CN1173877A - 新的幽门卷旋杆菌膜蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是基本纯化形式的幽门卷旋杆菌蛋白,能从幽门卷旋杆菌的膜部分得到,经10%SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳后,其分子量看来是76,54,50,32—35或30kDa左右。

Description

新的幽门卷旋杆菌膜蛋白
本发明的目的具体地是新近获得的基本纯化的幽门卷旋杆菌(Helicobacter pyloyi)蛋白，及含有该蛋白药物组合物。
卷旋杆菌是特征为革兰氏阴性螺旋型细菌的细菌属。几个种定居于哺乳动物胃肠道中。应特别提及的是幽门卷旋杆菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae。虽然幽门卷旋杆菌是最常见的与人类感染相关的种，在一些稀有情形下表明，亦可能从人中分离H.heilmanii和H.felis。
卷旋杆菌在发达国家感染多于50％成年人群，在发展中国家几乎是100％，因而使之成为世界范围内一个主要感染因子。
幽门卷旋杆菌至今排他性地发现于人胃粘膜表面上，特别是胃病灶和十二指肠溃疡病灶周围。该细菌目前被看做胃窦炎的致病因子，似乎是溃疡发生所需的辅因子之一。而且，胃癌的发生可能与幽门卷旋杆菌的出现相关。
因而看来开发一种用于预防或治疗幽门卷旋杆菌感染的疫苗是令人想望的。这样的疫苗最可能是亚单位性质的。
迄今已有多种幽门卷旋杆菌蛋白质被表征和分离。具体地，它们是，脲酶，和两个分别为30和67kDa的A和B亚基组成(Hu和Mobley感染免疫学(1990)58：992；Dwn等人生物化学杂志(1990)265：9464；Evans等人，微生物发病机理(1991)10：15；Labigne等人，J.Bact.(1991)173：1920)；87kDa的液泡细胞毒素(VacA)(Cover&Blaser，生物化学杂志(1992)267：10570；)Phadnis等，感染免疫学(1994)62：1557，WO 93/18150)；与细胞毒素相关的128kDa的免疫优势抗原(CagA，亦叫TagA)(WO93/18150；USP 5 403924)；分别为13和58kDa的热休克蛋白HspA和HspB(Suerbaum等，分子微生物学(1994)14：959；WO 93/18150)，54kDa过氧化氢酶(Hazell等，J.Gen Microbiol(1991)137：57)，20kDa原纤维血细胞凝集素(HpaA)；15kDa的富含组氨酸的蛋白(Hpn)(Gilbert等，感染免疫学(1995)63：2682)；30kDa的外膜蛋白(Bolin等，临床微生物学杂志(1995)33：381)；20kDa的膜相关脂蛋白(Kostrcynska等，细菌学杂志(1994)176：5938)，以及分子量在48至67kDa之间的孔蛋白家族HopA、HopB、HopC和HopD(Exner等，感染免疫学(1995)63：1567)。
这些蛋白质的几种包被提议为潜在的疫苗抗原。具体地，脲酶已被承认用于此用途的最优选的抗原(WO 94/9823；WO 95/3824；WO95/22987；Michelti等，胃肠道学(1994)107：1002)。事实仍然如此：对于新抗原的研究必须持续下去，特别是因为业已发现为了获得最佳疫苗效应，可能必须将几种抗原参入到疫苗之中。
总之，似乎必须鉴定另外的抗原，以将其参入到高效力疫苗之中。
因此，本发明的具体目的是提供一种基本纯化形式的幽门卷旋杆菌，它能够从幽门卷旋杆菌膜组分中获得，其经10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，其分子量看来是54，50，32-35或30kDa。另外，需特别指明的是：当蛋白质的分子量是54kDa时，它不与抗一过氧化氢酶抗血清反应。
具体地，可采用如实施例6中所述的经层析获得的过氧化氢酶制备物，按从下实施例5的免疫方法制备抗幽门卷旋杆菌抗血清。
“基本纯化形式”应被理解为意谓着该蛋白质被从其天然存在的介质中分离，换言之，它可能是缺乏具体的幽门卷旋杆菌的胞质和周质蛋白质。
其表观分子量为大约54kDa的膜蛋白，能够以以下方法获得，该方法中：
i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽门卷旋杆菌细菌，然后离心
ii)回收细菌沉淀，用溶菌酶处理并经超声处理，然后离心；
iii)回收离心沉淀，经20mM Tris-HCl缓冲液pH7.5洗涤，然后离心；
iv)回收由离心沉淀构成的膜级分，将其重悬于水性培养基中，重悬于含有5％两性离子洗涤剂3-14的碳酸盐缓冲液pH9.5中是优选的；
v)膜级分在Q-Sepharose柱上用0-0.5M NaCl梯度进行阴离子交换层析，该梯度被包含在含有0.1％两性离子洗涤剂3-14的碳酸盐缓冲液，pH 9.5中是优选的；然后用1M NaCl洗涤，该1M NaCl被包含在含有0.1％的两性离子洗涤剂3-14中的碳酸盐缓冲液pH 9.5中是优选的；
vi)回收以1M NaCl洗涤开始时洗脱的级分，在DEAE-Sepharose上用0-0.5M NaCl梯度进行阴离子交换层析，该梯度包含于含有0.1％两性离子洗涤剂3-14的Tris·HCl缓冲液pH7.5中，是优选的(优选的，1M NaCl中的级分预先用含有0.1％两性离子洗涤剂3-14的Tris·HCl缓冲液pH7.5透析；以及
vii)回收以0.1-0.25M NaCl洗脱的级分。
其表观分子量大约50kDa的膜蛋白，能够以以下方法获得，该方法中：
i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽门卷旋杆菌细菌，然后离心；
ii)回收细菌沉淀，用溶菌酶处理并经超声处理，然后离心；
iii)回收离心沉淀，经20mM Tris-HCl缓冲液pH7.5洗涤，然后离心；
iv)回收由离心沉淀构成的膜级分，将其重悬于水性培养基中，重悬于含有5％两性离子洗涤剂3-14的碳酸盐缓冲液pH9.5中是优选的；
v)膜级分在Q-Sepharose柱上用0-0.5M NaCl梯度进行阴离子交换层析，该梯度被包含在含有0.1％两性离子洗涤剂3-14的碳酸盐缓冲液，pH9.5中是优选的；然后用1M NaCl洗涤，该1M NaCl被包含在含有0.1％的两性离子洗涤剂3-14中的碳酸盐缓冲液pH9.5中是优选的；
vi)回收以1M NaCl洗涤开始时洗脱的级分，在DEAE-Sepharose上用0-0.5M NaCl梯度进行阴离子交换层析，该梯度包含于含有0.1％两性离子洗涤剂3-14的Tris·HCl缓冲液pH7.5中，是优选的(优选的，1M NaCl中的级分预先用含有0.1％两性离子洗涤剂3-14的Tris·HCl缓冲液pH 7.5透析；以及
vii)回收以0.3-0.4M NaCl洗脱的级分。
其表观分子量大约30kDa的膜蛋白，能够以以下方法获得，该方法中：
i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽门卷旋杆菌细菌，然后离心；
ii)回收细菌沉淀，用溶菌酶处理并经超声处理，然后离心；
iii)回收离心沉淀，经20mM Tris-HCl缓冲液pH7.5洗涤，然后离心；
iv)回收由离心沉淀构成的膜级分，将其重悬于水性培养基中，重悬于含有5％两性离子洗涤剂3-14的碳酸盐缓冲液pH9.5中是优选的；
v)膜级分在Q-Sepharose柱上用0-0.5M NaCl梯度进行阴离子交换层析，该梯度被包含在含有0.1％两性离子洗涤剂3-14的碳酸盐缓冲液，pH9.5中是优选的；然后用1M NaCl洗涤，该1M NaCl被包含在含有0.1％的两性离子洗涤剂3-14中的碳酸盐缓冲液pH9.5中是优选的；
vi)回收以0.28-0.35M NaCl洗脱的级分，在DEAE-Sepharose上用0-0.5M NaCl梯度进行阴离子交换层析，该梯度包含于含有0.1％两性离子洗涤剂3-14的Tris·HCl缓冲液pH7.5中，是优选的(优选的，1M NaCl中的级分预先用含有0.1％两性离子洗涤剂3-14的Tris·HCl缓冲液pH7.5透析；以及
vii)回收直接洗脱的级分(无NaCl)。
其表观分子量大约32-35kDa的膜蛋白，能够以以下方法获得，该方法中：
i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽门卷旋杆菌细菌，然后离心；
ii)回收细菌沉淀，用溶菌酶处理并经超声处理，然后离心；
iii)回收离心沉淀，经20mM Tris-HCl缓冲液pH7.5洗涤，然后离心；
iv)回收由离心沉淀构成的膜级分，将其重悬于水性培养基中，重悬于含有5％两性离子洗涤剂3-14的碳酸盐缓冲液pH
9.5中是优选的；
v)将(iv)中获得的悬液于大约200,000×g中离心，且回收上清；
vi)将(v)中获得上清的pH值降低到大约pH7，通过对磷酸盐缓冲液pH7透析是优选的；
vii)将(vi)中获得的制剂在SP-Sepharose柱上用0-0.5MNaCl梯度进行阳离子交换层析，该梯度包含于磷酸盐缓冲液pH7中优选；以及
viii)回收以0.26-0.31M NaCl洗脱的级分。
本发明的54，50，32和30kDa蛋白质可能是内在的膜蛋白或膜相关蛋白。54kDa蛋白质无论是在Western印迹，还是在斑点印迹中，都不与抗一过氧化氢酶抗体反应。30kDa蛋白质无论是在Western印迹，还是在斑点印迹中，都不与抗-脲酶A亚单位抗体反应。32kDa蛋白质被证实为碱性蛋白质；在某些实验条件下，其分子量看来略微大于35kDa。
一种幽门卷旋杆菌菌株(ATCC 43579)的50kDa蛋白质的N-末端序列如下(单字母密码)MKEKFNRTKPHVNIGTIGHVDH.这一信息并不排除如下事实：能够按上述方法纯化而得的等价蛋白可有略微不同的N末端序列，因为它们可以衍生于其他细菌菌株。这一差异确实反应了同一种内普遍发生的等位变异的现象。例如，细菌的种通常由细微等位特征彼此不同的一组菌株体现。在不同菌株中完成同一生物学功能的多肽可能具有不同于所有菌株的氨基酸序列。这一等位变异亦存在于DNA中。
在氨基酸序列水平上的等位变异可由一个或多个不改变生物学功能的氨基胺替代，缺失，或加成组成。
“生物学功能”被理解为意谓着参预了该蛋白质天然存在于此的细胞的存活的蛋白质功能(即使该功能不是绝对必需的)。例如，孔蛋白的功能是允许存在于外部基质的化合物进入细胞内，生物学功能不同于抗原功能。一种蛋白质可以有不止一种生物学功能。
本发明的目的是一种基本纯化的蛋白质，它可以按照上述方法之一从卷旋杆菌属的细菌中如幽门卷旋杆菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae中纯化。
本发明的另一目的是，能够按照上述方法纯化的卷旋杆菌蛋白的在抗原性意义上的类似物范围内的任一基本纯化的蛋白质或多肽。至于多肽，特别涉及将天然存在的且其纯化形式可由上述方法获得的蛋白质进行片段化或通过缺失，加成或替换而突变一个或多个氨基酸衍生而来的多肽。这些多肽具体地可借助于蛋白酶例如胃蛋白酶或胰蛋白酶酶促消化而得。就这些多肽而言，不需按上述方法纯化。
本说明书所用的术语“蛋白质”和“多肽”不依赖于分子的大小(氨基酸链长度)，亦不依赖可能的转录后修饰。在说明书的剩余部分，术语“多肽”意指由蛋白质片段化或突变衍生的产物。
本发明的蛋白质或多肽能够被制备用于抗可按上述方法纯化的卷旋杆菌蛋白质的单特异性抗体识别。具体的抗原性可按照一系列的方法揭示，例如通过Western印迹(Towbin等，PNAS(1979)76：4350)，斑点印迹和ELISA。
在Western印迹中，待测产物如无论是以纯化的制备物的形式或以细菌提取物的形式，按Laemmli U.K.，Nature(1970)227：680描述的方法进行SDS-Page凝胶电泳(10％聚丙烯酰胺)。转移到硝酸纤维素膜之后，将膜与稀释范围为1∶50至1∶5000，优选1∶100至1∶500的稀释的单特异性超免疫血清温孵。在包括于上述范围之一的稀释度下，特异的抗原性一经展示出对应于测试产物的一条带的反应性便得以证实。
在ELISA反应中，待测产物优选用于包被反应孔。纯化的制剂是优选的，虽然总提取物亦可使用。简言之，含10μg蛋白质/ml的100μl制剂被分布于96孔板的孔中。该板于37℃温孵2h，然后于4℃过夜。该板用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)(PBS/Tween缓冲液)洗涤。孔用含1％牛血清白蛋白的250μl PBS饱和。将其于37℃温孵1小时然后用PBS/Tween缓冲液洗涤。单特异性兔抗血清在含有0.5％BSA的PBS/Tween系列稀释。将100μl稀释液加入每一孔中。按标准方法将板进行可视化。例如，将抗兔免疫球蛋白的过氧化物酶偶联羊免疫球蛋白加到孔中。温孵于37℃持续90分钟，然后洗涤板。将反应物用合适的底物显色。用比色法测量反应(用分光光度计测量吸光度)。这种条件下，当稀释度为至少1∶50，优选至少1∶500，而OD值为1时，便为阳性反应。光密度测量的合适的波长依赖于底物。
在斑点印迹中，纯化的制剂是优选的，虽然总提取物亦可使用。简言之，含有100μg蛋白质/ml的待测产物制备物在50mM Tris-HCl，pH7.5中系列稀释两次。从每一稀释液取100μl通过96孔斑点印迹仪(Biorad)点样到0.45μm硝酸纤维素膜上。置于真空以除去缓冲液。加入50mM Tris-HCl pH7.5以洗涤孔，将膜空气干燥。将膜用封闭缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、0.15M NaCl，10g/l脱脂奶粉)饱和，然后用单特异性抗血清温孵，该抗血清在1∶50至1∶5000，优选1∶50至1∶500范围内稀释。该反应按标准方法可视化。例如，将抗兔免疫球蛋白的过氧化物酶偶联羊免疫球蛋白加到孔中。温孵于37℃持续90分钟，然后洗涤板。反应用合适的底物显色。通过比色或化学发光测定反应。此种条件下，当硝酸纤维素片的斑点在通过比色法而可视化的水平上直接观察到颜色，或通过化学发光法而于照相胶片上可视化，且这时稀释度为至少1∶50，优选为至少1∶500时，反应为阳性。
根据具体的实施方案，根据本发明的蛋白质可从卷旋杆菌中纯化获得，或在异源系统中由重组途径而表达(就根据本发明的多肽而言，情形亦如此)。在后一情形下，蛋白质可以展现出的转录后修饰不同于来源于起始菌株的相应蛋白质的转录后修饰。
根据本发明的蛋白质或多肽的治疗或预防效力可根据标准方法评价，例如：采用小鼠/H.felis模型和Lee等描述的方法(欧洲胃肠道学和肝学杂志(1995)，7：303或Lee等传染病学杂志(1995)172：161)测量粘膜免疫应答的诱导和具有治疗和预防效应的免疫应答的诱导，其前提是已采取如下预防措施：当蛋白质来源于H.felis以外的种时，Hfelis菌株应被属于由此衍生蛋白质的种的卷旋杆菌菌株替代，且适用于最终目的(其他实验条件是一致的)。例如，由幽门卷旋杆菌蛋白质经片段化而衍生的多肽诱导保护性或治疗性效应的能力通过替代幽门卷旋杆菌菌株而测试。这样的菌株为Kleanthous等人提议，其摘要在1995年7月7-9日，苏格兰爱丁堡举行的第8届国际胃十二指肠病理学研讨会上披露。与对照组相比，胃组织中的感染一经减弱，但可以观察到保护性效应。感染通过检测脲酶活性，细菌量或白细胞浸润而评价。例如当攻击之后，观察到胃组织中脲酶活性降低时，即使不能完全消除脲酶活性，也有理由断言有不完全的保护。
因此，本发明亦涉及(i)含有本发明的蛋白质或多肽及稀释剂及载体的物质的组合物；特别是(ii)含有治疗或预防有效量的作为活性成分的本发明的蛋白质或多肽的，试图具体用于卷旋杆菌感染预防或治疗的药物组合物；(iii)本发明的蛋白质或多肽的作为治疗或预防剂的应用；(iv)本发明的蛋白质或多肽在试图用于卷旋杆菌感染预防或治疗的药物生产中的应用，以及(v)一种用于在动物体内诱导针对卷旋杆菌，如，幽门卷旋杆菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae的免疫应答的方法，按照此方法，免疫有效量的本发明的蛋白质和多肽被施用于所述动物以发生免疫应答；特别是(vi)一种用于保护或治疗卷旋杆菌感染的方法，向个体施用预防或治疗有效量的本发明的蛋白质或多肽。
本发明的方法和药物组合物可治疗和防止卷旋杆菌感染，因而，可治疗和防止这一感染相关的胃肠疾病。具体地，它们是慢性和萎缩性急性胃炎；消化性溃疡，如胃和十二指肠溃疡；胃癌；慢性消化不良；难治性非溃疡性消化不良；肠组织变形和一些淋巴瘤(如低级MALT淋巴瘤)。
本发明的组合物可用疫苗领域内任一传统途径给药，特别是通过粘膜(如眼、鼻、口腔、胃、肠、直肠、阴道或尿道)表面或胃肠外(如，皮下，经皮，肌内，静脉内或腹膜内)途径。给药途径的选择取决于很多参数，如与本发明的蛋白质或多肽相关的佐剂。例如，假如使用粘膜佐剂，鼻内或口腔给药是优选的。假如使用脂质制剂，将选择胃肠外途径，优选皮下或肌内途径。
本发明的组合物除包含本发明的蛋白质或多肽之外，还至少包含另一卷旋杆菌抗原例如脲酶脱辅基酶、或脲酶的亚单位，片段，同系物，突变体或衍生物。
为用于本发明的组合物，根据本发明的蛋白质或多肽可以配制于脂质体中，或与脂质体一同配制：优选中性或阴离子脂质体，微球体，ISCOMS或病毒样颗粒(VLPs)，以提高蛋白质或多肽的寻靶机能，或增进其免疫应答。本领域技术人员可轻松地获得这些化合物。例如，参见脂质体：一种可行的探索，RRC New ED. IRL press(1990)。
除脂质体之外，还可采用佐剂。本领域技术人员熟知很多佐剂。这些佐剂参见下述：
就胃肠外给药而言，可特别提及铝化合物例如氢氧化铝，磷酸铝和羟基磷酸铝。按标准方法，抗原可以吸附到或沉淀到铝化合物上。其它佐剂例如RIBI(购自Immunochem(Hamilton.MT))亦可用于胃肠外给药。
就粘膜给药而言，可特别提及细菌毒素，例如，霍乱毒素(CT)，热不稳定大肠杆菌毒素(LT)难辨梭状芽孢杆菌毒素和百日咳毒素(PT)以及这些毒素的解毒形式(亚基，类毒素或突变体)例如，含有CT的B亚基(CTB)和小量CT的制剂亦可使用。因为保留了佐剂活性，这些毒素的片段，同系物和衍生物看来是适用的。优选地，采用具有减低的毒性的突变体。这些突变体在例如WO 95/17211(Arg-7-Lys CT突变体)，WO 95/34323(Arg-9-Lys，Glu-129-GlyPT突变体)和WO 96/6627(Arg-192-Gly LT突变体)。其他佐剂，例如，大肠杆菌，明尼苏达沙门氏菌，伤寒沙门氏菌或弗氏志贺氏菌的主要脂多糖(MPLA)可用于粘膜给药。
可用于粘膜和胃肠外给药的佐剂特别包括polyphosphazine(WO95/2415)，DC-胆(3-β-〔N-(N′，N′-二甲基氨基甲烷)氨甲酰基〕胆固醇(USP 5 283 185和WO 96/14831)和QS-21(WO88/9336)。
给药可以单剂量或一定时期之后，重复一次或几次剂量进行。合适的剂量依多种参数变动，例如受治疗的个体(或人或儿童)，疫苗抗原本身，给药的途径与频率，是否有佐剂出现，假如有的话，佐剂的类型和期望的效应(例如，保护或治疗)，这可由本领域技术人员决定。一般说来，本发明的抗原可以10μg至500mg，优选1mg至200mg的量施用。特别是，已表明胃肠外剂量不应超过1mg，优选不超过100μg。较高剂量可以遵医嘱使用于例如口服应用。不依赖于制剂，口服施用于人的蛋白质的量是例如1至10mg每剂量数量级，且推荐在4周间隔内至少3个剂量。
本发明的组合物可用传统方法生产。具体地，本发明的蛋白质或多肽可与可药用的稀释剂或载体组合使用，例如，当组合物试图用于口服或胃内给药时，可采用水或盐溶液例如磷酸盐缓冲液(PBS)，任选地补充碳酸氢盐，例如碳酸氢钠，例如0.1至0.5M。一般地，基于给药的方式和途径及标准的药物学实践而选择稀释剂或载体。可药用稀释剂和载体，以及所有药物学制剂中所必需的都在Remington氏药物科学中描述，这是该领域标准的教科书，及USP/NP中亦有描述。
在更详尽的描述方式中，提议例举由口服途径施用本发明的蛋白质或多肽，为此目的，本发明的蛋白质和多肽可以单独或者在其它幽门卷旋杆菌蛋白质的出现情况下，包装到明胶胶囊中，以保护抗原免受胃液降解，或者和碳酸氢钠共同施用。这样的制剂已用于药物组合物。(Black等，Dev.Biol.Stand.(1983)，53：9)。该蛋白亦可根据别处描述的方法(Eldridge等，Curr.Top.Microbiol.Immuno(1989)146：59)包装到PLGA微球(羰基乙酸乳酸共聚物)；该蛋白质亦包装到按照广泛描述的方法制备的脂质体中(脂质体：一种可行的探索，D.Rickwood和B.D.Hame编，1990，牛津大学出版社，ISBN 0-19-963077-1)。
替代地，本发明的蛋白质和多肽可经胃肠外途径给药。为此目的，本发明的蛋白质和多肽可按照完全传统的方法吸附到氧化铝凝胶上。在pH约为6.5的缓冲液中的1mg/ml蛋白质溶液，与Al+++量为10mg/ml的氢氧化铝接触1小时。最终的制剂组合物如下：蛋白质5-μg/ml，Al+++250μg/ml，硫柳汞1/10,000，以上各组分均在PBS中。在口服施用时，推荐使用3次剂量，每一剂量与前一剂量相距4周。
本发明的多肽可用做诊断试剂，例如，用于在生物学样品中，如血样中，检测到抗-卷旋杆菌抗体的存在。为此目的，这样的多肽优选地包含5至80氨基酸，优选10至50氨基酸。本发明的多肽试剂被标记或者是，按诊断方法使用。诊断方法已在本文中前述部分描述。
另一方面，本发明提供了能够识别本发明的蛋白质或多肽的单特异性抗体。
“单特异性抗体”应理解为意味着一种能够主要地与一种单一的卷旋杆菌蛋白质反应的抗体。这种抗体仅在使用基本纯化的蛋白质做为免疫原时才能获得。本发明的抗体可能是多克隆的或单克隆的，单克隆抗体可以嵌合的(例如，由鼠的可变区与人的恒定区相联)，或者人源化的(仅有高变区是来源于动物的，如来源于鼠)和/或一条链。多克隆抗体，如同单克隆抗体，可以是免疫球蛋白片段的形式，例如F(ab)′2或Fab片段。本发明的抗体可以是任意同种型的，例如IgG或IgA；多克隆抗体可以是单一同种型，或者是所有的或某些同种型的混合物。
下文中，术语“单特异性抗体”和“单特异性抗血清”可交互使用。
一种抗本发明的蛋白质的抗体可以被制备，然后用标准免疫学试验鉴定，例如Western印迹，斑点印迹或ELISA分析(例如，参见Goligan等人，当代免疫学方法(1994)John Wiley和Sons Inc.纽约，NY)；抗体，实验室手册，D.lane，(1988)Harlow编)。
本发明的抗体可用于诊断，以及用于大规模亲合层析纯化本发明的蛋白质或多肽，在被动免疫过程中，这一抗体亦可潜在地用作治疗剂。
因而，本发明亦提供了(i)用于检测生物样品中卷旋杆菌出现的试剂，包含根据本发明的抗体和多肽，和(ii)一种用于检测生物学样品中卷旋杆菌出现的诊断学方法，按照此种方法，生物学样品与本发明的抗体或多肽接触，因而形成了免疫复合物；任选地，去除未结合物质，检测在样品和本发明的抗体或多肽之间形成的免疫复合物，该复合物是样品中，或样品来源器官中卷旋杆菌出现的指征。
可以容易地理解：根据本发明的抗体使得检测胃提取液中卷旋杆菌的出现成为可能。
就用于诊断测试而言，试剂可以游离的形式或固定化于固体支持物；支持物可以是本领域普遍应用的任一支持物，例如试管，玻珠，或反应孔。固定化可以直接或间接方式完成。直接方法包括被动吸附(非共价键)或支持物和试剂之间的共价键。“间接方式”意谓着能够与试剂相结合的抗-试剂化合物首先与固体支持物相连。例如，如果采用一种多肽试剂，一种能够与其结合的抗体可用作抗-试剂，其前提是：该抗体结合到多肽的一个不参予出现于生物学样品中的抗体识别的表位上。间接方式也可以通过配基-受体系统完成，例如将一个分子例如维生素移植到多肽试剂上，然后固定化到固体形式的相应受体上。这可以由生物素-链霉抗生物素蛋白系统来说明。替代地，间接方法可采用，例如，向试剂加一肽尾，例如，床用化学方式，且通过被动吸附或通过共价键合肽尾而固定化移植产物。
本发明亦涉及一种用于从生物学样品中纯化本发明的蛋白质或多肽的方法。按照此方法，采有本发明的单特异抗体将生物学样品进行亲和层析处理。
为此目的，抗体可能是多克隆或单克隆的，优选地为IgG型。纯化的IgG可按照普遍使用的方法制备(参见，例如Coligan等)。
传统的层析支持物，和移植抗体的标准方法一样，在例如：抗体：实验室手册，D.Lane.Harlow编(1988)中被描述。
简言之，生物学样品，优选缓冲溶液，被加样到层析材料上，该材料优选地以用来稀释生物学样品的缓冲液平衡，致使本发明的蛋白质或多肽(抗原)吸附到材料上。这种层析材料，例如与本发明的抗体相联的凝胶或树脂可以床或柱的形式提供。未结合的组分被洗去，然后以合适的洗脱缓冲液洗脱抗原，例如甘氨酸缓冲液，或含离液剂的缓冲液，如盐酸胍，或高盐浓度(如3M MgCl2)。收集洗脱级分，检测抗原的出现，例如，通过测量280nm吸光度。
这一纯化方法可以例如用于从总提取物中纯化一种蛋白质。然而，假如抗体不是完全单特异性的，建议将待经免疫亲合层析处理的材料以一定量的待纯化蛋白质的形式预先富集。例如这一方法可用于完善32kDa蛋白质的纯化，该蛋白质是按上述的、包括在SP-Sepharose上纯化的步骤的方法获得的。
本发明的抗体的治疗或预防实用性可按Lee等人在上文中就本发明的蛋白质和多肽提出的保护性实验得以证实。因而，本发明的目的还有(i)一种包含本发明的单特异性抗体，和一种稀释剂或一种载体的物质的组合物；特别是，(ii)一种含有治疗或预防有效量的本发明的单特异性抗体的药物组合物；(iii)本发明的单特异性抗体在用于治疗或防止卷旋杆菌感染的药物生产中的应用；以及(iv)一种用于治疗或防止卷杆菌感染(例如，幽门卷旋杆菌，H.heilmanii，H.feis或H.mustelae)的方法，按照此方法，治疗或预防有效量的本发明的抗体被施用于需要此种治疗的个体。
为此目的，单特异性抗体可以是单克隆的或多克隆的，优选IgA同种型(占优势的)。在被动免疫方法范围内，抗体通过粘膜途径施用于动物，例如通过口服或胃内途径施用于胃粘膜，在碳酸氢盐存在下施用是优选的。本发明的单特异性抗体可以作为活性成分单独施用，亦可作为含有至少一种特异于每一种卷旋杆菌多肽的单特异性抗体的混合物施用。本方法所采用的抗体剂量可由本领域专业人员轻松地决定。例如，提议的剂量特征如下，每日施用100至1000mg抗体一周，或每日施用三次含100至1000mg的抗体的剂量施用二至三天。
根据上述含有本发明的蛋白质或多肽的组合物的制备原则，含有本发明的抗体的药物组合物可按照上述原则制备。而且，采用同样的药物指标。
参考附图，以在后文中说明本发明。
图1是制备幽门卷旋杆菌膜级分I，II，和III的方法概述。
图2表示膜级分I，II和III经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯蓝染色的分析结果。上样的样品是：膜级分I(泳道2)，膜级分II(泳道3)，膜级分III(泳道4)和分子量标志物(泳道1)。
图3表示由制备膜纯化的蛋白质经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯蓝染色的分析结果。上样的样品是：HpP1级分(泳道3)，HpP2级分(泳道4)，HpP4级分(泳道5)，HpP5级分(泳道6)，HpP6级分(泳道7)，分子量标志物(泳道1和8)和膜级分I(泳道2)。
图4表示级分7和9(于Q-Sepharose洗脱获得)过DEAE-Sepharose柱获得的级分的分析。该级分经10％和12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯蓝染色。上样的样品是：级分7(泳道2A)，级分7.1(泳道3A)，级分7.2(泳道4A)，级分9(泳道2B)，级分9.1(泳道3B)，级分9.2(泳道4B)，级分9.3(泳道5B)和分子量标志物(kDa)(泳道1A和1B)。
图5表示，经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯蓝染色，膜级分III(泳道3)经Q-Sepharose柱层析所得D级分和D级分经S-Sepharose柱层析所得的级分D′的电泳图谱。泳道1对应于分子量标志物，泳道2对应于膜级分III。实施例1：膜级分制备1A-培养
幽门卷旋杆菌菌株ATCC 43579在10升发酵罐中于液体培养基中进行培养。
一种于甘油中的冰冻微生物样品用于接种含有所谓“两相”培养基的75-cm2三角瓶(固相是含有6％新鲜绵羊血的哥伦比亚琼脂，液相是含有20％胎牛血清的胰酶(trypcase)水解大豆)。在微需氧环境下培养24小时之后，培养物的液相用于接种几个盛有缺乏平皿的两相培养基的75-cm2三角瓶。培养24小时之后，液相能够用于接种盛有含有10g/l β环糊精的液体大豆胰酶水解培养基的21生物发酵罐。培养物达到OD1.5至1.8时，接种到盛有液体培养基的10升发酵罐。培养24小时之后，于4000×g，4℃离心30分钟收集细菌。发酵罐中10升幽门卷旋杆菌ATCC 43579培养物可获得20至40g(湿重)细菌。1B-用正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)萃取
以上获得的微生物沉淀用500ml PBS(磷酸盐缓冲液；NaCl7.650g，磷酸氢二钠0.724g，磷酸二氢钾0.210g每升；pH7.2)/升培养物洗涤。在同样条件下再次离心微生物。
获得的细菌沉淀(C1)重悬于1％OG溶液(Sigma)中(30ml/升培养物)。将细菌悬液在磁力搅拌下于室温温孵1小时，然后于4℃，17,600×g离心30分钟。
沉淀(C2〕被储存，用于下一步处理。
获得的上清液(S2)在4℃透析(MWCO＝10000Da，Spectra/por)过夜，透析在磁力搅拌下，用稀释到1/2的1升PBS进行两次。透析过程中形成的沉淀于4℃，2600×g离心30分钟而收集，去除上清。含有膜蛋白的沉淀(Cs2d)贮存于-20℃。1C-破碎微生物
OG处理的微生物离心后所得沉淀(C2)重悬于20mM Tris-HCl缓冲液pH7.5和100μm Pefabloc(缓冲液A)然后经Ultraturrax(3821，Janke和Kungel)匀浆。获得的匀浆经溶菌酶(0.1mg/ml终浓度)和EDTA(1mM)处理。
匀浆物于4℃超声处理3次每次2分钟(探头φ＝0.5cm，功率＝20％，Sonifier 450 Branson，然后于4℃于210,000g超离心30分钟。去除含有胞质和周质蛋白的上清液(S3)，回收沉淀。用缓冲液A洗涤，然后于4℃于210,000g超离心30分钟。去除上清(S4)后，沉淀(C4)贮存于-20℃。该沉淀含有内在的和周围的膜蛋白。
该方法可以通过两次洗涤沉淀C4以除去周围的膜蛋白而继续。沉淀C4重悬于50mM NaCO3缓冲液pH9.5，100μM Pefabloc(缓冲液B)。悬液于4℃于210,000g超离心30分钟。去除上清液(S5)，然后在上述条件下对沉淀(C5)洗涤和超离心。去除上清液后，沉淀(C6)，其含有必需的内在膜蛋白贮存于-20℃。
在下文中级分C4、C6和Cs2d分别被称为膜级分I、II和III。1D-膜级分分析
按Laemmli方法(1970)，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析多种膜级分。蛋白质经考马斯蓝染色而可视。
如果考虑每一级分的主要蛋白，其SDS-PAGE图谱(图2)表明：膜级分I与膜级分II十分相似，另一方面，这两者显然不同于膜级分III。
膜级分I的图谱展示了7条蛋白主带，其分子量分别是87、76，67，54、50，47和32-35kDa(泳道2)。用抗ureB抗体和抗-过氧化氢酶抗体进行Western印迹，表明67kDa对应于脲酶B亚基，54kDa的带对应于过氧化氢酶。而级分II(泳道3)中无这两种蛋白质，因为用碳酸盐缓冲液洗涤去除了与膜微弱结合的蛋白。就膜级分II的蛋白质图谱而言，其展示了76、67、50和30kDa的4条主带的存在(泳道4)。实施例2：通过制备性SDS-PAGE纯化膜级分I蛋白
按照Laemmli的方法(1970)用5％浓缩胶和10％分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。膜级分重悬于缓冲液A中，用2×样品缓冲液对半稀释。混合物于95℃加热5分钟。大约19mg蛋白质上样于16×12cm大小，5mm厚的胶。50V预迁移2小时，然后于65V迁移过夜。用考马斯蓝R250(0.05％于超滤水)染色凝胶，使带清晰可见。
用刀片切下HpP1，HpP2，HpP4，HpP5和HpP6主带，置于盛有10或20ml萃取缓冲液的Ultra-turrax中，萃取缓冲液中含25mMTrisHCl pH8.8，8M尿素，10％SDS，100μm苯甲基磺酰氟(DMSF)和100μm Peflabloc(缓冲液C)；然后助借于一个挤压机于7巴压力下，于室温用Millipore  AP 20预过滤器(φ滤器＝4.7cm，φ孔＝20mm)过滤；然后用5至10ml缓冲液C洗涤，如上述过滤。合并由这两个基础产物而得的两份滤液。
用3倍体积的50∶50的75％甲醇和75％异丙醇混合物沉淀每一份滤出液，然后用70 TFT转头(J8-55，Beckman)，于240,000×g 10℃离心16小时。
将每一沉淀溶于2ml增溶缓冲液，增溶缓冲液含有10mM NaPO4pH 7.0，1M NaCl，0.1％十二烷基肌酸钠，100μm PMSF，100μmPefabloc和6M尿素(缓冲液D)。增溶样品用100ml含4M尿素和0.1％十二烷基肌酸钠的缓冲液D，100ml含2M尿素和0.5％十二烷基肌酸钠的缓冲液D，2次100ml不含尿素和含0.5％十二烷基肌酸钠连续透析。透析于室温下磁力搅拌进行1小时。最终的透析物于冰浴保温30分钟，然后于4℃，低速离心10分钟(Biofage A，Heraeus Sepatech)。回收上清液，用0.45μm Millipore滤器过滤并于-20℃贮存。
将每一级分进行SDS-PAGE分析(图3)。
每一级分的电泳图谱分析表明，级分HpP1，HpP2和HpP4是纯化的，这些级分各有一条带(分别于87，76和54kDa)，级分HpP5于50kDa处有一条高密度带，且被一条47kDa的带轻微地污染；同样级分HpP6于32kDa处有一条高密度带，且被一条35kDa的带轻微污染。实施例3：来自于膜级分I的30，50和54kD膜蛋白的纯化3A.在Q-Sepharose上进行阴离子交换层析
按制造商(Pharmacia)的推荐方案制备Q-Sepharose柱，柱体积是40ml(φ＝2.5cm，h＝8cm)。洗柱然后用含100μM Pefabloc和0.1％两性离子洗涤剂3-1 4的pH 9.5的NaCO3缓冲液平衡。通过于280nm UV检测柱流出物而监测层析的进行。
将140mg预先增溶的级分I膜蛋白上样于已用平衡缓冲液洗涤(50mM NaCO3 pH9.5，100μM Pefabloc和0.1％两性离子洗涤剂3-14)直至280nm处的吸光度稳定的柱上。蛋白质用包含于平衡缓冲液中的0.1至0.5M NaCl梯度洗脱(10×VT)；然后用含有0.5和1MNaCl的平衡缓冲液洗涤(2×VT)。收集的级分进行SDS-PAGE分析，且根据其电泳图谱合并于不同的合并液(pool)，然后贮存于-20℃，级分如下：
   级分     洗脱    级分     洗脱
    1 直接洗脱     6  0.25-0.28M NaCl
    2 平衡缓冲液洗涤     7  0.28-0.35M NaCl
    3 0-0.1M NaCl     8  0.35-0.5M NaCl
    4 0.1M-0.2M NaCl     9 洗涤开始1M NaCl
    5 0.2M-0.25M NaCl     10 洗涤结束1M NaCl
蛋白质洗脱表明：53％的蛋白质用0-0.5M NaCl梯度洗脱，14％蛋白质未吸附于柱上，33％蛋白质在用1M NaCl洗涤过程中被洗脱(表5)。未结合于柱上的蛋白质对应于碱性蛋白质，其在pH7.5时带正电荷，而用1M NaCl洗脱的蛋白质对应于酸性蛋白质，在该pH下是高度带电荷的。
级分7和9的纯化如下继续进行。3B-DEAE-Sepharose阴离子交换层析分离级分7和9的蛋白质
按制造商推荐方案(Pharmacia)制备DEAE-Sepharose柱，胶体积是10ml(φ＝1.5cm，h＝5cm)(最多10mg蛋白质/ml胶)。洗柱然后用含有100μM Pefabloc和0.1％两性离子洗涤剂3-14的50mMTris-HCl缓冲液平衡。如前述于280nm UV检测柱流出物而监测层析进行。
含有10mg蛋白质的，预先用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，100μM Pefabloc和0.1％两性离子3-14)透析的级分7被上样于DEAE-Sepharose柱。用平衡缓冲液洗柱，直至280nm处吸光度稳定。蛋白质用含于平衡缓冲液中的0至0.5M NaCl梯度洗脱(10×VT)，然后用含有1M NaCl的平衡缓冲液(2×VT)。收集的级分用SDS-PAGE分析，然后按照其电泳图谱合并成不同的合并液，贮存于-20℃。通过SDS-PAGE显示出级分7.1(直接洗脱)是最令人感兴趣的。
对于含有31mg蛋白质的级分9进行同样的纯化。通过SDS-PAGE，显示出级分9.1，9.2和9.3，其分别用0.1-0.25M NaCl，0.3-0.4M NaCl和1M NaCl洗脱是最令人感兴趣的。
就级分7而言(图4A)，结果表明仅有30kDa蛋白(泳道3；级分7.1)是富集的，经DEAE-Sepharose柱后被部分分离，其他蛋白质未被分离。就级分9而言(图4B)，电泳图谱表明54和15kDa的两种蛋白质被分离(泳道3和5，级分9.1和9.3)，50kDa蛋白质被富集(泳道4，级分9.2)。级分9.1的54kDa蛋白质不与抗过氧化氢酶抗体反应。实施例4：
从膜级分I中纯化32kDa膜蛋白
膜级分I于50mM NaCO3 pH9.5中，室温搅拌30分钟增溶。悬浮于+4℃，200,000×g离心30分钟。上清液用50mM NaPO4 pH7.4透析，然后上样于预先用同一缓冲液平衡的SP-Sepharose柱。用同一缓冲液洗柱后，该柱用0-0.5M NaCl处理。在0.26-0.31M之间洗脱的级分含有32kDa蛋白质。实施例5：制备抗级分HpP5和HpP6的超免疫抗血清
分别以制备性SDS-PAGE纯化的HpP5和HpP6超免疫兔，获得了特异于幽门卷旋杆菌主要膜蛋白的多克隆抗血清。在D0，用含有50μg乳化于完全弗氏佐剂的膜蛋白的制剂进行首次注射(皮下多个位点和肌内)。然后于D21和D42通过注射25μg完全弗氏佐剂中的膜蛋白进行加强免疫。于D60处死动物。获得的血清于56℃，30分钟去补体，通过用孔径为0.22μm的滤膜(Millipore)过滤而灭菌。
抗HpP5抗血清与实施例3的级分9.2分离的50kDa蛋白质反应。抗HpP6抗血清与实施例4中获得的在SP-Sepharose柱上用0.26-0.31MNaCl洗脱的级分分离的32kDa蛋白质反应。
明显地，上述免疫方法可用于以同一方式制备抗实施例3中纯化的任一种蛋白质的抗血清。在这些实施例中获得的制备物经制备型SDS-PAGE凝胶电泳处理是优选的。该蛋白带将如上述处理，以获得用于免疫的制备物。实施例6：从幽门卷旋杆菌中纯化过氧化氢酶
如实施例1A所述进行培养。洗涤的细菌沉淀重悬于50mM磷酸盐缓冲液pH 7.5中，该缓冲液含有100μM PMSF(苯甲磺酰氟，Sigma)(缓冲液A)，悬液的终浓度是0.1g(湿重)每升。悬液用Ultraturrax型混合器匀浆。细菌细胞用带有直径为1.8cm探头的Sonifier-型仪(Branson)超声破碎。超声间歇地进行，1分钟超声，1分钟静置冰上。10分钟超声足以完全破碎悬液中的5g微生物。获得的溶胞产物于4℃，4,000g离心15分钟。回收上清液然后于4℃，100,000g离心30分钟。回收第二次离心的上清液(S2)用于层析纯化。或按Hazell等人描述的方法或Beers和Sizer的方法生化杂志(1952)195：133)测得以此方法制备的S2级分保持了总的“过氧化氢酶”酶促活性的90％。
级分S2上样于预先用缓冲液A平衡的S-Sepharose柱。该柱用同一缓冲液洗涤。该层析过程中，以于280nm UV检测来监测蛋白质，以酶促活性来监测过氧化氢酶。除去未结合蛋白质之后(280nm的吸光度返回基线)，然后用含于缓冲液A中的0至1M NaCl梯度洗涤。回收对应于过氧化氢酶活性峰的级分，在一装备有截断值为100,000道尔顿的膜的Amicon-type浓缩小室中浓缩。如此获得的浓缩级分上样于预先用PBS缓冲液平衡的Sephacryl S-300HR柱。合并含有过氧化氢酶活性的级分，浓缩到1mg/ml，且用PBS缓冲液透析。终溶液用孔径为0.22μm的膜过滤，贮存于-70℃。
如此获得的蛋白质具有如下特征：
(i)典型的过氧化氢酶活性，而无过氧化物酶特性
(ii)典型的血蛋白可见光吸光光谱(visible spectrum)于406nm有一Soret峰，于520nm和550nm有α和β峰
(iii)在SDS-PAGE中于54kDa处，有一单体，具有以下N-末端序列：MVNKDVKQTTAFGAPVWDDNNVITAGPRG。实施例7：用免疫亲和层析纯化50kDa膜蛋白7.A-IgG类的纯化
如实施例5制备的抗级分HpP5的超免疫血清上样于预先用100mMTris·HCl pH8.0平衡的Protein A Sepharose 4 Fast Flow柱(Pharmacia)。树脂用10倍柱体积的100mM Tris·HCl pH8.0，然后10倍柱体积的10mM Tris·HCl pH8.0洗涤。IgG类以0.1M甘氨酸缓冲液pH3.0洗脱。IgG类以5ml级分收集，向其中加入0.25ml1M Tris·HCl pH8.0。于280nm处测量光密度然后合并含有IgG类的级分，如果需要，于-70℃冷冻。7.B柱制备
Pharmacia生产的适量的CNBr活化的Sepharose 4B凝胶(ref：17-0430-01)(已知1g干胶给出3.5ml水化胶，胶的密量是5至10μgIgG/ml胶)悬浮于1mM NaCl缓冲液中。借助于buchner通过加入小量1mM HCl洗涤胶。所用1mM HCl的总体积是200ml每克胶。
纯化的IgG于20+5℃对50倍体积的500mM磷酸盐缓冲液pH7.5透析4小时。然后稀释于500mM磷酸钠缓冲液pH7.5，终浓度为3mg/ml。
IgG类与胶于5+3℃振摇保温过夜。将胶装入层析柱并用2倍柱体积的500mM磷酸缓冲液pH7.5洗涤。然后将胶转移至试管中于100mM乙醇胺pH7.5于室温下振摇保温过夜。然后用2倍柱体积PBS洗涤。胶贮存于含1/10,000硫柳汞的PBS中。偶联到胶上的IgG的量通过测量起始IgG溶液和直接洗脱物加洗涤物之间的280nm处光密度的差值而确定。7.C抗原的吸附和洗脱
制备于50mM Tris HCl pH8.0，2mM EDTA的蛋白制剂，如1C中获得的级分I和II经0.45μm膜过滤，然后加样于预先用50mMTris-HCl pH8.0，2mM EDTA平衡的柱上，流速为大约10ml/h。柱用20倍体积的50mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA洗涤。另选地，吸附可发生于床，保温于5+3℃持续保温过夜，并振摇。
膜用2至6倍体积10mM磷酸钠缓冲液pH6.8洗涤。然后用100mM甘氨酸缓冲液，pH2.5洗脱抗原。洗脱物以3ml级分收集，向其中加入150ml pH8.0的磷酸盐缓冲液。每一级分的光密度于280nm测量；合并含有抗原的级分并贮于-70℃。10％SDS-PAGE凝胶电泳分析表明，仅在50kDa处有一条带。实施例8：亲合层析纯化32kDa膜蛋白
采用抗级分HpP6抗血清重复实施例7，以继续纯化实施例4所述的0.26-0.31M NaCl洗脱的级分。收集洗脱的级分，将含蛋白质的级分合并为单一制备物，后者经10％SDS-PAGE电泳分析。在32kDa处有一条单一的带。实施例9：凝集试验9A-培养
用于-70℃冻存于甘油中的幽门卷旋杆菌No.ATCC 43579(可从ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville MD-USA获得)接种一盛有两相培养基的25cm2三角瓶。两相培养基包括：由补充了6％新鲜绵羊血的10ml哥伦比亚琼脂(BioMerieux)组成的固相，和由含有20％胎牛血清的3ml大豆胰酶水解肉汤(Difco)的液相。三角瓶置于称为“generbag”(BBL)的密封袋中，在借助于Microaer System(BBL)获得的微需氧条件下(8-10％CO2，5-7％O2和85-87％N2)于37℃温孵48小时。
这一48小时的培养物被再次用于接种含有两相培养基的三角瓶。该培养物的起始600nm吸光度应为0.15至0.2。三角瓶在一致于上述条件下温孵。
48小时后，细菌悬液转移到测试管中。测量培养物的600nm吸光度，其应在3.0至3.5之间。革兰氏染色后镜检微生物的出现。9.B 抗血清
在使用前，如实施例4获得的抗血清经0.45μm膜过滤，以去除小的聚集物。9.C 凝集试验
在一黑底免疫沉淀板上(Prolabo ref.10050)，在第一孔中加入20μl生理盐水，中央孔中加入20μl免疫前收集的血清，在第三孔中加入抗血清。向三孔中的每孔加入20μl幽门卷旋杆菌细菌悬液，将液滴借助于带有密封吸头的巴氏吸管混合。
混合后，至多5分钟就可在放大镜下观察到凝集反应的开始。当混合物以含有大的聚集体的澄清溶液形式出现时，凝集反应完成。阴性对照，无论是生理盐水，还是免疫前血清，均保持混浊，表明细菌悬浮是完整的。
抗级分HpP5和抗级分HpP6的抗血清具有强烈的凝集反应。在测试条件下，幽门卷旋杆菌细菌快速凝集，而一分钟后完成。结果表明50和32kDa蛋白质可能暴露于卷旋杆菌表面。实施例10：54，50，30和32kDa膜蛋白的保护效应的证实
用1、5、25、50或100μg抗原经胃内途径免疫一组约10只6至8周龄Swiss Webster小鼠(Taconic Labs，Germantown，NY)，其中54，50或30kDa抗原以实施例3所述层析方法纯化，或者32kDa抗原按实施例4所述层析纯化，或按实施例8所述免疫亲合方法纯化，或50kDa抗原按实施例7的免疫亲合层析纯化(优选的)然后稀释于PBS或含有0.24M碳酸氢钠的PBS。抗原补充了5或10μg霍乱毒素(CT)(Calbiochem，San Diego)或热不稳定毒素(Berna Products，CoralGables FL)。首先用异氟烷麻醉小鼠，然后借助于插管施用体积为0.5ml的剂量。以7-10天为间隔，给每只小鼠施用4个剂量。在未次施用抗原之后的两周，用单剂量幽门卷旋杆菌ORV 2002菌株(每200μl PBS中有1×107活菌；OD550约为0.5)经胃内途径施用而攻击小鼠，没有接受抗原的对照组亦同样攻击。攻击后两周处死小鼠。或通过测量尿酶活性，或通过组织学评价细菌荷载(如Lee等描述，见上文)，或直接定量培养幽门卷旋杆菌来确定保护百分比。在此种条件下，与对照组相比，可能观察到就54，50，30和32kDa的每一种蛋白质而言，多数以25μg免疫的小鼠中，感染性荷载的极大降低，由此可以得出结论，54，50，30和32kDa的卷旋杆菌抗原是至少部分保护性的最好的结果是用32kDa蛋白质获得的(100％保护)。
            序列表(1)一般信息：
(i)申请人
  (A)姓名：Pasteur Merieux Serums et Vaccins
  (B)街道：58 avenue Leclerc
  (C)城市：Lyon
  (D)国家：法国
  (E)邮编：69007
  (G)电话：72 73 79 31
  (H)电传：72 73 78 50
(ii)发明名称：新幽门卷旋杆菌膜蛋白
(iii)序列数：2
(iv)计算机可读形式：
  (A)媒介类型：带
  (B)计算机：IBM PC兼容型
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：22氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设的：非
(iv)反义：非
(v)片段类型：N-末端(xi)序列描述：  SEQ  ID  NO：1：Met  Lys  Glu  Lys  Phe  Asn  Arg  Thr  Lys  Pro  His  Val1                   5                       10Asn  Ile  Gly  Thr  Ile  Gly  His  Val  Asp  His
       15                       20(2)SEQ ID NO：2信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：29氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设的：非
(iv)反义：非
(v)片段类型：N-末端
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met  Val  Asn  Lys  Asp  Val  Lys  Gln  Thr  Thr  Ala  Phe1                     5                       10Gly  Ala  Pro  Val  Trp  Asp  Asp  Asn  Asn  Val  Ile  Thr  Ala
       15                            20                  25Gly  Pro  Arg  Gly

Claims (12)

1.基本纯化形式的幽门卷旋杆菌蛋白质，它能够从幽门卷旋杆菌膜级分中获得，经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，其分子量看来是54，50，32-35或30kDa左右，其前提是当分子量是54kDa时，蛋白质不与抗过氧化氢酶抗血清反应。
2.权利要求1的蛋白质，其表观分子量是约54kDa左右，其可以按下述方法完成，在该方法中：
(i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽门卷旋杆菌细菌，然后离心；
(ii)收集细菌沉淀且用溶菌酶处理，并经超声处理，然后离心；
(iii)回收离心沉淀，经20mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5洗涤，然后离心；
(iv)回收由离心沉淀构成的膜级分，将其重悬于水性介质；
(v)用0-0.5M NaCl梯度，将膜级分在Q-Sepharose柱上进行阴离子交换层析，然后用1M NaCl洗涤；
(vi)回收在用1M NaCl洗涤开始时洗脱的级分，用0-0.5MNaCl梯度将其在DEAE-Sepharose柱上进行阴离子交换层析；以及
(vii)回收以0.1-0.25M NaCl洗脱的级分。
3.权利要求1的蛋白质，其表观分子量是约50kDa左右，其可以按下述方法完成，在该方法中：
(i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽门卷旋杆菌细菌，然后离心；
(ii)收集细菌沉淀且用溶菌酶处理，并经超声处理，然后离心；
(iii)回收离心沉淀，经20mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5洗涤，然后离心；
(iv)回收由离心沉淀构成的膜级分，将其重悬于水性介质；
(v)用0-0.5M NaCl梯度，将膜级分在Q-Sepharose柱上进行阴离子交换层析，然后用1M NaCl洗涤；
(vi)回收在用1M NaCl洗涤开始时洗脱的级分，用0-0.5MNaCl梯度将其在DEAE-Sepharose柱上进行阴离子交换层析；以及
(vii)回收以0.3-0.4M NaCl洗脱的级分。
4.权利要求3的蛋白质，它具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的N末端。
5.权利要求1的蛋白质，其表观分子量是约30kDa左右，其可以按下述方法完成，在该方法中：
(i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽门卷旋杆菌细菌，然后离心；
(ii)收集细菌沉淀且用溶菌酶处理，并经超声处理，然后离心；
(iii)回收离心沉淀，经20mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5洗涤，然后离心；
(iv)回收由离心沉淀构成的膜级分，将其重悬于水性介质；
(v)用0-0.5M NaCl梯度，将膜级分在Q-Sepharose柱上进行阴离子交换层析，然后用1M NaCl洗涤；
(vi)回收在用0.28-0.35M NaCl洗脱的级分，用0-0.5MNaCl梯度将其在DEAE-Sepharose柱上进行阴离子交换层析；以及
(vii)回收对应于直接洗脱的级分(无NaCl时)。
6.权利要求1的蛋白质，其表观分子量是约32-35kDa左右，其可以按下述方法完成，在该方法中：
(i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽门卷旋杆菌细菌，然后离心；
(ii)收集细菌沉淀且用溶菌酶处理，并经超声处理，然后离心；
(iii)回收离心沉淀，经20mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5洗涤，然后离心；
(iv)回收由离心沉淀构成的膜级分，将其重悬于水性介质，优选采用碳酸盐缓冲液pH9.5；
(v)在(iv)中获得的悬液于200,000×g离心，回收上清液；
(vi)将(v)中获得的上清液的pH降低到pH7，优选地用磷酸盐缓冲液pH7透析；
(vii)用0-0.5M NaCl梯度将(vi)中获得的制备物在SP-Sepharose柱上进行阳离子交换层析，该NaCl梯度优选地包含于磷酸盐缓冲液pH7中；以及
(viii)回收用0.26-0.31M NaCl洗脱的级分。
7.基本纯化形式的由所述蛋白质经片段化和/或突变衍生的卷旋杆菌蛋白质或多肽，它能够被制备用于抗权利要求1至6的蛋白质的抗血清识别。
8.用于防止或治疗幽门卷旋杆菌感染的药物组合物，它含有作为活性成分的权利要求1至7之一的蛋白质或多肽。
9.能够识别权利要求1至7之任一的蛋白质或多肽的单特异性抗体。
10.试图用于防止或治疗幽门卷旋杆菌感染的药物组合物，它包含作为活性成分的权利要求9的单特异性抗体。
11.使检测生物学样品中卷旋杆菌的出现成为可能的诊断方法，根据此方法，生物学样品与权利要求9的抗体或权利要求7的多肽相接触，致使免疫复合物形成，未结合物质被任选地除去，并检测样品和抗体或多肽间形成的免疫复合物。
12.用于从生物学样品中纯化权利要求1至7之一的多肽或蛋白质的方法，根据此方法，采用权利要求9的单特异性抗体将生物学样品进行亲合层析。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication