2)Fab’这种抗体片段是用胃蛋白酶处理完整抗体、再经还原产生的完整轻链和重链一部分；每个抗体分子可得到两个Fab’片段；(3)F(ab’)₂这种抗体片段是用胃蛋白酶处理完整抗体但不进行还原而产生的；F(ab’)₂是以二硫键连接两个Fab’片段形成的二聚体；(4)Fv是包含轻链可变区和重链可变区并表达为两条链的基因工程化片段；和(5)单链抗体(“SCA”)是以适当的多肽接头连接轻链可变区和重链可变区形成基因工程化融合的单链分子。

制备这些片段的方法本领域已知。(如参见Harlow和Lane，抗体：实验室手册，冷泉港实验室，纽约(1988)，已引入本文做参考)。

如本文所用，术语“表位”指抗原表面与抗体互补位结合的任何抗原性决定簇。表位决定簇通常由分子表面具有化学活性的基团如氨基酸或糖侧链组成，并通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。

可与本发明四种钩端螺旋体膜之任一种结合的抗体可用完整多肽或包含目的小肽的片段作致敏抗原制备而成。

SEQ ID NO：1-4的任一种蛋白质或其片段也可通过化学合成这四种蛋白质之任一种的氨基酸序列而产生(Goeddert等，美国国家科学院学报，85：4051-4055(1988))，这些氨基酸序列可通过对这四种钩端螺旋体膜蛋白之任一种的编码cDNA的克隆和测序预测。这四种钩端螺旋体膜蛋白可用本领域已知的标准肽合成法化学合成。这些方法包括R.Bruce Merrifield发明的固相法(Erickson和Merrifield，“固相肽合成”，《蛋白质》，卷2，H.Neurath &R.Hill(编)，Academic出版公司，纽约，255-257页；Merrifield，“固相肽合成”，科学，242：341-347(1986))。在固相法中，氨基酸被逐步添加到与不溶性基质如聚苯乙烯珠相连的逐渐延伸的肽链上。此法的一个主要优点是每一步的目的产物均与可快速过滤和清洗的珠子结合，从而无须纯化中间产物。所有反应均在一个容器内进行，这样可以排除重复转移产物所造成的损失。此化学肽合成固相法很易自动化，使之有可能以高产率及高纯度常规合成包含约50个残基的肽(Stewart和Young，固相肽合成，第二版，Pierce化学公司(1984)；Tam等，美国化学协会杂志，105：6442(1983))。

可由cDNA翻译或化学合成得到用于免疫动物的SEQ ID NO：1-4中任一种蛋白质或其片段，它们可与载体蛋白偶联(若有必要)。这类常用的与肽化学偶联的载体包括匙孔蝛血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。随后用偶联肽免疫动物(如小鼠、大鼠、或兔子)。

若有必要，可进一步纯化多克隆或单克隆抗体，如通过对吸附有引起抗体产生的四种蛋白质或其片段的基质进行结合和洗脱而纯化。本领域的技术人员知道有免疫学领域常用的各种技术可用于纯化和/或浓缩多克隆抗体及单克隆抗体(参见如Coligan等，第9单元，免疫学最新方案，Wiley Interscience，1991，已引入本文做参考)。

也可以用抗独特型技术产生模拟表位的单克隆抗体。如，针对第一单克隆抗体的抗独特型单克隆抗体在其高变区中有一个结合区是第一单克隆抗体所结合的表位的“影象”。

对本发明四种蛋白质中任一种的一级氨基酸序列的微小修饰可产生与本文所述天然钩端螺旋体蛋白基本上功能等价的蛋白质。这类修饰可以是有意的(如定向诱变)，也可以是自发的。通过这些修饰产生的所有蛋白质只要具有天然的功能(即能与特异于四种钩端螺旋体膜蛋白之任一种的抗体结合)，即都包括在此。

对四种膜蛋白中任一种的一级氨基酸序列的修饰还包括保守性变异。在此所用术语“保守性变异”指一个氨基酸残基由另一个生物学上相似的残基替代。保守性变异的实例包括疏水性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的相互替代；或极性残基之间的相互替代，如以精氨酸替代赖氨酸、谷氨酸替代天冬氨酸、或谷氨酰氨替代天冬酰氨，等等。术语“保守性变异”还包括用替代氨基酸替换原来的氨基酸，只要针对该替代型蛋白质或其片段产生的抗体与未替代的蛋白质或其片段也能发生免疫反应即可。

对本发明提供的微生物表达蛋白或其片段的分离和纯化，可用传统的方法，包括涉及单克隆或多克隆抗体的制备型层析和免疫学分离进行。

本发明进一步包括按所述方法，或本领域一般技术人员已知的其它方法(如用溶源噬菌体转移遗传物质，并使某原核生物表达四种钩端螺旋体膜蛋白激酶、通透酶、甘露糖基转移酶或内鞭毛素的基因)修饰的任意宿主。用编码本发明四种膜蛋白的四种钩端螺旋体基因中任一种转化的原核生物尤其对可用于免疫动物(如兔子)的多肽的产生十分有用。

在一个实施方案中，本发明提供可用于在动物体内诱导针对致病性钩端螺旋体的免疫应答的药物组合物，该药物组合物在制药学上可接受的载体中包含免疫学有效量的四种钩端螺旋体膜蛋白之任一种蛋白。描述本发明时用的术语“免疫学有效量”，指在动物体内诱导产生针对钩端螺旋体的免疫应答所必需的钩端螺旋体抗原量。本发明的四种钩端螺旋体膜蛋白特别可用于使动物的免疫系统致敏，从而产生能改善钩端螺旋体感染影响的免疫应答。

本发明的四种钩端螺旋体膜蛋白之任一种可经非胃肠道途径给药，如注射、快速灌注、鼻咽吸入、皮肤吸收和口服。非胃肠道给药的药学上可接受载体制剂包括无菌的或水性的或非水性的溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射的有机酯如油酸乙酯。可用封闭敷裹的载体增加皮肤的渗透性和抗原的吸收。口服给药的液体药剂形式常包括内有该液体药剂形式的脂质体溶液。悬浮脂质体的适当形式包括乳液、悬浮液、溶液、糖浆和含本领域常用惰性稀释剂的酏剂(如纯水)。除了惰性稀释剂，这类组合物还可包括佐剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、以及增甜剂、调味剂和加香剂。

含本发明四种钩端螺旋体膜蛋白中任一种的抗原制剂还可包括佐剂。佐剂是能非特异性增加特异性免疫应答的物质。通常，佐剂和抗原在呈递给免疫系统之前先混合，或分别呈递但进入免疫动物(含人)的同一部位。佐剂根据其组成可粗分为几组。

这些组包括油性佐剂(如弗氏完全和不完全佐剂)、矿物盐(如AlK(SO₄)₂，AlNa(SO₄)₂，AlNH₄(SO₄)，硅石，明矾，Al(OH)₃，Ca₃(PO₄)₂，高岭土，和碳)、多核苷酸(如poly IC和poly AU酸)、以及某些天然物质(如结核分枝杆菌的蜡质D，和在小棒杆菌、百日咳杆菌及一些布鲁氏菌属成员中发现的物质)。

在另一个实施方案中，提供了在动物(含人)体内诱导对致病性钩端螺旋体的免疫应答的方法。当使用多次免疫方案时，相应于不同的免疫时间安排有很多不同的技术。可对本发明的抗原制剂使用不止一次，以增加免疫动物免疫应答表达的水平和多样性。通常，若实行多次免疫，每次免疫将间隔2-4周。预期在其体内产生对钩端螺旋体的免疫应答的受试动物包括猪、牛和人。

通常，施与动物(含人)的本发明四种钩端螺旋体膜蛋白之任一种的剂量，将根据诸如年龄、身体状况、性别和发病范围(若有的话)以及可由本领域一般技术人员作出调整的其它变化而有所不同。

本发明的抗原制剂可给予单剂或多剂，每剂中四种钩端螺旋体膜蛋白抗原中任一种的剂量约10ug至1,000ug，更优选每剂约50ug至700ug抗原，最优选每剂约50ug至300ug抗原。当用于免疫治疗时，本发明的单克隆抗体可不做标记或用治疗性试剂标记。这些试剂可直接或间接与本发明的单克隆抗体偶联。间接偶联的一个实例是应用间隔部分。这些间隔部分可以是不溶的或可溶的(Diener等，科学，231：148(1986))，并可加以选择以使药物在靶位点从单克隆分子中释放出来。可与本发明的单克隆抗体偶联用于免疫治疗的治疗性试剂实例有药物、放射性同位素、凝集素和毒素。标记或未标记的本发明单克隆抗体也可与诸如上述的治疗性试剂联合应用。

尤其优选的是包含本发明的单克隆抗体、免疫调节剂和其它生物应答调节剂的联合治疗。本发明的单克隆抗体与各种治疗性试剂(如上述那些)联合应用时，单克隆抗体和治疗性试剂常基本上同时给予。术语“基本上同时”指单克隆抗体和治疗性试剂的给予时间合理地接近。通常，优选先给予治疗性试剂，再给予单克隆抗体。如治疗性试剂可在给予单克隆抗体的前1至6天给予。治疗性试剂的给予可以是每天一次，或考虑诸如病情、病人的状况和试剂的半衰期等因素而选择任何间隔期。

本发明单克隆抗体的给药剂量将大到足以在改善钩端螺旋体病症状发作时产生预期效果。剂量不应大到引起副作用(如不希望的交叉反应、过敏反应等)。一般剂量将根据受试者的年龄、状况、性别和患病程度有所变化，并可由本领域技术人员确定。在有并发症时剂量可由医生个人作出调整。剂量可从约0.1mg/kg至2000mg/kg变化，优选约0.1mg/kg至500mg/kg，每天一或多剂，持续一或数日。通常，当本发明的单克隆抗体与治疗性试剂联合应用时，可选用低于体内诊断造影所用的剂量。

本发明的单克隆抗体可经注射或输液进行非胃肠道给药。本发明的单克隆抗体可单独或与效应细胞联合经静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内、或穿皮给药。

非胃肠道给药制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液(包括盐水和缓冲基质)。非胃肠道载体包括氯化钠溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠，乳酸化Ringer’s静脉内载体包括流体和营养补偿物、电解质补偿物(如以Ringer’s葡萄糖为基础的那些补偿物)等等。也可包括防腐剂和其它添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。

在另一个实施方案中，本发明提供检测动物(含人)体内致病性钩端螺旋体相关性疾病的方法，包括用可与细胞成分结合的试剂接触细胞成分。该细胞成分可以是核酸(如DNA或RNA)或蛋白。若成分为核酸，则试剂为核酸探针或PCR引物。若细胞成分为蛋白，则试剂为抗体探针。

探针用如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合物或酶等可检测性标记。本领域一般技术人员将知晓可用于与抗体结合的其它适当的标记，或能用常规实验确定之。

为了本发明的目的，可用特异于本发明四种钩端螺旋体蛋白中任一种的抗体或核酸探针检测生物流体或组织中该蛋白(用抗体)或多核苷酸(用核酸探针)的存在。含有四种钩端螺旋体膜蛋白抗原或多核苷酸中任一种的可测量的任意样品均可使用。本发明的优选样品为血液、尿液、脑脊液或内皮来源的组织。

若细胞成分为核酸，可能需要在与钩端螺旋体特异性探针结合前扩增该核酸。优选用聚合酶链式反应(PCR)，但也可用其它核酸扩增操作，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。

另一项也有较高灵敏度的技术是将抗体与低分子量半抗原偶联。这些半抗原可随后用第二反应特异地检测。如常用的半抗原有与抗生物素蛋白反应的生物素，或可与特异性抗半抗原抗体反应的二硝基苯、吡哆醛和荧光素。

或者，可用本发明四种钩端螺旋体膜蛋白中任一种检测样品中它们各自的相应抗体。本发明四种钩端螺旋体膜蛋白尤其适用于免疫试验中，其中它可在液相中或与固相载体相结合的形式使用。此外，用于这些试验中的四种钩端螺旋体膜蛋白中任一种可用多种方法可检测性标记。

可应用本发明四种钩端螺旋体膜蛋白中任一种的免疫试验实例有直接或间接的竞争或非竞争免疫试验。这类免疫试验的实例有放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附试验、夹心(immunometric)试验、沉淀素反应、凝胶免疫扩散试验、凝集试验、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析和免疫电泳分析、蛋白印迹分析。对可与本发明四种钩端螺旋体膜蛋白中任一种结合的抗体的检测可应用正向、逆向、或同时发生模式进行的免疫试验，包括免疫组化试验对生理样品进行。所用钩端螺旋体膜蛋白的浓度根据免疫试验类型和所用可测性标记的特点不同而不同。但，若不考虑所用免疫试验的类型，所用钩端螺旋体膜蛋白的浓度可由本领域一般技术人员用常规实验轻易确定。

本发明四种钩端螺旋体膜蛋白中任一种可与很多不同载体结合，用于检测能与该蛋白特异性反应的抗体的存在。

已知载体的实例有玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然及修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。本发明所用载体可以是可溶性的或不可溶性的。

本领域的技术人员将知晓可与本发明四种钩端螺旋体膜蛋白中任一种结合的其它适合载体，或能用常规实验确定它们。

有很多不同的标记物和标记方法为本领域的一般技术人员已知。可用于本发明的标记物类型的实例有酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物。

为本发明的目的，与本发明的任一种钩端螺旋体膜蛋白可结合的抗体均可能存在于各种生物流体和组织中。含可检测量的针对四种钩端螺旋体膜蛋白中任一种的抗体的任何样品均可使用。一般，样品为液体(如尿液、唾液、脑脊液、血液、血清等)，或固体或半固体(如组织、粪便等)。直接针对本发明四种钩端螺旋体膜蛋白中任一种的本发明单克隆抗体也对体内抗原检测十分有用。可测性标记单克隆抗体按诊断有效的剂量给予。术语“诊断有效”指可测性标记的单克隆抗体的给予量足以实现对该单克隆抗体特异性的四种钩端螺旋体膜蛋白抗原中任一种进行检测。

所给可测性标记单克隆抗体的浓度应足以使与那些带有四种钩端螺旋体膜蛋白中任一种的细胞、体液、或组织的结合相比于本底可以检测出来。而且，可预期该可测性标记单克隆抗体将从循环系统中快速清除，以便产生最佳目标背景(target-to-background)信号比。

体内诊断用的可测性标记单克隆抗体按规律将根据诸如动物(含人)的年龄、性别、和疾病程度的不同而不同。单克隆抗体的剂量可在约0.001mg/m²至约500mg/m²之间变化，优选约0.1mg/m²至约200mg/m²，更优选约0.1mg/m²至约10mg/m²。这类剂量可根据如是否进行多次注射，以及本领域技术人员已知的其它因素进行改变。

体内成像时，所提供检测仪器的类型是选择放射性同位素时要考虑的主要因素。所选放射性同位素应具有所用仪器可检测的衰减类型。另一项在体内成像时选择放射性同位素要考虑的另一重要因素是，放射性同位素的半衰期将应足够长，以便能在靶位点的最大吸收峰时仍可检测，但也应足够短，以使宿主接受的有害放射为最小。理想情况是，用于体内成像的放射性同位素没有粒子发射，但产生大量传统γ照相机易测得的140-250 key range的光子。

体内诊断中，放射性同位素可与免疫球蛋白通过中间官能团直接或间接结合。常用于将金属离子性的放射性同位素与免疫球蛋白相结合的中间官能团均为双功能螯合剂，如二乙三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)及类似分子。可与本发明单克隆抗体结合的金属离子的典型实例为¹¹¹In，⁹⁷Ru，⁶⁷Ga，⁶⁸Ga，⁷²As，⁸⁹Zr，和²⁰¹Tl。

本发明单克隆抗体还可用顺磁性同位素标记以进行体内诊断，如用在磁共振成像(MRI)或电子自旋共振(ESR)中。一般可应用任何传统的显示诊断成像方法。常用发射γ和正电子的放射性同位素进行照相机成像，用顺磁性同位素进行MRI。这类技术中特别有用的因子包括¹⁵⁷Gd，⁵⁵Mn，¹⁶²Dy，⁵²Cr，和⁵⁶Fe。

本发明的单克隆抗体可用于监控钩端螺旋体相关疾病的改善过程。故通过测量各种体液或组织中本发明四种钩端螺旋体膜蛋白之任一或其相应抗体的增减，有可能确定为改善疾病而采取的特定治疗方案是否有效。

本发明方法中所用材料最好适合于制备试剂盒。这样一个试剂盒包含严密划分好的载体，可容纳一或多个诸如小瓶、小管之类的容器，每个容器可包含所述方法中所用的一个因子。如，其中一个容器可包含针对四种钩端螺旋体膜蛋白之任一种的结合试剂(如抗体)。第二个容器可再包含由该抗体识别的四种钩端螺旋体膜蛋白之任一种。其组成按所需可为液体或冻干形式。

以下实施例旨在举例说明本发明，无意限制。尽管它们是应用中的典型，但也可换成本领域技术人员已知的其它操作。

以下实施例描述了对活性钩端螺旋体感染动物期间产生的四种重要钩端螺旋体膜蛋白(即激酶、通透酶、甘露糖基转移酶和内鞭毛素)的鉴定。描述了这些基因的克隆和测序方法。显示了序列分析和同源性研究，进一步说明这些蛋白是致病性钩端螺旋体的膜蛋白，因此有可能是很好的疫苗。实施例1细菌菌株和生长条件

问号钩端螺旋体波摩那血清变型2966和博氏钩端螺旋体哈德焦牛血清变型Hb197得自养牛场原始分离的冻存物。所有体外培养的钩端螺旋体于30℃在PLM-5肉汤中培养。大肠杆菌DH5α在含或不含100μg/ml青霉素或50μg/ml卡那霉素的Luria-Bertani培养基中培养。在构建和扩增基因组小文库时应用大肠杆菌LE392。所有大肠杆菌于37℃培养。某些例中(pDFX210，ORF1)，用pL热休克启动子实现异源克隆化蛋白质在大肠杆菌宿主中的表达。在这些条件下，菌株首先于30℃在2x酵母胰蛋白胨培养基中培养至光密度(695nm)达0.5。然后将培养物移至42℃以诱导蛋白质表达。问号钩端螺旋体波摩那血清变型和博氏钩端螺旋体哈德焦牛血清变型Hb197的动物传代

毒性培养物的动物传代在Syrian仓鼠中进行，用受感染动物的肝脏匀浆物作为随后传代的接种物。将10^-1稀释于Stuart’s培养基或补加了0.1％琼脂糖的PLM-5中的已感染肝脏匀浆物共0.2cc将用于皮下(问号钩端螺旋体波摩那血清变型)和腹膜内(问号钩端螺旋体哈德焦牛血清变型)接种仓鼠进行传代。对肝脏匀浆物涂片进行显微镜检查以证实螺旋体的存在。来自受感染仓鼠肝脏的细菌mRNA的提取和纯化

受钩端螺旋体感染的仓鼠用CO₂施行安乐死，随后断颈。经尸检收获肝脏并用冰冷的PBS洗两次。将肝脏重新悬浮于10ml PBS(室温)，再加入等量的溶于50mM柠檬酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠中的4M异硫氰酸胍。将该悬浮液于冰上温育并间或旋转直至组织明显分离。迅速加入水饱和酚(pH5.2)促进DNA的清除。将该混合物旋转1分钟，再于室温下10,000xg离心30分钟。含核酸的水相用TRIS缓冲的苯酚(pH8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次。向这一主要含RNA的水相加入3M乙酸钠(pH4.5)0.1倍体积和95％乙醇2.5倍体积进行沉淀并于-20℃过夜。核酸将沉淀成团，进行清洗。为进一步去除剩余DNA，在3M乙酸钠(pH6.0)5ml中抽提沉淀团。重复抽提直至核酸沉淀透明。RNA的质量和数量通过检测254nm/280nm和260nm/230nm的光吸收值比率进行分光光度计测定。

用oligo dT纤维素层析柱，采用FastTrack mRNA分离盒(Invitrogen Corporation)按厂家说明书稍作修改，从制备物中获得真核mRNA。简单说，将RNA制备物的NaCl浓度用5M NaCl调至0.5M。再向制备物加入已用试剂盒中的结合缓冲液1ml预平衡的oligodT 50mg。混合物于室温温育60分钟，期间多次轻轻混合。然后将oligo dT纤维素在2,000Xg离心10分钟使之沉淀。含细菌mRNA的上清取出后加入乙酸钠(pH4.5)0.1倍体积、95％乙醇2.5倍体积进行沉淀，并于-20℃过夜。将细菌mRNA以这种状态保存直至需要时。

于30℃温育培养96小时后从增殖的PLM-5菌株分离细菌总RNA。通过刮取从琼脂上取出细菌细胞，并在冰冷PBS中洗4次。按上述分离RNA，但不进行oligo dT纤维素抽提。cDNA合成

以分离自受感染肝脏或PLM-5培养物的细菌mRNA作为模板，用禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶和RiboClone cDNA合成系统(Promega Corporation，Madison，WI.USA)按厂家说明合成双链DNA。新合成的cDNA用不含DNA酶的RNA酶于37℃处理30分钟，用苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提一次，并沉淀。第二条链按厂家说明在第一条链合成后迅速合成。

由PLM-5培养细菌衍生的cDNA用BioNick标记系统(BRL生命技术公司，Gaithersburg，MD.)按厂家说明进行生物素化。

在用于扣除杂交的制备物中，将双链cDNA制备物于95℃温育5分钟，再在冰浴中快速冷冻。扣除杂交

利用扣除杂交技术分离本发明的四种钩端螺旋体基因(Utt，E.A.等，加拿大微生物学杂志41：152-156(1995)))。当有两种细胞类型，其一表达特定RNA而另一不表达时，则可用此技术分离所述的特定mRNA。本发明测定，在活性钩端螺旋体感染仓鼠模型期间特定钩端螺旋体基因会打开和表达。当钩端螺旋体在培养基中培养时，这四种基因不表达。用钩端螺旋体感染仓鼠的肝脏(“靶或Vir⁺细胞)的mRNA作为底物，用于制备相应于所有表达基因的一套cDNA分子。为去除对靶细胞无特异性的序列，将cDNA制备物与培养钩端螺旋体(Vir细胞)的mRNA尽可能杂交。此步骤从cDNA制备物中去除两种细胞共有的所有序列。去除与其它mRNA杂交的所有cDNA序列后，所剩cDNA均与靶细胞的mRNA杂交，以证实它们代表编码序列。这些克隆包含特异于Vir⁺细胞mRNA的序列。

扣除杂交时，将肝脏抽提物(Vir⁺)的变性的体内细菌cDNA共50μg与PLM-5培养物(Vir^-)的变性并生物素化的cDNA 250μg在含20mM TRIS，0.6M NaCl，2mM EDTA，和0.2％十二烷基硫酸钠(终浓度)的杂交缓冲液中杂交。杂交于70℃恒温进行48小时。1∶4的两种cDNA比例将有助于确保所有共有转录种形成cDNA杂交体。

将杂交混合物与链亲和素包被的顺磁珠(Dynal公司)一起温育将选择性除去所有双链生物素化cDNA杂交体。将Dynal链亲和素珠共200μl置于1.5ml eppendorf试管中，用2X Dynal结合缓冲液(10mM TRIS(pH7.5)，1mM EDTA，2.0M NaCl)洗3次。接着将磁珠重新悬浮于2X结合缓冲液200μl中，并向其中加入等体积的扣除杂交混合物。于室温在85rpm的摇床上摇15分钟。温育后，按Dynal的说明书经磁性抽提去除顺磁珠结合的生物素化cDNA杂交体。加入3M乙酸钠(pH 5.3)0.1倍体积和异丙醇0.8倍体积沉淀所剩上清中的核酸。

上清中保留的cDNA产物可能代表了肝脏中生长和PLM-5中生长的问号钩端螺旋体之间在基因表达上的差异。这些产物在后文称为扣除产物。扣除杂交产物的扩增

双链cDNA扣除产物用Sau3A进行限制性内切核酸酶酶解，再与串联21体PCR引物接头连接。对带有Sau3A位点的接头AUS 1(5’GATCGGACGGTGAATTCTCGAGAGTG3’)和接头AUS 2(5’GACACTCTCGAGAATTCACCGTCC3’)均磷酸化，再在与扣除产物连接之前加热至94℃并冷却至室温(25℃)以便退火。AUS 2互补引物在随后的PCR扩增中使用。PCR反应条件是10mM Tris-HCl(pH8.0)，50mMKCl，2.5mM MgCl，10mM四种dNTP，1 pmole AUS 2，和Taq DNA聚合酶10个单位(均为终浓度)。反应总体积为100μl。使用的是Perkin-Elmer Cetus 9600型热循环仪，用以下程序，并有快速温度变化：94℃，60秒；37℃，30秒；55℃，60秒；共35个循环。差异表达的基因组位点的分离和鉴定

用质粒pUC18和pGEMT EASY作载体向大肠杆菌DH5α克隆。所有小文库的构建、转染、电穿孔、质粒分离、限制性内切核酸酶酶解、及其它基因操作，都按标准方法进行(Maniatis等，1982)。

将PCR扣除产物直接克隆进pGEMT-EASY载体(Promega)。在X-Gal氨苄青霉素Luria Bertani平板上筛选阳性克隆，克隆插入物经DNA测序分析(Advanced Genetics Analysis Corporation，Minneapolis，MN)。用BLAST算法通过序列数据库检索鉴定DNA序列。一个克隆pHLE001显示与多种细菌膜结合组氨酸激酶基因有同源性。因扣除产物代表部分基因，故此克隆用Genius系统(BoehreingerMannheim Biochemicals，Indianapolis，IN，USA)按厂家说明标记上地高辛(DIG)。然后以扣除产物作为探针，用于问号钩端螺旋体波摩那血清变型(波摩那钩端螺旋体)基因组DNA经限制性内切酶EcoR1酶解后的Southern杂交中。pHLE001探针与一个1200bp的片段杂交。制备800bp至2,500bp大小范围内的一个EcoR1基因小库，并用于回收上述1,200bp片段。将此片段克隆进质粒pUC18，命名为pHLE011。此克隆后经测定为包含ORF1和ORF2。

用不同蛋白表达载体表达所鉴定的各种ORF，使表达水平足以进行小批量蛋白纯化和疫苗保护作用研究。

用Vectorette策略(Genosys，Woodlands，TX.)进行其它克隆过程。用该策略搜索EcoR1 Vectorette基因库并找到基因的剩余部分。简单地说，根据测序已知的部分设计特异性引物，使之搜索原PCR产物的上游和下游。该策略最终将扩增扣除作用衍生的多个PCR引物所限定的片段。这些克隆子及其推测的特点总结见表1。

所克隆的1200bp插入物的DNA序列分析用Sanger的双脱氧链终止法在Applied Biosystems的自动DNA测序仪上完成。

用DNASTAR程序进行的pHLE011的DNA序列分析显示有两个开放读框(ORF)。这些命名为ORF1，ORF2和ORF3的阅读框分别由603bp，1131bp，618bp组成。

表1：本研究中所鉴定的扣除杂交克隆子克隆载体插入物大小序列pHLE011 pUC18 1200bp ORF1/ORF2pMW43 pFLEX10 1100bp ORF1pMW310 pFLEX10 1150bp ORF2pMW48 pFLEX10 680bp ORF3Vectorette文库的构建和筛选

按厂家说明应用Vectorette PCR(Genesys公司)以尝试分离各ORF的所剩部分。简单地说，设计ORF1 5’端的PCR引物以延伸其上游。设计ORF2 3’端的PCR引物以延伸其下游。按厂家说明，用PvuII，HindIII，Hpa I，Rsa I，EcoR I，Ssp I，Dra I，或Mfe I限制性酶解问号钩端螺旋体基因组DNA，再与特异性Vectorette引物结合位点在末端相连，产生Vectorette文库。用上述文库进行Vectorette PCR，产生不同长度的几种产物。利用特异性产物的DNA序列分析对比序列并使ORF2和截短形式ORF1得以完整化。扣除克隆概括于表1。λZAP噬菌体基因组文库的构建和筛选

用ZAP表达载体构建博氏钩端螺旋体哈德焦牛血清变型的Bam HI全基因组文库，作为Stratagene(La Jolla，CA，USA)的商业文库包。内鞭毛素便由此文库鉴别而得。

按厂家说明用大肠杆菌XL1-Blue MRF’测定文库滴度和扩增。出现空斑后，将在IPTG 5μM中预浸泡的干尼龙滤膜(Nytran)置于平板上，37℃倒置培养过夜。

过夜培养后，将平板置于4℃冷藏1小时。然后揭起滤膜，用PBST洗3次。再将滤膜于PBST/3％脱脂牛奶中室温温育1小时进行封闭。封闭过的滤膜在PBST中洗3次，向每张滤膜加入1∶5,000稀释于PBST中的免疫兔抗血清。将第一抗体与滤膜一起于37℃温育3小时。然后将滤膜用PBST洗3次，每次5分钟，再加入1∶5,000稀释的第二抗体，即碱性磷酸酶偶联的抗兔抗体。滤膜于37℃温育2小时。与第二抗体温育后，滤膜先用PBST洗1次，再用PBS洗两次，每次均5分钟。将滤膜于BCIP溶液中室温浸泡1分钟显示出阳性空斑。λZAP噬菌体文库克隆的分离和鉴定

共有14个空斑与免疫兔抗血清强烈反应。将每一个这样的阳性噬菌体转换成噬菌粒并转化进大肠杆菌XLOR细胞，以便进行质粒分离和扩增。每一个这样的克隆及其插入物大小概括于表2。

阳性空斑经切出并用厂家提供的方法体内转换为噬菌粒。

表2：本研究中所鉴定的λZAP表达文库克隆

克隆载体插入物大小 ORF

pDFX210 pFLEX10 900bp 内鞭毛素Northern分析

细菌RNA样品以来自pHLE011的³²P标记的3.2kb克隆片段为探针进行Northern杂交分析。进行Northern杂交的所有探针都用Multiprime DNA标记盒(Amersham Internations Pic，Amersham，UK)按厂家说明标记上³²P。杂交条件为：5X SSC，50％甲酰胺，0.02％SDS，0.1％N-肉桂酰肌氨酸，2％剪切的鲑精DNA，和20mM马来酸钠(pH7.5)。杂交于42℃进行16小时。严谨洗涤条件为：2X SSC，0.1％SDS室温洗2次，每次5分钟，和0.5X SSC，0.1％SDS于55℃洗2次，每次洗15分钟。信号经放射自显影显示。DNA序列分析

用LARK(The Woodlands，Texas，USA)的ABI 200 PRISM系统(染料中止剂)对所选克隆进行双链双向DNA序列分析。DNA和一级序列分析

对三个扣除杂交克隆的DNA序列分析鉴别出三个主要开放读框(ORF)。原扣除克隆pHLE011包含两个部分ORF，名为ORF1和ORF2。应用这些部分序列，采用Vectorette PCR使ORF1和ORF2完整化，随后将它们亚克隆进pFLEX10中，分别产生pMW43(图1)和pMW310(图2))的序列补充完整。对另一个扣除克隆pHLE004的DNA序列分析鉴别出另一个名为ORF3的主要ORF。该部分序列用于设计VectorettePCR的引物。这使ORF3序列变得完整(图3)。

三个ORF的一级序列都用DNASTAR软件包推断出来。所推得的三个ORF的一级序列分别鉴别出分子量为41,000Da，43,000Da，25,000Da的推定蛋白。内鞭毛素基因的完整ORF经证实长为849bp。所推得一级序列是含283个氨基酸，分子量经计算为32,000的一种蛋白质。序列数据库分析

通过生物技术国家中心(NCBI)BLAST电子邮箱服务器的序列数据库对这四种钩端螺旋体序列进行相似性研究。利用BLASTn和BLASTx序列分析推算法，以期鉴别出DNA和一级序列的同源性。推得的基因同源性概括于表3。表3：本研究鉴别的克隆化潜在抗原的BLAST数据库同一性

克隆基因同源性

pMW43 ORF1 膜激酶

pMW310 ORF2 膜通透酶

pMW50 ORF3 甘露糖基转移酶

pDFX210 内鞭毛素内鞭毛素实施例2Syrian仓鼠钩端螺旋体病攻击模型

用一至四月龄不等的雌性Syrian仓鼠进行细菌传代和攻击。波摩那血清变型攻击模型仓鼠用含活菌(相差显微镜测定)的肝脏匀浆物0.2ml经皮下进行感染。细菌稀释率从1∶1000(4×10⁵个细菌/ml)至1∶10(4×10⁷个细菌/ml)不等。

为进行哈德焦牛血清变型攻击，用含活菌(相差显微镜测定)的肝脏匀浆物0.5ml经腹膜内途径感染仓鼠。细菌稀释率从1∶1000(4×10⁵个细菌/ml)至1∶10(4×10⁷个细菌/ml)不等。

含活性钩端螺旋体的仓鼠肝脏组织尸检后经手术切出，操作如下：将约1克组织置于玻璃dounce匀浆器内。然后向组织中加入补加有0.1％琼脂糖的PLM-5共9ml。再将组织匀浆成一致的稠度。这代表10^-1稀释的细菌。所有后续稀释都用PLM-5稀释剂完成。重组蛋白表达

根据所用表达载体的不同，用PL启动子质粒表达蛋白时以热休克进行诱导，用lacZ启动子质粒表达蛋白时以IPTG诱导。所有蛋白质的表达均在培养于2X酵母胰蛋白胨肉汤(2X YT肉汤)的大肠杆菌DH5α(lacZ)或大肠杆菌LE392(PL)中进行。

简单地说，用lacZ表达的培养物于37℃培养直至光密度(695nm)达0.4至0.5。通过加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷)1mM诱导重组蛋白。根据所希望的蛋白产量，使温育继续进行2至12小时。

使用PL启动子系统的构建体于30℃培养直至光密度(695nm)达0.4至0.5。通过将培养温度变成42℃并继续培养2至4小时而进行重组蛋白的诱导。于4℃在8,000xG离心15分钟实现细菌细胞的收获。两次通过压强为20,000psi的French压力仓而裂解细胞。细菌碎片在20,000xG离心去除，上清贮于-20℃备用。

蛋白抽提物按标准方法经SDS-PAGE进行分析(ref)。实验性疫苗抗原在仓鼠钩端螺旋体病模型中的保护效应数据

来自携带pHLE011的重组克隆的蛋白抽提物在波摩那血清变型感染模型中保护了6只仓鼠中的4只(67％)免受致死性感染。pMW43(只包含pHLE011的ORF1)的纯化重组蛋白在波摩那血清变型感染模型中保护了6只仓鼠中的2只(33％)免受致死性感染。pDFX210的纯化重组蛋白对波摩那血清变型感染未提供任何保护作用。这些抗原中每一个在哈德焦牛血清变型感染模型中的保护潜能正在研究中。表4概括了所有受试抗原的疫苗攻击结果。

为进行实验性免疫接种，动物均间隔两周两次接种实验性抗原约5μg两次。末次接种两周后，这些动物用每种血清变型按上文概述的过程进行攻击。

表4：所选抗原在Syrian仓鼠钩端螺旋体病攻击模型中对致死性钩端螺旋体攻击的保护潜能抗原克隆来源波摩那保护性哈德焦牛保护性pHLE011 扣除文库 67％ -pMW43 ORF1(pHLE011) 33％ -pDFX210 噬菌体文库 0％ 100％

序列表<110>Pfizer产品公司<120>用于预防钩端螺旋体病的钩端螺旋体疫苗抗原<130>PC10463<140><141><160>8<170>PatentIn 2.0版本<210>1<211>201<212>PRT<213>氨基酸<400>1Met Arg Ser Val Gln Glu Lys Asn Glu Leu Ile Gln Glu Ile His His1 5 10 15Arg Val Arg Asn Asn Leu Gln Val Ile Ser Gly Leu Val Glu Met His

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50 55 60Glu Asn Tyr Phe Glu Ile Asp Phe Val Glu Val Met Asp Lys Ile Ile65 70 75 80Leu Asn Leu Ser Tyr Arg Leu Gly Lys Arg Ser Ile Lys Ile Glu Thr

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100 105 110Met Ile Phe Asn Glu Leu Leu Ser Asn Ser Leu Lys His Ala Phe Arg

115 120 125Ser Glu Lys Gly Thr Val Gln Ile Ser Phe Arg Lys Lys Gly Asp Lys

130 135 140Tyr Tyr Leu Gln Val Ser Asp Asn Gly Ser Gly Ile Lys Asp Phe Lys145 150 155 160Ile Trp Ser Lys Pro Lys Thr Ala Gly Phe Thr Leu Ile Gln Ile Leu

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195 200<210>2<211>377<212>PRT<213>氨基酸<400>2Met Lys Phe Ser Gly Leu Thr Asn His Ile Tyr Lys Asp Arg Asp Tyr1 5 10 15Leu Thr Arg Asn Arg Ala Phe His Leu Phe Ile Phe Asn Val Val Ser

20 25 30Leu Leu Leu Gly Leu Ser Val Asn Phe Tyr Val Trp Phe Val Lys Gly

35 40 45Asp Leu Leu Arg Pro Gly Phe Leu Ile Ile Met Leu Ala Ser Ala Val

50 55 60Ser Leu Phe Phe Leu Leu Arg Lys Lys Phe Glu Leu Ala Leu Arg Ile65 70 75 80Ile Leu Ile Ala Ser Val Ile Ala Val Ser Val Gly Trp Phe Phe Gly

85 90 95Leu Ser Gln Gly Asn Ser Pro Leu Asp Glu Gly Asn Lys Asn Ile Val

100 105 110Leu Ala Ile Phe Ile Met Ile Phe Leu Tyr Phe Ala Asn Val Lys Arg

115 120 125Thr Leu Leu Ile Ala Val Tyr Cys Phe Val Leu Ile Phe Met Glu Glu

130 135 140Leu Leu Met Gln Gln Ile His Glu Ser Ile His Met Ala Asp Arg Ile145 150 155 160Ala Leu Phe Phe Met Phe Ser Val Ile Ser Ile Ile Ala Val Arg Thr

165 170 175Leu His Gly Ser Ile Glu Glu Lys Asn Glu Leu Ile Gln Glu Ile His

180 185 190His Arg Val Arg Asn Asn Leu Gln Val Leu Ser Gly Leu Val Glu Met

195 200 205His Ser Asp Ser Asp Gln Gly Asn Leu Arg Asn Ile Leu Ser Asp Phe

210 215 220Gln Asn Arg Ile Leu Ala Ile Ser Glu Val His Asn Tyr Leu Tyr Lys225 230 235 240Ser Glu Asn Tyr Phe Asp Ile Asp Phe Ser Glu Val Ile Glu Arg Ile

245 250 255Ile Ala Asn Leu Ile His Lys Phe Gly Lys Gln Ser Val Lys Ile Glu

260 265 270Asn Leu Thr Glu Gln Ile Phe Leu Arg Ile Glu Tyr Ala Ile Pro Cys

275 280 285Ala Met Ile Phe Ser Glu Leu Leu Ser Asn Ser Leu Lys His Ala Phe

290 295 300Ser Ser Asp Met Gly Lys Ile Val Ile Arg Phe His Lys Glu Gly Asn305 310 315 320Lys Tyr Arg Leu Gln Ile Glu Asp Asn Gly Ser Gly Ile Ser Asp Ser

325 330 335Lys Thr Trp Leu Lys Pro Lys Thr Ser Gly Phe Lys Leu Ile Gln Leu

340 345 350Leu Thr Arg Gln Ile Lys Gly Asp Phe Gln Ile Leu Ser Asp Ser Gly

355 360 365Ser Ile Ala Val Leu Glu Phe Tyr Thr

370 375<210>3<211>205<212>PRT<213>氨基酸<400>3Met Phe Asn Phe Ser Gln Tyr Leu Thr Asn Gly Phe Glu Arg Phe Pro1 5 10 15Lys Ile Glu Lys Ser Lys Ser Lys Ile Lys Lys Ile Ile Phe Val Gly

20 25 30Arg Ile Thr Pro Asn Lys lys Gln Asp Asp Leu Ile Arg Leu Ala Phe

35 40 45Ala Tyr Lys Ser Ile Ile Ser Asp Gln Phe Gln Phe Tyr Leu Ala Gly

50 55 60Phe Ser Ser Lys Glu Leu Tyr Leu Tyr Arg Glu Glu Leu Glu Arg Met65 70 75 80Leu Asp Phe Tyr Asp Leu Arg Lys Asn Val Leu Ile Thr Gly Phe Leu

85 90 95Ser Asp Leu Glu Leu Asn Ser Leu Tyr Gln Glu Ala Asp Ala Phe Val

100 105 110Ser Met Ser Glu His Glu Gly Phe Cys Val Pro Leu Ile Glu Ala Met

115 120 125Ile Tyr Arg Ile Pro Ile Leu Ala Phe Ser Gly Gly Ala Val Ser Glu

130 135 140Thr Leu Asn Gly Ala Gly Val Leu Phe Lys Glu Lys Asn Phe Pro Asn145 150 155 160Leu Ala Ile Leu Leu Asn Lys Ile Leu Thr Asp Val Ser Phe Gln Asn

165 170 175Gln Ile Leu Thr Gly Gln Asp Leu Arg Leu Asn Glu Phe Lys Lys Thr

180 185 190Asp Tyr Lys Ser Val Leu Arg Lys Ala Leu Glu Ile Ile

195 200 205<210>4<211>283<212>PRT<213>氨基酸<400>4Met Ile Ile Asn His Asn Leu Ser Ala Val Asn Ser His Arg Ser Leu1 5 10 15Lys Phe Asn Glu Leu Ala Val Asp Lys Thr Met Lys Ala Leu Ser Ser

20 25 30Gly Met Arg Ile Asn Ser Val Ala Asp Asp Ala Phe Gly Leu Ala Val

35 40 45Ser Glu Lys Leu Arg Thr Gln Ile Asn Gly Leu Arg Gln Ala Glu Arg

50 55 60Asn Thr Glu Asp Gly Met Ser Phe Ile Gln Thr Ala Glu Gly Phe Leu65 70 75 80Glu Gln Thr Ser Asn Ile Ile Gln Arg Ile Arg Val Leu Ala Ser Arg

85 90 95Pro Arg Met Val Ser Gln Gln Arg Lys Ile Ala Ser Leu Gly Arg Trp

100 105 110Glu Val Leu Cys Ala Gly Gly Pro Lys Ser His Arg Ile Ala Ser Gln

115 120 125Ala Glu Phe Ile Ser Ser Ser Phe Leu Gly Ala Ile Arg Lys Arg Phe

130 135 140Thr Gly Arg Val His Val Val Ser Tyr Gly Ala Glu Arg Lys Ser Ala145 150 155 160Arg Glu Ile Leu Gln Arg Pro Glu Cys Phe Glu Ser Pro Glu Ala Cys

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245 250 255Ile Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala Met Leu Ala Gln Ala Asn Met Lys

260 265 270Pro Asn Ser Val Leu Lys Leu Leu Gln His Ile

275 280<210>5<211>603<212>DNA<213>核苷酸<400>5ATGCGATCCG TTCAAGAAAA GAACGAATTG ATACAAGAAA TTCATCATAG AGTTAGAAAT 60AATCTTCAGG TAATTTCCGG TTTAGTGGAA ATGCATAGTG GGTCTGGTAA AGAGAATCTG 120CAAATCATAT TATCCGATTT TCAAAATCGT ATATTAGCAA TATCTGAAGT TCATAATTAT 180TTATATAAGT CCGAAAATTA TTTCGAAATC GATTTTGTCG AGGTGATGGA TAAGATTATT 240CTAAATCTTT CTTATAGATT GGGAAAACGT TCGATCAAGA TAGAAACTGA AGCTGAGTCT 300ACTTTTTTAA GAATCGAAAA TGCGATTCCT TGTGCTATGA TTTTCAACGA ATTGTTATCC 360AATTCTTTAA AACACGCTTT TCGTTCGGAA AAAGGAACCG TTCAAATTTC GTTTCGAAAA 420AAAGGAGATA AATATTACCT TCAAGTTTCT GACAATGGTT CAGGAATCAA GGATTTTAAA 480ATTTGGTCCA AACCGAAAAC GGCTGGTTTC ACTTTGATAC AAATATTAAC AAAACAGATT 540AAAGGTCGTT TTCAAATTTT CTCTGAAGGC GGTTTTACTG CGGTTTTAGA GTTCAACTCA 600ATC 603<210>6<211>1131<212>DNA<213>核苷酸<400>6ATGAAATTTT CAGGATTAAC CAATCATATT TATAAAGACA GGGATTATCT TACTCGAAAT 60AGGGCGTTCC ATCTTTTCAT TTTTAATGTG GTGTCGCTTT TATTGGGTTT ATCTGTGAAT 120TTTTATGTTT GGTTTGTGAA AGGTGATCTA TTACGTCCTG GTTTTTTAAT CATCATGCTT 180GCATCTGCAG TCTCTCTGTT TTTTTTATTG AGAAAAAAAT TTGAATTGGC TCTCAGAATT 240ATTTTGATCG CAAGTGTAAT TGCTGTTAGC GTTGGTTGGT TTTTTGGACT TTCTCAGGGA 300AATTCTCCTT TGGACGAAGG GAATAAAAAT ATTGTTTTAG CTATATTTAT TATGATTTTC 360TTATATTTTG CAAATGTAAA GCGAACTCTT CTAATTGCGG TTTACTGTTT TGTTTTGATT 420TTTATGGAAG AGCTTTTAAT GCAACAAATT CATGAATCTA TTCACATGGC TGATCGAATC 480GCTCTATTTT TCATGTTTTC TGTAATTTCG ATTATCGCCG TAAGAACTCT TCATGGATCG 540ATTGAAGAAA AGAACGAATT GATACAAGAA ATTCATCATA GAGTTAGAAA TAATCTTCAG 600GTTCTTTCCG GTTTAGTAGA AATGCATAGT GATTCTGATC AAGGGAATCT TAGGAATATA 660TTATCTGATT TTCAAAATCG TATATTAGCA ATATCTGAAG TTCATAATTA TTTATATAAG 720TCCGAAAATT ATTTCGACAT AGATTTTTCA GAAGTGATTG AAAGAATCAT TGCAAATCTC 780ATTCATAAAT TTGGTAAACA ATCTGTAAAA ATAGAAAATT TAACGGAACA GATTTTTTTA 840AGAATCGAAT ATGCGATTCC TTGTGCTATG ATTTTTAGTG AACTTTTATC TAATTCTTTA 900AAACATGCGT TTTCTTCGGA TATGGGGAAA ATTGTCATTC GGTTTCATAA AGAAGGAAAT 960AAGTATCGTC TTCAAATTGA AGATAATGGT TCTGGAATAT CTGATTCTAA AACTTGGTTG 1020AAACCAAAAA CTTCTGGTTT TAAATTGATT CAACTTTTGA CCAGACAAAT AAAAGGTGAT 1080TTTCAAATTC TTTCGGATTC TGGTTCCATT GCTGTACTTG AATTTTACAC T 1131<210>7<211>618<212>DNA<213>核苷酸<400>7ATGTTTAATT TTTCCCAATA CCTAACCAAT GGTTTTGAAC GTTTTCCTAA AATCGAAAAA 60TCAAAATCTA AAATTAAAAA AATTATTTTT GTAGGTAGGA TCACTCCCAA TAAAAAACAG 120GACGATTTGA TCCGCCTTGC ATTCGCGTAT AAGTCTATAA TTTCCGATCA GTTTCAGTTT 180TATCTCGCAG GTTTTAGTTC TAAAGAATTA TATCTTTATC GGGAAGAATT AGAAAGGATG 240TTGGACTTTT ATGATCTCAG AAAAAACGTT TTGATCACAG GTTTTCTCTC CGACTTAGAA 300CTAAATTCCC TTTATCAAGA AGCGGATGCT TTCGTTTCCA TGAGTGAACA CGAAGGTTTC 360TGTGTTCCTC TGATCGAAGC CATGATTTAT AGAATTCCGA TCCTCGCTTT TTCAGGCGGC 420GCGGTTTCCG AAACTTTAAA CGGAGCCGGT GTTCTTTTTA AAGAAAAAAA TTTTCCGAAC 480TTGGCTATTT TACTCAATAA AATTTTGACT GATGTTTCTT TCCAAAATCA AATTTTAACA 540GGCCAAGATC TACGTCTGAA CGAATTTAAA AAAACGGATT ATAAATCCGT CCTTAGGAAG 600GCACTTGAAA TCATCTCT 618<210>8<211>849<212>DNA<213>核苷酸<400>8ATGATTATCA ATCACAACCT GAGCGCGGTG AATTCTCACC GTTCTCTAAA GTTCAACGAG 60CTTGCTGTGG ACAAGACGAT GAAGGCTTTG TCTTCCGGTA TGCGGATCAA TTCCGTGGCG 120GACGACGCTT TCGGACTCGC GGTTTCTGAA AAGCTAAGAA CGCAGATCAA CGGTCTGCGT 180CAGGCCGAAA GAAACACCGA AGACGGGATG AGCTTCATTC AAACTGCCGA GGGTTTCCTC 240GAACAGACGT CGAACATCAT TCAGAGAATC CGGGTGCTTG CATCCAGACC TCGAATGGTT 300TCTCAGCAAC GAAAGATTGC ATCTTTGGGC AGGTGGGAAG TATTGTGCGC TGGTGGACCA 360AAGTCCCACC GAATCGCTTC TCAAGCTGAA TTTATAAGTT CAAGCTTTTT AGGGGCAATT 420CGCAAAAGGT TCACGGGTCG GGTCCATGTG GTTTCATATG GGGCCGAACG AAAATCAGCG 480AGAGAGATTT TACAGCGGCC CGAATGCTTC GAAAGCCCTG AAGCTTGTAA AGCGGACGGG 540AGACCGATCG CGATTTCTTC TCCGGAAGAA GCCAACGATG TTATCGGTTT AGCGGATGCG 600GCTCTTACGA GGATCATGAA GCAGAGAGCG GATATGGGGG CTTATTACAA TAGGCTCGAG 660TATACCGCAA AAGGGGTGAT GGGTGCATAT GAAAATATGC AAGCATCGGA ATCCAGAATT 720CGGGACGCCG ATATGGCGGA GGAAGTTGTC TCGCTGACCA CAAAACAAAT ACTCGTTCAG 780AGTGGTACGG CAATGTTAGC GCAGGCAAAT ATGAAACCGA ATTCGGTTCT CAAGCTTCTG 840CAGCATATC 849

Claims

1.一种分离的钩端螺旋体膜激酶蛋白，其中包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段或其保守性变异体。

2.一种分离的钩端螺旋体膜通透酶蛋白，其中包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列或其片段或其保守性变异体。

3.一种分离的钩端螺旋体膜甘露糖基转移酶蛋白，其中包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其片段或其保守性变异体。

4.一种分离的钩端螺旋体膜内鞭毛素蛋白，其中包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列或其片段或其保守性变异体。

5.一种钩端螺旋体膜激酶多核苷酸序列，其中包含SEQ IDNO：5的序列或其片段或其保守性变异体。

6.一种钩端螺旋体膜通透酶多核苷酸序列，其中包含SEQ IDNO：6的序列或其片段或其保守性变异体。

7.一种钩端螺旋体膜甘露糖基转移酶多核苷酸序列，其中包含SEQ ID NO：7的序列或其片段或其保守性变异体。

8.一种钩端螺旋体膜内鞭毛素多核苷酸序列，其中包含SEQ IDNO：8的序列或其片段或其保守性变异体。

9.一种多核苷酸序列，其包含选自基本上由下述组成之组的多核苷酸序列的开放读框：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8或它们的片段或它们的保守性变异体。

10.至少12个核苷酸长的一对单链DNA引物，其可用于检测任意致病性钩端螺旋体菌株中编码钩端螺旋体膜蛋白的多核苷酸序列，这对引物选自由SEQ ID NO：5的1-301位核苷酸和302-603位核苷酸组成的组，其中这些引物在聚合酶链式反应中的应用导致合成包含来自任意钩端螺旋体致病株之钩端螺旋体膜蛋白编码基因的全部或至少12个连续核苷酸的DNA。

11.至少12个核苷酸长的一对单链DNA引物，其可用于检测任意致病性钩端螺旋体菌株中编码钩端螺旋体膜蛋白的多核苷酸序列，这对引物选自SEQ ID NO：6的1-566位核苷酸和567-1131位核苷酸，其中这些引物在聚合酶链式反应中的应用导致合成包含来自任意钩端螺旋体致病株之钩端螺旋体膜蛋白编码基因的全部或至少12个连续核苷酸的DNA。

12.至少12个核苷酸长的一对单链DNA引物，其可用于检测任意致病性钩端螺旋体菌株中编码钩端螺旋体膜蛋白的多核苷酸序列，这对引物选自SEQ ID NO：7的1-309位核苷酸和310-618位核苷酸，其中这些引物在聚合酶链式反应中的应用导致合成包含来自任意钩端螺旋体致病株之钩端螺旋体膜蛋白编码基因的全部或至少12个连续核苷酸的DNA。

13.至少12个核苷酸长的一对单链DNA引物，其可用于检测任意致病性钩端螺旋体菌株中编码钩端螺旋体膜蛋白的多核苷酸序列，这对引物选自SEQ ID NO：8的1-424位核苷酸和425-849位核苷酸，其中这些引物在聚合酶链式反应中的应用导致合成包含来自任意钩端螺旋体致病株之钩端螺旋体膜蛋白编码基因的全部或至少12个连续核苷酸的DNA。

14.一种检测钩端螺旋体病原体的方法，包括以下步骤：

(a)从感染了该病原体的动物，或从病原体本身分离DNA；

(b)用至少一个下述引物经聚合酶链式反应扩增该DNA，其中所述引物具有的序列与选自基本上由下述组成之组的序列中至少12个连续核苷酸相同：SEQ ID NO：5的核苷酸、SEQ ID NO：6的核苷酸、SEQ ID NO：7的核苷酸和SEQ ID NO：8的核苷酸；和

(c)通过显示聚合酶链式反应扩增的产物而检测钩端螺旋体病原体。

15.一种分离编码钩端螺旋体病原体之膜蛋白的多核苷酸序列的方法，包括以下步骤：

(a)从感染了该病原体的动物，或从病原体本身分离DNA；

(b)用至少一个下述引物经聚合酶链式反应扩增该DNA，其中所述引物具有的序列与选自基本由下述组成之组的序列中至少12个连续核苷酸相同：SEQ ID NO：5的核苷酸、SEQ ID NO：6的核苷酸、SEQID NO：7的核苷酸和SEQ ID NO：8的核苷酸；和

(c)分离聚合酶链式反应扩增的产物。

16.一种可用于在动物中诱导对致病性钩端螺旋体的免疫应答的药物组合物，其中在药学可接受的载体中含有免疫原性有效量的，选自基本上由激酶、通透酶、甘露糖基转移酶和内鞭毛素组成之组的钩端螺旋体膜蛋白。

17.一种对疑有钩端螺旋体病的动物其钩端螺旋体病临床诊断的确证方法，包括进行一项试验以测定动物体液或组织中是否有选自激酶、通透酶、甘露糖基转移酶和内鞭毛素的一种钩端螺旋体膜蛋白或其片段，其中该试验包括使得自该动物的体液或组织样品与可特异性结合钩端螺旋体膜蛋白或其片段的抗体，或可特异性结合钩端螺旋体膜蛋白的Fab片段相接触，其中钩端螺旋体膜蛋白或其片段的存在情况证实了对钩端螺旋体病的临床诊断。

18.权利要求17的方法，其中该试验包括一项选自下组的试验：放射免疫分析、酶联免疫吸附试验、夹心试验、沉淀素试验、凝胶免疫扩散试验、凝集试验、荧光免疫分析、蛋白A免疫试验、免疫电泳试验和Western印迹试验。