MXPA97004110A - Nueva proteina de membrana helicobacter pylori p76 - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona a una proteína de Helicobacter pylori en una forma substancialmente purificada, susceptible a obtenerse de una fracción de membrana de Helicobacter pylori y de lo cual el peso molecular después de electrofóresis en gel de poliacrilamida al 10%en la presencia de SDS, es de aproximadamente 76 KDa.

Description

NUEVA PRO EINA DE MEMBRANA HSLICOBACTER PY ORI P76 El objetivo de la presente invención es en particular una proteína Helicobacter pylori recientemente obtenida en forma substancialmente purificada, así como las composiciones farmacéuticas que la contienen. Helicobacter es un género bacterial caracterizado por bacterias helicoidales gran negativas. Varias especies colonizan el tracto gastrointestinal de mamíferos. Pueden mencionarse en particular H. pylori , H. heilmanii , H. felis y H. mustelae . Aunque H. pylori es la especie más comúnmente asociada con infecciones humanas, en algunos casos raramente admitidos, ha sido posible el aislar en humanos H. heilmanii y H. felis . Helicobacter infecta más del 50 % de la población de adultos en países desarrollados y casi el 100 % en países en desarrollo, siendo uno de los agentes infecciosos predominantes del mundo. H. pylori hasta la fecha se encuentra exclusivamente en la superficie de la membrana mucosa del estómago en humanos y más particularmente alrededor de las lesiones de cráter de úlceras gástricas y duodenales. Esta bacteria actualmente se reconoce como el agente etiológico de la gastritis antral y aparece como uno de los cofactores requeridos para el desarrollo de úlceras. Aún más, parece que el desarrollo de carcinomas gástricos, puede estar asociado con la presencia de ff. pylori .

Por lo tanto parece ser altamente conveniente el desarrollar una vacuna pretendida para tratar o evitar infecciones de H. pylori . Esta vacuna seria más probablemente de naturaleza subunidad. Diversas proteínas H. pylori se han caracterizado o se han aislado hasta la fecha. Son especialmente ureasa, compuesta por dos sub unidades A y B de 30 y 67 kDa, respectivamente (Hu & Mobley, Infect. Immun. (1990) 5_8_: 992; Dunn y colaboradores, J. Biol. Chem. (1990) 265; 9464; Evans y colaboradores, Microbial Pathogenesis (Patogénesis Microbial) (1991) 10 : 15; Labigne y colaboradores, J. Bact, (199) [sic] 173:1920); la vacuola citotoxina de 87 kDa (VacA) (Cover & Blaser, J. Biol. Chem. (1992) 267 : 10570; Phadnix y colaboradores, Infect. Immun. (1994) 6¿ : 1557; WO 93/18150); Un antígeno inmuno dominante de 128 kDa asociado con la citotoxina (CagA, también denominada TagA) (WO 93/18150; USP 403 924); proteínas de choque térmico HspA y HspB de 13 y 58 kDa, respectivamente (Suerbaum y colaboradores., Mol. Microbiol. (1994) 14 : 959; WO 93/18150); una catalasa de 54 kDa (Hazell y colaboradores, J. Gen. Microbiol. (1991) 137 : 57); una hemaglutinina fibrilar (HpaA) de 20 kDa; una proteína rica en histidina de 15 kDa (Hpn) (Gilbert y colaboradores., Infect. Immun. (1995) 63 : 2682); una proteína de membrana exterior de 30 kDa (Bolin y colaboradores, J. Clin. Microbiol. (1995) 33 : 381); una lipoproteina asociada con membrana de 20 kDa (Kostrcynska y colaboradores, J. Bact. (1994) 176 : 5938) así como una familia de porinas HopA, HopB, HopC y HopD, de peso molecular 48 y 67 kDa (Exner y colaboradores, Infect. Immun. (1995) £2.: 1567). Algunas de estas proteínas ya se han propuesto como antigenos de vacuna potencial. En particular, ureasa se reconoce como el antígeno más preferido que puede emplearse para este propósito (WO 94/9823; WO 95/3824; WO 95/22987; Michßtti y colaboradores Gastroenterology (1994) 107: 1002). Queda el hecho de que la búsqueda por nuevos antígenos debe continuar especialmente ya que se prevé que a fin de obtener un efecto de vacuna óptimo, probablemente habrán de incorporarse varios antígenos en una vacuna. En resumen, aún parece ser necesario identificar antígenos adicionales a fin de incorporarlos en una vacuna de alta eficacia. De acuerdo con esto, la materia de la invención es especialmente una proteína H. pylori en una forma substancialmente purificada, capaz de obtenerse de una fracción de membrana de ff. pylori , y cuyo peso molecular después de electroforésis en un gel de poliacrilamida al 10 % en la presencia de SDS, aparece en el orden de 76 KDa. "Forma substancialmente purificada" se pretende que significa que la proteína se separa del medio en el que existe naturalmente. Entre otros, puede ser una preparación que carece especialmente de las proteínas periplásmica y citoplásmica ff. pylori .

La proteína de membrana cuyo peso molecular aparente está en el orden de 76 KDa es capaz de obtenerse por un proceso en el que: (i) Las bacterias ff. pylori se extraen con n-octil BETA-D glucopiranósido, al 1 %, seguido por centrifugación; (ii) Se recupera un sobrenadante que esta sujeto a diálisis contra PBS 75 nM, pH 7.2, seguido por centrif gación; (iü) La fracción de membrana que consiste de nodulo de centrifugación se recupera y se le suspende en un medio acuoso ventajosamente en amortiguador carbonato pH 9.5, que contiene zwittergent 3-14 al 5 %; (iv) La fracción de membrana está sujeta a una cromatografía intercambio-aniónico en una columna Q-Sepharose en un gradiente de NaCl 0 - 0.5 M, ventajosamente en un amortiguador carbonato pH 9.5 que contiene zwittergent 3-14 al 0.1%; (v) La fracción eluída en NaCl 0.25 a 0.45 M, por ejemplo, en NaCl 0.25- 0.35 M o de preferencia NaCl 0.35-0.45 M se recupera y eetá sujeta a una cromatografía de intercambio aniónico en una columna de S-Sepharose, en un gradiente de NaCl de 0 a 1 M, ventajosamente un amortiguador acetato pH 5 que comprende zwittergent 3 a 14 al 0.1 % (ventajosamente la fracción NaCl 0.25 a 0.45 M, por ejemplo NaCl 0.25 a 0.35 M o en NaCl 0.35-0.45 M, primero se dializa contra amortiguadores acetato pH 5 que contiene zwittergent 3-14, 0.1 %; y (vi) La fracción eluída en NaCl 0.15 a 0.2 M, de preferencia en NaCl 0.15 M se recupera. Por razones de claridad, se especifica que una expresión tal como "una fracción eluida en NaCl 0.25 a 0.45 M" habrá de entenderse como sigue: Una fracción eluida a una concentración de NaCl de entre 0.25 y 0.45 M. La fracción eluida por lo tanto puede incluir el material eluido entre 0.25 y 0.45 M o el material eluido entre dos concentraciones en la gama de 0.25 a 0.45 M, por ejemplo 0.35 a 0.45 M. Es igualmente especificado que el gradiente de NaCl aplicado a la columna de S-Sepharose, de preferencia es un gradiente escalonado. Por ejemplo, se emplean etapas de NaCl de 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M y 1 M. La función biológica supuesta de la proteína de membrana de 76 KDa es una porina, probableaente situada al nivel de la membrana exterior. Exner y colaboradores, Infect. Immun, (Apr. 1995) 63 : 1567 caracteriza una familia de porinas cada una de las cuales exhibe en electroforésis de SDS-Page, un perfil de migración diferente ya sea que se hayan calentado a 95°C (proceso convencional) o de otra forma. Este no es el caso respecto a la proteína de 76 KDa de acuerdo con la invención; sin duda su migración de gel no se modifica con una muestra calentada a 60aC y no a 95°C. La secuencia N-terminal de la proteína de 76 KDa de una cepa ff. pylori (ATCC 43579) ee como sigue (código de una letra) EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV. Esta información no excluye el hecho de que proteínas equivalentes capaces de purificarse de acuerdo con el procedimiento indicado anteriormente puedan tener una secuencia N-terminal ligeramente diferente, ya que pueden derivarse de otra cepa bacterial. Esta diferencia sin duda reflejará el fenómeno de variancia alélica comúnmente encontrada dentro de la misma especie. Por ejemplo una especie bacterial usualmente se representa por un grupo de cepas que difieren entre si en menores características alélicas. Un polipéptido que cumple con la misma función biológica en diferentes cepas puede tener una secuencia de aminoácidos que no es diferente para todas las cepas. Esta variación alélica también existe en ADN. Las diferencias alélicas al nivel de la secuencia de aminoácido pueden consistir de una o más substituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos que no alteran la función biológica. "Función biológica" se entiende que significa la función de la proteína que participa en la supervivencia de las células en donde existe la proteína naturalmente (incluso si la función no es esencial absolutamente). Por ejemplo, la función de una porina consiste en permitir que compuestos presentes en el medio externo entren al interior de las células. La función biológica es distinta de la función antigénica. Una proteina puede tener más de una función biológica. El sujeto de la invención también es una proteina en una forma substancialmente purificada y que puede haber sido purificada de acuerdo con uno de los procesos descritos anteriormente a partir de una bacteria del género Helicobacter, por ejemplo ff. pylori , ff. heilmanii , ff. felis y ff. mustelae . La materia de invención también es cualquier proteína o polipeptido, en una forma substancialmente purificada y que sea análoga como en términos de antigenicidad, a una proteína Helicobacter capaz de purificarse con un procedimiento anteriormente descrito. respecto a los polipéptidos, son especialmente polipéptidos derivados por fragmentación o por mutación de uno o más aminoácidos, por ejemplo por eliminización, adición o substitución, de una proteína que existe en la naturaleza y cuya forma purificada puede obtenerse de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Estos polipéptidos pueden obtenerse especialmente por digestión enzimática con el auxilio de proteasas tales como pepsina o tripsina. No es necesario que estos polipéptidos se purifiquen de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.

La presente invención utiliza los términos "proteína" y "polipéptido" independientemente del tamaño de las moléculas (longitud la cadena aminoácido) y de las modificaciones post-translacionales posibles. En el resto de la descripción, el termino "polipéptido" se reserva para designar un producto de una proteína derivada por fragmentación o mutación. Una proteína o un polipéptido de acuerdo con la invención habrá de ser capaz de reconocerse por anticuerpos mono específicos desarrollados contra una proteína Helicobacter capaz de purificarse de acuerdo con un procedimiento anteriormente descrito. Esta antigenicidad específica puede revelarse de acuerdo con una cantidad de métodos; por ejemplo por manchado Western (blotting) (Towbin y colaboradores, PNAS (1979) 10 76 : 4350), manchado de puntos y ELISA. En manchado Western, el producto que se pretende probar, por ejemplo ya sea en la forma de una preparación purificada o en la forma de un extracto bacterial está sujeto a electroforesis de gel SDS-Page (poliacrilamida al 10 %) como se describe por Laemmli U.K., Nature (1970) 227: 680. Después de transferir sobre una membrana de nitrocelulosa, esta última se incuba por un suero hiperinmune mono específico diluido en la gama de diluciones de 1:50 a 1:5000, de preferencia de 1:100 a 1:500. La antigenicidad específica se demuestra tan pronto como una banda que corresponde al producto de prueba exhibe una reactividad en una de las diluciones incluidas en la gama establecida anteriormente . En ELISA, el producto pretendido a probarse de preferencia se emplea para revestir pozos. Una preparación purificada de preferencia se emplea aunque un extracto total también puede emplearse. Brevemente 100 µl de una preparación que contiene lOµg de proteina/ml se distribuyen en los pozos de una placa de 96 pozos. La placa se incuba por dos horas a 37°C y luego durante la noche a 4°C. La placa se lava con amortiguador PBS (salino amortiguado con fosfato) que contiene Tween 20 al 0.05 % (amortiguador PBS/Tween). Los pozos se saturan con 250 ?MU1 de PBS que contiene albúmina de suero bobino al 1 % (BSA) . Todo se incuba por una hora a 37°C y luego la placa se lava con amortiguador PBS/Twin. Un antisuero de conejo monoespecífico se diluye en serie en amortiguador PBS/Tween que contiene BSA al 0.5 %. Cien µl de una dilución se agregan a cada pozo. La placa se incuba por 90 minutos a 37°C y luego se lava. La placa se visualiza de acuerdo con métodos standard. Por ejemplo, una inmunoglobulina de cabra-peroxidasa conjugada contra inmunoglobulinas de conejo se agrega a los pozos. La incubación se continúa por 90 minutos a 37 °C y luego se lava la placa. La reacción se desarrolla con el substrato apropiado. La reacción se mide por colorimetria (absorbancia medida por espectrofotometría) . Bajo estas condiciones, una reacción positiva se observa cuando un valor OD de 1 se asocia con una dilución de al menos 1:50, de preferencia al menos de 1:500. La longitud de onda apropiada en la cual la densidad óptica se mide, depende del substrato. En manchado de puntos, una preparación purificada del producto a probar, de preferencia se emplea aunque también puede emplearse un extracto total. Brevemente, una preparación de producto a probarse que contiene 100 µg de proteina/ml se diluye en serie dos veces en 50 mM Tris-HCL pH 7.5. Si 1 µl de cada aplicación se aplican a una membrana de nitrocelulosa 0.45 µm en un aparato de manchado de puntos de 96 pozos (Biorad). El amortiguador se retira al colocar al vacio. Los pozos se lavan por adición de Tris HCl 50mM, pH 7.5 y la membrana se seca al aire. La membrana se satura con amortiguador de bloqueo (Tris-HCl 50mM, pH 7.5, NaCl 0.15 M, 10 g/1 de leche descremada) y luego incuban con un antisuero monoespecífico diluido en la gama de 1:50 y 1:5000 de preferencia 1:50 a 1:500. La reacción se visualiza de acuerdo con, métodos standard. Por ejemplo, una inmunoglobulina de cabra - peroxidasa conjugada contra inmunoglobulina de conejo se agrega a los pozos. La incubación se continúa por 90 minutos a 37°C y luego la placa se lava. La reacción se revela con el substrato apropiado. La reacción se mide por colorimetrla y quimioluminiscencia. Bajo estas condiciones, una reacción es positiva cuando se observa un color al nivel del punto en la hoja de nitrocelulosa directamente para visualización por colorimetría o en una película fotográfica para visualización por quimioluminiscencia, asociada con una dilución de al menos 1:50, de preferencia al menos 1:500. De acuerdo con la modalidad específica, una proteína de acuerdo con la invención puede obtenerse especialmente por purificación a partir de Helicobacter o expresarse por la ruta recominante en un sietema heterólogo (que también puede ser el caso para un polipéptido de acuerdo con la invención) . En el último caso, la proteína puede exhibir modificaciones post traslacionales que no son idénticas a aquellas de la proteína correspondiente derivada de la cepa original. La eficacia terapéutica o profiláctica de una proteina o de un polipéptido de acuerdo con la invención puede evaluarse con métodos standard, como por ejemplo medir la inducción de una respuesta inmune mucosal o la inducción de una inmuno respuesta que tiene un efecto terapéutico protector, utilizando por ejemplo el modelo de ratón/ff. felis y los procedimientos descritos por Lee y colaboradores, Eur. J. Gastroenterology & Hepatology, (1995), 7: 303 o Lee y colaboradores, J. Infect. Di. (1995) 172: 161, bajo la condición de que se tome la siguiente precaución: Cuando la proteína se deriva de una especie diferente a ff. felis , la cepa ff. felis, deberá reemplazarse por una cepa helicobacter que pertenece a la especie de la cual se deriva la proteína y adapta a este fin (las otras condiciones experimentales permanecen idénticas). Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido derivado por fragmentación a partir de una proteína de ff. pylori para inducir un efecto protector o terapéutico, se prueba al substituir una cepa ff. pylori . Esta cepa se propone por Klenthous y colaboradores, presentado en el VIIlo. Taller Internacional en Patología Gastroduodenal sita 9 de julio de 1995 en edimburgo Escocia. Un efecto protector se observa una vez que una infección en un tejido gástrico se reduce en comparación con un grupo de control. La infección se evalúa al probar la actividad de ureasa, la placa bacterial o la infiltración de leucocitos. Por ejemplo, cuando una reducción en la actividad de ureasa en el tejido gástrico se observa después de un ataque, incluso sino es abolido completamente, es razonable estimar que hay protección parcial. Consecuentemente, la invención también se relaciona a (i) una composición de material que comprende una proteína o un polipéptido de acuerdo con la invención y un diluyente o un portador; en particular (ii) una composición farmacéutica pretendida especialmente para la prevención o tratamiento de una infección de Helicobacter, que comprende como ingrediente activo, una proteina o un polipéptido de acuerdo con la invención, en una cantidad efectiva desde un punto de vista profiláctico o terapéutico; (iii) el uso de una proteína o un polipéptido de acuerdo con la invención como agente terapéutico o profiláctico; (iv) el uso de una protelna o un polipéptido de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento pretendido para la prevención o tratamiento de una infección Helicobacter,' así como (v) un método para inducir una inmuno respuesta contra Helicobacter, por ejemplo ff. pylori , ff. heilmanii , ff. felie y ff. jpuste2ae en un mamífero, de acuerdo a lo cual una cantidad inmunológicamente efectiva de una proteína o de un polipéptido de acuerdo con la invención se administra al mamífero a fin de desarrollar una inmuno respuesta; en particular (vi) un método para la prevención o tratamiento de una infección de Helicobacterlle [sic] se administra a un individuo en una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de una proteina o de un polipéptido de acuerdo con la invención. Los métodos y composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden tratar o evitar infecciones de Helicobacter y consecuentemente enfermedades gastrointestinales asociadas con estas infecciones. En particular son gastritis aguda, crónica y atrófica; úlceras pépticas, por ejemplo úlceras gástricas y duodenales; cánceres gástricos; dispepsias crónicas; dispepsias no ulcerosas refractarias; metaplasias intestinales y ciertos linfomas (por ejemplo linfoma MALT grado bajo). Una composición de acuerdo con la invención puede administrarse por cualquier ruta convencional en uso en el campo de vacunas, en particular a través de una superficie mucosal (por ejemplo ocular, nasal, oral, gástrica, intestinal, rectal, vaginal o del tracto urinario) o por ruta parenteral (por ejemplo subcutánea, intradermal, intramuscular, intravenosa o intraperitonal) . La selección de la ruta de administración depende de una cantidad de parámetros tales como el adyuvante asociado con la protelna o el polipéptido de acuerdo con la invención. Por ejemplo si se emplea un adyuvante mucosal, la ruta nasal u oral será preferida. Si se emplea una formulación de lípidos, la ruta parenteral, de preferencia la ruta subcutánea o intramuscular será selecta. Una composición de acuerdo con la invención puede comprender además de una proteína o un polipéptido de acuerdo con la invención, al menos otro antígeno Helicobacter tal como la apoenzi a ureasa, o una sub-unidad fragmento u homólogo mutante de esta ureasa. Para utilizar en una composición de acuerdo con la invención, una proteína o un polipéptido de acuerdo con la invención puede formularse en o con liposomas, de preferencia liposomas, microesferas, ISCOMS o partículas tipo virus (VLPs) neutrales o aniónicos, para promover el hacer objetivo de la proteína o polipéptido para mejorar la inmuno respuesta. Personas con destreza en la especialidad, obtienen estos compuestos sin dificultad alguna; por ejemplo ver Liposomes: A Practical Approach (liposomas: un enfoque práctico) RRC New ED, IRL press (1990) . Adyuvantes aparte de los liposomas también pueden emplearse. Una gran cantidad se conoce por personas con destreza en la especialidad. Estos adyuvantes, se refieren a continuación: Para administración parenteral , puede mencionarse en especial compuestos de aluminio tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio e hidrofosfato de aluminio. El antígeno puede absorberse o precipitarse sobre un compuesto de aluminio de acuerdo con métodos standard. Otros adyuvantes tales como RIBI a partir de ImmunoChem (Hamilton, MT) pueden emplearse para administración parenteral . Para administración mucosal, pueden mencionarse en especial las toxinas bacteriales, por ejemplo la toxina de cólera (CT), la toxina E. Coli termo lábil (LT) , la toxina Clostridium Difficile y la toxina pertussis (PT) asi como las formas desintoxicadas (sub-unidad toxoide o mutante) de estas toxinas. Por ejemplo, una preparación que contiene la sub-unidad B de CT (CTB) y una menor cantidad de CT pueden emplearse. Fragmentos, homólogos y derivados de estas toxinas igualmente son apropiados en cuanto que retienen una actividad adyuvante. De preferencia, un mutante que tiene una toxicidad reducida se emplea. Estos mutantes se describen por ejemplo en WO 95/17211 (mutante Arg-7-Lys CT), WO 95/34323 (mutante Arg-9-Lys Glu-129-Gly PT) y WO 96/6627 (mutante Arg-192-Gly LT) . Otros adyuvantes tales como el lipopolisacárido bacterial mayor (MPLA) de por ejemplo E. coli , Salmonella minnesota, Salmonella tifimuriom o Shigella flexneri , o puede emplearse para administración mucosal. Adyuvantes útiles tanto para administración como parenteral incluyen especialmente polifosfafina (WO 95/2415), DC-chol (3-beta-[N- 25 (NdN'-dimetilaminometano) carbamoil] colesterol (USP 5 283 185 y WO 96/14831) y QS-21 (WO 88/9336). La administración puede realizarse como una sola dosis o como una dosis repetida una o varias veces después de un cierto período. La dosis apropiada varía de acuerdo con los diversos parámetros, por ejemplo el individuo tratado (adulto o niño) el antigeno de vacuna misma, el modo y frecuencia de administración, la presencia o ausencia de adyuvante y de estar presente, el tipo de adyuvante y el efecto deseado (por ejemplo protección o tratamiento) , como puede determinarse por personas con destreza en la especialidad. En general, un antígeno de acuerdo con la invención puede administrarse en una cantidad en la gama de 10 µg a 500 mg, de preferencia de 1 mg a 200 mg. En particular se indica que una dosis parenteral no habrá de exceder 1 mg o de preferencia 100 µg. Pueden prescribirles superiores dosis por ejemplo para uso oral. Independientemente de la formulación, la cantidad de proteína administrada al humano por la ruta oral es por ejemplo del orden de 1 a 10 mg de dosis, y al menos 3 dosis se recomiendan a intervalos de 4 semanas. Una composición de acuerdo con la invención puede fabricarse en una forma convencional. En particular, una proteína o un polipéptido de acuerdo con la invención se combina con un diluyente portador que es farmacéuticamente aceptable, por ejemplo agua o una solución salina tal como salino amortiguado con sulfato (PBS), opcionalmente suplementado con una sal de bicarbonato tal como bicarbonato de sodio, por ejemplo O.l a 0.5 M, cuando la composición se pretende para administración oral o intragástrica. En general, el diluyente o portador se elige en base al modo y ruta de administración y de prácticas farmacéuticas standard. Diluyentes y portadores que son farmacéuticamente aceptables así como todo lo que es necesario para su uso en formulaciones farmacéuticas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Ciencias Farmacéuticas de Remington) , un texto de referencia standard de este campo y en USP/NP. En una forma más detallada, se propone a manera de ejemplo el administrar una protelna o un polipéptido de acuerdo con la invención por la ruta oral. Para este objetivo, una proteína o un polipéptido de acuerdo con la invención puede encapsularse solo o en la presencia de otras proteínas ff. Pilori en cápsulas de gelatina, a fin de proteger el antigeno contra degradación por jugo gástrico o administrarse en la presencia de bicarbonato de sodio. Estas formulaciones ya se han empleado para composiciones farmacéuticas (Black y colaboradores, Dev. Biol. Stand. (1983), 53: 9). La proteina también puede encapsularse en microesferas PLGA (copolímeros de ácido glicólico y ácido láctico) de acuerdo con el procedimiento descrito en otra parte (Eldridge y colaboradores, Curr. Top. Microbiol. Inmuno. (1989) 146 : 59); la proteína también puede encapsularse en liposomas preparadas de acuerdo con métodos convencionales ampliamente descritos ("Liposomes: a practical approach (Liposomas: Un enfoque práctico), Ed. RRC New, D. Rickwood & B.D. Hames, 1990, Oxford University Press, ISBN 0-19-963077-1). En forma alterna, una proteína o un polipéptido de acuerdo con la invención pueden administrarse por la ruta parenteral. Para hacer eeto, una proteina o un polipéptido de acuerdo con la invención se absorbe sobre gel de alúmina en una forma completamente convencional. La proteína es solución en 1 mg/ml en un amortiguador cuyo pH cercano a 6.5 se pone en contacto por 1 hora con hidroxi de aluminio a 10 mg/ml medido como AL+++. La composición final de la preparación es la siguiente: proteina 50 µg/ml, AL+++ 250 µg/ml, merthiolate 1/10,000, todo en PBS. Como en el caso de administración oral, se recomiendan tres inyecciones, cada una a intervalo de 4 semanas de la precedente. Un polipéptido de acuerdo con la invención también puede ser útil como reactivo de diagnóstico, por ejemplo para detectar la presencia de anticuerpo anti-Helicobacter en una muestra biológica, por ejemplo una muestra de sangre. Para este objetivo, ese polipéptido ventajosamente comprende 5 a 80 aminoácidos, de preferencia 10 a 50 aminoácidos. Reactivo polipéptido de acuerdo con la invención puede ser etiquetado o de otra forma, de acuerdo con el método de diagnóstico empleado. Métodos de diagnóstico se describen previamente en el texto.

De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo mono especifico capaz de reconocer una proteína o un polipéptido de acuerdo con la invención. "Anticuerpo mono específico" se entiende que significa un anticuerpo capaz de reaccionar predominantemente con una sola proteína helicobacter. Este anticuerpo solo puede obtenerse utilizando una proteína substancialmente purificada como inmunógeno. Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser policlonal o monoclonal; los monoclonales pueden ser quiméricos (por ejemplo que consisten de una región variable de origen marino asociada con una región constante humana o humanizados) solo las regiones hlpervariables son de origen animal, por ejemplo de origen murino (y/o una sola cadena) . Los policlonales como los monoclonales también pueden estar en la forma de fragmentos de inmunoglobulina, por ejemplo un fragmento F(ab)'2 o Fab. Un anticuerpo de acuerdo con la invención también puede ser de ser cualquier isotipo, por ejemplo IgG o IgA; un policlonal puede ser de un solo isotipo o una mezcla de todos o algunos de ellos. En el texto que sigue, los términos "anticuerpo mono específico" y "antisuero especifico" se emplean en forma intercambiable. Un anticuerpo que se dirige contra una proteína de acuerdo con la invención puede producirse y subsecuentemente identificarse utilizando un ensayo inmunológico standard, por ejemplo manchado Western, manchado de puntos o análisis ELISA (ver por ejemplo Coligan y colaboradores, Current in Immunology (Protocolos actuales en Inmunología) (1994) John Wiley & sons Inc., Protocols New York, NY); Antibodies : A laboratory Manual, (anticuerpos: Un manual de laboratorio) D. Lañe, (1988) Harlow Ed.) . Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser útil en diagnóstico, asi como en cromatografía de afinidad para purificación a gran escala de una proteína o un polipéptido de acuerdo con la invención; este anticuerpo también es útil potencialraente como agente terapéutico en un procedimiento de inmunización pasiva. Consecuentemente, la invención también proporciona (i) un reactivo para detectar la presencia de helicobacter en una muestra biológica, que comprende un anticuerpo o un polipéptido de acuerdo con la invención y (ii) un método de diagnóstico para detectar la presencia de helicobacter en una muestra biológica de acuerdo al cual la muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo o un polipéptido de acuerdo con la invención, de manera tal que un complejo inmune se forma; opcionalmente, el material no ligado se retira y el complejo inmune formado entre la muestra y el anticuerpo o el polipéptido de acuerdo con la invención, se detecta como un indicador de la presencia de helicobacter en la muestra o en el órgano del cual se recolectó la muestra.

Como puede comprenderse fácilmente, un anticuerpo de acuerdo con la invención hace posible probar la presencia de helicobacter en un extracto gástrico. Para utilizar en una prueba de diagnóstico, el reactivo que se baja [sic] proporcionar en una forma libre o puede inmovilizarse en un soporte sólido; este último puede ser cualquier soporte comúnmente empleado en este dominio, por ejemplo un tubo, una perla o un pozo. La inmovilización puede obtenerse por medios directos o indirectos. Los medios directos comprenden adsorción pasiva (unión no covalente) o uniones covalentes entre el soporte y el reactivo. "Medios indirectos" significa que un compuesto antireactivo capaz de interactuar con un reactivo primero se conecta a un soporte sólido. Por ejemplo, si se emplea un reactivo polipéptido, un anticuerpo capaz de ligarlo puede emplearse como anti-reactivo, siempre que pueda ligarse a un epitope del polipéptido que no se involucra en el reconocimiento de los anticuerpos presentes en las muestras biológicas. Medios indirectos también pueden implementarse a través de un sistema ligando-receptor, por ejemplo al injertar una molécula, tal como una vitamina sobre un reactivo polipéptido y luego al inmovilizar, en forma sólida, el receptor correspondiente. Esto se ilustra por ejemplo por el sistema biotina-estreptavidina. De manera alterna, se emplean medios indirectos por ejemplo al agregar una cola polipéptido al reactivo, por ejemplo por medios químicos, y al inmovilizar el producto injertado por adsorción pasiva o por unión covalente de la cola polipeptida. La invención también se relaciona a un procedimiento para la purificación de una proteina o de un polipéptido de acuerdo con la invención a partir de una muestra biológica, de acuerdo con lo cual la muestra biológica se somete a una cromatografía de afinidad que utiliza un anticuerpo monoespecifico de acuerdo con la invención. Para este objetivo, el anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal, de preferencia del tipo IgG. El IgG purificado puede prepararse a partir de un antisuero de acuerdo con métodos que se emplean comúnmente (ver por ejemplo Coligan y colaboradores) . Soportes de cromatografía convencionales, como métodos standard de injertar anticuerpos, se describen por ejemplo en Antibodies: A Laboratory Manual (anticuerpos: Un manual de laboratorio), D. Lañe, Harlow Ed. (1988)). Brevemente una muestra biológica de preferencia una solución amortiguador se aplican a un material de cromatografía de preferencia equilibrado con el amortiguador empleado para dilución de una muestra biológica, de manera tal que la proteína o el polipéptido de acuerdo con la invención (antigeno) pueda ser adsorbido sobre el material. El material de cromatografía tal como un gel o una resina asociada con un anticuerpo de acuerdo con la invención, puede proporcionarse en la forma de un baño o columna. Los componentes que permanecen sin ligar se retiran al lavar y el antigeno luego se eluye en un amortiguador de elución apropiado, tal como por ejemplo un amortiguador glicina o un amortiguador que contiene un agente caotrópico, por ejemplo guanidina-HCl , o una concentración rica en sal (por ejemplo MgCl2 3 M) . Las fracciones eluidas se recuperan y la presencia del antígeno luego se detecta, por ejemplo al medir la absorbencia a 280 nm. La utilidad terapéutica o profiláctica de un anticuerpo de acuerdo con la invención pueden demostrarse de acuerdo con la prueba de protección por Lee y colaboradores, propuesta anteriormente para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con la invención. De esta manera, la materia de la invención también es (i) una composición de material que comprende un anticuerpo mono especifico de acuerdo con la invención y un diluyente o portador; en particular (ii) una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la invención en una cantidad efectiva desde un punto de vista terapéutico o profiláctico; (iii) el uso de un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la invención es la preparación de un medicamento para tratar o evitar una infección de helicobacter; asi como (iv) un método para tratar o evitar una infección de helicobacter (por ejemplo ff. felis, ff. mustelae o ff. heilmanii ) de acuerdo a lo cual una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un anticuerpo de acuerdo con la invención se administra a un individuo que requiere dicho tratamiento. Para este objetivo, el anticuerpo monoespecífico puede ser policlonal o monoclonal, de preferencia de isotipo IgA (predominantemente) . En el contexto de un método de inmunización pasiva, el anticuerpo se administra por la ruta mucosal a un mamífero, por ejemplo al nivel de la membrana mucosa gástrica, ya sea por ruta oral o intragástrica, ventajosamente en la presencia de un amortiguador bicarbonato. Un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la invención puede administrarse como un componente activo único o como una mezcla que comprende al menos un anticuerpo mono especifico, específico a cada polipéptido de helicobacter. La dosis de anticuerpo que deberá emplearse en este método puede determinarse fácilmente por personas con destreza en la técnica. Por ejemplo, se sugiere que una dosis puede caracterizarse por una administración diaria de entre 100 y 1000 mg de anticuerpo por una semana o una dosis que comprende 100 a 1000 mg de anticuerpo administrado 3 veces por día por dos o tres días. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención puede fabricarse de acuerdo con las reglas establecidas anteriormente para una composición que comprende una proteína o un polipéptido de acuerdo con la invención. Igualmente, aplican indicaciones médicas idénticas.

La invención se ilustra a continuación con referencia a las siguientes figuras: La Figura 1, pista 4, presenta el análisis de la fracción de membrana Cß2d por electroforésis en un gel de poliacrilamida al 10 % y manchado con azul coomassie. Los marcadores de peso molecular aparecen en la pista 1. La Figura 2, pista 4, presenta el análisis por eletroforésis en un gel de poliacrilamida al 10 % y manchado con azul Csomassie, de la proteína de 76 KDa purificada a partir de un gel preparativo. Los marcadores de peso molecular aparecen en las pistas 1 y 8. La Figura 3, presenta después de eletroforésis en un gel de poliacrilamida al 10 % y manchado con azul Coomaseie, el perfil electroforético de la fracción D que se obtiene de la cromatografía en una columna Q-sepharose de la fracción de membrana Cß2 (pista 3) y de la fracción D' obtenida de la cromatografía en una columna S-Sepharose de la fracción D (pista 4). Pista 1 corresponde a los marcadores de peso molecular y la pista 2 a la fracción de membrana Cm2d. EJEMPLO 1: Preparación de las Fracciones de Membrana ÍA.- Cultivo La cepa ff. pylori ATCC 43579 se cultiva en medio líquido en un fermentador de 10 litros. Una muestra congelada de microorganismos en glicerol se emplea para inocular un matraz de 75-cm2 que contiene un medio así denominado de "dos fasee" (una fase sólida en agar Colombia que contiene sangre de oveja fresca al 6 % y una fase líquida en tripticasa de soya, que contiene 20 % de suero bobino fetal). Después de 24 horas de cultivo bajo condiciones icroaerofílicas, la fase líquida de este cultivo se emplea para inocular varios matraces de 75 cm2 en un medio de dos fases en la ausencia de sangre de oveja. Después de 24 horas de cultivo, la fase liquida hace posible inocular un bio-fermentador de 2 litros en un medio de tripticasa de soya líquida que contiene beta-ciclodextrina al 10 g/1. Este cultivo a OD 1.5 - 1.8 se inocula en un fermentador de 10 1 en medio líquido. Después de 24 horas de cultivo, lae bacterias se cosechan por centrifugado a 4000 x g por 30 minutos a 4°C. Un cultivo de 10 litros de ff. pylori ATCC 43579 en un fermentador hace posible el obtener aproximadamente 20 a 30 g (peso húmedo) de bacterias . IB - Extracción con n-octil beta-D-glucopiranósido (OG) El nodulo de microorganismos que se obtiene anteriormente se lava con 500 ml de PBS (salino amortiguador con fosfato; NaCl 7.650 g, fosfato disódico con 0.724 g, fosfato monopotásico 0.210 g por litro; pH 7.2) por litro de cultivo. Los microorganismos luego se centrifugan de nuevo bajo las mismas condiciones.

El nodulo bacterial que se obtiene (Cl) se resuspende en una solución OG (Sigma) a 1% (30 ml/litro de cultivo).

La suspensión bacteriana se incuba por una hora a temperatura ambiente, con agitación magnética y luego centrifuga a 17,600 por 30 minutos a 4°C. El sobrenadante (S2) obtenido se dializa (MWCO = 10000 Da, Spectra/por) durante la noche a 4°C con agitación magnética de nuevo dos vecee un litro de PBS diluido 1/2. El precipitado formado durante la diálisis se recupera por centrifugación a 2,600 por 30 minutos a 4°C. El sobrenadante (S2) se retira y el nodulo (Cß2-t) que contiene proteínas de membrana se almacena a -20°C. El nodulo se resuepende en amortiguador tris-HCl 20 mM pH 7.5 y pefabloc 100 µM (amortiguador A). 1C - Análisis de las Fracciones de Membrana La fracción de membrana Cß2d se analiza por electroforésis en un gel de poliacrilamida en la presencia de SDS de acuerdo con el método Laem li (1970). Las proteínas se visualizan después de manchado con azul Coomassie. El perfil de proteina de la fracción de membrana muestra la presencia de cuatro bandas principales 76, 67, 50 y 30 KDa (Figura l, pista 4). EJEMPLO 2: Purificación de la Proteína de 76 KDa por SDS - PAGE preparativa Se lleva a cabo una electroforésis en gel de poliacrilamida de acuerdo con el método de Lae mli (1970) con un gel de apilamiento al 5 % y un gel de separación al 10 %. La fracción de membrana se resuspende en amortiguador A y luego diluye a la mitad en amortiguador muestra 2X. La mezcla se calienta por 5 minutos a 95°C. Aproximadamente 19 mg de proteínas se cargan en un gel de 16 x 12 cm de tamaño y espesor 5 mm. Se realiza una pre-migración a 50 V por 2 horas, seguido por una migración a 65 V durante la noche. El manchado del gel con azul Coo aseie R250 (0.5% en agua ultrafiltrada) permite buena visualización de las bandas. La banda principal a 76 kDa se corta con un escalpelo y muele en una ultra-turrax en la presencia de 10 o 20 ml de amortiguadores de extracción que contiene Tris-HCl 25 mM pH 8.8, urea 8M, SDS al 10 %, fenil metil sulfonil fluórico 100 µm [sic] (PMSF) y 100 µm de pefabloc (amortiguador C); luego filtrado en un prefiltro Millipore AP20 ( filtro = 4.7 cm, fporo = 20 µm) con el auxilio de un extrusor a una presión de 7 bars, a temperatura ambiente; luego lavado con 5 a 10 ml de amortiguador C y filtrado como con anterioridad. Los dos filtrados obtenidos de los dos productos molidos se combinan. El filtrado se precipita con tres volúmenes de una mezcla 50:50 a 75% de metanol y 75 % de isspropanol y luego ultra centrifugan a 240,000 g por 16 horae a 10°C en tin rotor 70 TFT (J8-55, Beckman).

El nodulo se recoge en 2 ml de amortiguador de solubilización que contiene NaP04 10 mM, pH 7.0, NaCl 1 M, sarcosil al 0.1% , PMSF 100 µm, Pefabloc 100 µm, y urea M 6 (amortiguador D) . La muestra solubilizada se dializa sucesivamente contra 100 ml de amortiguador D que contiene urea 4 M y sarcosil al 0.1 %, contra 100 ml de amortiguador D que contiene urea 2 M y sarcosil 0.5 % y de nuevo dos veces 100 ml de amortiguador D sin urea y que contiene 0.5 de sarcosil. La diálisis se lleva a cabo por una hora, con agitación magnética, a temperatura ambiente. El dializado final se incuba por 30 minutos en un baño de hielo y luego centrifuga a baja velocidad por 10 minutos a 4° (Biofuge A, Heraeus Sepatech) . El sobrenadante se recupera, filtra en un filtro Millipore 0.45 µm y almacena a -2?'"c. Un análisis SDS-PAGE se lleva a cabo (Figura 2, pista 4). El análisis del perfil electroforético de la fracción ilustrada que es puro con una sola banda de gel. EJEMPLO 3 : Purificación de la Proteína de membrana 76 KDa a partir de la fracción de membrana C„M 3A - Separación de las proteínas de la fracción de membrana Cmaa en la columna de Q-sepharose 140 mg de proteínas de la fracción de membrana solubilizada previamente C^a se cargaron sobre una columna Q-Sepharose preparada como sigue: Columna Q-Sepharose se prepara de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Pharmacia) por un volumen de gel de 40 ml (phe = 2.5 cm, h = 8 cm) . La columna se lava y luego equilibra con amortiguador NaC03 50 M, pH 9.5, que contiene peflabloc 100 µm y zwittergent 3-14 a 0.1 %. Se verifica la cromatografía por detección UV a 280 nm a la salida de la columna. Despuée de lavar la columna con un amortiguador equilibrado (NaC03 50 mM, pH 8.5, que contiene peflabloc 100 µm y zwittergent 3-14 a 0.1 %) haeta que la línea base se obtiene, un lavado con NaCl 0.1 M en amortiguador de equilibrado se realiza hasta que la línea base se obtiene (fracción A) seguido por un gradiente de NaCl 0.1 a 0.5 M en amortiguador de equilibrado (fracciones B, C y E) , y luego por un lavado con NaCl 1 M en amortiguador de equilibrado (fracción F) . Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Fracciones Elusión Proteínas Totales (mg? A lavado NaCl 0.1 M 18 B NaCl 0.1-0.2 M 14 C NaCl 0.25 M 10 D NaCl 0.25-0.35 M 27 E NaCl 0.35-0.45 M 26 F lavado NaCl 1 M 20 La evaluación de proteínas no moslµró que el 55 % de lae proteínae ee eluyen en el gradiente NaCl 0.1 a 0.5 M, 15 % se eluyen durante el lavado con NaCl 0.9 M y 15 % se eluyen durante el lavado con NaCl 1 M. Los perfiles SDS-PAGE de cada una de las fracciones obtenidas después de pasar la fracción de membrana CB2d a través de la columna de Q-Sepharose son diferentes. Además, algunas proteínas se enriquecen en comparación con la fracción de membrana de partida Cß2d. Un enriquecimiento de la proteína de 76 kDa se observa en el perfil que corresponde la fracción D o de preferencia la fracción E, cuya purificación se lleva a cabo como eigue. 3A - Purificación en columna S-Sepharose de la proteína 76 kDa de la fracción D o E obtenida en la columna de Q- Sepharose Una columna S-Sepharose se prepara de acuerdo con las recomendacionee del fabricante (Pharmacia) para un volumen de gel de aproximadamente 10 ml (f » 1.5 cm, h = 5 cm) (máximo 10 mg de gel). La columna se lava y luego equilibra con amortiguador acetato 50 mM, pH 5.0, que contiene peflabloc 100 µm y zwittergent 3-14 a 0.1 %. La fracción D o E dializada con anterioridad contra el amortiguador de equilibrio (acetato 50 mM, pH 5.0, peflabloc 100 µm y zwittergent 3-14 a 0.1 %) se carga sobre la columna de S-sepharose. La columna de nuevo se lava con el mismo amortiguador hasta que la absorbancia a 280 nm ee estabiliza. Aproximadamente 3 volúmenes de columna son necesarios para regresar a la línea base. Las proteínas se eluyen por un gradiente NaCl de 0 a 0.5 M en el amortiguador de equilibrio (10 x Vt) seguido por lavado con amortiguador de equilibrio que contiene NaCl 0.5 - M (4 x Vt). Las fracciones recolectadas se analizan, combinan y almacenan como con anterioridad. La fracción D' o E' que sale durante el gradiente de NaCl de 0 a 0.5 M, entre NaCl 0.15 y 0.20 M, de preferencia a la concentración de NaCl 0.15 M, se recupera. Se lee un análisis en esta fracción por SDS y por manchado Western. Los resultados se presentan en la Figura 3. Estos resultadoe muestran que después de 2 columnas de intercambio iónico, la proteina de 76 KDa se enriquece; pero queda contaminada con una proteína de 54 KDa y una proteína 67 kDa (pista 4). La proteína de 54 kDa no reacciona con los anticuerpos anti-catalasa; consecuentemente por lo tanto no corresponde a catalasa; igualmente, la proteína de 67 kDa no reacciona con el anticuerpo anti-ureB en manchado Western, consecuentemente no corresponde a las sub-unidad B de ureasa. El análisis de manchado Weetern en la presencia de un anti-antisuero 76 kDa muestra que las bandas débiles observadas bajo la banda 76 kDa corresponden a una degradación de la proteína 76 kDa, ya que reaccionan débilmente con este antisuero (pista 7).

EJEMPLO 4 : Preparación de suero hiperinmune contra la proteína membrana de 76 kDa Un suero policlonal especifico para la proteína de membrana principal ff. pylori se obtiene por hiperin unización de conejos respectivamente con el antígeno purificado por SDS-PAGE preparativo. La primer inyección DO (multisitios subcutánea e intramuscular) se lleva a cabo con una preparación que contiene 50 µg de proteína de membrana emulsificada en adyuvante Freund completo, y luego los refuerzos D21 y D42 se efectúan por inyección de 25 µg de proteína de membrana en adyuvante de Freund incompleto. Los animales se sacrifican en D 26. Los sueros obtenidos se descomplementan por 30 minutos a 56°C y esterilizan por filtración en una membrana con una porosidad de 0.22 µm. El antisuero reacciona con la proteína de 76 kDa como se aisló de acuerdo con el ejemplo 3. Un suero mono específico puede obtenerse en una forma equivalente utilizando una preparación purificada de acuerdo con el procedimiento descrito en 3.B de la fracción E obtenida después de cromatografía en Q-Sepharose (3.A) y que corresponde a la fracción eluida en NaCl 0.15 M en S-Sefarorse. EJEMPLO 5: Purificación de la proteína de membrana de 76 kDa por inmuno afinidad. 5.A - Purificación de IgGs Un suero hiperinmune como se prepara en el ejemplo 4 se carga en una columna de flujo rápido de proteína A Sepharose 4 (pharmacia) previamente equilibrada en trie-HCl 100 mM pH 8.0. La reeina se lava con 10 volúmenes de columna de tris- HCl 100 mM pH 8.0 y luego con 10 volúmenes de columna de tris-HCl 100 mM pH 8.0. Los IgGs se eluyen en un amortiguador de glicina 0.1 M pH 3.0. Los IgGs se recolectan como fracciones 5 ml a las cuales 0.25 ml de tris-HCl 1 M 100 mM pH 8.0 se agrega. la densidad óptica del eluato se mide a 280 nm y las fracciones que contienen los IgGs se combinan y de ser necesario se congelan a -70 °C. 5.B - Preparación de la columna Una cantidad apropiada del gel Sepharose 4B activado con CNBr (sabiendo que 1 g de gel eeco da a aproximadamente 3.5 M del gel hidratado y que la capacidad del gel es 5 a 10 mg de IgG por ml de gel (fabricado por Pharmacia) (ref: 17-0430-01) se suspende en amortiguador de NaCl 1 nM. El gel luego se lava con el auxilio de un buchner al agregar pequeñas cantidades de HCl 1 mM. El volumen total de HCl 1 mM empleado es 200 ml por gramo de gel. Los IgGs purificados se dializan por cuatro horas a 20 + 5'C contra 50 volúmenes de amortiguador de fosfato de sodio 500 mM pH 7.5. Luego se diluyen en amortiguador fosfato de sodio 500 M pH 7.5 a una concentración final de 3 mg/ml. Los igGs se incuban con el gel durante la noche a 5 + 3°C con agitación rotatoria. El gel se coloca en una columna de cromatografía y lava con dos volúmenes de columna de amortiguador de fosfato 500 mM, pH 7.5. El gel luego se transfiere en un tubo e incuba en etanolamina a 100 mM pH 7.5 a temperatura ambiente con agitación. Luego se lava con 2 volúmenes de columna en PBS. El gel puede almacenarse en PBS erthiolate 1/10000. La cantidad de IgGs acoplada al gel puede determinarse al medir la diferencia en densidad óptica a 280 nm entre la solución IgG inicial y el eluato directo más lavados. 5.C - Adsorción y elusión del antigeno Una preparación de proteína del antígeno en 50 mM en tris-HCl 50 mM, pH 8.0, EDTA 2 mM, por ejemplo la fracción de membrana Cs2d obtenida en l.B se filtra a través de una membrana de 0.45 µm y luego se carga sobre la columna previamente equilibrada con tris-HCl 50 mM pH 8.0, EDTA 2 mM, a una velocidad de flujo de aproximadamente 10 ml/h. La columna luego se lava con 20 volúmenes de tris-HCl 50 mM, pH 8.0, EDTA 2 mM. En forma alterna puede llevarse a cabo la adsorción en un baño; la incubación se continua a 5 + 3°C durante la noche y con agitación. El gel se lava con 2 a 6 volúmenes de amortiguador de fosfato de sodio 10 mM pH 6.8. El antigeno se eluye con amortiguador de glicina 100 mM pH 2.5. El eluato se cosecha en fracciones de 3 ml a las cuales 150 µl de amortiguador de fosfato de sodio 1 M a pH 8.0, se agregan. La densidad óptica de cada fracción se mide a 280 nm; las fracciones que contienen el antígeno se combinan y almacenan a -60 °C.

EJEMPLO 6: Prueba de aglutinación 6.A - Cultivo Cultivo de una cepa ff. Pylori No. ATCC 43579 (disponible de ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD - E.U.A.) almacenado en glicerol a -10 ° C, un matraz de 25 cm2 que contiene un medio de dos fases, se inocula. El medio de dos fases que comprende fase sólida consiete de 10 ml de agar Colombia (BioMérieux) suplementado con sangre de oveja fresca al 6 % y una fase líquida que contiene 3 ml de caldo de Tripcasa de frijol soya (Difco) que contiene suero bobino fetal al 20 %. Los matraces se colocan en una bolsa sellada denominada "generbag" (BBL) e incuban con ligera agitación rotatoria a 37°c por 48 horas bajo condiciones microaerofílicas (8-10% C0a, 5-7% 02 y 85-87 % N2) obtenidas por Microaer System (BBL) . Este cultivo de 48 horas se emplea para de nuevo inocular matraces que contienen medio de dos fases. La absorbencia inicial de este cultivo a 600 nm deberá estar entre 0.15 y 0.2. Los matraces se incuban bajo condiciones idénticas a aquellas descritas anteriormente. Despuée de 48 horas, la suspensión bacterial se transfiere a un tubo de ensayo. La absorbencia de este cultivo se mide y deberá estar entre 3.0 y 3.5 a 600 nm. La apariencia de los microorganismos se verifica bajo microscopio después de manchado Gram. 6.B - Antisueros Un antisuero como se obtiene en el ejemplo 4 se filtra en una membrana de 0.45 µm para retirar pequeños agregados, de existir antes de uso. 6.C - Prueba de aglutinación En una placa de inmunoprecipitación de fondo negro (Prolabo ref. 10050), se depositan 20 µl de salino fisiológico en el primer pozo, 20 µl de suero, recolectar antes de inmunización en el pozo central y 20 µl de antisuero en el tercer pozo. 20 µl de suspensión bacteriana de ff. Pilori se agregan a cada uno de los tres pozos y las gotas luego se mezclan con el auxilio de una pipeta Pasteur con una punta redonda sellada. El inicio de aglutinación se observa bajo una lupa a lo más a 5 minutos despuée de mezclado. La aglutinación se completa cuando la mezcla aparece en la forma de una solución clara que contiene grandes agregados. Los controles negativos, ya sea con salino fisiológico o con el suero pre-inmunizado deberán permanecer turbios, revelando que la suepensión bacteriana está intacta. El anti-antisuero de 76 kDa da un muy fuerte reacción de aglutinación. Bajo las condiciones probadas, la bacteria ff. Pilori rápidamente se aglutina y la reacción se completa después de un minuto. Los resultados indican que la proteína de 66 kDa probablemente se expone en la superficie de ff. Pilori . EJEMPLO 7 : Demostración del efecto protector de la proteina de membrana 76 kDa. Grupos de aproximadamente 10 ratones Webster Suizos con edad de 6 a 8 semanas (Taconis, Germantown) se inmunizan por ruta intragástrica con 1, 5, 25, 50 o 100 µg del antigeno de 76 KDa purificado por cromatografía como se describe en el ejemplo 3, y diluyen en PBS o en PBS que contiene bicarbonato de sodio 0.24 M. El antígeno se suplementa con 5 a 10 µg de toxina de cólera (CT) (Calbiochem, San Diego) o con toxina termolábil (LT) (Berna Products, Coral Gables FL). Los ratones primero se anestesian con isoflurano y luego la dosis se administra en un volumen aproximado de 0.5 ml con el auxilio de una cánula. Se administran 4 dosis a cada ratón a intervalos de 7 a 10 días. Dos semanas después de la última administración de antígeno, se ataca a los ratones con una sola dosis de cepa ff. Pilori ORV2002 (1 x 107 bacterias vivas en 200 µl de PBS; 0Dsso de aproximadamente 0.5) administradas por ruta intragáetrica. Un grupo que no ha recibido dosis de antigeno y que sirve como control, se ataca igualmente. Dos semanas después del ataque, se sacrifican los ratones. Los porcentajes de protección se determinan ya sea al medir la actividad de ureasa o al evaluar la carga bacterial por híetologia como se describe por Lee y colaboradores (arriba) o directamente por cultivo cuantitativo de ff. pylori . Bajo estas condiciones, es posible observar una reducción substancial en la carga infecciosa en la mayoría de los ratones inmunizados con 25 µg cooperado con el grupo de control; esto hace posible concluir que el antígeno ff. pylori de 76 KDa es al menos parcialmente protector (velocidad de protección de aproximadamente 60-70%) LISTADO DE SECUENCIA (I) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: Pasteur Merieux Serums et Vaccins (B) CALLE: 58 avenue Lee1ere (C) CIUDAD: Lyon (D) PAÍS: Francia (E) CÓDIGO POSTAL: 69007 (G) TELEFONO: 72 73 79 31 (H) TELEFAX: 72 73 78 50 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Nueva Proteína de membrana Helicobacter pylori p76 (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 1 (iv) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Cinta (B) COMPUTADORA: compatible PC IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Releaee #1.0, Vereión #1.30 (EPO) ( 2 ) INFORMACIÓN PARA SEC ID No: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos (B) TIPO: amíno ácido (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO MOLÉCULA: proteína (iii) HIPÓTESIS: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : SEC ID NO: 1: Glu Asp Asp Gly Phe Tyr Thr Ser Val Gly Tyr Gln lie 1 5 10 Gly Glu Ala Ala Gln Met Val 15 20

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES 1.- Proteína Helicobacter pylori en una forma substancialmente purificada, capaz de obtenerse a partir de una fracción de membrana ff. pylori , y cuyo peso molecular después de electroforésis en un gel de poliacrilamida al 10% en la presencia de SDS, aparece en el orden de 76 kDa.
2. 2.- Proteina de conformidad con la reivindicación 1, cuyo peso molecular aparente está en el orden de 76 kDa y que es capaz de obtenerse por un procedimiento en el que: (i) las bacterias ff. pylori se extraen con n-octil Beta-D glucopiranósido al 1% seguido por centrifugación; (ii) un sobrenadante se recupera que se somete a una diálisis contra PBS 75 mN, pH 7.2, seguido por centrifugación; (iii) la fracción de membrana que consiste del nodulo de centrifugación se recupera y se resuspende en el medio acuoso; (iv) la fracción de membrana se somete a una cromatografía de intercambio aniónico en una columna de Q-Sepharose en un gradiente NaCl 0 a 0.5 M; (v) la fracción eluida en NaCl de 0.25 a 0.45 M se recupera y se somete a una cromatografía de intercambio aniónico en una columna S-Sepharose en un gradiente NaCl de o a 1 M; y (vi) la fracción eluida en NaCl 0.15 a 0.20 M se recupera.
3. 3.- Proteína de conformidad con la reivindicación 2, cuyo peso molecular aparente está en el orden de 76 kDa y que es capaz de obtenerse por un proceso en donde: (i) las bacterias ff. pylori se extraen con n-octil B-D glucopiranósido al 1% seguido por centrifugación; (ii) un sobrenadante se recupera que se somete a una diálisis contra PBS 75 mN, pH 7.2, seguido por centrifugación; (iii) la fracción de membrana que consiste del nodulo de centrifugación, se recupera y se resuspende en medio acuoso; (iv) la fracción de membrana se somete a una cromatografía de intercambio aniónico en una columna de Q-Sepharose en un gradiente NaCl de 0 a 0.5 M; (v) la fracción eluida en NaCl de 0.35 a 0.45 M se recupera y se somete a una cromatografía de intercambio aniónico en una columna S-Sepharose en un gradiente NaCl de 0 a 1 M; y (vi) la fracción eluida en NaCl 0.15 M se recupera.
4. 4.- Proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, que tiene la función biológica de ser una pori a.
5. 5.- Proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene una secuencia N terminal, la secuencia aminoácido como se ilustra en ID SEC No. 1.
6. 6.- Proteína helicobacter en una forma substancialmente purificada, que es capaz de obtenerse por un proceso en el que: (i) las bacterias ff. pylori se extraen con n-octil ß-D glucopiranósido al 1% seguido por centrifugación; (ii) un sobrenadante se recupera que está sujeto a diálisie contra PBS 75 mN, pH 7.2, eeguido por centrifugación; (iii) la fracción de membrana que coneiste del nodulo de centrifugación se recupera y se resuepende en medio acuoso; (iv) la fracción de membrana se sujeta a una cromatografía de intercambio aniónico en una columna de Q-Sepharose en un gradiente NaCl 0 a 0.5 M; (v) la fracción eluida en NaCl de 0.25 a 0.45 M se recupera y se somete a una cromatografía de intercambio catiónico en una columna S-Sepharose en un gradiente en un gradiente 0 a 1 M NaCl; y (vi) la fracción eluida en NaCl 0.15 a 0.20 M se recupera. 7.- Proteína de conformidad con la reivindicación 6, que es capaz de obtenerse por un procesamiento en el que: (i) las bacterias ff. pylori se extraen con n-octil ß-D glucopiranósido al 1% seguido por centrifugación; (ii) un sobrenadante se recupera que está sujeto a diálisis contra PBS 75 N, pH
7. 7.2, seguido por centrifugación; (iii) la fracción de membrana que consiste del nodulo de centrifugación se recupera y se resuepende en medio acuoso; (iv) la fracción de membrana se somete a una cromatografía de intercambio aniónico en una columna de Q-Sepharose en un gradiente NaCl de 0 a 0.5 M; (v) la fracción eluida en NaCl de 0.25 a 0.45 M se recupera y se somete a cromatografía de intercambio catiónico en una columna S-Sepharose en un gradiente de NaCl 0 a 1 M; y (vi) la fracción eluida en NaCl 0.15 M se recupera.
8. 8.- Polipéptido derivado por mutación o fragmentación a partir de una proteína de conformidad con una de las reivindicaciones l a 7, en una forma substancialmente purificada, que es capaz de reconocerse por un anticuerpo monoespecífico que se desarrolla contra una proteína de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7.
9. 9.- Composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de una infección ff. pylori , que comprende como ingrediente activo una proteína o un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8. 10.- Anticuerpo mono especifico capaz de reconocer una proteína o un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8. 11.- Composición farmacéutica pretendida para la prevención o tratamiento de una infección de ff. pylori que comprende como ingrediente activo un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la reivindicación 10. 12.- Método de diagnóstico que hace posible el detectar la presencia de Helicobacter en una muestra biológica de acuerdo con lo cual la muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10 o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 8, de manera tal que se forma un complejo inmune, el material no ligado se retira opcionalmente y el complejo inmune se forma entre la muestra y el anticuerpo o el polipéptido se detecta. 13.- procedimiento para la purificación de una prsteína o de un polipéptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, a partir de una muestra biológica, de acuerdo con lo cual la muestra biológica se somete a una cromatografía de afinidad utilizando un anticuerpo monoespecifico de acuerdo con la reivindicación
10. 10.