CN1020857C - 相应于轮状病毒的主要中和蛋白质的抗原和免疫决定子的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了相应于牛轮状病毒三种主要中和蛋白抗原决定子的合成肽。这些肽在增进免疫和抵抗病毒传染力方面是有效的并且可用作疫苗,另方面可用于治疗、预防或诊断鸟类和包括人在内的动物的轮状病毒的传染。

Description

本发明涉及轮状病毒的主要外壳中和糖蛋白(病毒蛋白7或VP7),内或壳包核酸蛋白(病毒蛋白6或VP6)及外壳蛋白(病毒蛋白3或VP3)肽片断,及用它们作鸟类和包括人在内的动物体内的疫苗。本发明进一步涉及有关轮状病毒肽片断的制备,涉及将肽粘附在载体上,涉及将它们用作疫苗。VP3肽的另一特点是它能与轮状病毒竞争胰蛋白酶,因而阻碍病毒传染。所以,VP3肽也可有治疗用途。
附图简述
图1表示轮状病毒VP7糖蛋白的氨基酸顺序,14K多肽列于框内。
图2表示SA-11基因6克隆复制体的核苷酸序列。示出了(+)向股(对应于mRNA)。示出了蛋白产物的予计的氨基酸顺序,终端部位下划了线。
图3示出轮状病毒VP3蛋白的氨基酸顺序。C486(牛的)VP3氨基酸顺序在我们的实验室中得到。SA-11(猴的)VP3氨基酸顺序来自现有技术。
图4示出牛轮状病毒(BRV)14K肽片断的分离。泳道A和B分别图解说明用65μg木瓜蛋白酶/cm凝胶和130μg木瓜蛋白酶/cm凝胶制成的BRV糖蛋白的降解模式。泳道C图解说明提纯的14K肽片断。泳道表示杂交瘤11D12-6与单克隆抗体的免疫斑-ELISA反应。泳道D图解说明在银染色的聚丙烯酰胺凝胶中的提纯的14K肽片断。
图5示出在免疫进程中三个不同时间14K多肽各种制剂的抗体效价。上面部分示出使用双壳轮状病毒作为抗原由ELISA测定的总抗 体效价。下面部分示出用噬斑减数检测法测定的中和抗体的效价。A组,14K未结合的多肽;B组,14K BSA-结合的多肽;C组,提纯的VP7;D组,传染性的牛轮状病毒(BRV);E1组,受传染性BRV61天的动物;E2组,施用佐剂的动物。免疫作用记录在表2中更详细地叙述。
图6示出老鼠血清与C486牛轮状病毒(BRV)蛋白的免疫斑ELISA反应。泳道P,予抽血的;泳道A,施用14K未结合的多肽的组;泳道B,14K结合的多肽;泳道C,施用BRV VP7(38.2K糖蛋白)的组;泳道D,施用传染性病毒的组;泳道E和E2分别施用盐水和弗罗因德氏(Freund)完全佐剂的组。各组的免疫进程在表2中更详细地叙述。
图7示出为确定14K的位置用金黄色酿脓葡萄球菌V8蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和溴化氰对VP7进行解离的模式。
图8示出合成肽VP7阻止病毒粘附在细胞上的能力。
图9示出合成肽的ELISA抗体效价。
图10示出在老鼠体内由合成肽VP7诱导的经病毒中和的抗体效价。
图11示出由单克隆1D7(泳道B);1B4(泳道C);1B9(泳道D)和1D10(泳道E)免疫沉淀〔35S〕蛋氨酸示踪牛轮状病毒感染的细胞的溶胞产物。泳道A,是与由超免疫产生的兔抗牛轮状病毒抗体的反应。分子量标志的位置在左边。
图12示出单克隆抗体和单特异性多克隆抗血清与转移到硝化纤维素薄膜上的牛轮状病毒多肽的反应。泳道A,单克隆抗体1D7;泳道B,1B4;泳道C,1B9;泳道D,1D10和泳道E,抗 壳包核酸单特异性抗血清。反应蛋白的分子量给在左边。
图13示出牛、猴、猪和人轮状病毒VP6壳包核酸蛋白与单克隆抗体1B4的免疫斑ELISA反应。泳道A,从牛分离出的C486;泳道B,从猪分离出的OSU;泳道C,从牛分离出的NCDV;泳道D,从人分离出的Wa;泳道E,从牛分离出的UK;泳道F,从人分离出的ST4;泳道G,从猴分离出的SA-11。从人分离出的Wa和ST4属亚群2,而所有其它分离物属亚群1。分子量在右边指明,腹水对照也标明。
图14示出牛轮状病毒VP6壳包核酸蛋白与单克隆抗体1D7,1B4,1B9和1D10及与单特异性抗血清的降解反应。每次降解所用的酶及量在图上示出。
图15示出VP6壳包核酸蛋白的部分羧肽酶降解和溴化氰化学解离及与单克隆抗体1B9的免疫斑ELISA反应。泳道A-I表示降解的自动射线照相;泳道A′-I′表示使用单克隆抗体1B9的对应的免疫斑ELISA反应。泳道A,A′100μg羧肽酶;B,B′50μg羧肽酶;C,C′,25μg羧肽酶;D,D′,2.5μg羧肽酶;E,E′,0.25μg羧肽酶;F,F′,未降解的壳包核酸;G,G′与50μg溴化氰2小时降解;H,H′,与50μg溴化氰1小时降解;I,I′,与50μg溴化氰30分钟降解。分子量基准位置在图的左边示出。
图16示出抗VP3合成肽232-256抗血清与轮状病毒蛋白的反应。上面部分(泳道A-H)表示自动射线照相,下面部分(泳道A′-H′)表示上部示出的蛋白与抗合成肽血清的免疫斑ELISA反应。泳道A-D表示在含BME的、煮沸了的Laemmli 样品缓冲剂存在下产生的蛋白质图形,泳道E-H表示在没有BME但煮沸了的Laemmli样品缓冲剂存在下产生的蛋白质图形。泳道A,A′及E和E′表示100μg合成肽,2.0μg双壳轮状病毒和0.96μg胰蛋白酶的混合物。泳道B和B′及F和F′表示25μg合成肽,2.0μg双壳轮状病毒和0.96μg胰蛋白酶的混合物。泳道C和C′,D和D′及G和G′表示2.0μg双壳轮状病毒和0.96μg胰蛋白酶。泳道H和H′表示双壳病毒。数字表示本文中涉及的各种蛋白质的位置,分子量标志在右边标明。
图17示出合成肽与牛轮状病毒的VP3壳包核酸蛋白的反应能力。泳道A表示2.0μg双壳病毒与25μg合成肽反应之后的蛋白质图形,泳道B表示的图形同A,为用0.96μg胰蛋白酶处理后的图形。泳道C表示2.0μg双壳病毒与100μg合成肽反应后的蛋白质图形,而泳道D表示的图形同C,为用0.96μg胰蛋白酶处理后的图形。泳道E表示用0.96μg胰蛋白酶处理2.0μg病毒后的蛋白质图形,而泳道F表示2.0μg未经处理的双壳病毒蛋白质图形。分子量基准位置标在右边。泳道C中的括号(〔)表明在45K,90K和135K区域形成的梯次。
图18示出抗232-256VP3合成肽抗血清与基于VP6壳包核酸单体和二聚物的梯次复合物的反应能力。泳道A表示病毒蛋白图形。泳道B表示与100μg合成肽复合,然后用0.96μg胰蛋白酶处理后的病毒蛋白图形;泳道B′表示在泳道B中电印迹并与抗合成肽抗体反应后的病毒图形。泳道C表示与100μg合成肽复合后的病毒蛋白图形;泳道C′表示在泳道C中电印迹并与抗合成肽抗体反应后的病毒图形。右边示出分子量标志的位置。
图19示出为维持232-256    VP3合成肽-VP6复合物所需的样品缓冲剂条件试验。2μg放射性同位素示踪双壳轮状病毒与100μg合成肽于37℃反应30分钟。电泳前将样品等分并用尿素样品缓冲剂处理,泳道A′;无BME    Laemmli样品缓冲剂,泳道B;含BME并煮沸的Laemmli样品缓冲剂,泳道C。箭头指示45K,90K,135K梯次的位置。分子量基准的位置在右边。
图20示出合成肽的胰蛋白酶解离。泳道B,D和F分别表示19.2μg,9.6μg和0.96μg胰蛋白酶。泳道A,C和E分别表示100μg合成肽与19.2μg,9.6μg和0.96μg胰蛋白酶反应。泳道G表示100μg合成肽,箭头指示单体和二聚物的位置。泳道H表明分子量标志的位置。
图21示出232-256    VP3合成肽与完整的84000VP3竞争胰蛋白酶。泳道A表示双壳轮状病毒蛋白图形。泳道C-F表示病毒与0.0097μg胰蛋白酶于37℃保温30分钟并增加合成肽量之后的病毒蛋白图形。泳道B表示无合成肽,泳道C有25μg;泳道D,50μg;泳道E,75μg;而泳道F,200μg合成肽。分子量标志的位置在左边。泳道B上的箭头指示在60000处观察到的成对物的位置,泳道F上的箭头指示84000蛋白的位置。
图22示出增加合成肽的量对轮状病毒传染性的影响。井状空间A表示MA-104细胞对照,井状空间B表示病毒对照大约100pFU。井状空间C-H分别表示在100μg、200μg、300μg合成肽存在下吸附于MA-104细胞单层的100PFU的成对样品。
轮状病毒是引起多种飞禽和牲畜(也包括人)胃肠功能失调与腹泻的重要原因。轮状病毒基因组由11节双股RNA组成。这11个基因编码,至少产生该病毒六种不同结构的蛋白质。整个病毒微粒中,六种蛋白质按双壳排列,三种内壳蛋白质是指病毒蛋白(VP)1、2和6,三种外壳蛋白质中,两种系指VP3和VP7,而第三种外壳蛋白(由基因组节10或11编码)尚未给定代号。
这些蛋白质的分子量列于表1。
表1.主要轮状结构蛋白质的基因分配及分子量
基因节 蛋白指定代号 分子量a位置b
1    VP1    110K    内
2    VP2    92K    内
4    VP3    84K    外
6    VP6    45K    内
7
8    三联体    VP7    41K    外
9
10    or    11    ND(尚未指定)    20K    外
注a:不同的轮状病毒,其基因组节的绝对次序并不总是与同种基因一致。例如,轮状病毒中,7、8、9片断的电泳顺序随不同动物种类而异,这称之为基因组节颠倒(inversion)或翻转(flip-flopping)。由7、8、9片断形成的基因三联体编码的三种多肽,以病毒蛋白质(VP)7表示特定中和作用的主要外壳 糖蛋白及两种未写出结构的蛋白质未列入表中。轮状病毒菌株SA-11、W和Wa中,基因9编码为VP7,相反,轮状病毒菌株DS-1和U.K牛轮状病毒,基因8编码为VP7。有关VP7以及其它轮状病毒蛋白质的精确分子量,文献中的记载均不一致,有些科研人员指出这与使用的各种不同方法有关:1),分离单个多肽,2),电泳制备病毒样品,3),于聚丙烯酰胺凝胶中检测多肽以及4),检测原发基因产物的各种转译后的变异体。另外,特别对于牛和人的轮状蛋白质而言,来源于同一种类而从不同离析物衍生的蛋白质的移动动性有所不同。表1中的分子量由Sabara等提供(Journal    of    Virology,Vol53:58-66,1985)
注b指出结构蛋白质在整个轮状病毒微粒的内壳或外壳中的位置。
VP7、VP6和VP3的肽亚单位系本发明主题。
a),病毒蛋白质7(VP7)
主要的外壳多肽、VP7,是一种糖蛋白质,其未还原形分子量约为38200(38.2K),还原形分子量约为41900(41.9K)。已表明它是对病毒引起中和抗体的主要抗原,糖蛋白也是造成病毒粘附细胞的主要因素。
轮状病毒有不同的血清型出现,并以VP7激发的中和活性来定义,至今已鉴定出七种血清型,其中四种(血清型1-4)在人体中发现,五种(血清型3-7)在牲畜中找到。此种血清型差别的重要性并不清楚,因为近期研究表明,人和牲畜中属于不同血清型的菌株中间,可出现交叉保护。此种交叉保护之所以出现是因为存在与血清型无关的普通VP7抗原定子决定簇。换言之引起血清型特性的VP7中特定氨基酸顺序(抗原决定基)可诱发造成交叉保护的交叉反应抗 体。
因为分子量为38.2/41.9K,那么VP7大概由325个氨基酸(图1)组成。几种不同来源离析出的轮状病毒的VP7所含氨基酸顺序已测定过,结果表明氨基酸同系性范围是75-86%。将这些VP7顺序加以比较,显示出氨基酸顺序在某些范围内变化。然而,在本发明以前,从未将任一种这些断片、也未将任何其它相似天然或合成材料用以证明其在体内的保护作用。
使用中和单克隆抗体描绘VP7抗原决定基,限于分子量约为14000(14K)的肽成份的中和吸附区。提纯后,该14K肽激发形成小鼠中和抗体。由桥接二硫化物测定的此种肽的二级结构是维持抗原性所必需的。14K肽中,鉴定出4种抗原决定基具有VP7的以及整个轮状病毒微粒的某些生物活性。
b),病毒蛋白质6(VP6)
分子量45K的壳包核酸蛋白,虽不是主要的外壳成份,但也是很重要的抗原。使用各种技术:包括补体固定、ELISA、免疫粘附胶结测定以及特定单克隆抗体,表明该蛋白系亚型抗原。由于某些单克隆抗体与所有轮状病毒反应以及多克隆血清抵制单一轮状病毒型可检出大部份其它轮状病毒菌株,45K壳包核酸也被说成是普通轮状病毒类抗原。除具抗原特性外,壳包核酸蛋白也很具免疫力,某些学者发现多克隆血清使得此种蛋白具中和能力。
在牛轮状病毒中,于病毒微粒和感染细胞之中,VP6均以三聚体存在,具有由非共价键相互作用组成的内亚单位键。这些三聚体借桥接二硫化物作用进一步络合形成较大单位,某些学者用电子显微镜观察到这些较大单位往往表现出环状结构。使用不同的缓冲剂,在聚丙 烯酰胺凝胶中可观察到这些壳包核酸配位体。
已制出具有低中和能力的4种VP6-特定单克隆抗体。它们与单壳粒和三聚体反应,显现出引起中和作用的部位。若考虑到病毒微粒中壳包核酸的构型,对于每个环形结构,按串连方式,这样的部位趋于可表示至少18次。进一步分析放射标记病毒可知感染病毒微粒有很高百分比(80%)系部分双壳结构,以致单克隆抗体可识别该VP6,并免疫沉淀该病毒微粒。但是这些粘附抗体的感染病毒只有少数可由抗体中和。这可以用以解释VP6的免疫力高而中和力低的原因。
VP6-特殊单克隆抗体也与从猿(SA-11),猪(OSU),牛(UK和NCDV),猕猴(RRV)以及人(Wa和ST4)分离出的轮状病毒交叉作用。因为这些病毒属不同亚组,单克隆抗体可能识别一个共同抗原部位。
为了鉴定由单克隆抗体识别的抗原部位,采用已发表过的牛、猿和人轮状病毒的VP6氨基酸分析法,并将牛轮状病毒蛋白水解消化和化学分解。完整的VP6长度(图2)为397个氨基酸,最小的VP6活性抗体断片分子量约为6300(6.3K),并且在位置40-97含有57个氨基酸。并进一步表明,6.3K断片中,公认的亚组特定部位,位于位置40-60氨基酸之间。
c),病毒蛋白3(VP3)
轮状病毒的外壳多肽VP3,是含776个氨基酸的蛋白质,其未还原形分子量为82000(82K)还原形分子量为84000(84K)(图3)。此种肽也已表明是造成对病毒引入中和抗体的主要抗原。这种蛋白对血红细胞亦有凝集能力,与VP7相结合,对 测定病毒血清型起作用。
轮状病毒复制的最初阶段包括两个主要过程:病毒微粒粘附于目标细胞和病毒微粒穿透细胞。胰蛋白酶能增强病毒的传染性,但这种增加仅在吸附以后出现,因为胰蛋白酶不影响病毒粘附细胞的能力和速变,但却能增加在细胞中找到未复盖微粒的能力。胰蛋白酶增强传染性的分子作用机理,是分子量约84000的VP3蛋白质分解为分子量约为28000及60000的两个断片。因此,在轮状病毒复制中,VP3的胰蛋白酶的分解部位是很重要的。
组成牛轮状病毒VP3的776个氨基酸其顺序已被排定,猿VP3的部分氨基酸顺序也已测定(图3)。将这些VP3蛋白质的氨基酸顺序加以对照表明,仿制的肽断片、其胰蛋白酶分解部位(图3的方框)保存于该病毒两个离析体之间,很可能大部份轮状病毒中保存这个区域,因为大多数轮状病毒需要胰蛋白酶来增强它的感染性。
我们已合成了与如图3所示的胰蛋白酶分解部位一致的肽。这种合成肽显示了三种重要特性。
第一,它能激发动物体中能中和病毒的抗体的形成。
第二,它能通过与VP6单体的和齐聚的蛋白质单元键合来与牛轮状病毒键合。从这种类型键合的实际应用可以予计可将VP6蛋白作为载体,以增强对这种合成肽以及含有与之相一致的键结构的其它合成肽的免疫响应。由于VP6蛋白与肽之间的相互作用经得起严酷条件处理,比如在十二烷基磺酸钠中煮沸,那么在疫苗制剂中它会相当稳定。由于使用一种属于抗原并具高免疫力的病毒蛋白作载体,那么在制备疫苗中使用少量免疫原,即可更大地达到增强抗病效果。
此种合成肽的第三个重要特点是它可由胰蛋白酶降解,由此证明 它在这一方面表现出像真正的VP3蛋白质。因为合成肽可与天然84000蛋白竞争胰蛋白酶,那么感染速度可以受到某种程度的抑制。由此,合成肽对治疗新生胃肠炎也是很有价值的。
如同本领域的常规作法,在本说明书中,在一给定的顺序里,一个氨基酸的位置被给定一个号码,该号等于从N端到该位置这一顺序中氨基酸的残基数。关于合成顺序,与天然多肽或天然多肽的部分类似,总的来说,可根据天然多肽的编号系统,作为用于合成顺序编号的基础,是适宜的,即使合成序列可能不同于天然顺序。
在其它系统中,与特殊病毒蛋白断片相应的短键合成肽表现出带有完整蛋白质的抗原特性。这样,合成肽被用于诱发抗体,抵抗各种病毒,包括流感、灰质脊髓炎、脚和口腔疾病以及B型肝炎等。现在,我们已证明了轮状病毒合成肽的相似特性。
本发明基于我们的发现即轮状病毒VP7、VP6和VP3的肽具有重要的生物活性。含有中和氨基酸顺序(抗原决定基)的VP7的14K肽以及其中更为短的肽,至少表明是整个轮状病毒糖蛋白或轮状病毒本身的免疫活性的基本部分。同样,6.3KVP6断片和其中的更短肽也具中和特性。本发明也关系到相应于该蛋白胰蛋白酶降解部位的VP3合成肽,并具三个重要特征:1)、它能诱发形成抗病毒的中和抗体;2)、它通过VP6蛋白与病毒微粒结合;3)、能仿制胰蛋白酶降解部位,该部位能被胰蛋白酶裂解,因此它能与病毒竞争胰蛋白酶,从而抑制感染性。
短链肽(抗原决定基)可直接合成或融合蛋白制得,而14K和6.3K肽则只能融合蛋白得到。因为生成异种蛋白,此种肽基本上不含病毒原的其它蛋白以及感染体本身,因此可把它用作疫苗而不担 心传入疾病。而且这些肽不含哺乳动物原的其它蛋白物质。
因此本发明包括免疫融合多肽和合成肽,该肽具有相应于至少一部份的轮状病毒VP7、VP6和VP3顺序的氨基酸顺序。所有这些肽显示出一定程度的免疫力,能充分诱发产生中和轮状病毒抗体。因此本发明主要有关含肽组合物及特别是用作疫苗的特殊组合物,以及将这些疫苗用于飞禽和哺乳动物免疫抵抗轮状病毒感染。此外,VP3肽能与病毒竞争胰蛋白酶,以此方式来干扰病毒感染,因而将其作为治疗药剂。
第一步是通过合成或重组DNA法生产相当于轮状病毒VP7、VP6或VP3的抗原断片的肽。然后将这些肽与适当的载体相接,将之用作疫苗,接种后引起中和轮状病毒抗体产生,可予防感染。
具有如下氨基酸顺序的肽能诱发产生中和抗体
a),病毒蛋白7(VP7)
肽165-295牛轮状病毒14K断片的氨基酸顺序示于图1的方框中。这种14000分子量(14K)的断片全长165-295个氨基酸,发现对完整的VP7的免疫学活性起主要作用,并表明能诱发抗体以中和病毒并阻止病毒粘附宿主细胞。由于它的大小很大(130个氨基酸残基),14K断片含大多数抗原定子,其中有一些处于不同轮状病毒菌株的经受顺序变化区或易变性区(可变菌株特定区)而其它一些处于不同菌株中的普通或高保留区(保留区)。相应于两类区的肽可用于配制疫苗并包括下述物质:
肽174-183    Try-Gln-Gln-Thr-Asp-Glu-Ala-Asn-Lys
肽(178-181)-(251-259)    Asp-Glu-Ala-Asn-Lys-Lys-Leu-Gly-Pro-Arg-Glu-Asn-Val-Ala
肽247-259    Arg-Asn-Cys-Lys-Lys-Leu-Gly-Pro-Arg-Glu-Asn-Val-Ala
肽275-295    Pro-Thr-Thr-Ala-Pro-Gln-Thr-Glu-Arg-Met-Met-Arg-Ile-Asn-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Gln-Val
b),病毒蛋白6(VP6)
肽40-97Thr-Met-Asn-Gly-Asn-Glu-Phe-Gln-Thr-Gly-Gly-Ile-Gly-Asn-Leu-Pro-Ile-Arg-Asn-Trp-Asn-Phe-Asn-Phe-Gly-Leu-Gly-Thr-Thr-Leu-Leu-Asn-Leu-Asp-Ala-Asn-Tyr-Val-Glu-Thr-Ala-Arg-Asn-Thr-Ile-Asp-Tyr-Phe-Val-Asp-Phe-Val-Asp-Asn-Val-Cys-Met,
此分子量为6,300(6.3K)的断片全长40-97个氨基酸(见图2的方框),它与能免疫沉淀和中和整个病毒的单克隆抗体作用。在此57个氨基酸的间隔中,一种更短的顺序也能诱发形成中和抗体,而能作为疫苗使用,该较短肽的氨基酸顺序如下:
肽40-60    Thr-Met-Asn-Gly-Asn-Glu-Phe-Gln-Thr-Gly-Gly-Ile-Gly-Asn-Leu-Pro-Ile-Arg-Asn-Trp-Asn.
c),病毒蛋白3(VP3)
肽232-256    Asn-Ile-Ala-Pro-Ala-Ser-Ile-Val-Ser-Arg-Asn-Ile-Val-Tyr-Thr-Arg-Ala-Gln-Pro-Asn-Gln-Asp-Ile-Ala
此种肽跨伸VP3的胰蛋白酶降解部位,它在VP3的氨基酸顺 序中的位置见图3的方框。
本发明的14K和6.3K多肽、VP7和VP6各自的肽组份以及相应于VP3胰蛋白酶降解部位的肽,可用于予防、治疗或诊断鸟和牲畜也包括人的轮状病毒感染。这些肽,或其组合体,或其变型体与本技术领域已知的载体相接作为疫苗,不管对被动免疫还是主动免疫作用均有效,并且相应于VP3胰蛋白酶部位的肽可作为治疗药剂阻止或干扰病毒感染。
本发明揭示了,实验动物体内的中和抗体是由与钥孔
Figure 861089758_IMG2
血兰蛋白共价连接的肽引起的。在本技术领域内已知的其它载体,包括任何天然的和合成的载体,均可用于与本发明的肽顺序形成这种结合。“载体(carrier)”这一术语,在本技术领域中、在文献中是公认的,有时称为“填充剂(coupler)”“蛋白载体”或“半抗原载体”于本发明使用的天然载体是已知的,是普通的钥孔
Figure 861089758_IMG3
血兰蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、β-半乳糖苷酶、青霉素酶。合成载体是典型的多-聚-DL-丙氨酰-聚-L-赖氨酸和聚-L-赖氨酸。另外,相应于VP3胰蛋白酶降解部位的合成肽,可以不同形式粘附于VP6这一事实也已公开,因此,VP6也可作为相应于VP3胰蛋白酶降解部位的合成肽的载体。这就使VP3胰蛋白酶降解部位的氨基酸顺序结合,各种大分子,可有另外的用途,并将它们通过这些部位与VP6相连,从而增加大分子的免疫力。
一般说来,本发明的肽与大分子化合物系共价键相连,或者特殊情况下,它与大分子化合物以重组DNA技术构成,本发明的顺序还能以某些其它方式与结合成更大分子化合物,例如,当更大分子化合物是多肽时(β-半乳糖苷酶或青霉素酶等),它可插入该化合物的 氨基酸键中。同时,还可用重组DNA技术按多次重复方式合成肽,得到含免疫区的重复抗原决定基的多肽。本发明也包括含有肽(抗原)和免疫刺激剂或辅药的具生物活性的组合物,其中以免疫刺激剂辅助肽。弗罗因德(Freund)氏完全辅药,如氢氧化铝和脂质体便是这样的免疫刺激剂。其它天然的和合成的免疫刺激剂均系本技术领域已知物。抗原和辅药不一定同时引入,可以先引入其中之一的部份或全部。
本发明的肽可按已知制备药用组合物的方法配制,这样,多肽则与药用载体赋形剂混合。合适的赋形剂以及配方,已于E.W.Martin著“Remington药物学”一书中详述,该书已列入本文参考文献。这样的组合物含有效量的多肽产物和适量的载体赋形剂,以配制成适于对宿主施用有效的药用组合物。较好的给药方式是肠外施用。在细节上作必要的改变后,与药的组合物一样,业已配制出适当的动物保健制剂。
掺合按本文所述制得的适当的多肽或肽,根据已知的方法,可配制出本发明的疫苗,其中所说的多肽或肽与适当的赋形剂相混合。适当的赋形剂包括如盐水溶液,各种已知辅药或本技术领域内用于予防病毒感染的组合物中的其它公知添加剂。这种疫苗含有本发明的多肽或肽的有效量及赋形剂适当量,以配制成有效施用于宿主的疫苗。请详见“疫苗的新趋势和发展”一书,编者:A.Voller和H.Friedman.University    park出版,Baltimore,1978,该书已列入本文参考资料中,作为配制疫苗的详细背景。
本发明的肽可按照任何合成肽的常规方法来制备,液相法或固相法均可采用,例如“肽”第2卷〔(1984),E.Gross和 J.Meinhaffer编,Academic出版,New    york,U.S.A〕所介绍的合成肽的方法。
同时,也可能将相应于这些氨基酸顺序的DNA顺序,无性培养成本技术领域已知的载体,例如ρBR322,因为这种质粒能迅速地接受短键DNA并在例如E    coli    HB101或本技术领域里已知的其它宿主上生长。为便于多肽的表达,在DNA序列中加入促进剂或以其它已公开的方法使之进一步增长。因此本发明还有关可复制的DNA表达媒介,该表达媒介包含可对多肽编码为可表达的形式的基因顺序。本发明还有关重组宿主细胞,例如,与本技术领域已知的表达媒介变异的微生物,菌株或细胞系,还关系到它们的培养基。
显然,所有在本说明书中通过实施例给出的顺序,及其他有关的相应的抗原决定子或引入了受限制的保留的氨基酸变化的顺序的复合物,都可使用。
本发明的详细说明
a)VP7的14K多肽
为了制备用于免疫的各种抗原,在MA-104细胞中繁殖牛轮状病毒(离体C486,亚克隆13),用离心法提纯。然后,1毫克提纯的双壳病毒在10%制备的聚丙烯酰胺凝胶上分离。将38.2K糖蛋白通过用考马斯兰对该凝胶的附带条染色而固定在该凝胶上。为了提取糖蛋白,凝胶条进行电洗提。
14K多肽断片通过将含有38.2K糖蛋白(VP7)的凝胶条放在堆积5%的20%溶解的聚丙烯酰胺凝胶的井状空间中制得。将一13cm×1cm凝胶条用木瓜蛋白酶(Calbiochem    Behring,San    Diego,Ca.)进行常规处理,凝胶的浓度为130 ug/cm;此法是得到14K多肽的最好制剂法,如图4(泳道B)中所示,根据Cleveland等详述的方法进行38.2K糖蛋白的电泳和在原处酶消化作用(Cleveland,D.W.,S.G.Fisher,Kirsch-ner    and    U.K.Laemmli.1977.Peptide    mapping    by    limited    proteolysis    in    SDS    and    analysis    of    gel    electrophoresis.J.Biol.Chem.252:1102-1106),为了显示出在14.3K和18.4K标记物之间的最大拆开时间,使用予先染色的分子量标记物。用该分子量标记物达到14K多肽的进一步定位。然后,肽的片断从凝胶片中电洗脱下来,测定蛋白质。通过在聚丙烯酰胺凝胶上检验肽的图象(图4,泳道C)和其与从杂交瘤/(hybridoma)11D12-6得到的单克隆抗体的反应(图4,泳道D),验证肽的真实性和纯度。
将电洗脱的14K多肽冻干,一部分制剂按照下述方法结合到牛血清白蛋白(BSA)上。首先,将1毫升肽溶解于125ul0.1MPBS(PH7.4)中。BSA溶液通过将1.25mg    BSA溶于600ul0.1M    PBS(PH7.4)中制备,将250ul2.5M的戊二醛溶液滴加到该溶液中,接着在15分钟内滴加肽溶液。反应混合物在室温下缓慢地搅拌24小时,然后,用无菌蒸馏水进行广泛地渗析。冷冻结合肽,得到粉红色的粉末,在-20℃贮存于干燥剂中。
所有抗原一旦制得,多组小鼠(一组10只)(Charles    River,Wilmington,MA)用BSA未结合的多肽,BSA结合的多肽,感染性的双壳病毒或提纯的VP7,根据表2中提出的要点进行免疫。所施用的抗原量按等摩尔基准测定。相应于不同抗原的 抗体的表征是ELISA和免疫斑-ELISA反应,用牛轮状病毒(离体C486,亚克隆12和13)作为抗原,和用血清中和测定。
如在图5(上部)中所示,有一个明显的抗体对所用的全部抗原都有反应。值得注意的是VP7(38.2K糖蛋白)和14K多肽断片之间反应的相似性。看来好象14K多肽与载体的结合对引起好的抗体反应不是必要的。这可能是由于多肽片断大的关系,因而提高了它含有B-细胞和T-细胞决定子的概率。
用14K断片免疫的动物在61天用传染性的双壳病毒激发。这是为了研究片断起免疫反应的可能性。在分析全部血清后,尽管动物确实表现出对肽的良好的抗体反应,但是在传染性病毒使用(68天)后,也显示出辅加的反应,即使是辅助性的。这些结果能说明单独用14K多肽能够引起相当好的抗体效价。较重要的是,这些抗体有中和能力。A-D组的血清具有中和的抗体(图5,下部),并有用传染性病毒免疫的动物引起的最好反应(D组)。用ELISA测定的全部抗体效价和中和抗体效价对多肽的结合形式和未结合形式是相似的。在68天,在所有组受到传染性病毒作用后,中和抗体效价稍高于在51天观察到的效价,认为后面的每个作用进一步促进免疫反应,另一方面,可能在能够引起中和反应的传染性病毒上有其他抗体。这些抗原大多数的可能选择物是次要的外层蛋白质(VP3,84Kmol.wt.)和主要的内层蛋白质(VP6,45Kmol.wt.)。有几个报告已经指出,在这些蛋白质中,有两个能够引起中和抗体,当然比起主要的糖蛋白的程度要小得多。事实上,这由在68天由免疫斑-ELISA反应所表明的45K蛋白质抗体而得到支持。而对84K蛋白质的抗体不一定测定(图6)。下面将进一步讨论,对 45K抗原的单特异性和单克隆抗体所证明的中和能力。
在37天、51天和68天,各组中选择的动物血清的免疫斑ELISA反应在图6中表示。所有血清,除了免疫前得到的和负对照组(E)的以外,都具有对VP7的抗体。抗肽抗体,虽然是从存在于牛轮状病毒离体C486中仅一种糖蛋白种制备的14K多肽产生的,可与存在于亲代离体C486蛋白质图形中的两种糖蛋白种反应。这是明显的,因为从离体C486的两种亚克隆中的基因组RNA的电泳分析证明对于这种糖蛋白按密码信息参入的相应基因的迁移度是不同的。可是,看来尽管有遗传异质性,14K多肽在很大程度上在BRV离体C486亚克隆12和13的两种糖蛋白质种之间是守恒的。另外有趣的观察到由糖蛋白质种与抗肽抗体反应显示出相似强度,认为14K多肽可代表一个糖蛋白质的免疫显性区。
在14K多肽内的组分肽
为了能够合成合适的肽,必须把14K分子量多肽片段固定在VP7中。为了完成这个定位,要考虑到14K多肽的下述特征。14K肽具有:ⅰ)碳水化合物部分;ⅱ)广泛的桥接二硫化物;ⅲ)在不同的轮状病毒血清型中有相对守恒的区域(S);ⅳ)亲水区域;ⅴ)潜在的免疫原区域。另外,通过用胰凝乳蛋白酶、金黄色酿脓葡萄球菌V8蛋白酶、木瓜蛋白酶和溴化氰进行糖蛋白质的部分蛋白水解作用而得到的降解模式,有助于定位14K多肽片段(图7)。
Nebraska小牛腹泻病毒(NCDV牛轮状病毒)的氨基酸顺序,表现出与C486牛轮状病毒有高度的核酸同系性,是相同的血清型,用于给复盖氨基酸165-295的区域的14K多肽片段作图。相应的NCDV糖蛋白质的亲水性图用于识别在这个区域中的几 个亲水区。根据这个图,有四种肽,相应与氨基酸残基174-183    178-181和251-259连接在一起的、247-259和在牛轮状病毒VP7上的275-295用Merrifield固相肽合成法合成。
每个肽具体的氨基酸序列如下:
肽175-183    Try-Gln-Gln-Thr-Asp-
Glu-Ala-Asn-Lys
肽(179-183)-(251-259)    Asp-Glu-
Ala-Asn-Lys-Lys-Leu-
Gly-Pro-Arg-Glu-Asn-
Val-Ala
肽247-259    Arg-Asn-Cys-Lys-Lys-
Leu-Gly-Pro-Arg-Glu-
Asn-Val-Ala
肽275-295    Pro-Thr-Thr-Ala-Pro-
Gln-Thr-Glu-Arg-Met-
Met-Arg-Ile-Asn-Trp-
Lys-Lys-Trp-Trp-Gln-
Val
各种肽的纯度用薄层色谱和反相高效液体色谱评定。快速原子轰击质子光谱用于确定分子量。
合成肽的反应性和特性用几种方法测定。
1)抗VP7单特异血清的ELISA,指出VP7多肽的特性(表3)。
2)对中和糖蛋白质(VP7)特定的并具有阻断病毒粘附的能力单克隆抗体的ELISA,指出不同区域的肽或VP7抗原决定基的特性(表3)。
3)吸附阻断分析,指出两种肽,247-259和275-295,阻断病毒粘附在MA-104细胞上,而另外两种肽没有这种特性(图8)。
合成肽的对小鼠的免疫原性测定如下。
肽174-183通过双偶氮化的联甲苯胺键与钥孔
Figure 861089758_IMG4
虫血兰蛋白(Keyhole limpet homocyanin,(KLH)结合,产生N端结合的肽。其他三个肽通过N-马来酰亚氨基苯甲酰基-N′-羟基琥珀酰亚胺酯与KLH结合,产生N端结合的肽结合物。根据表4中所列的进程,将每种肽施用于多组CD-1小鼠体内,每组10只小鼠。
第1组到第4组中的每一个鼠分别注射一份100ug在弗罗因德氏佐剂中的KLH结合的肽。第5组每一个注射4份25μg的在弗罗因德氏佐剂中的KLH结合的肽。第6组注射1.6μg传染性的双壳轮状病毒,第7组是负对照组,注射盐水和弗罗因德氏佐剂。在一个六星期的周期内注射3次抗原制剂。小鼠在每次免疫前抽血。
用多肽在小鼠体中所引起的抗体活性和特性是与完全的轮状病毒微粒的反应活性,且每个肽有其相应反应性。对双壳轮状病毒的抗体效价(图9,上部)和对个别相应肽的抗体效价(图9,下部)用酶联免疫吸收剂测定法测定所有四个合成肽都诱发在第一次免疫后与轮状病毒反应的抗体。以后的免疫引起所有组的反应增加。在第一次免疫后,也能诱发对个别相应肽的抗肽抗体,表明所有KLH-肽是致 免疫的(下部)。
抗两种肽的小鼠抗体也能抑制病毒的传染性,由以下在体外进行的空斑减少测定中所测定。
用鼠抗血清中和牛轮状病毒离体C486,通过标准的50%空班减少测定法来确定。表示30-50%PFU的病毒稀释液与抗体的各种稀释液以1∶1混合,在37°保温1小时。病毒吸附在MA-104单层上可在病毒接种物除去之前在37℃进行2小时;用MEM洗细胞,然后用1.6%MEM稀释的Bacto琼脂(Difco)涂复,补充胰酶每毫升5μg,0.7%1∶1000的中性红色母液溶液,和0.1%DEAE右旋糖酐。在37℃保温5-6天后出现空斑。
正如在图10中所表明的,肽247-259,肽275-295和这四种肽的混合物诱发病毒中和抗体,在每次免疫后增加。这表明由这两种多肽诱发的抗体与包在病毒附件内的病毒抗原决定基反应。
为了证明保护,用特别用于识别合成肽275-295的单克隆抗体10D2-7进行被动抗体转移试验(表5)。四组鼠,每组10只,鼠令7天,出生后2小时从母鼠那里分离出来,通过管子向胃里施用适量的Time    O制剂。大约1小时后,施用Time    1制剂。鼠在33℃保持8小时,并定时监测粪便稠度。8小时后处死鼠,取出肠,粉碎。肠中传染性病毒的量由50%空斑减少测定法来测定。
如同表5中所示,未接受单克隆抗体的第Ⅲ组中的鼠不被保护,它们腹泻,在攻击8小时后制备的肠均浆中有5log(对数为5)的轮状病毒。在第Ⅰ组(口服单克隆抗体后用病毒攻击)和第Ⅱ组(用单克隆抗体和病毒的混合物攻击)中腹泻鼠的量和鼠肠均浆中病毒的 量显著减少。
这些VP7肽免疫原性和保护能力的其他证据表示在下面关于VP6的b)部分后面。
b)VP6的6.3K多肽
对牛轮状病毒(离体C486)VP6(45K壳包核酸蛋白质)的四种单克隆抗体通过感染细胞溶胞产物的免疫沉淀和免疫斑ELISA法鉴别(图12)。证明四种单克隆抗体(1D7、1B4、1B9、1D10)的中和能力与对单特异抗血清VP6观察到的相似,但是比通过对两种外壳蛋白质VP7和VP3的抗血清显示的低(表6)。另外,在免疫斑-ELISA法中这四种单克隆抗体的混合物识别下面的壳包核酸蛋白质,属于第1亚组的猪轮状病毒(OSU)、牛轮状病毒(NCDV,UK)和猴轮状病毒(SAll,RRV),和属于第2亚组的人轮状病毒(WA,ST4)(图13)。
为了定位由这些单克隆抗体识别的抗体决定子,用单克隆抗体和单特异抗血清进行关于VP6的有污斑的硝化纤维素的部分蛋白质降解的免疫斑ELISA反应(图14)。检验每个具体酶的检验表明所有四种单克隆抗体在降解中都基本识别相同的肽。在胰凝乳蛋白酶和S.aureus    V8蛋白酶降解的情况下,单特异血清的反应性与用单克隆抗体试验所示的相同。图15说明通过用溴化氰(CNB4)和羧酞酶化学解离产生的VP6的降解模型和抗体反应性模型。正如箭头所指出的,最小的抗体-反应的CNBr产生的片段分子量大约6,300。基因6转译顺序的计算机分析(图2,取自Estes,M.K.,B.B.Mason,S.Crawford    and    J.Cohen,1984.Cloning    and    nucleotide    sequence    of    the    simian    rotavirus    gene6    that    codes    for    the    major    inner    capsid    protein.Nucelic Acids    Research    12∶1875-1887)指出,只有两种能与本发明的单克隆抗体反应的溴化氰片段,即:氨基酸40-97,分子量6,302.7;氨基酸300-365,分子量6,830(表7)。关于VP6的羧酞酶降解的抗体反应性指出,抗体部位定位在前79个氨基酸分子的末端氨基上,因为分子量9,500的片段是免疫活性的,所以分子量6,000的片段(50个氨基酸)不是免疫活性的(图15,泳道1)。因此,决定中和活性的6.3K多肽片段由在第40至第97位的57个氨基酸组成。这些酸括在图2的框中。
VP6的6.3K组分肽
用与上面描述VP7的14K多肽的肽片段相似的方法,合成VP6的6.3K的氨基酸残基40-60。
具体的肽的氨基酸顺序如下:
肽40-60    Thr-Met-Asn-Gly-Asn-Glu-Phe-Gln-Thr-Gly-Gly-Ile-Gly-Asn-Leu-Pro-Ile-Arg-Asn-Trp-Asn-Gly-Cys-OH
末端的Gly-Cys-OH结构不是抗原片断部分,但加入到该顺序中,以提供一个键连接部位。
合成多肽的反应性和特性由几种方法测定。
1)对抗VP6单特异血清的ELISA,表示VP6肽的特性(表8)。
2)对中和蛋白质(VP6)特定的单克隆抗体的ELISA,表示VP6抗原决定基肽的特性(表8)。
3)与单克隆抗体的免疫斑ELISA,表示VP6抗原决定基的特性。
VP6和VP7肽的免疫原性和保护能力由下面实施例进一步说明。
相应与VP7的275-295和VP6的40-60的肽用Fmoc保护的氨基酸和固相肽合成法合成(Cambridge    Research    Biologics,Cambridge,England;IAF    Biochemical,Laval,Cuebec,Canada)。
肽-钥孔 虫血兰蛋白(KLH)结合物用衍生KLH的N-马来酰亚氨基-苯甲酰基-N′-羟基琥珀酰亚胺(MBS)酯和加到肽的N端基上的半胱氨酸(Cambridge Research Biologics,Cambridge,England)或水溶性的碳二亚胺制备。肽也可与Ecoli Pilin蛋白质K99结合。经脲素提取和硫酸铵沉淀的K99精制后用碳化二亚胺法把肽和K99结合。得到肽和K99肽的比为3.5∶1的结合物,由紫外光谱和氨基酸分析测定,并由凝胶电泳进一步确定。
肽和结合物的合成后,用对多克隆抗体-轮状病毒血清进行免疫斑-ELISA法评定产物的免疫反应性。
为了增加分娩前母牛体中的抗体量,试验与K99载体结合的VP7的合成肽275-295的能力。正如下面表明的,在免疫前两头母牛都有抗轮状病毒的抗体,在单独用K99载体蛋白质接种疫苗后效价不增加。将K99和合成肽的结合物在DDA-氢氧化铝凝胶(100ug结合物)中施用,在一次免疫后,抗体反应增加1.0-1.5log(对数)。
由ELISA法测定的抗轮状病毒的抗体效价
予采血    单独施用    施用K99
K99以后    和VP7的
合成肽275-295后
母牛1 8,000 8,000 100,000a
母牛2    10,000    10,000    100,000
在第二次试验中,小鼠用在弗罗因德氏完全佐剂中的100ugKLH-肽结合物或K99-肽结合物免疫,监测抗轮状病毒免疫反应。用于免疫的结合物总量中含有大约等量的各种轮状病毒肽。经过三次免疫,小鼠对结合物的反应无差别(表9)。虽然这两种载体分子量差别很大,KLH大约3.5×106道尔顿,K99大约19,000道尔顿,它们产生抗这些肽半抗原的抗体看来好象是等效的。
在产生抗肽免疫反应中,除了使用载体外,试验了许多佐剂,以进一步增加这些反应。可惜,对增加免疫反应很有效的大多数佐剂,对于人和动物的应用是不能接受的。用于这一研究所选择的佐剂是季氨基表面活性剂,溴化二甲基二辛基癸基铵(DDA)。选择这一佐剂是因为已报道过能作为半抗原有效的佐剂和已批准用于食用动物的事实。我们用K99-VP7275-295结合物比较DDA和弗罗因德氏完全佐剂的效力。
在免疫后,测定抗轮状病毒效价和在免疫的鼠血清中发现的抗K99的活性。每只鼠接受100μg结合物和0.1ml    FCA或100μg    DDA。在两次免疫后,在两组中轮状病毒抗体效价显著增加(表10)。在此试验中轮状病毒抗体的量近似于用活轮状病毒 在保护免疫日程后的量(表11)。
然后,我们检定了产生这个保护反应所需的抗原剂量。我们使用三个K99-VP7肽结合物剂量(1,10和100μg/鼠),与佐剂DDA混合。正如在表11中表示的,结合物的剂量关系到对载体蛋白质K99的反应,但是仅100μg剂量达到了由病毒免疫对照所产生的抗轮状病毒抗体的水平。
通常,“游离的”合成肽仅产生低效价的,短期的反应。这些反应包括使用有限有实际用途的浓的佐剂。可是,或自发地或通过使用脂类侧链而形成凝聚的肽,已产生功能性的效价。另一方面,肽已被用于诱发免疫系统,当用亲代蛋白质的次最佳剂量免疫时产生第二类型反应。我们研究了用于产生对其他肽反应的几种方法。这些方法包括:1)肽与含有佐剂的脂质体结合,2)设法用佐剂DDA凝聚肽,3)用肽混合FCA诱发免疫反应。
从上述研究收集的数据表明,与载体结合的合成肽能在鼠的血清中产生抗轮状病毒的抗体效价与接种活病毒后观察到的效价相似。这促使我们对轮状病毒腹泻使用轮状病毒鼠模型系统,以证明新生鼠对疾病攻击的保护。在生育和妊娠期间,雌性鼠免疫三次。在生仔前两周进行最后一次免疫。每种载体和合成肽与FCA混合使用。K99结合物也与DDA混合使用(表12)。养育鼠仔,在鼠令7天时用牛轮状病毒株攻击。新生鼠受攻击后,用单盲试验测定免疫效果。攻击后48小时计算发病率、死亡率和腹泻的严重性。大多数腹泻和死亡在攻击后3-5小时内出现。
所有合成肽制剂都使死亡率显著减少,两种制剂对于全部病毒具有相等的保护。在这个试验中,K99和KLH一样不起载体作用, 但是肽-K99结合物对攻击却具有保护作用。
c)VP3的胰蛋白酶降解部位
VP3潜在的胰蛋白酶降解部位的氨基酸顺序根据下列事实选择:1)由VP3蛋白质胰蛋酶降解得到的片段的大小已知;2)已知VP3的氨基酸顺序(图3);3)已知酶胰蛋白酶的降解特性。降解部位的具体的氨基酸顺序如下:Asn-Ile-Ala-Pro-Ala-Ser-Ile-Val-Ser-Arg-Asn-Ile-Val-Tyr-Thr-Arg-Ala-Gln-Pro-Asn-Gln-Asp-Ile-Ala。该肽的分子量为2,753,代表VP3的氨基酸232-256。
图16说明抗合成肽的抗血清,特别与减弱的(1和1′所示)和未减弱的(4和4′所示)VP3反应。因为它特别与接近迁移84,000的双峰的较低区带反应(如1所示),可明确地确定它是基因4的产物,并得到相应于真实的VP3上这个部位的合成肽。
因为胰蛋白酶降解部位在生物学上是很重要的,重要的是测定抗这个肽的抗血清是否能中和病毒的传染性。下面表13说明,抗合成肽的抗血清以及特别与这个肽反应的单克隆抗体能够有效地中和病毒的传染性。
表13    抗VP3合成肽232-256
的抗血清    的中和能力
抗体    由50%空斑减少测定法
测定的病毒中和效价
抗合成肽的    5,000
抗血清
抗合成肽的    10,000
单克隆抗体
在37℃,100μg合成肽和2.0μg提纯的病毒反应30分钟,观察到VP6(45K壳包核酸蛋白质)的梯级(图17,泳道C)。在肽浓度较低即25μg时,未观察到梯级(泳道A)。与在45K位置相应的梯级也在90K和135K区域观察到(泳道C)。梯级中的分子量增量与合成肽单体的分子量相符合证明肽与VP6的结合。另外,病毒-肽复合物的胰蛋白酶处理(泳道B和D)减少了壳包核酸单体(45K),二聚体(90K)和三聚体(135K)中的梯级,结果,病毒图形与未复合的胰蛋白酶处理的病毒图形几乎相同(泳道E)。
与VP6结合的肽的明确证据由用抗合成肽产生的抗血清在45K和90K区域中测定的梯级所说明(图18,泳道C)。当病毒与合成肽反应和然后用0.96μg胰蛋白酶处理时(图18,泳道B)却未观察到反应性。说明甚至当它与VP6蛋白质结合时,它仍保持胰蛋白酶降解部位。
试样在37℃用脲素试样缓冲液处理30分钟(图19,泳道A)和试样用没有B-巯基乙醇(BME)的但在沸点下的(Laemmli缓冲液,保持VP3合成肽232-256与VP6的反应性。可是,在电泳之前当BME加入试样缓冲液中并使试样沸腾时,在45K和90K区域(由箭头表示)中的梯级消失(泳道C),这可认为为保持VP6-合成肽复合,以二硫化物桥接为特点的二级结构是必要的。
相应于VP3胰蛋白酶降解部位的合成肽其真实性通过与胰蛋白酶反应进行检定。在用考马斯兰染色后对肽电泳,观察到了单体和二聚体(图20,泳道G)。可是单体不是清楚可见的,因为在退色时它很快扩散出17.5%溶解的凝胶。在37℃,100μg合成肽用 9.6μg(泳道C)和19.2μg(泳道A)胰蛋白酶处理30分钟,可见肽的量减少90-100%。在浓度为0.96μg胰蛋白酶/100μg肽时,大约剩下30%的肽未降解(泳道E)。通过增加胰蛋白酶的浓度而使肽逐渐的降解说明,可以用酶在两个潜在部位中的一个部位来专门识别肽。
由于已经证实合成肽能够识别和用胰蛋白酶降解,所以我们对于这个酶是否能对完整的84K    VP3竞争进行了研究。用增加合成肽的浓度以减少真实VP3降解成两个产物量的能力来测定竞争的程度(图21泳道B下部箭头指出的分子量大约60,000,泳道F上部箭头指出的分子量是28,000)。确定了用于这个试验中的胰蛋白酶的量,使用的合成肽的最低量,即25μg肽和25μg    VP3完全降解(图21,泳道B)。当合成肽的量增加到200μg时,VP3变成明显(泳道F中箭头所示),因此,证明合成肽是真实的。
由于合成肽能与壳包核酸蛋白质结合,还能用胰蛋白酶降解,所以我们要研究它是否有病毒传染性的作用。当增加与传染性病毒混合的合成肽的量时,可见的空斑数量减少。当用高浓度合成肽时(图22,泳道E-H),只在对照井(B)中观察到空斑后5-6天可见到空斑。可是,这些空斑很小,扩散,在E-H井中不容易观察到。根据这个情报,合成肽除了予防应用外,还有治疗应用。
为抗有关疾病的轮状病毒而接种疫苗的剂量范围,每公斤体重大约1-100μg肽。已经发现对于本说明书中公开的任何肽,该剂量范围具有有效的免疫反应。
可能用其他氨基酸残基取代上述顺序中的一个或多个氨基酸残基, 这些取代对抗原性或免疫原性预计没有较大的影响。也可在这些顺序中或这些顺序的两侧加上或去掉氨基酸残基,没有显著地改变抗原性或免疫原性。因此,这些顺序的抗原等同物和免疫原等同物也构成本发明的一部分。
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Claims (9)

1、制备抗轮状病毒感染的疫苗组合物的方法,该方法包括:
通过化学合成提供含有选自下列氨基酸顺序的多肽:
Thr-Met-Asn-Gly-Asn-Glu-Phe-Gln-Thr-Gly-Gly-
Ile-Gly-Asn-Leu-Pro-Ile-Arg-Asn-Trp-Asn-Phe-Asn-Phe-Gly-
Leu-Leu-Gly-Thr-Thr-Leu-Leu-Asn-Leu-Asp-Ala-Asn-Tyr-Val-
Glu-Thr-Ala-Arg-Asn-Thr-Ile-Asp-Tyr-Phe-Val-Asp-Phe-Val-
Asp-Asn-Val-Cys-Met(VP7:165-295);
Arg-Asn-Cys-Lys-Lys-Leu-Gly-Pro-Arg-Glu-Asn-Val-Ala(VP7:247-259);
Pro-Thr-Thr-Ala-Pro-Gln-Thr-Glu-Arg-Met-Met-Arg-Ile-Asn-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Gln-Val(VP7:275-295);
Thr-Met-Asn-Gly-Asn-Glu-Phe-Gln-Thr-Gly-Gly-Ile-Gly-Asn-Leu-Pro-Ile-Arg-Asn-Trp-Asn(VP6:40-60);
Asn-Ile-Ala-Pro-Ala-Ser-Ile-Val-Ser-Arg-Asn-Ile-Val-Tyr-Thr-Arg-Ala-Gln-Pro-Asn-Gln-Asp-Ile-Ala(VP3:232-255);
Asn-Ile-Val-Pro-Val-Ser-Ile-Val-Ser-Arg-Asn-Ile-Val-Tyr-Thr-Arg-Ala-Gln-Pro-Asn-Gln-Asp-Ile-Val(VP3:232-255),
需要时将该多肽与大分子载体偶联,
将该多肽与至少一种药物上可接受的赋形剂相结合。
2、按权利要求1的方法,其中制备所述多肽的方法包括将该多肽的各个氨基酸通过酰胺连锁逐个偶联在一起。
3、按权利要求1的方法,其中所述大分子载体选自钥孔 血兰蛋白(KLH),牛血清蛋白(BSA),卵白蛋白(OVA),β-半乳糖苷酶,β-青霉素酶,多聚-DL-丙氨酰-聚-L-赖氨酸,聚-L-赖氨酸和VP6牛轮状病毒蛋白。
4、按权利要求1-3之任一项的方法,其中所述多肽主要含有
Thr-Met-Asn-Gly-Asn-Glu-Phe-Gln-Thr-Gly-Gly-Ile-Gly-Asn-Leu-Pro-Ile-Arg-Asn-Trp-Asn-Phe-Asn-Phe-Gly-Leu-Leu-Gly-Thr-Thr-Leu-Leu-Asn-Leu-Asp-Ala-Asn-Tyr-Val-Glu-Thr-Ala-Arg-Asn-Thr-Ile-Asp-Tyr-Phe-Val-Asp-Phe-Val-Asp-Asn-Val-Cys-Met(VP7:165-295)。
5、按权利要求1-3之任一项的方法,其中所述多肽主要含有
Arg-Asn-Cys-Lys-Lys-Leu-Gly-Pro-Arg-Glu-Asn-Val-Ala(VP7:247-259)。
6、按权利要求1-3之任一项的方法,其中所述多肽主要含有
Pro-Thr-Thr-Ala-Pro-Gln-Thr-Glu-Arg-Met-Met-Arg-Ile-Asn-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Gln-Val(VP7:275-295)。
7、按权利要求1-3之任一项的方法,其中所述多肽主要含有
Thr-Met-Asn-Gly-Asn-Glu-Phe-Gln-Thr-Gly-Gly-Ile-Gly-Asn-Leu-Pro-Ile-Arg-Asn-Trp-Asn(VP6:40-60)。
8、按权利要求1-3之任一项的方法,其中所述多肽主要含有
Asn-Ile-Ala-Pro-Ala-Ser-Ile-Val-Ser-Arg-Asn-Ile-Val-Tyr-Thr-Arg-Ala-Gln-Pro-Asn-Gln-Asp-Ile-Ala(VP3:232-255)。
9、按权利要求1-3之任一项的方法,其中所述多肽主要含有
Asn-Ile-Val-Pro-Val-Ser-Ile-Val-Ser-Arg-Asn-Ile-Val-Tyr-Thr-Arg-Ala-Gln-Pro-Asn-Gln-Asp-Ile-Val(VP3:232-255)。
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