JPS61500664A - 大腸菌の熱不安定な腸毒素の一部に対応する合成ポリペプチド、その組成物及びそれによる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 大腸菌の熱不安定な腸毒素の一部に 対応する合成ポリペプチド、その組 成物及びそれによる方法 説明 関連出願の対照 本出願は、１９８３年１２月１２日出願の係属中の出願シリアル■５５９．４６ ９の一部継続出願であり、■５５９．４６９は、１９８３年１月３日出願の係属 中の出願シリアル″Ｖ１４５５．２６５の一部継続出願である。

背景 大腸菌の腸毒素原性株（Ｅ、ｃｏｌｉ又はＥＴＥＣ）による小腸の一時的集落形 成による急性下痢症は、ヒト及び家畜育成のいずれにとっても地球的観点の大き な健康問題の一つである。これら生物は、ロータウィルス及びカムピロバタクー 　ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ：　Ｃ，ｊｅｊｕｎ ｉ）と共に・開発途上国に住む幼児及び新生児動物、とくに子羊及び小隊におい て多い、しばしば致命的なセ、性下痢の主な原因でる。ＥＴＥＣ株はまた、熱帯 に旅行する温暖な地方からの人における急性下痢の通常の原因であり、温暖な又 は熱帯の地域に住む子供及び大人における下痢の散在的又は流行的な発生の原因 となりうる。

ＥＴＥＣによりひき起されるこの病気は、二つの腸毒素（腸管前、エンテロトキ シン）の一つ又は二つの放出により伝達される。

ヒト又はブタ起源のＥＴＥＣ株により作られた低分子量の熱安定な毒素（ＳＴ） は、最近、精製分離された。ＳＴの調製物は、比較的高含量の半シスチンを含み 、グアニル酸環化酵素を刺激することにより分泌をひき起し、大分子量の担体に 結合された毒素で免疫化された動物における抗毒素反応を起すその能力により証 明されるようにハプテン的である。

大分子量の抗原性の熱不安定な毒素（ＬＴ）は、均質な程度まで精製分離された 。そのサブユニット構造は、（１１全体毒素（完全な毒素）を粘膜表面上の特定 のＧＭ、ガングリオシド受容体に付着させる５つのＢ−サブユニット、及び（２ ）細胞内７デニル酸環化訂素活動を刺激する即ち体液及び電解質分泌を起こさせ る一つのＡ−サブユニットとして特徴づけられてきた。

生物的ＬＴ、生物的ＬＴ　Ｂ−サブユニット、又は生物的ＳＴ毒素のいずれかに よる免疫化は、実験動物において、免疫化のために用いられた特定の毒素を作る 株の対応（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）及び非対応（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）血 清タイプに対して保護する抗毒素反応を誘発する。

すなわち、ＬＴ全体毒素又はそのＢ−サブユニットによる免疫化は、この毒素の みを作る成育しうる非対応株（ＬＴ”　／ＳＴ−）に対する保護を与える又はＳ Ｔも一緒に作るそれ（ＬＴ”／ＳＴ”）に対する保護を与えるが、ＳＴのみを作 るもの（ＬＴ−／ＳＴ”　）に対して保護を与えない。

同様に、生物的ＳＴでの免疫化は、成育しうる非対応ＳＴ産出ｎ　（＋、ｒ−／ ＳＴ−及びＬＴ−／ｓＴ”　）による直接的攻ｖに対して保護を与えるが、ＬＴ 産出株に対して保護を与えない。

しかし、この生物的毒素又はＢ−サブユニットは、それらの毒性、他の毒素形を 作る・株に対する保護を与えてないこと及びバブテン的な生物的３７分子を免疫 原性とするた゛めに用いられてきた大分子量担体が典型的にはｉ＝トでの使用に 不適当であるという事実の観点から、単独で用いられるとき、免疫化のために適 当でない、従って、ＥＴＥＣで誘発される下痢の防止の最も実際的なアプローチ は、ＬＴ及び５ＴＩＩ！毒素の一方又は双方を作る非対応ＥＴＥＣ血清タイプに 対する保護を与え、不適切な担体分子を用いないところの免疫プログラムであろ う。

クリプスタイン（Ｘｌ’＋ｐｓｔｅｉｎ）の米国特許第４，４１１，８８０号及 びクリプスタイン等のＪ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、　１４７：　３１８−３２６（ １９８３）は、なかんずく、カルボジイミド反応によって天然又は合成のＳＴ毒 素をＬ”ｌ素の生物的Ｂ−サブユニット（ＬＴＢ）に接合することにより作られ たワクチンの開発を報告する。この反応の結果、合成ＳＴは、大分子量ＬＴＢ担 体に結合されたとき免疫原性を獲得し、ＬＴＢはその免疫原性の殆んどを維持し 、一方、架橋された物質の両者は、それらの毒性（分泌誘発性）の殆んどを失う 。そのようにして作られたワクチンで免疫化されたラットは、ＬＴ又は生物的Ｓ Ｔによる攻撃に対して、ならびにこれら毒素を作る生育しうるＥＴＥＣ株による 攻撃に対して強く保護されたと報告されている。

このワクチンのために用いられたＬ　Ｔ　Ｂ　調製物は、組換え法で得られた。

この調製法は、有用な結果を生むが、比較的高価である。なぜなら、得られた絹 換えＬＴＢは、ＳＴと組合せて有用なワクチン接種剤へと調合される前に毒性物 質を除去するために高変に精製されなければならないからである。組換えＬＴＢ はまた、可溶性カルボジイミド、グルタルアルデヒド又はジメチルスベリミデー トのような共有結合剤によりＳＴに結合（カップル）され゛　なければならず、 これら剤はヒトで用いられる最ＰＥＮ製物では許容されない、最後に、ＬＴＢの サイズが、ＬＴ／ＳＴ免疫原処方の調製において過剰のＳＴの使用を必要とし、 これが従ってコストを増加させる。

リチャードＡ、レーナー（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ａ、Ｌｅｒｎｅｒ）及び共同研究者 達は、そのアミノ酸残基配列が蛋白質の一部のそれに対応するところの合成ポリ ペプチドが、完全な蛋白質をＬ２諏する抗体を誘発するために用いられることを 示した。総説として、スッチクリフ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）ら、サイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）　２１９：　６６０−６６６　（１９８４）を参照されたい、レ ーナーらの初期の研究に続く設計された合成ポリペプチドは、前記の合成５７分 子の調製のために成功裡に用いられた。

ヒト及びブタに感染する（各々ＬＴｈ及びＬ　ＴＰ　）　Ｅ、ｃｏｌｉからのＬ ＴＢ蛋白質をコードするヌクレオチド配列が決定されている。

ヌクレオチド配列のアミノ酸配列への翻訳は、その最大の形が１２４のアミノ酸 残基を含みうる蛋白質をもたらす、ダラス（Ｄａｌｌａｓ）及びファルコウ（Ｆ ａｌｋｏｗ）　、ネイチア（Ｎａｔｕｒｅ）　２８８：４９９−５０１（１９８ ０）　、及び白木ら、ジャーナル　オブ　バクテリオロジイ（Ｊ、　Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ、）　１５５：　７２８−７３３　（１９８３）参照。

１２４の残基の蛋白質は、ときにシグナルペプチドと呼ばれるところのものの中 のアミノ末端に２１のアミノ酸残基を含む０文献に報告されたＬＴＢのアミノ酸 残基位置数は、報告される研究の著者がその位置ナンバリング法において２１の 残基のシグナルペプチドを含むか除くかに依存して、位置が２１だけ異る。

本発明の概要 本発明は、いくつかの局面を持つ、いくつかの局面は、大腸菌の熱不安定な腸毒 素のＢ−サブユニット（ＬＴＢ）のアミン末端からほぼ位置３５〜はぼ位置９５ のアミノ酸残基配列に配列において対応する約ｌＯ〜約３５のアミノ酸残基を含 む合成ポリペプチドを意図する；位置数は、Ｂ−サブユニットの２１の残基のシ グナルポリペプチドを含む、特に好ましい態様において、合成ポリペプチドは、 配列においてＢ−サブユニットのアミノ末端からほぼ位置５５〜はぼ位置８５に 対応する約１５〜約３０の残基を含む、ここで再び位置数は、２１の残基のシグ ナルポリペプチドを含む、最も好ましくは、この合成ポリペプチドは、配列にお いて、熱不安定な腸毒素のＢ−サブユニットの７ミノ末端からほぼ位置６０〜は ぼ位置８５に対応する約２０〜約２５のアミノ酸残基を含む、ここで再び位置数 は、このサブユニー／　）の２１の残基のシグナルポリペプチドを含む。

本発明の別の局面は、互にペプチド結合された二つのアミノ酸残基配列を含む約 ２５〜約５５のアミノ酸残基を含む複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを意図する。こ れらアミノ酸残基配列の一つは、配列において、大腸菌の熱安定な腸毒素（ＳＴ ）の少くともカルボキシ末端１４残基に対応し、一方、第二の配列は、大腸菌の 熱安定なＮ＆毒素（ＬＴＢ）のＢ−サブユニットのアミノ末端から位置約３５〜 約９５に対応する。ここで後者の位置数はＢ−サブユニットの２１残基シグナル ポリペプチドを含む。

好ましい態様において、このポリペプチドの初めに挙げたアミノ酸残基配列部分 は、大！！閏の熱安定な腸毒素の１８残基配列、及び大ｌ！苗の熱不安定な腸毒 素のＢ−サブユニットの一部に対応する前述のより好ましい配列を含む。

最も好ましくは、意図されるポリペプチドは、熱安定な腸毒素の１８残基配列、 及び大腸菌の熱不安定な腸毒素のＢ−サブユニットの一部に対応する前記の約２ ０〜約２５残基配列を含む、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを構成する二つの配列 は好ましくは、一つの配列のカルボキシ末端残基と他の配列のアミノ末端残基の 間のペプチド結合により互に結合される。

本明細書で複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドと呼ぶ上述のポリペプチドはまた、−又 は両末端に結合された１〜約４の追加的なアミノ酸残基、ならびにこの複合体を 構成する二つのポリペプチド配列の間の１〜約２の追加的アミノ酸残基を含むこ とができる。これら追加的残基の各々は、空腸のｐＨ（約ｐＨ６，５）において イオンＴＬ荷を持つことのできる酸性又は塩基性＠鎖を持つ。

これら追加的残基が一つより多（存在する場合、追加的アミノ酸残基の側鎖の各 々は空腸ｐＨ（Ｕで同じイオン電荷を持つことができる。末端の一方又は両者に 及び構成要素ポリペプチドの間に結合されることができる好ましい追加的アミノ 酸残基は、リジン（Ｌｙｓ）及びアルギニン（Ａｒｇ）残基より成る群から選ば れ、又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇ　１　ｕ）残基より成 る群かみ選ばれる。

本発明のこの態様の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドはまた、左から右にかつアミノ 末端からカルボキシ末端の方向に、下記式に対応する化合物として表わすことが できる：（Ｘ）ａ−（Ａ）Ｏ−（Ｚ）、−Ｂ−（Ｚ）ｓ−（Ａ）、−（Ｙ）、こ こでＸ、Ｙ及びＺが存在する場合には、これらは＋ａｔ　Ｌｙｓ及びＡｒｇ残基 より成る群から選ばれた、又は（ｂｉ　Ａｓｐ及びＧ１ｕ残基より成る群から選 ばれた、配列に対する追加的アミノ酸残基であり；ｎ及びｍは、０．１．２．３ 又は４の整数であって、ｎとｍの一方又は両方がゼロであるときにＸ及びＹの各 々は存在せず、ｎとｍの一方又は両方がゼロでない値を持つときに各Ｘ及びＹ残 基は存在し、ポリペプチド当り存在するＸ及びＹ残基の平均数はＸ及びＹの各々 の値に等しく； 「及びＳは、０．１又は２の整数であって、ｒとＳの一方又は両方がゼロである ときに各Ｚは存在せず、「及びＳが存在するときに各Ｚは存在し、複合ＬＴ／Ｓ Ｔポリペプチド分子又は繰返し単位当りの２残基の平均数はｒ又はＳの値に等し く、但しｒ又はＳの一方がゼロより大きいときにｒ及びＳの他方はゼロであり、 そのｒ又はＳがゼロである各Ｚは存在せず；０及びｐは０又は１の整数であって 、０及びｐの一方がゼロの値を持つとき対応するＡは存在せず、但し。及びｐが 同し値を持つことはなく； Ａは、大腸菌の熱不安定腸毒素のＢ−サブユニットのアミノ末端から駒位置３５ 〜約位置９５のアミノ酸残基配列に配列において対応する約ｌθ〜約３５のアミ ノ酸残基を含むポリペプチドであり、ここで位置数はＢ−サブユニットの２１残 基シグナルポリペプチドを含んでおり、そして Ｂは、大腸菌の熱安定腸毒素の少くともカルボキシル末端１４残基に配列におい て対応する１８までのアミノ酸残基を含むポリペプチドである。

本発明においてまた、大腸菌の熱安定腸毒素のＢ−サブユニットのアミン末端か ら駒位置３５〜約位置９５のアミノ酸残基配列に配列において対応する約ｌＯ〜 約３５のアミノ酸残基を含む多数のポリペプチド繰返し単位を含むところのポリ マーが意図され、ここで位置数はＢ−サブユニットの２１残基シグナルペプチド を含む。これらポリマーは、接種物としての生理学的に許容できる希釈剤中に溶 解又は分散し、有効量で宿主哺乳動物に導入したときに、天然のＩｌｉ毒素Ｂ− サブユニットと免疫反応する抗体の土庄を誘発することができる。

一実施態様において、本発明のポリマーの繰返し単位は、繰返し単位末端に付加 されたＣｙｓ’Ａ％の酸化により形成されたシスチンジスルフィド結合によって 互に結合されており、Ｃｙｓ残基は、酸化前に繰返し単位ポリペプチドのアミノ 末端及びカルボキシ末端の両者に存在する。そのような繰返し単位は、非酸化形 で、ジＣｙｓ−ＬＴポリペプチドと呼ばれる。このポリマーは、ポリマー形成酸 化の間に他の七ツマー状繰返し単位が存在しなければ、線状ホモポリマーである 。

１４カルボキシ末端アミノ酸残基に対応する第二のポリペプチド繰返単位の両者 を用いて酸化的重合を行うとき、ランダムな三次元ネットワークコポリマーが得 られる。ネットワークポリマーが望まれる場合、ＳＴポリペプチドの少くとも三 つ、最も好ましくは六１０　つ総てのＣｙｓ残基が存在する。完全な１８残基Ｓ Ｔポリペプチド配列を用いることも好ましい。

多数の複合Ｌ　Ｔ／Ｓ　Ｔポリペプチド繰返し単位を含むネ７）ワークポリマー は、本発明のポリマーの更に別の一局面であると考えられる。左から右へかつア ミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いてポリペプチド繰返し単位は、それぞ れに、前述の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの式に対応する。左から右へかつアミ ノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、特に好ましいネットワークポリマー の繰返し単位は、それぞれに、下記式に対応する＝（Ｘ）ｌｌＭｅｔＶａｌｌｌ ｅｌｌｅＴｈｒＰｈｅＭｅＬ（Ｌｙｓ）ＳｅｒＧｌｙＧｌｕ（Ａ　Ｉａ）　Ｔｈ ｒＰｈｅＧ　ＩｎＶａ　ＩＧ　ＩｕＶａ　１ＰｒｏＧ　Ｉ　ｙＳｅｒＧ　ｌｎＨ ｉｓ　Ｉ　１ｅＡｓｐｓｅｒＧ　Ｉ　ｎkｙｓ ＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧｌｕＬｅｕＣｙｓＣｙｓＴｙｒ（Ａｓ ｎ）ＰｒｏＡ］ａＣｙｓＡＩａＧｌｙＣｙｓＡｓｎ（Ｔｙｒ）　（’／）ｍここ でＸ及びＹが存在するとき、これらは（ａｌ　Ｌｙｓ及びＡｒｇ残基より成る群 から選ばれる、又はｆｂｌ　Ａｓｐ及びＧｌｕ残基より成る群から選ばれるアミ ノ酸残基であり； ｎ及びｍは、０、ｌ、２．３又は４の整数であって、ｎとｍの一方又は両者がゼ ロの値のときには各Ｘ及びＹは存在せず、ｎとｍの一方又は両者がゼロでないと きには各Ｘ及びＹは存在し、ポリペプチド繰返し単位当りのＸ及びＹ残基の平均 数は各々Ｘ及びＹの値に等しく； カッコ内のアミノ酸残基は各々、弐の配列において直前のアミノ酸残基二二対す る代替物であり； 繰返単位は、繰返単位の酸化されたＣｙｓ１Ａ基の間に形成された分子内、ポリ ペプチド間シスチン結合により互に結合される。

本発明においてまた、診断法及び合成に用いられる抗体を発生させるためにを用 な、又は大腸菌の熱不安定な又は熱不安定な及び熱安定な腸毒素からヒトを含む 動物を保護できるワクチンとして有用な接種物が意図される。この接種物は、生 理学的に許容できる希釈剤中に上述したＬＴＢポリペプチド接合体、複合ＬＴ／ ＳＴポリペプチド接合体又はネットワークポリマーの存効量を含む、この接種物 は、たとえば注射又は経口的に宿主哺乳動物に一単位投与量で導入されたとき、 少くとも大腸菌の熱不安定腸毒素のＢ−サブユニットと免疫反応する抗体の生産 を誘発できる。より好ましい態様では、そのように誘発された抗体は、大腸菌の 熱不安定腸毒素及びりさ安定腸毒素の両者と免疫反応する。そのような接種物は 、ヒト、ブタ又は実験動物たとえばラットのような宿賜菌力・ら宿主を保護する 。

図面の簡単な説明 七記載の一部を成す図面において、 第１図は、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端へ書かれた大腸菌のブ タ（ＬＴＰ　）及びヒ）（ＬＴｈ）の熱不安定腸毒素のＢ−サブユニットの翻訳 されたアミノ酸残基配列を示す。

アミノ酸残基を結合するペプチド結合は、ノ＼イフンで示されている。２１の残 基のシグナルペプチド配列のアミノ酸残基は、小文字で示され、蛋白質の主要部 分の残基は大文字で示される。小斜線（１）は、シグナルペプチド配列を残りの 配列から分ける。

ＬＴｂ配列（ＬＴｒＣｅ列の下の）におけるダッシュは、二つの配列において同 し残基が存在することを示す。配列りこはって異る残基が表示されている。ＬＴ Ｐ配列の数字は、７ミノ末端から測った残基位置を示す。この配列は、ダラス及 びファルコウ、ネイチｙ２ＢＢ　：４９９−５０１　（１９８０）　、白木ら、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１５２：５０６−５０９　（１９８２）及び白木ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１５５ニア２８−７３３　（１９８３）により報告された。

第２図は、材料及び方法の部に記述するＢ／Ｂ　ＥＬＩＳＡ法により測定された 研究されたＬＴＰ関連ポリペプチドの三つの抗原性を示すグラフであり、天然の ＬＴｈＢ−サブユニー／　）の抗原性に対するパーセントとして示しである。ｅ 軸は、天然ＬＴ、Ｂ−サブユニット抗原性のパーセントである。横軸は、ＬＴＦ Ｂ−サブユニット蛋白質上の配列位置を示す、　Ｌ　Ｔｒ　Ｂ関連ポリペプチド 華独の抗原性は、斜線ハンチングを囲む相形により示される。

閉じられたハツチングの密度は読みやすいためであって、測定における実験誤差 を示すためではない、５Ｔｌｂｈポリペプチドのアミノ末端残基にペプチド結合 され、酸化的に重合されたＬＴｓ関連ポリペプチドの抗原性は、点線で囲った錯 形により示される。

第３図は、第一の腸管外菟疫化（ＩＰ）及び続く二回の経口（ＰＯ）免疫化によ るラットの免疫化結果を示すグラフである。

纒−は、減少された腸分泌の％を示し、横軸はＬＴｈ　Ｂ−サブユニソ）　（Ｂ ）抗原単位での経口全投与量を示す０段階分けした抗原単位投与量は、天然のＬ Ｔｌ、Ｂ−サブユニット（・−・；天然Ｂ、）、又は１Ｂ残ｉｓＴ　Ｉｂｈポリ ペプチドにペプチド結合されたＬＴＰＢ−サブユニット関連ポリペプチドのモノ マー形（複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド）単独（Δ：ＢＦｌｌＡＧ　ＳＴ華独）又 はブタ免疫グロブリンＧ（ＰＩＧ）に接合されたもの（ｏ−ｏ；Ｂ□ａｃ−Ｓ　 Ｔｘ　Ｐ　Ｉ　Ｇ、）のいずれかを活性成分（免疫原）として含むワクチンを用 いて導入された。ラットは、生育しうるＬＴ”／ＳＴ−大腸菌株ＰＢ２５８で攻 撃された。結果は、同様に攻撃された対照と比べての、免疫化ラットにおける平 均上ＳＥＭの減少された分泌として示される。データ点の上又は下の数字は、こ れらの点に対する粘膜１ｇＡ抗毒素力価を示す。

第４図は、第一の腸管外免疫比重Ｐ）及び続く二回の経口（ＰＯ）免疫化による ラットの免疫化の結果を示すグラフである。

段階分けした抗原単位投与量は、天然Ｌ”ｒｈｓ−サブユニットに化学的に架橋 された合成の１８残基ＳＴ　Ｉｂｈポリペプチド〔・−・；ＳＴ　（Ｓ）ＸＢ） 　、及び左方の図に示す繰返し卑位として第３図の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド を持つネットワークポリマＬＯ・・ｏ　ｉ　ＢＦＩＡＧ−３Ｔ〕及び右方の図に 示す天然ＬＴｂＢ−サブユニットて・−・；天然Ｂゎ〕を活性成分（免疫原）と して含むワクチンを用いて導入された。攻撃は、左方の図では生育しうる大腸菌 ＬＴ’　／ＳＴ−株Ｔｘ４５２、右方の図では生育しうる大ｌ！！菌ＬＴ’　／ ＳＴ−株ＰＢ２５Ｂを用いて行った。両図における縦重鱈よ、第３図と同しであ る。横軸は、左方の図及び右方の図で各々、ＳＴ　（Ｓ）及び天然ｒ−ＴゎＢ− サブユニ７）抗原単位での合計Ｐ○投与量を示す。横軸の抗原単位に対応する免 疫原のミリグラム（ｍｇ）故も示されている。他の結果は、第３図と同様に示さ れている。

第５図は、繰返し単位として第３図の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを含むネット ワークポリマー〔Δ及びム：ワクチン〕、天然ＬＴｋＢ−サブユニ、ト〔・−・ ；Ｂサブユニット〕、又は天然ＬＴｂＢ−サブユニットに架橋された前述の合成 ＳＴ　（０・・・ＯＳ　ＳＴ　（Ｓ）ＸＢ３を活性免疫原として含むワクチンの ４回の逓倍のＰＯ免疫化（ＰＯ／ＰＯ）を与えられたう７）の免疫化の結果を示 すグラフ（右方）である、攻撃及び結果の表示は、第３図と同様であるが、但し 、ワクチン中の免疫原のミリグラムは、投与された抗原単位の数と同様に横軸に 示される。

本発明は、い（つかの利益及び利点を提供する０本発明の一つの利益は、それが 大腸菌の熱不安定な及び熱安定な腸毒素の両者を生産する株に対する一元的な完 全に合成のワクチンを提供することである。

別の利益は、この一元的ワクチンが、免疫化された宿主において腸分泌を実質上 全く誘発しないことである。すなわち、本発明に従い作られたワクチンは、どち らの腸毒素の不都合な分泌誘発作用をも実質上台まない。

本発明の一つの利点は、そのＬＴ　Ｂ−サブユニット関連ポリペプチドが標準的 実験室合成法により合成的ζ＝作られ、それによって望ましくない生物学的汚ン 物を含まないことである。

本発明の別の利点は、そのポリペプチドが、生物学的又は組換えＤＮＡの技術に 比べて比較的安価に調製及び精製されることである。

さらに別の利益及び利点は、以下の詳細な説明から当業者には明らかであろう。

本発明の詳細な説明 本発明ユよ、大腸菌の熱不安定な腸毒性のＢ−サブユニ、トのアミノ末端から駒 位置３５〜約位置９５に配列において対応するＶフｌＯ〜約３５のアミノ酸残基 を含む合成ポリペプチドを意図する。

ここで位置数は、Ｂ−サブユニットの２１残暴シグナルペプチドを含む。そのよ うなポリペプチドを含む接合体、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド及びポリマー、な らびに接合されたポリペプチド、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド又はポリマーの有 効量を含む接種物、該接種物により誘発された抗体及びこ机らに関係する方法も また、意図される。

１、ＬＴＢポリペプチド ＬＴ、及びＬＴｂのＢ−サブユニットの翻訳されたアミノ酸残基配列が第１図に 示される。箪−配列として左から右ヘアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書 いて配列位置３５から配列位置９５まで（ここで位置数は２１残基シグナルポリ ペプチドを含む）の大腸菌の熱不安定腸毒素のＢ−サブユニットのアミノ酸残基 配列は、下記式Ｉにより示される。

式Ｉ ＡｓｎＴｈｒＧ　Ｉ　ｎ　Ｉ　Ｉ　ｅＴｙｒ丁ｈｒＩ　１ｅＡｓｎＡｓｐＬｙｓ 　Ｉ　ＩｅＬｅｕＳｅｒＴｙｒＴｈｒＧ　ｌ　ｕｓｅｒｌｅ　ｔＡ　ｌａＧ　Ｉ 　ｙＬｙｓＡｒｇＧ　ｌｕＭｅｔＶａ　ｌ　Ｔ　ｌｅ　Ｉ　ＩｅＴｈｒＰｈｅＭ ｅ　ｔ　（ＬｙｓjＳｅｔ ＧｌｙＧＩｕ（Ａｌａ）ＴｈｒＰｈｅＧＩｎＶａｌＧＩｕＶａｌＰｒｏＧＩｙＳ ｅｒＧｌｎ旧５ｌｌｅＡｓｐｓｅｒＧ　Ｉ　ｎＬｙｓＬｙｓＡ　ｌａ　ｊｌ　ｅ Ｇｌ　ｕＡｒｇＭｅｔＬｙｓＡｓｐＴｈｒＬｅｕＡｒｇＩ　ｌｅここで、カッコ 内のアミノ酸残基は、各々、式の配列中の直前の残基すなわちカッコ付きの残基 の左側の残基に対応する代替物である。特定の残基の上の数字は、７ミノ末端か ら測り、シグナルペプチド配列を含めた配列中のアミノ酸位置を示す。

式Ｉの配列は、二つの代替的アミノ酸残基を含むことに留金しなければなるない 。これら残基は、アミノ末端から位置６４及び６τに位置する。特記なき限り、 ＬＴＢの一部に対するアミノ酸残Ｍ＆列を含む本発明のポリペプチド（ＬＴＢポ リペプチド）を本明細書で云うとき、複合配列としてＬ　Ｔ　ｔ、及びＬ　Ｔ　 Ｐポリペプチド配列の両者を包含すること、すなわちｆａ＋位置６４にＬｙｓ又 はＭｅｔ残基、そしてへ）位置６７にＧｌｕ残基又はＡｆｆｉａ残基を含むアミ ノ酸残基配列を包含することを意味する。すなわち、位置６４〜６７に下記の四 つの配列を含むＬＴＢポリペプチドが、ＬＴＢポリペプチド又はＬＴＢと云うこ とによって意味される：（Ａ　）　ＭｅｔＳｅｒＧｌｙＧｌｕ （Ｂ　）　ＬｙｓＳｅｒＧｌｙＧＩｕ （Ｃ）　ＭｅｔＳｅｒＧｌｙＡｌａ （Ｄ　）　ＬｙｓＳｅｒＧＩｙＡＩａ 下記で検討するデータは、配列において熱不安定腸毒素のＢ−サブユニ、）（Ｌ ＴＢ）の位置３５〜約９５に対応する約ｌＯ〜約３５０アミノ酸残基を含む合成 ポリペプチドが、大腸菌により生産される熱不安定腸毒素（ＬＴ）の存在を診断 するのに有用であろう抗体の生産を誘発する免疫原として有用であることを示す 。

より好ましくは、本発明のポリペプチドは、接種物における免疫原として用いら れる。これら使用において、ポリペプチドが約１５〜約３０のアミノ酸残基を含 むこと、及びポリペプチドの配列が位置約５５〜約位置８５のＬＴＢ配列に対応 することが好ましい。

最も好ましくは、約２０〜約２５の残基を含むポリペプチドが用いられ、このポ リペプチドの配列は、ＬＴＢの駒位置６０〜約位置８５の配列に対応する。その ように用いられるポリペプチドは、担体にカップリングされたポリペプチド接合 体として典型的に用いられる。接合されていないポリペプチドもまた、抗しＴＢ ポリペプチド又は抗天然ＬＴ抗体のための抗原又は競争リガンドとじて診断にお いて有用である。

ｎ、ＬＴＢ配列を含む複合Ｌ　Ｔ　／　Ｓ　Ｔポリペプチド本発明の特にを用な 実施態様は、約２５〜約５５のアミノ酸残基番含む複合ポリペプチドであり、第 一の配列のカルボキシ末端残基と第二の配列のアミノ末端残基の間のペプチド結 合により互に結合された二つのアミノ酸残基配列より成る。この複合ポリペプチ ドの二つのアミノ酸残基配列は、そのアミノ酸残基配列がＬＴＢのアミノ末端か ら約３５〜約９５の位置に対応する前述の合成ポリペプチドを含む。第二の配列 は、大腸菌の熱安定腸毒素（以下では一般にＳＴと云う）の少くともカルボキシ 末端１４アミノ酸残基に対応する。そのようなポリペプチドは、以下では、複合 ＬＴ／ＳＴポリペプチドと呼ばれる。

複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを構成する二つのアミノ酸残基配列の間のペプチド 結合は、ＳＴ配列のアミノ末端残基とＬＴＢ配列のカルボキシ末端残基の間に、 又はＬＴＢ配列のアミノ末端残基とＳＴ配列のカルボキシ末端残基の間に形成さ れることができる。ｙｉ合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを構成するポリペプチド配列 はまた、頭尾結合されていると云われることもできる。

複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドＯ熱安定（ＳＴ）部分に対応するアミノ酸配列がＳ Ｔ分子の１８残基（１８−ｍｅｒ）配列を含むことが特に好ましい。

ＳＴの少くとも二つのタイプが、その物理特性により同定されている。ＳＴＩと して知られる第一タイプ（ＳＴ、とも呼ばれる）は、メタノール可溶であり、幼 児マウスモデルにおいて活性である。第二のタイプ、５ＴＩＩ　（ＳＴ、とも呼 ばれる）は、メタノール不溶であり、幼児マウスモデルにおいて活性でなく、し かし結さくしたブタ回腸ループにおいて活性である。ＳＴＩポリペプチドがここ で興味あり、ここで言及される唯一のＳＴポリペプチドタイプであろう。

ＳＴＩポリペプチドのうち、少くとも二つの類似のポリペプチド、又はこれらポ リペプチド決定子ｆ＋Ｊ！域が同定されており、それらのアミノ酸残基配列が決 定されている。ＳＴＩのこれら二つのタイプは、本明細書で （ｉ）ウシ大ｌｉ！＠株において初めに見い出され、その一部がブタ株において もコードされているＳＴＴ、、及び（１１）大腸菌のヒト分離物からの指定され たＳ　Ｔ　１　ｂと呼しぼれる。

ＳＴ　１．ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が決定されている。ヌク レオチド配列のポリペプチドアミノ酸配列への翻訳は、カルボキシ末端でチロシ ン基により封鎖された７２のアミノ酸を含むポリペプチドを与える〔ソー（Ｓｏ ）ら、Ｐｒｏｃ、〜ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７：　４０１１−４０１５（１９８０）〕、　 Ｓ　Ｔ　Ｉｂポリペプチドは、僅か１８のアミノ酸を含むと作告され〔チャン（ Ｃｈａｎ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２５６：　７７４４−７７４６（ １９８１）　）　、これら１８残基は、ＳＴＴのヌクレオチド配列によりコード される１８カルボキシ末端残基と相同である。

最近の証拠は、５ＴＩｂについて初めに報告されたアミノ酸残基配列は誤りであ ったことを示す。初めに報告されたカルボキシ末端アスパラギン（Ａｓｎ）残基 は今では、チロシン（Ｔｙｒ）残基であると信じられ、一方、１８−ｒａｅｒの アミノ末端から位置１１の初めに報告されたＴｙｒは今では、Ａｓｎ残基である と信じられている。検討の容易のために、チャンら（前出）により報告された元 の配列にその【こ列が対応するところのポリペプチドは、ここで５ＴＩｂｈと呼 ばれ、改正された配列に対応するポリペプチドは、ＳＴ　Ｉｂｐと　呼ばれるで あろう。

ＳＴ　Ｉｂｈポリペプチドの１８のアミノ酸（１８−ｐｅｒ　）は、ＳＴ　Ｉａ のポリペプチドの５５〜７２と番号を付されるアミノ酸と大きな同種性を示す。

ＳＴ　Ｉｂｈの同種の、はとんど同一の領域は、５ＴＩａの及びＳＴ　Ｉｂｐの 報告された配列と共に、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に 、５ＴＩａポリペプチドのアミノ酸数５５から始めて下記に示される：ＳＴ　Ｉ ａ　：ＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧｌｕＬｅｕＣｙｓＣｙｓＡｓｎ ＰｒｏＡｌａＣｙｓＡｌａＧＩｙＣｙｓＴｙｒＳＴ　Ｉｂｈ：ＡｓｎＴｈｒＰｈ ｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧｌｕＬｅｕＣｙｓＣｙｓＴｙｒＰｒｏＡＩａＣｙｓＡＩ ａＧｌｙＣｙｓＡｓｎＳＴ　Ｉｂｐ：ＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧ ｌｕＬｅｕＣｙｓＣｙｓＡｓｎＰｒｏＡｌａＣｙｓＡｌａＧＩｙＣｙｓＴｙｒ見 られるように、ＳＴ　ＩａとＳＴ　Ｉｂｐの１８残基配列は同しである。

上述の三つ（二つの異る）１８アミノ酸残基ポリペプチド配列の検討はまた、六 つの半シスチン（Ｃｙｓ）残基が存在することを表わす。これら半シスチン残基 を、天然腸毒素における分子内、ポリペプチド内ジスルフィド結合を含むシスチ ン残基へ酸化することは、この物質に観察される熱安定性を与えると考えられる 。

しかし、シスチンジスルフィド結合は天然ＳＴ中に存在すると知られているが、 半シスチン残基のどのペアーが結合して天然ＳＴ分子中に存在する三つのジスル フィド結合を形成するのが知られていないことにさらに留意しなければならない 、これら三つのジスルフィド結合は、理論的に、存在する六つのＣｙｓ残基の１ ５の異る組合せから形成されうる。

ステーブルズ（Ｓｔａｐｌｅｓ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５５： 　４７１６−４７２１（１９８０）は、生物的ＳＴのジスルフィド結合が毒素の 生理学的活性のために必要であることを示した。すなわち、半シスチンを形成す る化学的還元又はシスティン酸への過ギ酸酸化は、毒素の生理学的活性を破壊す ることが示された。加えて、チャンら（前出）は、ＳＴ　Ｉｂｐの上述の配列の 相同な１８のアミノ酸のアミノ末端から最初の四つの残基が生理学的活性のため に必要でないことを報告している。すなわち、生理学的活性は、上述のカルボキ シ末端１４アミノ酸及びそれらのジスルフィド結合を含む、アミノ酸含をポリペ プチドから得られた。

アイモト、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、’　Ｃｈｅ＋＋ 、　１１２：　３２０−３２６（１９８３年４月１５日）は、彼らがＴＳ、と呼 ぶ物質のカルボキシ末端１４アミノ酸残基の合成について報告している。その合 成分子は、幼児マウス評価を用いて、分子基準で天然Ｓ　Ｔ　ｂの２〜５倍の生 理学的活性を持つと報告された。

ダフロント（Ｄｕ’ｆｌｏｔ）らによる１９８２年８月２９日の口頭表示、プロ シージンゲス　ヨーロピアン　ペプチド　シンポジウム（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｓ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）　：　６８３　 ６８６において、これら研究者は、Ｃｙｓメルカプト基がアセタミドメチル基で ブロックされた（Ｓ−ブロックされた）ブタ及びヒトＳＴ１８−ｓｅｔポリペプ チドの合成を報告した。これらアミノ酸残基配列は、報告されるところによると ソーら（前出）によりＳＴ　Ｉａについて報告された、またチャンら（前出）に よりＳＴ　Ｉｂｈについて報告された配列と同じである。しかし、ダフロ７トら により報告された配列のアミノ末端から第７番目のアミノ酸残基はグリシン（Ｇ ｆｙ）であったが、一方、前述した配列におけるその残基はグルタミン酸残基（ Ｇｌｕ）である。

ダフロントらは、天然又は合成毒素を等しく認識した抗体を作った破傷風トキソ イド又はオバルブミンにカンプリングされたＳ−ブロックされたブタＳＴ毒素に よるマウス又はラビットの免疫化を報告した。Ｓ−ブロックしたブタ合成ポリペ プチド毒素にっ。

いて、幼児マウス評価においてほとんど全く生理学的活性は報告されなかった。

これら著者は、Ｓ−ブロックされた分子における分子内ジスルフィドの不存在に よるべき生理学的活性の欠除を報告し、これはステーブルズら（前出）の先の報 告と符合する。

ここで考慮されるＳＴポリペプチドは、ＳＴ　Ｉｂｈ及びＳＴ　Ｉｂｐ（ＳＴ　 Ｉａ　）の少くともカルボキシ末端１４残基を含む、このポリペプチドはまた、 ＳＴ配列の六つのＣｙｓ残基に対する、四つまで、好ましくは三つ以下、最も好 ましくは二つ以下の代替的アミノ酸残基を含みうる。また、Ｃｙｓ残基が存在す る場合、存在するＣｙｓ残基の四つまで、好ましくは三つ以下、最も好ましくは 二つ以下の硫黄原子がアルキル化されることができる。

有用なＳＴポリペプチドは、少くとも一つの分子内シスチンジスルフィド結合を 含む、結局、Ｃｙｓ残基に対する一以上の代替的アミノ酸残基Ｏ存在、及び−以 上のアルキル化Ｃｙｓメルカプタン基の存在は、ＳＴポリペプチドが少くとも一 つの分子内シスチンジスルフィド結合を形成できるという前提に従う。

左から右へかつアミン末端からカルボキシ末端の方向に書いてＳＴＯカルボキシ 末端１４残基に対応する有用な１４残基ＳＴポリペプチド配列は、下記の式■に 対応する。

弐Ｂ ここでカンコ内の二つの特定のアミノ酸残基（Ａｓｎ及びＴｙｒ）は各々、式の 配列における直前のアミノ酸残基に対する代替物であり； ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｒｃａ−ｆ）、及びｇ、ｈ、ｉ、Ｌｋ及びｌ（ｇ−１） は各々ゼロ又は１の整数であり、但し、ａ〜ジスルフィド結合を形成し、一方、 もしａ　−ｆ又はｇ〜ｌのいず又は異る基であり、水素、１〜約４個の炭素原子 を含むアルキル基たとえばメチル、エチル、イソプロピル及び第ニブチル基、及 び２〜約４個の炭素原子を含む置換アルキル基たとえばカルボキシメチル、カル バモイルメチル、カルボキシエチル及びカルバモイルエチル基より成る群から選 ばれ； 基に対する代替アミノ酸残基であり、中性の側鎖を持つアミノ酸残基たとえばア ラニンＣＡ１ａ”）及びセゾン（Ｓｅｔ）の群から選ばれ；そして 少くともａ　ｗ　ｒの二つ及びｇ−１の二つはゼロであり、二つの隣接しないＣ ｙｓ残蟇が存在し、但し、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの合成ＳＴポリペプチド 部分が、存在する少くとも二つのＣｙｓ残基から形成される少くとも一つの分子 内シスチンジスルフィド結合を形成する能力を持つこと。

モノマー形のとき、上述の少くとも一つのジスルフィド結合は、ＳＴポリペプチ ド中に存在する少くとも二つのＣｙｓ’Ａ基の間に形成された分子内、ポリペプ チド内シスチンジスルフィドである。

ＳＴポリペプチドが、多数のＬＴポリペプチド含有繰返し単位を含むポリマー形 であるとき、上述の少くとも一つのジスルフィド結合は、各ＳＴポリペプチド繰 返し単位中に存在する少くとも二つのＣｙｓ残基の間に形成された分子内、ポリ ペプチド内シスチンジスルフィドでありうる。

この少くとも一つのジスルフィド結合はまた、第一のＳＴ含有繰返し単位中に存 在する少くとも二つのＣｙｓ残基の一つと第二のＳＴ含有繰返′一単位中に存在 する少くとも二つのＣｙｓ残基の別の一つ又は別のポリペプチド繰返し単位中に 存在することができるＣｙｓ残基の一つとの間に形成された分子内、ポリペプチ ド間シスチンジスルフィド結合であることもできる。従って、分子内シスチンジ スルフィド結合は、ＳＴのモノマー状及びポリマー状複合形の両者の中に存在す ることが理解される。モノマー状ＳＴ含有複合体において、そのシスチンジスル フィド結合はポリペプチド内結合であり、一方、繰返し単位中にＳＴポリペプチ ド配列を含むポリマーにおいて、ジスルフィドはポリペプチド間又はポリペプチ ド内結合であることができる。

式■の上述のＳＴポリペプチドに関して、合成ＳＴポリペプチドのモノマー及び ポリマー形についてのより好ましい態様において： ａが０のときｅは０であり、 ｂがＯのときｄは０であり、そして Ｃが０のときｆはＯであり、そして ａが０のときｇ及びｋの各々が０であり、ｂがＯのときｈ及びｊの各々がＯであ り、そしてＣがＯのときｉ及びｌの各々が０である。

二つの特定の代替的アミノ酸及びＷ換の代替的Ｒ基なしの式■に示される配列は 、ＳＴ　Ｉｂｈのカルボキシ末端１４アミノ酸残基配列に対応する。　ＳＴ　Ｉ ａのアミノ酸５９〜７２を含む１４アミノ酸残基（ＳＴ　ＩｂｐＯカルボキシ末 端１４残基）は、位置６５において（アスパラギン（Ａｓｎ）残基がＳＴ　Ｉｂ ｈの７ミノ末端から１１の位置（カルボキシ末端から残基位置８）において千ロ ジン（Ｔｙｒ）残基を置き代える場合）、及びＳＴ　ｌｂｐのアミノ末端から位 １１１８（カルボキシ末端）においてチロシン残基が示されているアスパラギン 基を置き代える場合）、その代替アミノ酸及びＲ基なしの式Ｈに示される配列と 異る。

すなわち、アミン末端から第四のＣｙｓ残基（ＳＴ　ＩａのＴｙｒ−６５）のす ぐ右のＴｙｒ残基は、上述の式■においてカッコ内のＡｓｎ残基により置き代え られることができる。逆に、示されているカルボキシ末′ｐＪＡ　ｓ　ｎは、最 後のＴｙｒ残基のカッコにより示されるようにＴｙｒで置き代えられることがで きる。

１８残基ＳＴ　Ｉｂｈ及びＳτＴｂｐ分子の配列中に存在する四つのアミノ酸残 基の少くとも一つがまた、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの合成３７部分中のその 天然の位置的配列に、又はＳＴポリペプチドを含む任倉の他のものの中に存在す ることが特に好ましい、これら追加的アミノ酸の四つの総てが、それらがＳＴ　 Ｉｂｈ及びＳＴ　Ｉｂｐ中に存在する同じ天然の位置的配列中の合成ＳＴ部分に 存在することが更に好ましい。

ＳＴポリペプチドのアミノ末端における好ましい四つの追加的アミノ酸は、ＳＴ 　Ｉａのアミノ酸位置数５５〜５８　（ＳＴ　Ｉｂｐの位置１〜４）に対応し、 ＳＴ　ｌｂｈにおけるこれら四つのアミン末端アミノ酸と同じである。

好ましい実施態様における式■の合成ＳＴのアミノ末端に追加的に存在する４ア ミノ酸ポリペプチド（４−ｍａｒ）は、左から右へかつアミノ末端からカルボキ シ末端の方向に、下記の弐ｍに示される配列を持つ： 六回 ＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒ すなわち、好ましいＳＴポリペプチドは、先に示したＳＴ　Ｉｂｈ又はＳＴ　Ｔ ｂｐ　（ＳＴ　Ｔａ　）の配列に同じ１８残基のＣご列を持つ０通常のＳＴポリ ペプチドはまた、カルボキシ末端にＡｓｎ残基、及びＳＴ　Ｉｂｈのアミノ末端 かる１１の位置にＡｓｎを含むことができる。

逆に、二つの残基がＴｙｒ残基であることができる。そのように定義された四つ の有用な５Ｔ１８残基配列は、前述したように書いて弐■に示される。

弐■ （Ａ）　ＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧｌｕＬｅｕＣｙｓＣｙｓＡｓ ｎＰｒｏＡｌａＣｙｓＡｌａＧＩｙＣｙｓＴｙｒ（Ｂ）　Ａｓｎ丁ｈｒＰｈｅＴ ｙｒＣｙｓＣｙｓＧＩｕＬｅｕＣｙｓＣｙｓＴｙｒＰｒｏＡＩａＣｙｓＡｌａＧ ＩｙＣｙｓＴｙｒ（Ｃ）　ＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧＩｕＬｅｕ ＣｙｓＣｙｓＴｙｒＰｒｏＡＩａＣｙｓＡＩａＧＩｙＣｙｓＡｓｎ（Ｄ）　Ａｓ ｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧＩｕＬｅｕＣｙｓＣｙｓＡｓｎＰｒｏＡｌ ａＣｙｓＡＩａＧｌｙＣｙｓＡｓｎ弐■の四つの配列は、カッコ内の代替残基を 用いて一つの配列として書くことができる。前述のように書いて、代替残基の基 礎としてＳＴ　Ｉｂｈのアミノ酸残基配列を用いて、−緒にしたＳＴポリペプチ ド配列は、下記の式Ｖにより表わされる。

式■ ＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧｌｕＬｅｕＣｙｓＣｙｓＴｙｒ（Ａｓ ｎ）Ｐｒ。

ＡｌａＣｙｓＡＩａＧｌｙＣｙｓＡｓｎ（Ｔｙｒ）ここで、特定のカッコ内アミ ノ酸残基：；！、式に示される直前の残基の各々に対する代替物である。

本明細書で特記なき限り、ＳＴ又はＳＴポリペプチドというときには、代替アミ ノ酸残基を包含するＳＴ関連ポリペプチドアミノ酸残基配列を云う、これは、１ ４残基ポリペプチド、１８残基ポリペプチド及び１５〜１７残基を含むものに対 して妥当する。

左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、弐■ 述した通りである。

このモノマー状の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドは、少くとも一つの分子内、ポリ ペプチド内ジスルフィド結合、より好ましくは二つの分子内、ポリペプチド内ジ スルフィド結合、そして最も好ましくは三つの分子内、ポリペプチド内ジスルフ ィド結合を含む。

このジスルフィド結合は、ａ　４　ｆがゼロの値を持つとき、Ｒ１とのＣｙｓ残 基の対の間に形成されると考えられる。

しかし、Ｒ１とＲ１のＣｙｓ残基、ならびにＲ１とＲ’のこれらは、ｊＡ接の門 り合う対である。従って、一つのジスルフィド結合を含む複合ＬＴ／ＳＴポリペ プチドは、この箪−・のジスルフィド結合がＲ１とＲｓ又はＲ２とＲ５のＣｙｓ 残基の間に形成されているかどうかに拘わりなく、はぼＭ（ＩＩの二次構造及び 免疫原性を持つことができる。類伯の結果は、Ｒ２とＲ６などではなくてＲ１と Ｒ４のＣｙｓ残基の間のジスルフィド形成により形成される二次構造に関係する 。

分子内、ポリペプチド内ジスルフィド結合の酸化的形成に先立って合成される複 合ＬＴ／ＳＴポリペプチドは、少くとも二つのＣｙｓ残基を含む、従ってｇ−１ の少くとも二つの値はゼロであり、イド結合の形成により与えられる二次構造の 類似性の観点で、Ｒ３及びＲｅ　、Ｒ′、０　、　Ｒｅ　、Ｒ１及びＲ１；及び Ｒ９、Ｒ１６及びＲ＋ｚに先行するＣｙｓ残基より成る群から選ばれる。８丁含 有物の３７部分におけるアミノ酸残基位置に関して、合成３７部分における隣り 合わないＣｙｓ残基の対は、５Ｔ１８残基ポリペプチド部分のアミノ末端から、 ５又は６及び９又は１０．５又は６及び１４、及び９又は１０及び１７の位置の これらから成る群から選ばれる。

複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド、及び繰返し単位として複合ＬＴ／ＳＴポリペプチ ドを含むネットワークポリマーは、ＬＴＢ−サブユニット（ならびに全ＬＴ毒素 ）及び生物的天然ＳＴの両者により誘発された血清（抗体）に対する抗原である 。そのような抗原性は、下記の結果の部■で詳しく検討する。

しかし広くは、合成ＳＴ配列ならびにＬＴＢ配列を含む複合ＬＴ／ＳＴポリペプ チドの抗原性のパーセント値は、合成ＳＴをＬ！Ｒする（それに結合する）抗生 物的ＳＴ抗体の量の、同じ抗生物的ＳＴ抗体により認識される生物的ＳＴに比べ ての相対的尺度、及び合成ＬＴＢポリペプチド部分をＬｐ　７６する（それに結 合する）同様に測定された抗ＬＴＢ抗体の量の、同し抗ＬＴＢ抗体によりＬＱ　 ＰされるＬＴＢに比べての相対的尺度である。抗原性の計算は、用いられた抗原 の重量に基づいており、評価される抗原が七ツマー形かポリマー形かに関係しな い。

好ましいＬＴＢポリペプチド、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド、及びＬＴＢポリペ プチド繰返し単位たとえば複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド繰返し単位を含むネット ワークポリマーは、天然ＬＴＢ−サブユニー／　トの抗原性の少（とも５％を示 す、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド、及び複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド繰返し単位 を含むネットワークポリマーはまた好ましくは、天然ＳＴの抗原性の少くとも約 １０％を示す。

適当な抗原性及び免疫性はまた、Ｃｙｓ残基の硫黄原子がシスチンジスルフィド 結合以外の結合部分を含むところの合成ＳＴ含有分子についても見い出された。

この事実の故に、複合ポリペプチドの合成３７部分のための式■及び■の上述の 配列のＣｙｓ残基は、しかし、少くとも一つの分子内、ポリペプチド内シスチン ジスルフィド結合がモノマー状合成ＳＴにおける抗原活性及び生理学的活性（も し望まれるなら）のために必要なので、水素以外のＲ１′″″基の六つの総てが 一つの合成ＳＴポリペプチド中に存在してはならないことに留意せねばならない 、むしろ、せいぜいこれら基の僅か四つが任意の一分子中に存在することができ る。すなわち、たとえば、Ｒ’及びＲ５のＣｙｓ蔑基が組合わさって分子内、ポ リペプチド内シスチンジスルフィド結合を形成している場合、六つのＣｙｓ残基 の間に形成されるシスチン残基の−、二又は三つの分子内ジスルフィド結合の存 在を説明するために、Ｒ５ｌ〜６の各々は、下付き文字のａｘｆをも付された。

各々の下付き文字は、０又はｌの整数を示す。より好ましい態様において、ａが ０のときｅはＯであり、ｂが０のときｄは０であり、Ｃが０のときｆはＯである という条件及び３、ｂ又はＣの少くとも一つは０でな；すればならないという別 の条件、及びジスルフィド結合が、一つのゼロの下付き文字が別の下付き文字が ゼロであることを必要とするところのＣｙｓ残基の各月の間に存在することとい う条件が加えろれる。

合成ＳＴ中に存在するＲ’〜６基の各々は、水素であることができる。その場合 、Ｒ１〜６基が結合されているＣｙｓ残基は、水素がＣｙｓ残基の硫黄原子に結 合される通常の基であるので、置換されていない、システィンの硫黄原子に結合 された水素の存在は、本明細書で表示Ｃｙｓ又はＣｙｓＨにより表わされる。

Ｒ’〜６基はまた、１〜約４個の炭素原子を含むアルキル基であることもできる 。そのようなＲ１−６％の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ −ブチル、第ニブチルなどである。

Ｒ１〜６基はさらに、２〜約４個の炭素原子を含む置換アルキル基であることが でき、ここで置換基としてはヒドロキシ、カルボキシ、及びカルボキサミドが包 含される。そのような置換アルキル基の例は、２−ヒドロキシエチル、２−ヒド ロキシプロピル、カルボキシメチル（−ＣＭ２ＣＯ□Ｈ）、カルボキサミトメチ ル（−Ｃ）１．Ｃ０ＮＩ（Ｚ）、カルボキシエチル（−ＣＨｚＣｔｈＣＯｚＨ） 、及びカルボキサミドエチル（−ＣＨｚＣＨｚＣＯＮＨｚ）である。

Ｒ１−、ｂ７Ｊは、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド分子中に離されて存在すること ができ、又はＲ１″′６基の混合が一つのポリペプチド又はポリペプチド繰返単 位中に存在することができる。七ツマー状ＳＴポリペプチド含有物の下付き文字 ａ　％　ｆの総てがゼロの値を持つとき、Ｒ１〜６基は存在せず、三つの分子内 、ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合が、酸化されたポリペプチド中に存 在する。

に存在せず、ここで、繰返し単位の合成ＳＴポリペプチド含存部分の二つ及び／ 又は三以上の間の分子内、ポリペプチド間シスチンジスルフィド結合が存在する 。繰返し単位部分の合成ＳＴ含有部分内の分子内、ポリペプチド内シスチンジス ルフィド結合はまた、ネットワークポリマー中に存在することもできる。

平均して、ネットワークポリマー中のＳＴポリペプチド繰返し単位は、繰返し単 位当り少くとも約二つのそのようなポリペプチド間シスチン結合を含む。従って 、好ましい態様において、少くともａ　＝　ｆの四つ及びｇ−１の四つがそのよ うなポリペプチド繰返し単位のためにゼロの値を待ち、少く己も四つのＲ１〜６ 基及び形成の故に存在しない。

抗原性及び免疫原性はまた、ジスルフィド結合に含まれないＣｙｓ残基が同し又 は異る代替アミノ酸残基たとえばＳｅｒ残基により置き代えられるとき、ＳＴ　 Ｉｂｈ又はＳＴ　Ｉｂｐポリペプチド部分のアミノ末端から各々、位置５及び１ ０，６及び１４、及び９及び１７に対応するとＲ−とＲ５，Ｒ２とＲ４、又はＲ ３とＲ６に結合されるような、式■及び■で示されているもののようなＣｙｓ残 基対の間の少くとも一つの分子内、ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合を 含む複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを用いて得ることができる。

弐ｎ及び■のＣｙｓ残基に対する好ましい代替アミノ酸残基は、中性側鎖を含む 、すなわち、生理的ｐ）ｌ値の水性溶液に合成ポリペプチドカ９容解されたとき に合成ポリペプチドにイオン電荷を与えない；すなわち、好ましい代替アミノ酸 残基は、複合ＬＴ／ＳＴボ°Ｊペプチドの部分が水性ｉＷＭ中にあるときに、イ オン電荷を有さない。アミノ酸蔑基アラニン（Ａｆｆｉａ）及びセリン（Ｓｅｔ ）は、Ｃｙｓ残基を置き代えるために有用な好ましい代替アミノ酸の例である。

非ジスルフィド結合するＣｙｓ５に対する代替アミノ酸残基は、残基（アミノ末 端の方向へ隣接するＣｙｓ残基）を置き代えることができ、そしてここで下付き 文字ｇ−１は０又は１の値を持つ整数である。好ましい合成ＳＴポリペプチドに おいて、もしａが〇ならｇ及びｋは各々０であり；もしｂが０ならｈ及びｊは各 々０であり；そしてもしＣがＯならｉ及びｌは各々０である。

部分を含む複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドに、及びその配列が弐〜］に示される１ ８アミノ酸残基を含むより好ましい合成ＳＴ含を複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドに 等しくあてはめうる。その開示はまた、そのアミノ酸残基配列がＳＴＯカルボキ シ末端１４残基に対応し、かつさらにそのアミン末端に、示されたようなその天 然に生じる配列中の１４残基ポリペプチドのアミノ末端に結合された弐ｍに示さ れた配列のカルボキシ末端から１．２又は３つの残基を含むところの複合Ｌ　Ｔ ／Ｓ　Ｔポリペプチドにあてはめうる。すなわち、上述の開示はまた、そのアミ ノ酸残基配列が１４カルボキシ末端ＳＴ残基プラス１４残基ＳＴ配列のアミノ末 端に結合された追加的Ｔｙｒ、ＰｈｅＴｙｒ又はＴｈｒＰｈａＴｙｒペプチドに 対応する複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドにもあてはめうる。

本発明の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドは、ＳＴポリペプチドのアミノ末端又はカ ルボキシ末端に結合されたそのＬＴＢポリペプチド部分を持つことができる。

１複合ＬＴ／″ＳＴポリペプチド」という表現は、ＬＴポリペプチド部分に関係 するＬＴポリペプチド部分の再配置を包含することを意味される。

複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの二つのポリペプチド部分は、互に直接にペプチド 結合される。すなわち、一つのポリペプチド部分のカルボキシ末端残基：よ、他 のポリペプチド部分のアミノ末端残基にペプチド結合される。実際、複合ＬＴ／ ＳＴポリペプチドは好ましくは、単一のポリペプチド調製において合成される。

アミノ末端及びカルボキシＬＴＢポリペプチドの両者を含む複合ポリペプチドは 、以下に示される。

他の実施Ｂｅにおいて、ＳＴ及びＬＴＢポリペプチド部分は、複合ポリペプチド 、又はそれが一部分をなす接合体、又は複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドが繰返し単 位であるネットワークポリマーの溶解性を改善するために典型的に加えられる− 又は二つのペプチド結合された追加的アミノ酸残基によりへだてられる。　ＬＴ Ｂ及びＳＴポリペプチド部分をへたてる追加的アミノ酸残基は、ＬＴＢ又はＳＴ 配列中には存在せず、空腸のｐＨ値すなわち約ｐｌ（６，５において複合ＬＴ／ ＳＴポリペプチドにイオン電荷を与える側鎖を持つものである。すなわち、その ようなアミノ酸残基は、酸性又は塩基性側鎖を含み、各々、Ａｓｐ又はＧ１１ｕ 、及びＬｙｓ又はＡｒｇにより例示される。

二つの追加的アミノ酸残基が複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドのＬＴＢ及びＳＴポリ ペプチド部分をへだでるとき、二つの残基が同しである必要はなく、しかしこれ ら残基は、ｐＨ６，５で複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドに同じイオン電荷を与える べきである。すなわち、二つの０７！ｕ残基、二つのＡｓｐ残基、又は一つのＧ ｌｕ残基と一つのＡｓρ残基が一緒に用いられることができる。同様に、二つの Ｌｙｓ残基、二つのＡｒｇ残基、又は一つのＡｒｇ残基と一つのＬｙｓ残基が一 緒に用いられうる。しかし、たとえば一つのＧｌｕと一つのＡｒｇ、又は一つの ＡｓｐとＬｙｓは一緒に用いられない。

（ａｌ担体に結合された場合の接合体としての、（１））遊離の、（ｃｌ又は最 も好ましくはネットワークポリマーの繰返し単位としての複合Ｌ　Ｔ／Ｓ　Ｔポ リペプチドのアミン及び／又はカルボキシ末端はまた、前述したような約四つま での追加的な、イオンを荷を与える（酸性又は塩基性側鎖を備える）アミノ酸残 基を含むことができる。好ましくは、二つのそのような追加的残基が用いられ、 そして再び、これら残基は好ましくは塩基性側鎖すなわちＡｒｇ及びＬｙｓを含 むものである。

本発明の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドは、すなわち、下記の式％式％ 式■ （Ｘ）　、、−（Ａ）、−（Ｚ）、−Ｂ−（Ｚ）、−（Ａ）、＋　（Ｙ）。

ここで、Ｘ、Ｙ及びＺが存在するときは、これらはｆａｌ　Ｌｙｓ及びＡｒｇ残 基より成る群から選ばれる、又は （ｂｌ　Ａｓｐ及びＧｌｕ残基より成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、 ｎ及びｍは、Ｏｌｌ、２．３又は４の整数でありで、ｎとｍの一方の又は両者が ゼロのとき各Ｘ及びＹは存在せず、ｎ及びｍの一方又は両者がゼロでないときに は各Ｘ及びＹ残基は存在し、ポリペプチド当りのＸ及びＹ残基の平均数は各々Ｘ 及びＹの値に等しく　； ｒ及びＳは、０．１又は２の整数であって、ｒ及びＳの一方又は両者がゼロのと き各Ｚは存在せず、ｒ及びＳが存在するとき各Ｚは存在し、複合ＬＴ／ＳＴポリ ペプチド分子又は繰返し単位当りのＺ残基の平均数はｒ又はＳの値に等しく、但 し、ｒ又はＳの一方がゼロより大きいときにはｒ又はＳの他方はゼロであり、そ のｒ又はＳがゼロであるところの各Ｚは存在せず；０及びｐは、Ｏ又は１の整数 であって、０及びｐの一方がゼロであるとき対応するＡは存在せず、但し、０及 びｐの両者が同じ値を持つことはなく； Ａは、大腸菌の熱不安定腸毒素のＢ−サブユニットのアミン末端から駒位置３５ 〜約位置９５のアミノ酸残基配列に配列において対応する約１０〜約３５のアミ ノ酸残基を含むポリペプチドであり、ここで位置数はＨＧ　Ｂ−サブユニットの ２１残基シグナルポリペプチドを含み；そして Ｂは、大腸菌の熱安定腸毒素の少くともカルボキシ末端１４残基に配列において 対応する１８までのアミノ酸残基を含むポリペプチドである。

弐■においてＡが示されるポリペプチド配列は、本明細書で開示されるＬＴＢポ リペプチドのいずれであってもよい、しかし前述したように、好ましいＬＴＢア ミノ酸残基配列は、ＬＴＢ−サブユニットのアミノ末端から駒位置５５〜約位置 ８５に配列において対応する約１５〜約３０残基を含む。最も好ましいＬＴＢ配 列は、ＬＴＢ−サブユニットのアミノ末端から駒位置６０〜約位置８５に配列に おいて対応する約２０〜約２５アミノ酸残基を含む。

例示的ＬＴＢポリペプチドは、後記の結果の部（Ｖｌ）で示され式■においてＢ が示されるポリペプチド配列は、本明細書で開示されるＳＴポリペプチドのいず れであってもよい、好ましくは、前述したように、ＳＴポリペプチド部分は、Ｓ Ｔ　Ｉａゲノムによりコードされる７２残基配列がＳＴ　Ｉｂｐの同じ１８残基 配列で終了するので、ＳＴポリペプチドのカルボキシ末ｆ？４１８残基とも定義 されうる、ＳＴ　Ｉｂｈ又はＳＴ　Ｉｂｐの１８残基配列を含む、また、好まし いＳＴポリペプチド部分は、ゼロであるところの少くともａ　ｘ　ｆの四つ及び ｇ−ｐの四つを含む。最も好ましくは、ＳＴポリペプブチド繰返し単位において Ｃｙｓ残基のほぼ総ては、モノマー状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドにおいて分子 内、ポリペプチド内ジスルフィド結合を形成する又は繰返し単位として複合ＬＴ ／ＳＴポリペプチドを含むネットワークポリマーにおいて分子内、ポリペプチド 間ジスルフィド結合を形成するシスチン残基のような酸化形で存在する。すなわ ち、最も好ましくは、ａ　−ｒ及びｇ−１の総てがゼロである。

モノマー状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドは典型的には、約０．５ミリグラム／ミ リリツトル（ｍｇ／ｍ１）より低い濃度でポリペプチドを含む、還元されたＬＴ ／ＳＴポリペプチド含有酸化媒体の空気酸化により作られる。より好ましくは、 この濃度は約０．１〜約０．２５＋ｏｇ／ｍ　ｆである。より低い濃度が用いら れることができるが、しかし典型的には、多くの目的に有用であるためにはあま りに少しのモノマー状の酸化されたＬＴ／ＳＴポリペプチドしか作らない。モノ マー状ポリペプチドの量の減少は、約０．２５＋ｇ／ｍ１より上の濃度で起る。

環境空気中に存在する酸素が、酸化剤として好ましく用いられる。他の酸化剤た とえば過酸化水素及びフェリシアニドイオンを用いることができるが、好ましい ものではない。

酸化は、Ｔ！離のメルカプタン基がエルマンテスト〔エルマン（εｌｌａｍａｎ ）、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　８２　：　７Ｏ−７７（ １９５９））によりもはや検出されなくなるまで、おだやかな攪拌下に、又は攪 拌なしで行なわれる。この酸化は、典型的には１〜約２４時間にわたって行われ 、そして三つの分子内、ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合が形成される 場合、−ｍに約８時間後に完了する。

二つ又は一つの分子内、ポリペプチド内結合は、典型的には約８時間未満で形成 される。

還元された複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドは、約７．５〜約１０．５のｐＨ値を持 つ酸化媒体中に溶解又は分散される。空気酸化は、約７．０〜約９．５のｐＨで 好ましく行われる。より好ましくは、酸化は約７．５〜約８．０ＯｐＨ値で行わ れる。酸化二よ典型的には、環境室温で行われるが、好ましくは約ｏ℃〜約２５ ℃で行われる。

酸化反応完了後に、酸化された複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドは典型的には、たと えば凍結真空乾燥により集められる。このように集められた乾いた物質は、その まま用いられるが、又はたとえば静止相としてイオン交換樹脂又はゲル除去マト リックスを用いるカラムクロマトグラフィにより精製される。

先の研究は、モノマー状合成ＳＴ中の分子内、ポリペプチド内シスチンジスルフ ィド結合が、アミノ末端から第一と第五、第二と第四、及び第三と第六のＣｙｓ 残基の間に形成されることが見い出されることを示した；これらＣｙｓ残基は、 アミノ末端がらそれぞれ位置６と１０．５（！：１４、及び９　ト１７０）ＳＴ 　Ｉｂｈ（７）残基ニ対基ＳＴポリペプチド中のカルボキン末端からの位置は、 式ｎに示される１４残基ポリペプチド中のカルボキシ末端位置と同様である。

モノマー状合成ＳＴポリペプチドのための分子内、ポリペブチから番号を付けて 、ジスルフィド結合形成の順序は、位置６と１０のＣｙｓ残基、次に位置９と１ ７、続いて５と１４のＣｙｓ残基の間であった。

モ／　？−状合成ＳＴ　Ｉｂｈの一次及び二次構造は、従って、アミノ末端から カルボキシ末端へと下記の通りであった：ここでＣｙｓ残基を結ぶ線は、これら 残基の間に形成された分子内、ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合を示す 。

ＳＴ関連アミノ酸残基配列の同定、本発明のＳＴ含有複合ＬＴ／ＳＴポリペプチ ドと先に作られた非置換ＳＴモノマー状ポリペプチドにより示されるＳＴ抗原性 の１Ｗ（Ｕ性の観点がら、モノマー状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの３７部分の 二次構造は、先に作られたＳＴポリペプチドのそれとほぼ同じであると考えられ る。

従って、三つの分子内、ポリペプチド内シスチン結合を含む例示的複合ＬＴ／Ｓ Ｔポリペプチドは、下記の弐■ａ及び■ｂより示される一次及び二次構造を持つ と考えられる。

弐■ａ ここで、ＬＴＢ−は、ＳＴＩｂｈのアミノ末端に又はＳＴ　Ｉｂｐのカルボキシ 末端にペプチド結合された前述のＬＴＢポリペプチドの任意のものであり、Ｃｙ ｓ残基を結ぶ線は、これらＣｙｓ残基の間に形成された分子内、ポリペプチド内 シスチンジスルフィド結合を示す。

同様に、二つの分子内、ポリペプチド間シスチンジスルフィドつと考えられる。

弐■ Ｔｙｒ（Ａｓｎ）ＰｒｏＡｌａＣｙｓＡＩａＧｌｙＣｙｓＡｓｎ（Ｔｙｒ）Ｓ ここで、ＬＴＢ−１Ｃｙｓ残基を結ぶ線、カッコ付きのＡｓｎ及び一つの分子内 、ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合ヲ含弐Ｘ Ｔｙｒ（Ａｓｎ）ＰｒｏＡＩａＣｙｓＡＩａＧＩｙＣｙｓＡｓｎ（Ｔｙｒ）ここ で、ＬＴＢ−５Ｃｙｓ残基を結ぶ線、カッコ付きのＡｓｎ及びＬＴＢポリペプチ ドは複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドのＳＴ配列部分のカルボキシ末端に結合されう ろこと、及びｐｎ６．ｓで電荷を持つ側鎖を持つ二つまでの追加的残基は複合体 のＬＴＢと３７部分の間にあることができること、及びｐＨ６，５で同しイオン 電荷を与える１〜４つの追加的な酸性又は塩基性側鎖残基が複合体のＬＴＢ及び ３７部分の一方又は双方の末端に結合されることができることに留意すべきであ る。

１１１、ＬＴＢポリペプチド繰返し単位を含むポリマー前述したＬＴＢポリペプ チド繰返し単位を含むポリマーは、本発明の特に好ましい実施態様である。

ポリマーは、類似のモノマー状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド又はＬＴＢポリペプ チドのモノマー形に比べていくつかの利点を持つ、第一に、免疫原として用いら れるとき、ポリマーは担体蛋白質を必要としない、第二に、ポリマーは一般に、 ＳＴが含まれるポリマー状繰返し単位であるときに、天然に生じるＬＴＢ−サブ ユニット又はＳＴ毒素のいずれの生物学的活性をもほとんど示さない。第三に、 ＬＴＢ及びＳＴポリペプチド繰返し単位の両者がポリマー中に存在するととき、 このポリマーの両繰返し単位の免疫原性は、同じ配列の類領のモノマー状物質よ り良く、とくにポリマーの３７部分に関して典型的に改善される。

Ａ、線形ポリマー 線形ポリマーは、ＬＴＢポリペプチド繰返し単位を含む意図されるポリペプチド の一群を包含する。そのような物質は、繰返し単位として、先述したＬＴＢポリ ペプチドの多数を含む、還元された七ツマー形において、各ＬＴＢポリペプチド は、そのアミン末端に結合された追加的Ｃｙｓ残基、及びカルボキシ末端に結合 された追加的Ｃｙｓ残基を含む、そのように構成されたポリペプチドは、ジＣｙ ｓ−ＬＴポリペプチドと呼ばれる。

後記するジＣｙｓ−ＬＴポリペプチドの酸化は、多数のＬＴＢポリペプチド繰返 し単位を含む線形ポリマーを与える。そのようなポリマーの繰返し単位は、ＬＴ Ｂポリマー繰返し単位にペプチド結合された末＠Ｃｙｓ残基の酸化により形成さ れた分子内、ポリペプチド間シスチンジ入ルフィド結合により互に結合される。

重合媒体がジＣｙｓ−ＬＴポリペプチドのみを含むとき、ホモポリマーが得られ る。もし、Ｃｙｓ残基の四つに対する代替物として四つのＳｅｒ残基を含む先述 のＳＴポリペプチドのように、僅か二つのメルカプタン含有Ｃｙｓ’Ａ基を含む 別のポリペプチドが重合媒体中に混入されるなら、コポリマーが得られる。

そのＬＴＢポリペプチド繰返単位がアミノ酸残基配列においてＬＴＢの位置５８ 〜８３に対応したジＣｙｓ−ＬＴポリペプチド（ジＣｙｓ　ＬＴｓ＊−＋＋ｓ　 ）の酸化により作ったポリマーを用いて、予備研究が行われた。これら研究の結 果は、後述するように、同しＬＴＢ配列の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを用いて 得たのと類似の免疫反応性を示した。

Ｂ、ネットワークポリマー 先述のＬＴＢポリペプチド及びＳＴポリペプチド繰返し単位を含むネットワーク ポリマーは、本発明の特に意図される実施態様である。

これらポリマーは、ネットワークポリマーと呼ばれる。なぜなら、このポリマー は、分子内、ポリペプチド内シスチンジスルフィド及びポリペプチド間シスチン ジスルフィド結合の両者を形成しうる、即ち架橋した三次元ネットワークを形成 しうる六つのＣｙｓ残基を好ましくは含むＳＴ含有ポリペプチドの酸化により作 られるので、著しく架橋されるからである。

（１）複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド繰返し単位本発明の一つのネットワークポリ マーは、繰返し単位として、先述の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの多数を含む。

この繰返じ単位は、酸化されたシスチン（Ｃｙｓ）残！４こより与えろれる分子 内、ポリペプチド間シスチンジスルフィド結合により互に結合される。

ネットワークポリマーは、環境空気中の分子酸素により酸化された先述の複合Ｌ Ｔ／ＳＴポリペプチドの還元（システィン含有）形から作られる。複合ＬＴ／Ｓ Ｔポリペプチドは約０．５　ｍｇ／　ｍ　１より高い濃度、より好ましくは約１ 〜約５ｍｇ／ｍ１の？；度又は複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの酸化媒体への溶解 限界までの濃度で酸化される。

やはり、酸化は、おだやかな攪拌下又は攪拌なしで行われ、溶液（酸化媒体）と 酸化剤空気の間の接触は、約１〜約２４時間、より好ましくは約８時間、または 先述したエルマン法で測定してＴ１刈メルカプタンモノマーが存在しな（なるま で続けられる。複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの還元形の濃度を除いて、モノマー 状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを形成するため又は繰返し単位として多数の酸化 された複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを持つネットワークポリマーを形成するため の酸化は、はぼ同じである。

本発明のネットワークポリマーの分子量は、広く変りうる。平均分子量は、約２ ０，０００ダルトン（２０ｋｄ）から百方ダルトン以上にわたる。

＋２１　Ｌ　Ｔ　Ｂポリペプチド及びＳＴポリペプチド繰返し単位本発明のネッ トワークポリマーの別の実施Ｑｐは、先述したような第一のジＣｙｓ−ＬＴ繰返 し単位の多数なちびに先述したような第二のＳＴポリペプチド繰返し単位の多数 （ここでＳＴポリペプチドは式■で示されたようなＳＴの少くとも１４カルボキ シ末端残基を含み、ペプチド結合されたＬＴＢポリペプチドを含まない）を含む 、すなわち、このポリマーは最初に挙げた及び第二のポリマー繰返し単位が、繰 返し単位の各々に存在するＣｙｓ残基の酸化により形成されたところのシスチン ジスルフィド結合により互に結合される。

この二種の繰返し単位は、約ｌＯ：１〜約１：１０のモル比でポリマー中に存在 できる。好ましくは、繰返単位は、約５：１〜約１：５のモル比で存在する。最 も好ましくは、ジＣｙｓ−ＬＴ対ＳＴ繰返し単位のモル比は、約ｌ：ｌ〜約３： １である。なぜなら、ＬＴ、Ｂ−サブユニットの位置５８〜８３に対応するよう な好ましいＬＴＢポリペプチドは、天然のＬＴＢ−サブユニー／　）の約１／２ 〜１／３の免疫原性を持つことが見い出され、一方、ＳＴポリマーは典型的には 天然ＳＴと同等に又はより高く免疫原性であるからである。

ＳＴポリペプチド繰返し単位がＣｙｓメルカプクンに結合されたブチド繰返ル華 位たとえば複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド繰返し単位を含む他のポリマーの調製の ために木明１８書で述べられるように、存在することが好ましい、なぜなら、少 くとも一つの分子内ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合を持つことが好ま しく二つのＣｙｓ残基が線形重合のために必要であるからである。すなわち、二 つのＣｙｓ残基が、ネットワークポリマーの架橋の形成のために利用できる。

これらネットワークコポリマーは、繰返単位の還元形から、ポリマーの！ＩＩ製 について後述の■部の手順に従って作られる。

（３）追加的ＬＴＢポリペプチド含有不フトワークポリマーＬＴＢポリペプチド 含有ポリマーのさらに別の群は、（ｉ）ジＣｙｓ−ＬＴポリペプチド及び（ｉｉ 　）複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドより成る繰返し単位を含むコポリマーである。

これらポリマーは後述の酸化手順に従って、ジＣｙｓ−ＬＴポリペプチド及び複 合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの還元形を含む酸化媒体（溶液又は分散物）と環境中 の分子酸素を接触させることにより作ることができる。そのようなコポリマーの 繰返し単位はまた、還元されたポリペプチド中に存在する酸化されたＣｙｓ５Ｍ ７Ｌのシスチンジスルフィド結合により互に結合される。

これらコポリマーは、ジＣｙｓ−ＬＴポリペプチドにより与えられるＬＴＢポリ ペプチド繰返し単位、及び複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドにより与えられるＬＴ／ ＳＴ繰返し単位を約０．２５：１〜約５：１のモル比で含むことができる。より 好ましくは、用いられるモル比は、上述した順で約１：ｌ〜約２：ｌである。す なわち、そのようなポリマーにおけるＬＴＢポリペプチド含有繰返し華位合計対 ＳＴポリペプチド繰返し単位のモル比は、約１．２５：１〜約６；１、より好ま しくは約２：ｌ〜約３：１である。

二つのＬＴＢポリペプチド含有繰返し単位におけるＬＴＢポリペプチド配列は同 じである必要はない、しかし好ましくは、両者は同しであり、先に述べた特に好 ましいＬＴＢポリペプチド配列に対応する。

■、ＳＴ含有ポリペプチドを酸化するため及びポリマーを調製するための一般的 合成手順 ＳＴポリペプチドたとえば複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを含むモノマー状物質を 作るため、及びＬＴＢポリペプチド繰返し単位を含むポリマーを作るための、後 述の結果及びいくつかの他の測定に基づく一般的合成手順は、下記の通りである 。

（１１還元性のＣｙｓｒＡ基を含む七ツマー状の第一のポリペプチドは、酸化剤 の実質的不存在下で作られる。第一のポリペプチドは、前述した追加的アミノ酸 残基を有する又は存さない、本発明のＬＴＢポリペプチドのアミノ酸残基配列た とえばジＣｙｓ−１−Ｔポリペプチド又は複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを含み、 分子内シスチンジスルフィド結合を実質上台まない。

（２）そのようにして作られた第一のポリペプチドが用意され、ポ／ｍ１未満の 濃度、最も好ましくは約１ｍｇ／ｍ１〜約０．５ｍｇ／ｍｌｌの濃度で；そして モノマー状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを作るために約０．５　ｍｇ／　ｍ　１ 未満、より好ましくは約０．２５〜約０、１　ｍｇ７　ｍ　ｌで水性酸化媒体中 に溶解又は分散される。第一のポリペプチドがその中に溶解される又は分散され る酸化媒体のｐＨ値は、好ましくはアルカリ性であり、約１Ｏ８５未満、より好 ましくは約７．５〜約１０．５である。

（３）第一のポリペプチドを含む酸化媒体は、その後、酸化剤としての空気中分 子酸素と接触させられる。酸化の間の媒体のｐｉ（値は、好ましくは約７．０〜 約９．５、より好ましくは約７．５〜約９、最も好ましくは約７．５〜約８．０ である。媒体は好ましくは、おだやがな攪拌あり又はなしで、環境空気と接触さ せられる。

（４）酸化媒体と空気の間の接触は、存在するＣｙｓ　（ＣｙｓＨ）残基から少 くとも一つの分子内、ポリペプチド内又はポリペプチド間シスチンジスルフィド 結合を形成するために、約１〜約２４時間、より好ましくは約２〜約８時間続け られる。モノマー状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドに関しては、少くとも一つのシ スチンジスルフィド結合が分子内、ポリペプチド内結合であり、一方、ポリマー に関しては少くとも一つのシスチンジスルフィドが分子内、ポリペプチド間結合 である。ポリマーの各ＳＴポリペプチド含を繰返し単位が平均約二つのポリペプ チド内シスチンジスルフィド結合を形成して、二より多い複合ＬＴ／ＳＴポリペ プチド繰返し単位を持つポリマーが形成されることが好ましい。

モノマー状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの好ましい実施態様において、各々ＳＴ 　Ｔｂｈ又はＳＴ　ｉｂｐ分子のアミノ末端から５と１４．６とｌＯｌ及び９と １７の残基の位置に対応する、式■及び■のの間に、ジスルフィド結合が形成さ れる。より好ましい態様において、分子酸素と溶液の間の接触は、二つのジスル フィド結合を好ましくは上述のＣｙｓ残基対の間に形成するため、及びより好ま しくは三つのジスルフィド結合をやはり好ましくは上述のＣｙｓ残基対の間に形 成するために十分な時間、維持される。

酸化は、好ましくは約り℃〜約２５℃で行われる。

（５）酸化反応の完了後に、合成モノマー状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド又はポ リマーは、典型的には、たとえば凍結真空乾燥により集められ、カラムクロマト グラフィにより精製される。

■　免疫化及び抗体 本発明のポリペプチド接合体、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド接合体又はポリマー は、生理学的Ｃ二許容される希釈剤中の有効量のポリペプチド接合体、複合ＬＴ ／ＳＴポリペプチド接合体又はポリマーを有する単位投与量接種物として哺乳動 物宿主に導入されると、ＬＴＢ−サブユニット単独又はＬＴＢ−サブユニットな らびにＳＴポリペプチドに免疫反応する宿主咄乳動物中で抗体の生産を誘発する ことができ、そして好ましくは宿主動物をこれら毒素を分泌する大腸菌によりひ き起されるインビボ感染から保護す華位投与量中のポリペプチド接合体、複合Ｌ Ｔ／ＳＴポリベブチド接合体又はポリマーの「有効量」は、多数の因子に依存す る．これら因子としては、免疫化される動物の体重及び用いられるよう望まれる 接種回数が含まれる．個々の華位投与接種は、典型的には、噛乳動物宿主の体重 １ｋｇ当り約１０μｇ〜約５＋ｅｇのポリペプチド、複合ＬＴ／ＳＴボリペプチ ド又はネットワークポリマーを含む．通常用いられる単位投与量は、宿主体重１ ｋｇ当り約０．５＋ｉｇを含む．抗体の生産及び生育しうるＥＴＥＣに攻撃され たときの保護のためにラビット及びラットにおける接種法及び量は、各々、後に 記載される． ポリマーの繰返し華位でないポリペプチドは、担体に共存結合されたポリペプチ ドハプテンの接合体として投与される．ここで用いられる有用な担体は、プク免 疫グロブリンＧ（ＰＩＧ）、破傷風トキソイド（Ｔ　Ｔ）及びキイホールリンベ ノトヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）である．他の存用な担体としては、ウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ピーナソッ凝集素、オバ ルブミン、クルクビン（ｃｕｒｃｕｂｉｎ）　、ボリＬ−（Ｌｙｓ：Ｇｌｕ）な どが挙げられる。

生理学的に許容できる希釈則は、従来周知である．そのような希釈剤の例は、萎 留水又は脱イオン水、通常の食塩溶液及びリン酸塩で緩衝した食塩（Ｐ　Ｂ　Ｓ ）溶液である．免疫化組成物つまり接種物は、公知法を用いて、経口的に又は静 脈内、皮下又は腹膜内注射などにより宿主中に導入されうる．補荊たとえば完全 フロインドの補則（ＣＦＡ）　、不完全フロインドの補則（ＩＦＡ）、みょうば ん、破傷風トキソイド及び免疫学分野で周知の他のものなどが、生理学的に許容 できる希釈剤の一部として接種物に含められることもできる。促進注射もまた、 宿主の血清において望む抗体力価を得るために、望まれるなら与えることができ る． 正確な投与量は、動物及び用いられるポリペプチド接合体、複合ＬＴ／ＳＴポリ ペプチド又はポリマーに依存し、公知の攻撃法を用いて決定できる． 本明細書で「接種物」という言葉は、何らかの免疫化組成物を意味するものとし て用いられる．従って、この言葉はまた、腸毒素生産性大腸菌株に対するインビ ボ保護を与えるための、ヒト及び噛乳動物で有用なワクチンをも含意する．所与 のワクチンと接種物とは、ヒト以外の補乳動物が関係する場合には同一でありう るが、しかレヒトが意図される宿主であるときには典型的には異る．この異るこ との理由は、ＣＦＡのような補則はヒトでは用いられず、もし何らかの補則がヒ トワクチン中に存在すべきであるなら他の補則を用いなければならないことであ る．「単位投与量」という言葉は、動物のための単位の投与量として適当な物理 的に分割された単位を云い、各華位は、必要な希釈剤又はビヒクルとの関係で望 む治療効果をうるべく計算された所定量の作用物質を含む．本発明の新規な単位 投与単位のための処方は、（ａｌ免疫原の特存の特性及び達成されるべき特定の 治療効果、及び山）動物における治療的使用のためのそのような作用物質を配合 することに固有の技術的制限により指示されかつ直接に依存する． 本発明のポリペプチド、複合ＬＴ／ＳＴボリペプチド又はポリマーに対する抗体 は、ＥＴＥＣ感染を評価する又は処置するために用いうる．この抗体は、そのま まの抗体全体として直接に用いることができ、又はＦａｂ又はＦ（ａｂ’）ｔ部 分（これらの総てが生理学的に活性である）をうるために加工することができる ．「抗体」という言葉は、そのままの抗体全体、又は生理学的に活性でありその 抗原リガンドすなわち完全なＬＴ毒素、その日−サブユニット及び／又は適当で ある天然ＳＴと免疫反応できるすなわち結合できる、抗体のイディオタイプ含有 ボリアミド部分を示す．抗体を作るために、前述の免疫化接種物はたとえば注射 により宿主動物に導入される．この宿主は、抗体が誘発されるに十分な時間、通 常１〜約４ケ月間維持される．誘発された望む抗体は、その後、宿主体液から集 められる．そのように誘発された抗体そのものを直接用いることができ、又はそ れらは周知のようにペプシン又はパパインにより開裂されて、使用されるＦ（ａ ｈ’）ｚ又はＦａｂ部分を提供することができる．作られた抗体はまた、受動的 免疫的予防法のための処置剤として用いることもできる．■．結果 Ａ．ＬＴＢポリペプチドの抗原性 ＬＴＢサブユニットの１２４アミノ酸配列の種々の領域からのアミノ酸の種々の 長さを含む一連のポリベブチドを合成した．Ｂ／Ｂ　ＥＬＩＳＡ（材料及び方法 の部で述べる）により測定して天然のＢ−サブユニットの抗原性の約５％超を持 つ三つの例示的ポリペプチドを第１図に図示的に示す．　ＧＭ＋　／　Ｂ　Ｅ　 Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ（材料及び方法の部で述べる）により測定された値は、各例にお いて、Ｂ／Ｂ　ＥＬＩＳＡにより得た値と極めて類似した．二つのＬＴＢポリペ プチドが、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを形成するために、ＳＴ　’　Ｉｂｈの １８アミノ酸残基配列のアミノ末端から配列的に一緒に合成された．繰返し単位 として複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを持つネットワークポリマーを得るための複 合ＬＴ／ＳＴボリペプチドの酸化は、Ｂ−サブユニットポリペプチド部分の抗原 性を高めた．つまり、ＬＴＢの位置３５〜位置５５に対応する配列のＢ−サブユ ニット抗原性は約４９％に高まり、位置５８〜位置８３に対応する配列のそれは 天然Ｂ−サプユニ−／　｝のそれの約９５％に高まった（第１図）．二つの複合 ＬＴ／ＳＴボリペプチドの配列は、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末 端の方向に、各々式Ｘｌａ及び式Ｘｌｂにより下記に示される：式Ｘｌａ ＡｓｎＴｈｒＧＩｎｌｌｅＴｙｒＴｈｒｌｌｅＡｓｎＡｓｐＬｙｓｌｌｅＬｅｕ ＳｅｒＴｙｒＴｈｒＧｌｕＳｅｒＭｅｔＡ１ａＧＩｙＬｙｓＡｓｎＴｈｒＰｈｅ Ｔ　ｙｒＣｙｓＣｙｓＧ　Ｉ　ｕＬｅｕＣｙｓＣｙｓＴｙｒＰｒｏＡ　ＩａＣｙ ｓ　Ａ　ｌ　ａＧ　ｌｙｃｙｓＡｓ　ｎ式Ｘｌｂ ＭｅｔＶａｌｌｌｅＴｌｅＴｈｒＰｈｅＭｅｔＳｅｒＧｌｙＧｌｕＴｈｒＰｈｅ ＧｌｎＶａｌＧＩｕＶａｌＰｒｏＧｌｙＳｅｒＧ１ｎＨｉｓｌｌｅＡｓｐＳｅｒ Ｇ　ＩｎＬｙｓＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧ　ｌｕＬｅｕｃｙｓｃ ｙｓＴｙｒＰｒｏＡｌａＣｙｓ＾ｌａＧ　ｌｙｃｙｓＡｓｎ式ＸＴｂの複合ＬＴ ／ＳＴボリペプチドが、単独で、接合体として及びネットワークの繰返し単位と して担体に結合されてさらに評価されるために選ばれた． Ｂ．モノマー状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの免疫原性式Ｘｌｂの複合ＬＴ／Ｓ Ｔボリペプチドの免疫原性は初めに、この物質単独又は大分子量抗体（ブタ免疫 グロブリンＧ（ＰＩＧ））マー形について評価された．このポリペプチドは、カ ンプリング剤としてグルグルアルデヒドを用いて、ポリペプチド対１１Ｇ比−２ ，３５：１（重量比）でＰＩＧに接合された。得た接合体は、複合ＬＴ／ＳＴＴ ／ペプチドを５８重量％含んだ、複合ＬＴ／ＳＴＴ／ペプチドの抗原性は、接合 反応により影響されなかった。

従って接合体の１ミリグラム（ｍｇ）は、５８０Ｂ−サブユニット抗原単位（Ａ ｌｌ）を含んだ。

ラットは、天然のＢ−サブユニット又は複合ＬＴ／ＳＴＴ／ペプチドの２００Ａ Ｕによる腹膜内（ＩＰ）第一免疫化を与えられ、次に段階分けしたＡＵ投与量の ２回の経口ＣＰＯ’）促進を受けた。第３図に示すように、接合されたポリペプ チドは、天然Ｂ−サブユニットにより達成されるのと比べて、Ｂ−サブユニット に対する腸ＩｇＡ抗毒素の同じ力価を生じ、僅かにのみ低い程度の、生育しうる ＬＴ°／ＳＴ−株による攻撃に対する保護を与えた。

予期されるために、低分子量の接合されていない複合ＬＴ／ＳＴＴ／ペプチドに よる免疫化は、抗毒素反応を生じる又は保護を与えることに失敗した。接合体に よるこれら有望な結果が、重合された形の複合ＬＴ／ＳＴＴ／ペプチドの製造及 び特性の把握へと導いた。

Ｃ１複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド繰返し単位を含むネットワークポリマーの特性 （１）抗原性　複合ＬＴ／ＳＴＴ／ペプチドの配列式Ｘｌｂに対応する繰返し単 位を持つもう一つのネットワークポリマーの抗原性は、ＧＭ、／Ｂ　ＥＬＩＳＡ で測定して天然Ｂ−サブユニットのそれの５７％、Ｂ／Ｂ　ＥＬＩＳＡで測定し て５４％であった；そのＳＴ抗原性は、ＳＴ／ＳＴ　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ　（材料及 び方法の部で述べる）で測定して、合成ＳＴのそれの４７％であった。

（２）毒性　このネットワークポリマーは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ Ｏ）評価〔グーラント（ＧｕｅｒｒａｎＬ）　ｔ　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍａｕｎ 。

１０　：　３２０−３２７（１９７４））において、この評価法における陰反応 を引き出すために必要なＬＴの最小投与量（２０ナノグラム（ｎｇ）　）の５百 万倍である１００マイクログラム（８ｇ）の最大テスト投与量において陰反応を 示した。このネットワークポリマーは、幼児マウス評価〔ギアネラ（Ｇｉａｎｎ ｅｌｌａ）、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　１４　：　９５−９９．　（１ ９７６）　）において、この評価法における天然又は合成上ツマー状ＳＴの最小 有効投与量５ｎｇの２万倍である１００μｇの最大テスト投与量において陰反応 を示した。

このネットワークポリマーのｌａｇの滴下は、結さくしたラット回腸ループ〔ク リブスティン（Ｋｌｉｐｓｔｅｉｎ）、　Ｉｎｆｅｃｔ、　ｌｍ５ｕｎ、　４０ ：９２４−９２９（１９８３）　）において体液分泌を誘発するのに失敗した。

この値は、ＬＴのＥＤｓ＊（最大分泌を与える投与量の半分）　（１７０ピコグ ラム（ｐｇ）　）の５．９百万倍であり、この評価法におけるＳＴのＥＤ、。投 与量（２０ｇ）の５０万倍である。

（３）免疫原性　ワクチンにおける免疫原としてネットワークポリマーによるラ ットの免疫化の結果は、天然のＢ−サブユニット又は天然のＢ−サブユニットに 化学的に結合された合成ＳＴによる免疫化により達成されるそれと比較された。

これらの結果を第４図に示す。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡ測定法に基づいて、ネットワークポリマー含有ワクチンは、ＳＴ 及びＢ−サブユニットの両者の５００ＡＩＪを含むと考えられた。総てのラブド は、２００ＡＵによるＩＰ第一免疫化を受け、次に段階分けしたＡＵ投与量によ る２回のＰＯ促“進免疫化を受ける。

ネットワークポリマー含有ワクチンの４０００ＳＴＡＵの合計ＰＯ投与量は、化 学的に結合された合成ＳＴ／天然天然チーサブユニット接合体Ｔ　（Ｓ）ＸＢ） における３０００ＳＴＡＵの合計投与量により達成されるのと同じレベルの腸１ ｇＡＳＴ抗毒素力価を生し、かつ生育しうるＬＴ／ＳＴ’による攻撃に対して同 じ程度の保護を与えた。しかしネットワークポリマー含存ワクチンの６０００Ｂ −サブユニットＡυの合計ＰＯ投与量が、天然Ｂ−サブユニットの２００ＯＡＬ ｌと同等の抗毒素反応及びＬＴ”　／ＳＴ−株での攻撃に対する保護を得るため に必要であった。これらのｖＬ察は、ネットワークポリマー免疫原のＳＴポリペ プチド部分の免疫原性は合成ＳＴ単独のそれとほぼ同じであったこと、しかしネ ットワークポリマー免疫原のＬＴＢポリペプチド部分のそれは天然Ｂ−サブユニ ットのそれの１／２〜１／３であったことを示した。

ネットワークポリマー含有ワクチンの免疫原性はまた、専らＰＯルートで各４週 ごとに免疫化されたラットにおいて評価された。

ラットは、腸管外第一免疫化なしで毒素又は架橋されたトキソイドワクチンのよ り多いＰＯ投与量を必要とする点で、ラビットに典型的に異る〔クリブステイン （Ｋｌｉｐｓｔｅｉｎ）とエンゲルト（Ｅｎｇｅｒｔ）、ＴｎｒｅｃＬ、　Ｔｔ ｓｔｓｕ口、　３１　：　２５２−２６０（１９８１）　：において、クリプス テインらｒｎｆｅｃｔ、ｆｍｕｎ、　４０　：　９２４−９２９（１９８３）及 びクリプステインら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　４０　：　８８８−８９３ （１９８３））　−腸１ｇＡ抗毒素力価１２８に上げラットにおいて強い保護を 与えるために必要なこのアプローチによる合計ＰＯ投与量は、４０００Ａｌｌの 合成ＳＴ（天然Ｂ−サブユニットに化学的に架橋された）及び５０００ＡＵのＢ −天然サブユニット、つまりＩＰ／Ｐｏアプローチにより必要とされるものの約 二倍であった。これは、第５図のデータから判る。

この発明、及びネットワークポリマーのＬＴＢポリペプチド部分が天然Ｂ−サブ ユニットのそれの約半分であったという事実に基づいて、ラットはＳＴ及びＢ− サブユニットの１０．０００Ａｌｌを含む合成ワクチンの合計ＰＱ投与量２０■ で免疫化された。これは、合成ＳＴ又は天然Ｂ−サブユニットでの免疫化より得 られるのと同し抗毒素反応及び保護程度を達成した。

ネットワークポリマー免疫原のＬＴＢポリペプチド部分が天然Ｂ−サブユニット より低免疫原性であるという発明は驚ろくべきことである。なぜなら、従来の結 果は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡで測定された抗原性が実験動物における免疫化への反応に より測定される免疫原性と密接に関係することを示したからである〔クリプステ インら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍａｕｎ、　４０　：　９２４−９２９（１９８３） 　；及びクリプステインら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉ＋ａａ＋ｕｎ、　４４　：　２６ ８−２７３（１９８３）　）　、この相違の理由は不確かであるが、しかし、比 較的に低下された免疫原性は免疫原のＬＴＢポリペプチド部分のアミノ酸残基配 列がブタローサブユニットについて述べたものに基づいており（ダラス（Ｄａｌ ｌａｓ）とファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）　、ネイチア（Ｎａｔｕｒｅ）、　２７ ７：４０６−４０７（１９７９））、一方、免疫化されたラットはヒ）ＬＴ生産 大腸菌株により攻撃されたという事実によることが疑われる。

第一に、ブタとヒトのＢ−サブユニットのアミノ酸残基配列は、僅か六つのアミ ノ酸により異っており、位置５８〜位置８３の領域における唯一の違いは、ブタ ローサブユニットにおけるＭｅｔ及びヒトＢ−サブユニ、トにおけるＬｙｓを含 む位置６４にある〔中本ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５２　：　５０６ −５０９（１９８２）　）　、　’Ｊ−二に、ブタ及びヒトＬＴは、同じかつ顕 著に抗原性の決定子を含み〔ホンダ（Ｈｏｎｄａ）ら、Ｔｎｆｅｃｔ、［ｓ＋ｓ ｕｎ、　３４　：　３３７−３４０（１９８１））　、違いはＢ−サブユニット にある〔クレメン゛ン（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ）　、Ｉｎｆｅｃｔ、夏ｍ５ｕｎ。

３８　：　８０６−８０９（１９８２））が、ヒト又はブタの天然Ｂ−サブユニ ットによる免疫化は、対応又は非対応ＬＴ毒素又はこれら毒素を作る生育しうる 株に対する同じ程度の保護を与えたことが報告された〔クリプステインら、Ｔｎ ｆｅｃｔ、ｌ＋ｕａｕｎ、　４０　：　９２４−９２９（１９８３）　；及びク リブステインら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉ＋ｕｓｕｎ、　４３　：　８１１−８１６（ １９８３））　。

観察された相違が他の要因によることが、よりありそうなことである、これら要 因の一つは、合成ワクチンのポリマー形の立体配置でありうるｉ１８アミノ酸残 基ＳＴ分子の立体化学がその免疫原性に深く影響し〔クリプスティンら、Ｉｎｆ ｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　４４　：２６８−２７３（１９８４）　）　、位置５８ 〜位開位置のアミノ酸を含むＢ−サブユニットポリペプチドの免疫原性は、それ が単独であるがＳＴに結合されているか、また免疫原全体がモノマー形がポリマ ー形かにより変化されてきた。

可能性のある第二の要因は、ワクチンの免疫原の最適でない溶解特性である。ネ ットワークポリマーは、ある例における十二指腸、空腸の内容物より少しアルカ リ性である、７．０未満ＯｐＨ値において不溶性になる。

予備研究は、合成ワクチンの免疫原性が、それを、十二指腸のアルカリ性を増す ために重炭酸塩を伴って投与することにより高められうろことを示した。また、 本明細書で述べるように、合成の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドのアミノ酸残基配 列は、腸管において合成免疫原を可溶化することを助けるために、空腸のｐｉ（ 値（約６．５）でイオン電荷を備える、ＬＴＢ又はＳＴポリペプチド配列中には 存在しない酸性又は塩基性側鎖含有残基の付加により変えられうる。

Ｄ、別の抗原性研究 下記の表１のデータは、アミノ末端から駒位置３５〜約位置９５のＬＴＢ蛋白質 配列の部分に対応する（位置数には２１残基シグナルペプチドを含む）合成ポリ ペプチドの抗原性を例示する。

データは、ブタＬＴＢポリペプチドの （ａｌ　単独の場合、又は （１））　ネットワークポリマーの複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド繰返し単位とし ての場合（ポリマー） についてのものである、抗原性は、ＬＴＢポリペプチドのためのＢ／Ｂ及びＣＭ 、／Ｂ　ＥＬＩＳＡ評価法、及び後記の材料及び方法の部で述べるＳＴ／ＳＴ　 ＥＬＩＳＡ評価法を用いて測定された。

表１　抗原性１ 旦工旦抜兇ａ　ＳＴ抗原性 ３７−７５　ポリマー　３１　２２　４８６４−７５　ポリマー　３２　２５　 ４８５８−８３　単独　２１　２７　−− ポリマー３５３−１２６　５３−９８　−−６３−８３　ポリマー　５２　４７ 　５３６９−８３　ポリマー　１３　１２　２８７６−８３　ポリマー　２７　 ２５　３５１：　抗原性は、天然ＬＴＢ−サブユニット又は合成ＳＴ−１ｂｈモ ノマーの活性のパーセントとして表現される。

２：ＬＴＰＢ−サブユニット蛋白質のアミノ末端がらのアミノ酸残基位置、各ポ リペプチドにおけるアミノ酸残基は、第１図又は後述の節！中の表６に示される 配列を参照して決定されうる。

３：　三つのネットワークポリマー調製物についてのＥＬＩＳＡ測定した抗原性 の範囲。

上の結果は、ポリペプチド、及び繰返し単位として複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド を含む種々のぶフトワークポリマーの抗原有効性を示す。

Ｅ　免疫原性／抗原性研究 別の抗原性研究が、担体としての破傷風トキソイド（ＴＴ）及びキイホールリン ペットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）に接合されたＬＴ、Ｂポリペプチドより成る 免疫原に対して生じた抗体についても行われた。ここで、生理学的に許容される 希釈剤中に分散された免疫原性接合体はワクチンとして、宿主動物としてのラビ ットに単位投与量で導入された。

宿主動物は、ＬＴ、Ｂポリペプチドに対する抗体を誘発するのに十分な時間、約 ４〜約５週間、維持された０次の動物は出血され、免疫原性ポリペプチドに対す る抗体含有抗血清が得られた。

各抗血清について、最高結合の１７２の力価が、抗原としてポリペプチド免疫原 又は天然ＬＴＰＢ−サブユニ７）を用いてＥＩＬＩＳＡにより評価された。用い られた手順の詳細は、後の材料及び方法の部に記載される。担体として破傷風ト キソイドを用いたこれら評価の結果は、下記の表２に示される。

表２ ＬＴＰＢポリペプチド／破傷風トキソイド接合体の抗原性３ＬＴ、Ｂ　抗ボリベ ブチド力価３　抗天然ＬＴｋＢ力価４ヱｌム役位１２ ３５−５５　３２０；１２８０　３６０−６４０４３−６３　１２８０　１０よ り小 ４８−５７　１２８０より大　２０ ４８−６３　１２８０より大、６４０　１０より小５４−７２　１２８０より大 　４０；８０−１６０５８−８３　１２８０　；　１２８０より大　３２０；１ ０より小５８−８３’　３２，０００；２０００　６２０−１２８０；８０−１ ６０６１−７７　３２．０００　３２０−６４０６３−９３　１６，０００　； 　３２．０００　８００−１６００７１−８７　３２００−６４００　；　２５ ，０００　１６０−３２０　；　４０−８０７７−９４　１２８０より大　１０ より小；３２０５Ｂ−８３／５Ｔ−１ｂｈ’　１２８０より大？　１２８０　１ ６０　；　６４０−１２８０４８−５７／５Ｔ−１ｂｈ’　１２８０より大；　 １２８０　１０より小表２の結果は、本発明のポリペプチド及び複合ＬＴ／ＳＴ ポリペプチドが免疫原性であり、また抗原性であることを示している。

これらポリペプチドは、それらが天然ＬＴｋＢ−サブユニット蛋白質と免疫反応 する（結合する）抗体の生産を誘発できる点で免疫原性である。これらポリペプ チドは、それらが誘発した抗体と免疫反応する点で抗原性である。

開襟の研究が、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドのための担体としてのＫＬＨを含む 接合体を用い、しかし宿主哺乳動物として一匹だけのラビットを用いて行われた 。その研究結果を、下記の表３に示す。

表３ −ＬＴ、Ｂポリペプチド／ＫＬＨ接合体の抗原性１ＬＴ、Ｂア　抗ポリペプチド 力価３　抗天然ｔ、ＴｈＢ力価４１左筐亘！２ ３５−５５　３２．０００−６４．００００　８０００４　Ｂ　−６３１６，０ ００−３２，０００２０−４０５４−７２８，０００−１６，０００２０−４０ ５８−８３４，０００−８，０００８０５８−８３’　４，０００−８．０００ 　８０６１−７７　１６．０００−３２．０００　４０−８０６３−９３　１６ ．０００−３２，０００　８０−１６０７１−８７　３２．０００−６４，００ ０　８０−１６０？　？　−９４３２，０００−６４，０００４０−８０１〜５ ：表２の脚注１〜５を参照 上の結果から判るように、担体としてのＫＬＨの使用は、ＴＴに比べて、免疫化 ポリペプチドのための誘発された抗体の抗原性を改善し、一方、天然ＬＴ、Ｂ− サブユニットに対する抗体の抗原性を低減する。

表２及び表３の結果は、表１又は第２図の結果と重要に異っていることに留意さ れなければならない６表２及び３の結果は、本発明のポリペプチド接合体及び複 合ＬＴ／ＳＴポリペプチド接合体により誘発された抗体と天然ＬＴ、Ｂ−サブユ ニット蛋白質分子との直接的相互反応を示す０表１及び第２図に示す抗原性は、 天然ＬＴ、Ｂ−サブユニット蛋白質に対して生じた抗体とポリペプチド又は複合 ＬＴ／ＳＴポリペプチドとの免疫反応性を示す。

完全な無欠の蛋白質に対して生じた抗体がしばしば、この蛋白質の抗原的決定子 にアミノ酸残基配列において対応するポリペプチドに結合しないことが知られて いる。たとえば、シンニング（Ｓｈｉｎｎｉｃｋ）ら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、門１ ｃｒｏｂｉｏ１．３７：４２５：４４６（１９８３）参照。

すなわち、Ｇ　Ｍ　＋　／　ＢまたはＢ／Ｂ　ＥＬＩＳＡ研究において結合を示 さないこと又は低い結合力価は、完全な天然ｔ、”ｒｋ１３−サブユニット全体 により誘発された抗体が本発明のポリペプチド又は複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド を認識しないことを単に示しているにすぎない。

免疫化法及びＥＬ　Ｉ　ＳＡ研究の詳細は、材料及び方法の部に示される。

Ｆ、ワクチンの再現性 別の研究が、許容される希釈側に分散された本発明のネットワークポリマーを用 いて作られたワクチンを用いて得られた結果の再現性を評価するために行われた 。用いられたネットワークポリマーは、複合体のＳＴ　Ｉｂｈポリペプチド配列 のＣｙｓ残基により与えられた分子内、ポリペプチド間シスチンジスルフィド結 合により互に結合された多数の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを含むポリマーの二 つの調製物であった。複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドのＬＴポリペプチド部分は、 ＬＴ、Ｂ−サブユニットの位置５８〜８３に配列において対応した。

一つのポリマー状免疫原及びワクチン（以下ではロット００１と云う）の結果を 、後記の０部で延べ、第４及び５図に示す、この物質はまた、第４及び５図でＢ □ＡＧＳＴワクチンと呼ばれる。

このポリマー状免疫原の第二のＦＡ調製物、以下でロット００２と呼ばれる。こ のロフトは、Ｂ／Ｂ及びＧＭ、／Ｂ評価による天然ＬＴＢ抗原性の５３及び５３ ％の抗原性、及びＳ　Ｔ／Ｓ　Ｔ評価によるＳＴ抗原性の４８％を示した。

ロット００１により示された毒性欠除は、先に述べた。ロット００２は、二匹の マウスの各々に１００マイクログラムの投与量での幼児マウス評価において陰反 応を示した。ロット００２は、２匹のラットの各々に、ｉ、ｏｏｏマイクログラ ムの投与量でラットの結さくした回腸ループにおいて体液分泌を誘発するのに失 敗した。従って、両鋼製物は、生物学的活性は実質上示されなかった。

ロット００１及びロフト００２の各々を含んで作られたワクチンが、ラットを免 疫化するために用いられた。免疫化法は、ワクチン中の６００μｇの免疫原の第 一の腸管外注射及び続く二つのロフトの各々の各４ｍｇの２回のＰＯ促進を用い た。

平均腸ｒｇＡを評価したとき、宿主動物の抗毒素力価は、両ワクチンについて、 ＳＴに対して６４、ＬＴＢ−サブユニットに対して１２８であった。このように 免疫化されたラットの、５Ｔ（ＳＴ”　／ＬＴ−）又はＬＴ　（ＳＴ−／ＬＴ” 　）Ｋｎ毒素を生産する生育しうるＥＴＥＣ株による攻撃に対する保護は、下記 の表４に示される。

表４ 腸毒素生産性大腸菌による攻撃 ロフト番号　ＳＴツＬＴ−に対する保護Ｉ　鉦シＣ二且旦工ゑ尿履１００１　８ ４±２　６９±１ ００２　７９±２　７２±３ １：数値は、免疫化されず攻撃された対照ラットに比べての免疫化されたラット における分泌減少のノで一セントである。

表４のデータから判るように、ワクチンは、分泌を低減し、大％Ｉ＆菌の攻撃株 から免疫化宿主動物を保護するにおいて、はとんど同等である。

ネットワークポリマーから作られたワクチンロフト００２は、宿主動物において 何らかの悪い副作用が観察されるかどうか確かめるために、通常用いられるより も高いレベルでも投与された。

ここで、各２００〜２５０ｇ体重の２匹のモルモット及び１２〜１５ｇ体重の２ 匹のマウスの各々に１５ｍｇの腹膜的注射を与えた。

動物の体重及び全般的状況を、７日間にわたって研究した。モルモットは、４０ ．１及び４７．６ｇ体重が増え、一方、マウスは、５．３及び８．８ｇ増えた。

どの動物においても悪い副作用は観察されなかった。

Ｇ　種々のＬＴポリペプチド鎖長による抗原性／免疫原性複合ＬＴ／ＳＴポリペ プチドのＬＴＢポリペプチドの部分のポリペプチド鎖長の影響を評価するために 、担体としての破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合された一連の複合ＬＴ／ＳＴポ リペブチ・ドを用いて、さらに別の研究を行った；　ＬＴＢポリペプチドは、Ｌ ＴＢ−サブユニットの位置５８〜８３の領域からであり、位置数は２１残基シグ ナルペプチド配列を含む、これら研究は、先述のＶＩＥ部及び表２に述べたよう に行われた。結果を、下記の表５に示す。

表５ Ｌ　Ｔｓ＊−ｓｚ　／　Ｓ　Ｔ／　ＴＴ接合体の抗原性１ＬＴ、Ｂアミノ　抗複 合体　抗天然ＬＴＦＢ　抗ＬＴｓｅ−ｓｉ畝亘Ｌ−−力−員二一　−カー囁ａ− 一　−カー債り一５８−８３／ＳＴ　１６，０００−３２．０００　８，０００ −１６．０００５８−８３／ＳＴ’　１２．８００　６０−８０　８，０００− １６．０００６１−８３／ＳＴ　６，４００　８０−１６０　３．２００−６． ４００６３−８３／ＳＴ　６，４００−１２．８００　８０−１６０　３．２０ ０−６．４００６９−８３ノＳＴ　６，４００−１２．８００　６０−８０　、 　４００−８００７３−８３／ＳＴ　６．４００−１２．８００　６０−８０　 ２００−４００５Ｂ−８３’　−−１６，０００−３２，０００ＬＴＢ　１，６ ００−３．２００　６４．０００　６４０−１，２８０１〜４：表２の脚注１〜 ４参照 ５：複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの第二調製物６　：　ＬＴＰ　Ｂの位置５８〜 ８３に対応する遊離ポリペプチドに対する力価 ７：ｓＴポリペプチド部分なしの位１ｔ５８〜８３に対応するＬＴＢポリペプチ ドがＴＴに接合されて用いられた。

８：ＬＴ、Ｂ−サブユニットが全体分子免疫原として用いられた。

上述の結果は、１１〜３６残基を含み、ＬＴポリペプチド部分の位置５８〜８３ に対応するアミノ酸残基配列を持つテストされた複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの 総てが、天然ＬＴｈＢ−サブユニ、トと免疫反応する抗体を生産するにおいて同 様に有効な免疫原であったことを示す。

上述の複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド接合体により誘発された抗体の免疫反応がま た、５ＴＩｂｈ及び５ＴＩｂｐに対して評価された。

複合体のＳＴポリペプチド部分は変らずであったがＬＴポリペプチド部分におけ る約２０〜２５残基を含む複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドにより、改善された力価 がまた観察された。誘発された抗体は、５ＴＩｂｈ及び５ＴＩｂｐの両者と免疫 反応し、５ＴＩｂｈに対する力価はｓ”ｒｔｂｐに対するよりも数倍大きかった 。

Ｈ０追加的ポリペプチド ５ＴＩｂｈのアミノ末端にペプチド結合されたｔ、Ｔｐｓ−サブユニットの位置 ４８〜位置５７　（シグナルペプチドを含め番号をつけて）の残基を含む複合Ｌ Ｔ／ＳＴポリペプチドを作った。（このポリペプチドの位置数字は、もしシグナ ルペプチドアミノ酸残基を含めないなら、位置２７〜位開位置に対応する。）そ してポリペプチドは、二重酸化手順を用いて０．５　Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝 液中のＱ、　ｌ　ａ＋ｇ／　ｍ　１．１．０　ｍｇ／　ｍ　１．及び５．０　Ｂ ／　ｍ　Ｉｌの濃度で、及び０．１　Ｍ酢酸アンモニウム中でｐＨ８で０．１　 ｙａｇ／　ｍ　１及び０、２　Ｂ／　ｍ　１の濃度テ酸化さレタ。

０．１及び０．２　ｍｇ／　ｍ　ｉ　ｔｌｘ度は、主にモノマー状の複合ＬＴ／ ＳＴポリペプチドを含むと考えられる。　１．０　ｍｇ／　ｍ　１での酸化は、 繰返し華位として複合１．、、　Ｔ　／　Ｓ　Ｔポリペプチドを含む主にネット ワークポリマーを与えると考えられる。　５．０　ｍｇ／　ｍ　Ｉｌ　調製物は 、はとんどポリマーのみを含んだ。

材料及び方法の部で述べるｓｒ／ｓ’ｒｉ亨価を用いて評価された抗原性は、（ ａ）重炭酸アンモニウム緩衝液中の０．１　ｍｇ／　ｍ　１酸化で３１．５及び ６８．１％；酢酸アンモニウム緩衝液中で０．１及びＱ、　”ｌ　ｗａｇ　／　 ｍ　１で各々３２．９及び４１．９％；（Ｃ）重炭酸アンモニウム中で１．０　 ＩＲｇ／　ｍ　ｌ　ａ化で１０３．３及び３５０．０　％　ｉ及び（ｄ）重炭酸 アンモニウム中で５．０＋ｇ／ｍ１酸化で９８．４及び２６２．５％の免疫原性 を与えた。パーセント値は、天然５ＴＩｂｐとほぼ同等の抗原性を持つモノマー 状５ＴＩｂｈポリペプチドにより示される抗原性に基づいたものである。

もう一つの複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを用いて、同様の研究を行った。そのポ リペプチドの配列は、５ＴＩｂｈのアミノ末端に直接ペプチド結合されたＬＴｐ Ｂ−サブユニットの位置５８〜８３（シグナルペプチドを含め）に対応した。（ このポリペプチドの配列位置は、シグナルペプチド残基を除いて位置３７〜６２ に対応する。） 前述したような環境空気での酸化は、０．５Ｍ重炭酸アンモニア中で０．１８５ ｍｇ／ｍ　１．０．２５　ｍｇ／　ｍ　ｊ！、０．５０ｍｇ／　ｍ　ｊ！及び０ 、５２３ｖａｇ／ｍ　１で行われた。酸化はまた、Ｏ，ｌ　Ｍ酢酸アンモニウム 中でｐ＋ｓ、ｏで０．２５ｍｇ／ｍ　１及び１．２５ｍｇ／ｍ　ｊ！で行われた 。

上述のようにして測定された抗原性は、各々、２０５．４４６．２０８．２３６ ．４２及び１３％であった。

上の二つの研究の結果は、研究された酸化条件の総ての有用性を示す、これら結 果はまた、酸化緩衝系として酢酸アンモニウムに比べて、重炭酸アンモニウム中 での酸化により、改善された抗原性を持つ物質が得られたことを示す。

５Ｔｌｂｈポリペプチドのカルボキシ末端に直接ペプチド結合されたＬＴｐＢ− サブユニットの位置３５〜５５にアミノ酸残基配列において対応するＬＴＢポリ ペプチドを含む、及び５Ｔｌｂｈポリペプチドのアミノ酸末端にペプチド結合さ れたＬＴｐＢ−サブユニットの位置５８〜８３に配列において対応するＬＴＢポ リペプチドを含みそしてさらにＬＴＢポリペプチドのアミノ末端にペプチド結合 された二つの追加的Ｌｙｓ残基を含む複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドも作られた。

従って、これらポリペプチドの最初に挙げたもの（ＳＴ−−ＬＴｘｓ〜ｓｓ）は 、式■において、 ｎ、ｏ、ｒ、ｓ及びゼロであり； ｐが１であり； Ｂが大腸菌の熱安定腸毒素のカルボキシ末端１８残基に配列において対応する１ ８アミノ酸残基を含むポリペプチド；すなわち５ＴＩｂｈポリペプチドであり； そしてＡが大腸菌の熱不安定腸毒素のＢ−サブユニットのアミノ末端から位置３ ５〜５５のアミノ酸残基配列に配列において対応する２１アミノ酸残基を含むポ リペプチド（シグナルポリペプチドを含め）；すなわちＬＴｐＢ−サブユニット であるところの化合物に一致する。

これらポリペプチドの第二のもの（Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＬＴｓｙ−ｓｓ−５Ｔ）は 、式■において、 ｎは２であり； ｐは１であり： ｒＳｓ、ｏ及びｍはゼロであり； ＸはＬｙｓであり； ｙ及び２は存在せず； Ａは、大腸菌の熱不安定腸毒素のＢ−サブユニ７）のアミノ末端から位置５８〜 位頁位置の配列に配列において対応する２７アミノ酸残基を含むポリペプチドで あり（シグナルペプチドを含め）；そして Ｂは、直上で述べたＳＴポリペプチドであるところの化合物に一致する。

Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＬＴｓｙ−ｅ＊−−５Ｔｍ返し単位の多数を持つネットワーク についての初めの研究は、ＬＴＢ及びＳＴポリペプチドの同じ配列を持ちしかし 追加的Ｌｙｓ残基を持たない複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドから同様に作られたポ リマーに比べて溶解度が改善されたことを示した；二つのポリマーの免疫反応性 は、実質上同じである。

接合体として又はネットワークポリマーの繰返し単位としての特定の結果を本明 細書で述べられるところの残る複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドは、式■において、 ｎ、「、ｓ、ｐ及びｍがゼロであり； ｘ、ｙ、及び２が存在せず； Ｏが１であり； Ａが、大腸菌の熱不安定＋ｉｉ素のＢ−サブユニットのアミノ末端から約位置３ ５〜約位置９５のアミノ酸残基配列に対応する８〜３１アミノ酸残基を含むポリ ペプチドであり、ここで位置数は、２１残基シグナルペプチドを含み：そしてＢ が、上述したような大腸菌の熱安定Ｉｌ！毒素のカルボキシ末端１８残基に配列 において対応する１８アミノ酸残基を含むポリペプチドである ところの化合物に一致する。

１９作られたＬＴＢポリペプチドの配列下記の表６は、ここで述べたＬＴＢ含有 ポリペプチドの配列を与える。各ポリペプチドは、ＬＴ　Ｂ−サブユニットのア ミノ末端から数えた（２１残基シグナルペプチドを含めて）下付き文字の配列位 置を示す略記及びポリペプチド配列がＬＴＢポリペプチドのみに対応するが複合 ＬＴ／ＳＴポリペプチドに対応するかを示す略記により表に示される。アミノ末 端にＬＴＢポリペプチドを持つ複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドは、略記ＬＴ下付文 字−−ＳＴにより示され、一方、アミノ末端にＳＴポリペプチドを持つポリペプ チドは、５Ｔ−−ＬＴ　下付文字　により略記される。

各略記に対応するアミノ酸残基配列は、略記の右側に示され、左から右へかつア ミノ末端からカルボキシ末端の方向に書がれる。

下記の各ＳＴポリペプチド配列は、５ＴＩｂｈのそれである。

表６　作られたＬＴＢポリペプチド ＬＴＢポリペプチド　±ユ丘１±工父剋ＬＴＢ配列位置 Ｌ　Ｔ　Ｂ　３ｓ−ｓｓ　ＡｓｎＴｈｒＧｌｎｌｌｅＴｙｒＴｈｒｌｌｅＡｓｎ ＡｓｐＬｙｓｌｌｅＬｅｕＳｅｒＴｙｒＴｈｒＧｌｕＳｅｒＭｅｔＡＩａＧｌｙ ＬｙｓＬ　Ｔ　Ｂ　ａ　３−　ｈｘ　ＡｓｐＬｙｓｌ　ＩｅＬｅｕＳｅｒＴｙｒ ＴｈｒＧ］ｕＳｅｒＭｅｔＡ！ａＧＩｙＬｙｓＡｒｇＧＩｕＭｅｔＶａｌｌｌｅ ｌｌｅｈｒＰｈｅ Ｌ　Ｔ　Ｂ　、＊−ｓ。

ＴｙｒＴｈｒＧＩｕＳｅｒＭｅｔＡＩａＧＩｙＬｙｓＡｒｇｌｕ Ｌ　Ｔ　Ｂ　、、、、　ＴｙｒＴｈｒＧｌｕＳｅｒＭｅｔＡｌａＧｌｙＬｙｓＡ ｒｇＧｌｕＭｅｔＶａｌｌｌｅｒｌｅＴｈｒＰｈｅＬ　Ｔ　Ｂｓ、−ｔｚ　ＧＩ ｙＬｙｓＡｒｇＧＩｕＭｅｔＶａｌｌｌｅｌｌｅＴｈｒＰｈｅＭｅｔＳｅｒＧｌ ｙＧｌｕＴｈｒＰｈｅＧＩｎＶａｌＧｌｕＬ　Ｔ　Ｂｓ＠−ａｘ　ＭｅｔＶａｌ ｌｌｅｌｌｅＴｈｒＰｈｅＭｅｔＳｅｒＧＩｙＧＩｕＴｈｒＰｈｅＧｌｎＶａｌ ＧｌｕＶａｌＰｒｏＧｌｙＳｅｒＧｌｎＨｉｓｌｌｅＡｓｐＳｅｒＧＩｎＬｙｓ Ｌ　Ｔ　Ｂ　＆＋−？７１１ｅＴｈｒＰｈｅＭｅｔＳｅｒＧｌｙＧＩｕＴｈｒＰ ｈｅＧＩｎＶａｌＧｌｕＶａｌＰｒｏＧｌｙＳｅｒＧＩｎＬ　Ｔ　Ｂ　ｂｙ−ｑ ｓ　ＰｈｅＭｅｔＳｅｒＧｌｙＧｌｕＴｈｒＰｈｅＧｌｎＶａｌＧＩｕＶａｌＰ ｒｏＧＩｙＳｅｒＧＩｎＨｉｓｌｌｅＡｓｐＳｅｒＧＩｎＬｙｓＬｙｓＡＩａｌ ｌｅＧｌｕＡｒｇＭｅｔＬｙｓＡｓｐｈｒＬｅｕ Ｌ　Ｔ　Ｂ　、ｌ−＊、ＶａｌＧＩｕＶａｌＰｒｏＧｌｙＳｅｒＧｌｎＨｉｓｌ ｌｅＡｓｐＳｅｒＧｌｎＬｙｓＬｙｓＡＩａＴＩｅＧｌｕＬ　Ｔ　Ｂ　ｑ７−ｑ ｍ　Ｇ１ｎＨ４５ｌｌｅＡｓｐＳｅｒＧＩｎ１．ｙｓＬｙｓＡｌａｌｌｅＧｌｕ ＡｒｇＭｅｔＬｙｓＡｓｐＴｈｒＬｅｕＡｒｇｄｉｃｙｓ−ＬＴｓｗ−ｅ、　Ｃ ｙｓＭｅｔＶａｌｌｌｅＴＩｅＴｈｒＰｈｅＭｅｔＳｅｒＧ１ｙＧｌｕＴｈｒＰ ｈｅＧＩｎＶａｌＧｌｕＶａｌＰｒｏＧｌｙＳｅｒＧＩｎＨｉｓｌｌｅＡｓｐＳ ｅｒＧ１ｎＬｙｓＣｙｓ複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド Ｌ　Ｔ　Ｂ　５ｓ−ｓｓ　−−ＳＴ　ＡｓｎＴｈｒＧｌｎＴｌｅＴｙｒＴｈｒｒ ｌｅＡｓｎＡｓｐＬｙｓｌｌｅＬｅｕＳｅｒＴｙｒＴｈｒＧｌｕＳｅｒＭｅｔＡ ＩａＧ　ＩｙＬｙｓＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧ　ＩｕＬｅｕＣｙ ｓＣｙｓＴｙｒＰｒｏＡｌａＣｙｓＡｌａＧｌｙＣｙｓＡｓｎＬ　Ｔ　Ｂ　ｆｆ ｆｆ−？５−５Ｔ　ＧＩｎｌｌｅＴｙｒＴｈｒＴｌｅＡｓｎＡｓｐＬｙｓｌｌｅ ＬｅｕＳｅｒＴｙｒ↑ｈｒ［；ＩｕＳｅｒＭｅｔＡＩａＧｌｙＬｙｓＡｒｇＧＩ ｕＭｅｔＶａｌｌ　ｌｅｌｌｅＴｈｒＰｈｅＭｅｔｓｅｒＧＩｙＧｌｕＴｈｒＰ ｈｅＧｌｎＶａｌＧｌｕＶａｌＰｒｏＧｌｙＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣ ｙｓＧ　１ｕＬｅｕｃｙｓｃｙｓＴｙｒＰｒｏＡＩａＣｙｓＡｌａＧｌｙＣｙｓ ＡｓｎＬ　Ｔ　ａｍ−ｓｔ　−−５Ｔ　ＴｙｒＴｈｒＧ１ｕＳｅｒＭｅｔＡｌａ ＧＩｙＬｙｓＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧｌｕＬｅｕＣｙｓＣｙｓ ＴｙｒＰｒｏＡ１ａＣｙｓＡＩａＧＩｙＣｙｓＡｓｎＬＴｓ＊−ｓｚ　−−３Ｔ 　ＭｅｔＶａｌｌｌｅｒｌｅＴｈｒＰｈｅＭｅｔＳｅｒＧＩｙＧｌｕＴｈｒＰｈ ｅＧｌｎＶａｌＧｌｕＶａｌＰｒｏＧＩｙＳｅｒｇｌｎＨｉｓｌ　ＩｅＡｓｐＳ ｅｒＧｌｎＬｙｓＡｓｎＴｈｒＰｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧ　ＩｕＬｅｕＣｙｓ ＣｙｓＴｙｒＰｒｏＡ　ｌ　ａＣｙｓＡＩａＧＩｙＣｙｓＡｓｎ ＬＴＬｙｓｔｙｇｓ＠−ｍｓ−５Ｔ　ＬｙｓＬｙｓＭｅｔＶａｌｌｌｅｌｌｅＴ ｈｒＰｈｅＭｅｔＳｅｒＧＩｙＧｌｕＴｈｒＰｈｅＧｌｎＶａｌＧｌｕＶａｌＰ ｒｏＧｌｙＳｅｒＧＩｎＨｉｓｌｌｅＡｓｐＳｅｒＧＩｎＬｙｓＡｓｎＴｈｒＰ ｈｅＴｙｒＣｙｓＣｙｓＧ　１　ｕＬｅｕＣｙｓＣｙｓＴｙｒＰｒ。

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合成ＳＴは、クリプステインら、ＪＡｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　ｌ　４７　：　 ３１８−３２６　（１９８３）に記載のように接合剤として水溶性のカルボジイ ミドを用いて、天然Ｂ−サブユニットに化学的に架橋された。ワクチンにおいて 用いられた天然及び合成の免疫原の量は、ロウリイ　（Ｌｏｗｒｙ）ら、Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９３　：　２６５　２７５（１９５１）の方法により測 定されるそれらの蛋白質温度に基づく。

Ｂ、ポリペプチドの合成 ポリペプチドは、ダラス及びファルコウ、゛ネイチア、２８８：４９９−５０１ 　（１９８０）に記述されるブタ熱不安定腸毒素Ｂ−サブユニット（ＬＴｐ　Ｂ ）配列中の種々の領域からの種々の長さのアミノ酸残基を含んで作られた。これ らポリペプチドは、単′独に調製されるか、又は複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを 形成するためにＳＴアミノ酸残基配列のアミノ又はカルボキシ末端上に合成され た。

ポリペプチドは、ヒエ−テン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）ら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐ ｔ。

Ｐｒｏｔ、Ｒｅｓ、１６：３１１　３２０　（１９８０）及びメリフィールド（ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、Ｊ、　Ａ＋＊、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、８５　：　２ １４９−２１５４　（１９８３）、により一般的に記載され、ここで述べるよう に変更された固相法により作られた。サム（Ｓａｇ）　ＩＩ自動化ペプチド合成 機（バイオリサーチ社、サンラフアニル、カリフォールニア）又はベックマン（ ［１ｅｃｋａ＋ａｎ）モデル９９０Ｂペプチド合成機（ベックマン　インストル メンツ社、バークレイ、カリフォールニア）が合成のために用いられた。

下記の検討は、そのようなポリペプチドの合成として複合ＬＴ／ＳＴポリペプチ ドの調製に特に関係し、また複合ＬＴ／ＳＴポジＣｙｓ−ポリペプチドも下記の ように作られたが、但し、ブロックされたＣｙｓ残基はポリペプチドの第−及び 最後の残基であった典型的には、フッ化水素で開裂してカルボキシ末端ＳＴアス パラギンを与るためにα−０−ベンジル−ＢＯＣ−アスパラギン酸のような特定 配列の保護されたカルボキシ末端アミノ酸残基がカップリングされるベンズヒド リルアミン樹脂（１グラム当り０．５７ミリ当１：　ｍｅｑ／ｇ）から合成を始 めた。これ及び続くカンブリングは、カンプリングするペプチド結合形成剤とし てジシクロへキシルカルボジイミドを用いて、１０（６モル過剰のアミノ末端ア ミン保護されたアミノａ（Ｎ−ｔ−ブチル−オキシカルボニル；ＢＯＣ）により 行った０両剤の２モル過剰もまた用いられた。

通常用いられるアミノ酸側鎖保護基が用いられたが、下記の通ルオキシカルボニ ル）、スレオニンのためにＯ−ベンジル、グルタミン酸及びアスパラギン酸のた めにベンジルエステル、システィンのためにＳ−メトキシベンジル、ヒスチジン のためにジニトロフェニル、及びアルギニンのためにトシル（もしこれら基が存 在すれば）。

保護されたアスパラギンが存在するカンブリングのために、当モル量のＮ−ヒド ロキシ−ベンゾトリアゾールが反応混合物に加えられ、ジメチルホルムアミド（ ＤＭＦ）が溶媒として加えられた。ギシン（Ｇｉｓｉｎ）、　Ａｎａｌ、　Ｃｈ ｅｗ、＾ｃｔ、５８　：　２９８−２４９（１９７２）のピクリン酸テストによ り、カフプリングは典型的には９９％を越えて完了したことが見い出された。保 護されたアミノ酸は、薄層クロマトグラフィーにより単一のスポットを与えるよ う、使用前に適当な溶媒から再結晶された。ヒスチジン保護基は、ＤＭＦ中で１ ％チオフェノールによる硫黄分解的（ｔｈｉｏｌｙ−ｔｉｃ）開裂による樹脂か らの開裂の前に除去された。アミノ末端ＢＯＣ基もまた、フン化水素開裂段階の 間メチオニンのアセチル化を除くために最終的三フフ化酢酸保護除去段階による 樹脂からの開裂前に除去された。

ブロックされたアミノ酸は、順次的に樹脂にカップリングされた。最後にカップ リングされたアミノ酸のアミノ末端ＢＯＣ基は、望むポリペプチドが樹脂にリン クされ（結合され）で合成されるまで、次のブロックされたポリペプチドの付加 前に除かれた。樹脂に結合したポリペプチドは次に開裂されて、樹脂及びポリペ プチドを与えた。

それらの樹脂からのポリペプチドの開裂及び残る保ｉ［の除去は、ポリペプチド −樹脂〔０，５グラム（ｇ）〕を０．５ミリリットル（ｒｎｌ）のアニソール及 び２０ｍｆｆ１の無水フン化水素で（又はボリペプチドー樹脂をその二倍重量の アニソール及び重量に比例するその体積の４０倍の無水フン化水素で）４℃で１ 時間処理することにより達成された。

初めＮｔ流で、最後に水流減圧でフン化水素を気化させた後に、残虐を無水エー テルで三度抽出してアニソールを除去し、水流減圧下、次に真空下で乾燥した。

真空乾燥した物は、最初に５％酢酸水溶液（各５０ｍ１で三度）で抽出し、次に ５０％酢酸水溶液（５０ｍｊ！で四度）で抽出した。

第一抽出は低分子量ポリペプチド及びチロシンを除去し、これはある調製におい てＣｙｓメルカプタン基を保護するために用いられた。第二抽出は、樹脂から遊 離のポリペプチドを分けた。１０〜２０％酢酸の濃度まで水で希釈した後に、得 た溶液を凍結真空乾燥して、モノマー状の酸化されていない最初のポリペプチド を得た。

この粗ポリペプチドは、その還元状態を保つために３倍モル過剰のジチオスレイ トールと混合され、溶離剤としてのＯ，１モル濃度（Ｍ）の重炭酸アンモニウム （ｐＨ８，０）で５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０ゲル濾過（ファーマシア　ファ イン　ケミカルズ社、ビス力タウエイ、ニューシャーシー）により部分的に精製 された。カラムの空隙体積中の第一分画（−調製物の６３重量％）は凍結真空乾 燥され、又はスルフヒドリル基が存在するときは制御できない酸化を防ぐために 、集めた直後に用いられた。このような物質のアミノ酸組成が測定され、理論値 の±１０％であることが見い出された。

合成ＳＴポリペプチドに結合されない合成ＬＴＢポリペプチドのｙｎｓ物は、典 型的には、上述のゲル濾過精製後に用いられた。

複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドのｉＩｉＩＭ物は、下記のように更に処理された。

一つの調製において、Ｂ−サブユニット残基５８〜８３を含む４４アミノ酸残基 複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド配列は、ＬＴＢ残基８３のカルボキシ末端Ｌｙｓ残 基と合成３７部分の７ミノ末端Ａｓｎ残基の間にペプチド結合によりＳＴ合成の １８アミノ酸残基配列に直接に結合されて作られた。繰返し単位として用いられ るこのモノマー状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドは、０．１　Ｍ重炭酸アンモニア （ｐＨ８，０）の１ｍ１当り典型的には１．０■ｇで存在する還元形ＬＴ／ＳＴ 複合ポリペプチドを含む水性酸化媒体と、環境空気中の分子酸素（０□）を接触 させることにより酸化されて、ポリペプチド間シスチンジスルフィド結合により 互に結合された複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド繰返し単位を持つネットワークポリ マーを形成した。遊離のスルフヒドリル基は、エルマン反応〔エルマン、Ａｒｃ ｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、８２　：　７０−７７　（１９５９ ）　）で測定して無視できる程であった。他のＬＴポリペプチド配列を含むネッ トワークポリマーが、特記なきときは同様にして作られた。

酸化形モノマーを形成するための複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの調製は、他の点 では同様の酸化条件を用いて典型的には０．１〜０゜２５−ｇ　／　ｍ　１！で 行われた。

を用なモノマー状及びネットワークポリマー状複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを形 成するための酸化はまた、０．５Ｍ炭酸アンモニウム及び０．１　Ｍ酢酸アンモ ニウムを用いても行われた。この酸化媒体のｐｏ値はまた、ｐＨ６，０とｐＨ１ ０，０の間で変えられた。

このポリマー状物質の部分的精製は、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐ）１８． ０）で平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０（ファーマシア社）カラムに 通すことにより行われた。空隙物質が集められ、凍結真空乾燥された。　５ｅｐ ｈａｃｒｙｌ　Ｓ　２００　（ファーマシア社）の分級（ｓｉｚｉｎｇ）カラム は、約２２，０００ダルトンの分子量のそのように作られた一つのネットワーク ポリマーの単一ピークを示した。

Ｃ９毒性の評価 ＶＩ　Ｃ（２１で横針したネットワークポリマー免疫原の毒性は（１）ＬＴ活性 のためにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）組織培養評価法〔グエラント（ Ｇｕｅｒｒａｎ　ｔ）ら、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｔ＋ｓｍｕｎ、　１０　：３２０− ３２７　（１９７４）］、（ｉｉｉＳＴ分泌活性のための幼児マウス評価法〔ギ アネラ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍａ＋ｕｎ、１４　：　９５　１９９（１９７６ ））及び（ｉｉｉ　）分泌活性のための結さくしたラット回腸ループ中への滴下 〔クリブスティンら、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　４０　：９２４−９２９ 　（１９８３））によりテストされた。

Ｄ、抗原性の評価 合成ポリペプチドの抗原性は、四相／第二抗体のために、ＧＭ。

ガングリオシド（シグマケミカム社、セントルイス、ミズリー）／抗ＬＴ　Ｂ− サブユニット過免疫抗血清（ＣＭ、／Ｂ）　、又はＢ−サブユニットに対する重 複種（ｄｏｕｂｌｅ　５ｐｅｃｉｅｓ）過免疫抗血清（Ｂ／Ｂ）　、及び合成Ｓ Ｔに対する重複挿過免疫（ＳＴ／ＳＴ）を用いて、先に記載されるように〔クリ ブスティンら、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、Ｉ４７：３１８−３２６　（１９８３）及びクリプスティンら、Ｉｎｆ ｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、４４　：　２６８　２７３　（１９８４）　）、ダブル サンドイッチｔγ素結合免疫吸着体評価法（ＥＬＩＳＡ）により行われた。

簡華に云うと、ＬＴＢ又はＳＴ又はガングリオシドに対して生じた一つの動物種 からの抗体が、固体支持体としてのマイクロ滴定プレートくぼみ上に吸着され、 過剰の結合しなかった物質があれば除去される。適当な抗原（ＬＴポリペプチド 、ＳＴ又はＬＴＢ）が次に固体支持体と混合され、抗体又はガングリオシドと抗 原との間に結合が起るのに十分な時間接触を保ち、何らかの過剰の結ＬＴＢ又は ＳＴに対して生じた第二の動物種（又はＧＭ、／Ｂ評価のための第一の種）から の抗体が、固体支持体と結ｖした抗原と混合された。この混合物を、混合された 抗体が免疫反応するのに十分な時間維持した後、何らかの過剰の、免疫反応しな かった抗体は、すすぎにより除去された。固体支持体と結合した抗原と免疫反応 した最後に加えられた抗体の量が次に測定され、この最後に加えられた抗体の研 究れれるポリペプチドに対する結合と対照抗原たとえば天然ＬＴＢ−サブユニッ トに対する結合とが比較された。

Ｅ、担体としての破傷風トキソイドにカンブリングされたＬＴ及び複合ＬＴ／Ｓ Ｔポリペプチドの接合体複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド調製物が秤量され、等量の 破傷風トキソイド（ＴＴ）と混合された。このポリペプチド及びＴＴは、リン酸 塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７，２）中に溶解され、２−８７ｍ１の担体の最 終濃度まで希釈された。

グルタルアルデヒド架橋剤（ＧＡ）は、２５％貯蔵溶液として初めに作られた。

貯蔵溶液の２００ｕ１．をＰＢＳの１３ｍＡ’と混合して、実用ＧＡ溶液を形成 した。この実用ＧＡ溶液は冷蔵された。この実用溶液を、１ｍｌの担体−ポリペ プチド溶液当り１２４μｌの量で混合した。

実用ＧＡ溶液／担体−ポリペプチド溶液混合物を環境室温で約１８時間撹拌した 。この反応混合物を次に、蒸留水又は脱イオン水に対して６時間透析し、次に凍 結真空乾燥した。

乾いた、凍結真空乾燥された物質は、経験がら担体の９０％回収量を含むと推測 される。このカンブリングされ、架橋されたポリペプチドは、典型的に、全回収 物質の約４０重量％を構成する。

類似のｔｌｉｌ製物は、クリプスティンら、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、１ ４７　：３１８−３２６　（１９８３）に述べられている。

Ｆ、ｌ旦体としてのキイホールリンペットヘモシアニンにカソフ。

リングされたＬＴ及び複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドの接合体 表２のＬＴＢポリペプチドがまた、担合体を形成するために、キイホールリンペ ットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）にカップリングされた。アミノ末端Ｃｙｓ残基 が、その配列がそのような残基を含まないところのポリペプチドに付加された。

ＫＬＨは、１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）に対して透析され、その濃度 は使用前に２０■ｇ　／　ｍ　１に調節された。カップリングされるべきポリペ プチドの溶液は、５＋ｇ／ｍ１の濃度で調製された。５ｍｇのポリペプチドに対 して４ｍｇのＫＬＨのカンブリング濃度が利用された。

上述のＫ　Ｌ　Ｈ溶液の望む体積が選ばれ、そして上述のリン酸塩緩衝液の５５ μｌが４ｍｇのＫＬＨ当り加えられた。ＤＭＦ中に６ｍｇ　／　ｍ　ｊ！　Ｔ： 　７８解されたニーマレイミドベンゾイル　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス テル（ＭＢＳ）を含む溶液が次に、４０：ｌのＭＢＳ　：　ＫＬＨモル比を与え るべ（４＋＋＋ｇのＫＬＨ当り８５μｌの体積で加えられた。得られた反応混合 物は次に、環境室温で３０分間攪拌された。

３０分間たった後に、反応溶液を、約１５ｍ１の床体積を含む５ｅｐｈａｄｅｘ 　Ｇ　−２５（ファーマシ７社）に通した。カラムの調製のために用いられた緩 衝液は、６．０のｐｉ（の５０ｍＭリン酸塩であった・ １ｍｌずつの分画を、ＮｔＳカラムから集めた。各分画は、どの分画に得られた ＭＢＳ活性化ＫＬＨ（ＫＬＩ（ＭＢ）があるかを確かめるために、２８０ｎｍの 波長の光で読まれた。そしてＫＬＨ−ＭＢ含存分百を一緒にした。この手順で、 ＫＬＨ−ＭＢの８０重重景の回収が推定される。

集められ、−諸にされたＫＬＨ−ＭＢ含存溶液は次に、貯蔵溶液として用いられ 、これはポリペプチドの各々にカンブリングするために利用された。上述したポ リペプチド含有溶液（５ｍｇ／ｍｌ）の量は、４ｍｇのＫＬＨ−ＭＢを含む反応 混合物を与えるように、回収されたＫＬＨ−ＭＢ含有溶液の量に加えられた。

反応混合物のｐＨ値は、適当なＮａＯＨ又はＨＣｌにより７．０〜７．５に調節 され、そして環境室温で３時間攪拌された。その後、反応溶液を凍結し、用いる まで凍結貯蔵した。

Ｇ、免疫原及び抗原としてのポリペプチド接合体表２及３の＠Ｑｉ及び結果と関 係して用いられた免疫化及びＥＬＩＳＡ手順は、下記の通りであった。

約０．７５　ｍ　ｊ！の完全フロイントの補液（ＣＦＡ）及び７．２のｐＨ値を 持つリン酸塩緩衝した食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）の０．７５ｍｌ１中の分散された、 上述で作ったＴＴ又はＫＬＨ接合体のｌｌ１ｇを含むワクチンで、ラビットを第 ０日に皮下（ＳＱ）注射した。この動物は、０．７５ｍｊ！の不完全フロイント の補’ｅ＋０．１５ｍ１のＰＢＳ中に含まれる同じ量の接合したポリペプチド又 は複合ＬＴ／ＳＴポリペプチドを含むワクチンの促進皮下注射を第１４日に受け 、次に第２１日に二番目に挙げたワクチンの第二の腹膜内（ＩＰ）促進注射を受 けた。免疫化されたラビットからの血清サンプルを、第−免疫化後第２８及び３ ５日に耳静脈から得た。

二匹のラビットが各ＴＴ接合体について用いられ、一方、−四のラビットが各Ｋ ＬＨ接合体測定のために用いられた。

天然ＬＴｈＢ−サブユニット抗原は、ｐＨ４，０のＴＥＡＮ緩衝液（Ｔｒｉｓ、 　Ｂ　Ｄ　Ｔ八、アジ化ナトリウム、塩化ナトリウム）中に溶解され、１ｍｇ／ ｍｌを含む貯蔵溶液を与えた。この貯蔵溶液は次に、８．０のｐＨ値を持つ炭酸 塩／重炭酸塩緩衝液で希釈されて、ｌＯピコモル１５０μｌの濃度で天然ＬＴｈ Ｂ−サブユニフトを含む第二の貯蔵溶液を与えた。

第二の貯Ｗｉ溶液の５０μｌを、マイクロ滴定プレートの（ぼみに置き、各くぼ み当り１０ピコモルの抗原を与えた０次にプレートを、環境室温で１８時間、湿 潤チャンバー中でインキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）　した。

次にくぼみを、０．０７％のＰｏ１ｙｓｏｒｂａｔｅ　２０　（Ｔ　Ｗ　Ｅ　Ｅ 　Ｎ　（商Ｉｊｔ）２０；ＩＣＩユナイテッド　ステーツ社、ウイルミントン、 プラウエア）を含むｐＢｓｔ８ｉｆｆｌで三度洗い、次に脱イオン水で二度洗っ た。ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）の１ ００μｌを次に各くぼみに加えて、非特異的結合の部位をブロックし、このＢＳ Ａ含有溶液を３７℃で１時間、くぼみの中に維持した（インキュベートした）。

結合されなかったＢＳＡを含む１８液をプレートから振って落した。最初にプレ ートを乾燥せずに、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳの９０μｌをくぼみの最上列の各くぼ みに加え、一方、プレートの残りのくぼみの各々に１％　ＢＳＡ／ＰＢＳの５０ μｋを加えた。その後、抗血清の１０μｌを、くぼみの最上列の各々に加え、そ のようにして作った混合物を混合した。最上列の各くぼみからの抗血清含有溶液 の５０μｌは次に、その下のくぼみの中の１％Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ　Ｂ　Ｓの５０μ ｌを加えられ混合して、二倍希釈物を与えた。同様に連続的二倍希釈が、プレー トの残りのくぼみに対して続けられた。総ての希釈が行われた後に、希釈された 抗血清含有くぼみを、３７℃で１時間インキニーベートした。その後、くぼみの 中の液体を除き、くぼみを上述のようにすすいだ。

ペルオキシダーゼ（ジムド　ラボラトリーズ、バーリンガム、カリフォールニア ）でラベルされたヤギ抗ラビット血清を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１１０００体積 比に希釈した。得た希釈された抗体含有溶液５０μｌを、各くぼみに加えた。そ のように調製したくぼみを、３７℃に１時間維持しくインキュベートシ）、次に 上述のように洗った。オルトフェニレンジアミン（ＯＰ　Ｄ）の溶液が、６ｍｌ の脱イオン水にＯＰ　Ｄ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　（ビッツマン・ムーア社、ワシ ントンクロシング、ニューシャーシー）の−錠を溶解することにより作られ、こ れに３％過酸化水素の一滴も加えられた。得た溶液の１００μｌをマイクロ滴定 プレートの（ぼみの各々に加えた。くぼみにおける発色を環境室温で進展させ、 各くぼみに４ｒ［Ｈの２５μｌを加えることにより、２０分後に停止させた。各 くぼみ中に存在する色の量を、その中の液体の光学密度を４９２ｎｎで測定する ことにより決定した。

プレート上のＬＴＢ抗原の１／２を飽和するのに必要な、ラビット血清中の抗体 量をその後、標準的方法を用いて計算した。

Ｈ０免疫化手順 第３〜５図に示したデータのための免疫化手順は、下記の通りである。スプラグ ーーダウレイ　（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラド（１５０〜１７５ｇ）は 、フロイントの完全補液を用いて第一免疫化を腹膜内（ＩＰ）に与えられ、次に ４日間隔で経口的（ＰＯ）に二回の促進免疫化を与えられた。経口免疫化は、胃 酸分泌を除去するために、シメチジン（ＴＡＧＡＭＥＴ　）　（商標）ニスミス 　クラインアンド　フレンチ　ラボラトリーズ、カロリナ、プエルトリコ）の５ ０５ｇ／ｋｇ体重の投与量での経口投与後２時間後に胃内チューブを経由して与 えられた。

化学的に架橋された５Ｔ−−Ｂ−サブユニット接合体、及び複合Ｌ　Ｔ　／　Ｓ 　Ｔポリペプチド繰返し単位含有ネットワークポリマーの投与量は、ｍｇ当りの 抗原単位（Ａ　Ｕ）で表現される。そのような投与！（ＡＵで）は、ＥＬｒＳＡ によって、天然の毒素に対する接合体の抗原性のパーセント値をめ、この値に１ ０００を掛けることにより導かれた。ＩＡＵは、弱められていない天然毒素の１ μｇに等価の抗原性を持つ。

■、攻Ｖ手順 上述の免疫化ラビットは、最後の促進免疫化の４〜６日後に、先に述べられてい るように〔クレプスティンら、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ。

１４７：３１８−３２６　（１９８３）及びクレプスティンら、Ｉｎｆｅｃｔ、 　ｌ５ｓｕｎ、４０　：　９２４−９２９　（１９８３）　）　、大腸菌ＬＴ− ／ＳＴ”株ＴＸ４５２　（０７８：ＨＩ３）又は大腸菌ＬＴ”／ＳＴ−株ＰＢ２ ５８　（０１５：Ｈ−）の、１ｍ１当り１０’＋７１生育しうる菌を含む肉汁培 養物の０．１　ｍ　ｌを１８時間、ディサル（ｄｉｓａｌ）回腸の一つの１０（ Ｊの結さくしたループ中に滴下することにより攻撃した。各データ点は、４〜６ 匹の免疫化ラットにおいて測定され、報告された結果は、５匹の同様に攻撃され た非免疫化対照における値と比べての、免疫化ラットにおける平均（ＳＥＭ）分 泌減少パーセントの平均上標準誤差として示される。５０％より小さい減少され た分泌は、二つの独立な平均値のためのスチューデントの検定によると、免疫化 動物及び対照動物における値の間の存意な（０，００１より小さいＰ）差を意味 する。

Ｊ、抗毒素反応 ＳＴ及びＢ−サブユニットに対する腸分泌１ｇＡ抗毒素カ価は、先に述べられた ようにダブルサントイフチＥＬＩＳＡにより測定された〔クレプスティンら、Ｊ 、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、１４７　：　３１　Ｂ−３２６（１９８３））、 各群における平均力価の逆数は、データ点の上又は下の数字として第３．４及び ５図に示される。

■０診断評価及び方法 ＬＴＢポリペプチド、複合ＬＴ／ＳＴポリペプチド、及び多数のＬＴＢポリペプ チド繰返し単位を含むポリマー、ならびに上述のＬＴＢポリペプチド、複合ＬＴ ／ＳＴポリペプチド及びポリマーに対して生じた抗体及び抗体結合部位（受容体 ）、及び本発明の方法は、免疫評価（イムノアツセイ）のような診断テストのた めにも有用である。そのような診断法としては、たとえば酵素イムノア７セイ醇 素マルチプルドイムノアツセイ（ＥＭＩＴ）、酵素結合免疫吸着体（ＥＬ　Ｉ　 ＳＡ）　、ラジオイムノアンセイ（Ｒ１＾）。

螢光イムノア７セイ、シングル又はダブル抗体法、又は受容体又は抗原がある検 出しうる目印又は指示手段をラベルされる他の方法が挙げられる。

−ｉ的には、マギオ（Ｍａｇｇｉｏ）　、エンザイム、イムノアツセイ、ＣＲＣ プレス、クリーブランド、オハイオ（１９８１）；ゴールドマン（Ｇａｌｄ鋼ａ ｎ＞、Ｍ、、フルオレセント　アンチボディメソッド、アカデミ、ツクプレス、 ニューヨーク、ニューヨーク（１９８０）を参照されたい、そのような評価法及 び、これら方法を実施するために有用な系の特定の例を、下記に述べる。

体サンプル中の天然しＴ腸毒素又はそのＢ゛−サブユニットの存在を評価する方 法が、ここ全意図される。一般的方法において、評価されるべき体サンプルたと えば便サンプルが用意され、その中に存在するバクテリアが好ましくは培養され る。培養されたバ′クチリアサンプル又は便サンプル自体が、本発明のＬＴＢポ リペプチド含存含量分子えば前述のネットワークポリマーの一つにより誘発され た抗体結合部位を含む受容体分子と混合される。混合物は、受容体が培養物中に 存在する腸毒素と免疫反応するのに十分なＷの時間維持される。この免疫反応の 量が次に、腸毒素分子が被評価体サンプル中に存在するかしないかを決めるため に測定される。

体サンプル中に存在するＬＴＩ！毒素を検出するために有用な、本発明の一面を 具現化するキットの形の例示的診断系は、本発明のポリペプチドにより誘発され た本発明の受容体分子を一つの容器に含む、そのような受容体の例は、抗体、抗 体のほぼ全体、又は生した抗体部分Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）ｚのような抗体結合 部位である。

この系はまた、受容体と抗原の間の免疫反応の存在を知らせるための指示手段を 含む。

典型的な指示手段としては、放射性同位元素たとえば目ｓ１及び１ｆｆｌ　ｌ、 酵素たとえばアルカリホスファターゼ、ホースラディノンユ　ペルオキシダーゼ 、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ、及び螢光染料たとえ ばフルオレセイン及びローダミンが挙げられる。指示手段は、本発明の受容体に 直接に結合されることができる。指示手段はまた、別途の分子たとえば第二抗体 、抗体結合部位又は本発明の受容体と反応する（結合する）黄色ブドウ球菌（５ ，ａｕｒｅｕｓ）蛋白質入に結合されることもできる。別途の分子の指示手段の 特定の例は、＋ｔＪでラベルした黄色ブドウ球菌蛋白質Ａ及びペルオキシダーゼ を結合したヤギ抗ラビット抗体である。

この指示手段は、免疫反応生成物を検出すること可能にし、本発明の受容体に直 接結合されないときには、受容体と別けて包装される。バクテリア培養サンプル と混合されたとき、受容体分子はＬＴ腸毒素と免疫反応して免疫反応物を形成し 、そして存在する指示手段が免疫反応生成物の形成を知らせる。

ＬＴ腸毒素診断法の−Ｂ様は、免疫螢光評価法である。そのような評価法におい て、バクテリア細胞培養物塗抹が、固体支持体としてのきれいな顕微鏡スライド に固定される０本発明に従って、たとえばラビットにおいて生じられた（受容体 ）抗体の一部が、周知法を用いてスライドと接触される。受容体及びバクテリア 細胞は、受容体が免疫反応するのに十分な時間、ＬＴと接触を維持される。

本発明の何らかの免疫反応しなかった受容体をすすいで除いた後に、スライド上 の何らかの非特異的結合部位は典型的に、もし望むなら、ウシ血清アルブミン（ ＢＳＡ）のような蛋白質でブロフクされる。第二の反応剤（増幅剤）、たとえば 補体、又は抗免疫グロブリン抗体たとえばモルモット補体が次に混合され、反応 が起るのに十分な時間、受容体結合細胞と接触を維持される（インキユベートさ れる）ことができる。

この第二インキュベーシッン後に、何らかの未反応の増幅剤をたとえば、評価ス ライド上の最初に挙げた抗体に結合された増幅剤をすすぎ去ることにより除去す る。第三の反応剤（指示手段）、たとえばヤギ抗モルモット補体のような抗体を 次に、スライド及びその結合物質と接触させ、そして反応が起るに十分な時間、 結合された増幅剤と接触を維持する（インキユベートする）、第三の反応剤は、 たとえばフルオレセインインチオシアネー）　（ＦＩＴＣ）、ローダミンＢ　イ ソチオシアネート（ＲＩＴＩ）、テトラメチルローダミン　イソチオシアネート （ＴＲＩＴＣ）　、４．４“−ジイソチオシアノスチルベン−２，２゛−ジスル ホン酸（ＤＩＯＳ）などとの反応により、周知のように螢光染料に結合されてラ ベルされる。

何らかの未反応の第三反応剤を、この第三インキュベーション後にすすぎ、スラ イド上の補体に結合する何らかの螢光ラベルされたヤギ抗モルモット補体抗体を 除く、螢光染料ラベルされた第三反応剤の存在は、螢光顕微鏡を用いて検出され 、それにより、大腸菌のＬＴ生産株による感染の存在を知らせることができる。

この評価はまた、第二及び／又は第三反応剤を用いずに行うこともできる。ここ で、本発明の抗−ＬＴ受容体は、螢光染料に直接結合されることができ、この指 示手段含有受容体は直接用いられる。

上述の評価法を行うのに有用な、好ましくはキットの形の、好ましい診断系は、 別々の包装中に、（ａｌ天然ＬＴエンドトキシンと免疫反応する本発明の受容体 （抗体）　、（ｂｌ受容体と反応する第二の増幅剤、たとえば補体たとえばモル モット補体、抗免疫グロブリン抗体、又は黄色ブドウ球菌蛋白質Ａ、そして（ｃ ｌ　（ｉ　）増幅手段に直接結合、されうる、（１１）増幅剤と反応する抗体又 は抗体部分のような別途の分子の一部でありうる、又は（ｔｉｉ　）抗−ＬＴ受 容体に直接結合されうる指示手段を含み、この場合、キットは唯一の免疫反応性 剤を含むことを必要とする。指示手段は、受容体分子及びＬＴエンドトキシンの 免疫反応を、好ましくは増幅剤の介在を通して、間接的に知らせる。

ここで述べる任意の診断系の受容体分子及び別途の指示手段、ならびに上述の増 幅剤は、液体分散物のような溶液として、又は実質上乾燥した粉末たとえば凍結 真空乾燥した形で用意されることができる。指示手段が増幅剤とは別れた別途の 分子である場合、指示手段は別に包装されることが好ましい、指示手段が酵素で ある場合、酵素の基Ａは系の別れた包装中に用意されることもてきる。前述した 顕微鏡スライドのような固体支持体、−又はそれ以上の緩衝剤及びアセトンは、 本診断評価系において別に包装された要素として含められることもできる。

診断系との関係でここで述べた包装及び容器は、診断系で通常用いられているも のである。そのような包装は、ガラス及びプラスチック（たとえばポリエチレン 、ポリプロピレン及びポリカーボネート）ボトル、小ビン、プラスチック製又は プラスチック箔を積層された包みなどである。

全体の、完全な、生物学的に活性な抗体の使用は、上述した免疫螢光評価法のよ うな多くの診断系では必要がない、むしろ、抗体分子の免疫学的に活性な、イデ ィオタイプを含有する、抗原結合及び認識受容体部位、すなわち抗体結合部位の みを用いることができる。そのような抗体結合部位の例は、当該分野で周知のよ うに、パパイン又はペプシンを用いる蛋白質分解により作られたＦａｂ及びＦ　 （ａｂ’）ｚ抗体部分のような公知のものである。

本発明のもう一つの診断の６４１は、競争評価法でとくに有用であり、この系は 、好ましくはキットの形で、第−反応剤及び第二反応剤を別々の容器に含む、固 体又は液体の形の緩衝剤塩、マイクロ滴定プレート、指示手段基質などがまた、 それら自身の容器に含まれることができる。

第一反応剤は、抗原として本発明の抗原性ＬＴＢポリペプチドたとえば複合ＬＴ ／ＳＴポリペプチド繰返し部位を含むネットワークポリマーを含む、第二反応剤 は、前述したような天然ＬＴＢ−サブユニットと免疫反応する受容体たとえば抗 体を含む、抗原と受容体の間の免疫反応の存在を指示する手段は、さらに抗受容 体、＋ｔＪのような放射性元素、フルオレセインのような螢光染料又はペルオキ シダーゼのような酵素のような目印に結合された受容体により知らされる。指示 手段は、独立した容器中にたとえばペルオキシダーゼを結合されたヤギ抗ラビッ ト抗体中に含められ、その基質（たとえば０−フェニレンジアミン）のために別 の独立した容器を伴い、あるいはたとえば放射性元素が受容体分子に結合される 場合には第二反応剤の一部であることができる。指示手段はまた、別途に供給さ れることができる。

便サンプルのような被評価サンプル又は便サンプルからのバクテリア培養物の所 定量の存在下で第−及び第二反応剤の所定量の混合物は、指示手段でシグナルさ れる免疫反応の景を与える。免疫反応の量は、腸毒素又はそのＢ−サブユニット が被評価サンプル中に存在すると、既知の免疫反応の量と異る。

通常、第一反応剤としてのＬＴＢポリペプチド含有抗原は、固体支持体たとえば マイクロ通定プレート又はニトロセルロース浸漬棒に結合される。固体支持体上 の非特異的結合の部位は、無関係な蛋白質たとえばＢＳＡにより周知法で結合さ れる。

バクテリア培養物及び第二反応剤の所定量は、水性媒体に加え混合される。混合 物を、存在するかも知れないＬＴエンドトキシンと第二反応剤が免疫反応するの に十分な時間、維持する。

その後、固体支持体に結合された第一反応剤、及びバクテリア培養物及び第二反 応剤を含む水性媒体を混合して、固／液相混合物を形成する。この混合物は、液 相中に存在する第二反応剤が固相に結合された第一反応剤と免疫反応するのに十 分な時間、維持される。

固相と液相はその後、分離されて、固相に結合された免疫反応物を与える１次に 、固相に結合された免疫反応物の量を測定し、＋してこの量は、既知量のＬＴＩ 毒素が同じ方法で評価されるときに起る免疫反応の量と比較される。

全部の、完全な、生物学的活性な抗体の使用はやはり、直上で述べた競争評価法 のような多くの診断系において必要でない、むしろ、抗原性ＬＴＢポリペブチＦ ′に結合する抗体分子の生物学的に活性なイディオタイプ含有アミド部分のみが 、前述したように必要でありうる。

以上は、本発明を例示するものであって、制限するものではない、多数の変化及 び変更が、本発明の真の精神及び本発明の新規な概念の範囲を離れることなく行 われることができよう。

浄書（内容に変更なし） ＬＴｈ　−舅−−−ａ　冨３−　−−−・　−・　−−合へ〇−ザブユニットフ ラグ゛メントのａ虎」ｔ分計＃１０殺楊子　（１ル嫁１権Ｘ１０３）手続補正書 （方式） ％式％ ３、補正をする者 事件との関係　出願人 名　称　スクリップス　クリニック　アンド（氏　名）　リサーチ　ファウンデ ーション５、補正命令の日付　昭和６０年１２月２４日国際調査報告 ｍ＋ｅ＋ｗ＋−ａＩ１ｍｌＡ１１４１１１１１１ｍＳ１Ｃ：：ｒ！ＩＪＳＧ＋、 ／ｒ））６”、ｎ

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．大腸菌の熱不安定な腸毒素のＢ−サブユニットのアミノ末端からほぼ位置３ ５〜ほぼ位置９５に配列において対応する約１０〜約３５のアミノ酸残基を含む 合成ポリペプチド（ここで上記の位置数は、該Ｂ−サブユニットの２１の残基の シグナルポリペプチドを含む）。
2. ２．該ポリペプチドが、該Ｂ−サブユニットのほぼ位置５５〜ほぼ位置８５に配 列において対応する約１５〜約３０のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１項記載 の合成ポリペプチド。
3. ３．ポリペプチドが、Ｂ−サブユニットのほぼ位置６０〜ほぼ位置８５に配列に おいて対応する約２０〜約２５のアミノ酸残基を含む請求の範囲第１項記載の合 成ポリペプチド。
4. ４．約２５〜約５５のアミノ酸残基を含む合成の複合ポリペプチドであって、該 複合ポリペプチドがペプチド結合により互に結合された二つのアミノ酸残基配列 を含み、この二つの配列は（ａ）大腸菌の熱安定な腸毒素の少くともカルボキシ 末端１４残基に対応するアミノ酸残基の配列、及び（ｂ）大腸菌の熱不安定な腸 毒素のＢ−サブユニットのアミノ末端から残基位置約３５〜９５に対応するアミ ノ酸残基の配列であり、位置数はＢ−サブユニットの２１残基シグナルポリペプ チドを含むところの複合ポリペプチド。
5. ５．二つの配列が、上記熱安定腸毒素配列のアミノ末端残基と上記熱不安定腸毒 素Ｂ−サブユニット配列のカルボキシ末端残基と間に形成されたペプチド結合に より互に結合される請求の範囲第４項記載の複合ポリペプチド。
6. ６．左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、式 【配列があります】 （ここでカッコ内のアミノ酸残基は各々、式の配列中の直前のアミノ酸残基に対 する代替物である）に対応する請求の範囲第５項記載の複合ポリペプチド。
7. ７．左から右にかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、式 （Ｘ）ｎ−（Ａ）ｏ−（Ｚ）ｒ−（Ｚ）ｓ−（Ａ）ｐ−（Ｙ）ｍ〔ここでＸ、Ｙ 及びＺが存在する場合には、これらは（ａ）Ｌｙｓ及びＡｒｇ残基より成る群か ら選ばれた、又は（ｂ）Ａｓｐ及びＧｌｕ残基より成る群から選ばれた、追加的 アミノ酸残基であり； ｎ及びｍは、０、１、２、３又は４の整数であって、ｎとｍの一方又は両方がゼ ロであるときに各Ｘ及びＹは存在せず、ｎとｍの一方又は両方かゼロでない値を 持つときに各Ｘ及びＹ残基は存在し、ポリペプチド当り存在するＸ及びＹ残基の 平均数はＸ及びＹの各々の値に等しく； ｒ及びｓは、０、１又は２のの整数であって、ｒとｓの一方又は両方がゼロであ るときに各Ｚは存在せず、ｒ及びｓがゼロでないときに各Ｚは存在し、複合ポリ ペプチド分子当りのＺ残基の平均数はｒ及びｓの値等しく、但しｒ又はｓの一方 がゼロより大きいときにｒ及びｓの他方はゼロであり、そのｒ又はｓがゼロであ るところの各Ｚは存在せず；ｏ及びｐは０又は１の整数であって、ｏ及びｐの一 方がゼロの値を持つとき対応するＡは存在せず、但しｏ及びｐが同じ値を持つこ とはなく； Ａは、大腸菌の熱不安定腸毒素のＢ−サブユニットのアミノ末端から約位置３５ 〜約位置９５のアミノ酸残基配列に配列において対応する約１０〜約３５のアミ ノ酸残基を含むポリペプチドであり、ここで位置数はＢ−サブユニットの２１残 基シグナルポリペプチドを含んでおり、そしてＢは、大腸菌の熱安定腸毒素の少 くともカルボキシル末端１４残基に配列において対応する１８までのアミノ酸残 基を含むポリペプチドである。〕 に対応する合成ポリペプチド。
8. ８．ｎが２； ＸがＬｙｓ； ｏが１； ｎ、ｓ、ｐ及びｍがゼロであり； Ａが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、式 【配列があります】 に対応するポリペプチドであり、そしてＢが、左から右へかつアミノ末端からカ ルボキシ末端の方向に書いて、式 【配列があります】 に対応するポリペプチドであり、 ここで、上記ポリペプチドの各々におけるカッコ内のアミノ酸残基は該配列中の 直前のアミノ酸残基に対する代替物であるところの請求の範囲第７項記載のポリ ペプチド。
9. ９．大腸菌の不熱安定腸毒素のＢ−サブユニットのアミノ末端から約位置３５〜 約位置９５のアミノ酸残基配列に配列において対応する約１０〜約３５のアミノ 酸残基を含むポリペプチド繰返し単位の多数を含むポリマー、（但し、ここで位 置数はＢ−サブユニットの２１残基シグナルペプチドを含む）。
10. １０．繰返し単位が、酸化前の繰返し単位ポリペプチドのアミノ末端及びカルボ キシ末端の両所に存在するＣｙｓ残基の酸化により形成されたシスチンジスルフ ィド結合により互に結合される請求の範囲第９項記載のポリマー。
11. １１．ポリマーが線形ホモポリマーである請求の範囲第１０項記載のポリマー。
12. １２．ポリマーが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書い て、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ここでカッコ内のＡｓｎ及びＴｙｒアミノ酸残基は各々、式の配列における直 前のアミノ酸残基に対する代替物であり；ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆ、及びｇ、 ｈ、ｊ、ｊ、ｋ及びｌは各々ゼロ又は１の整数であり、但し、ａ〜ｆ又はｇ〜ｌ のいずれかの値がゼロなら対応するＲａｌ、Ｒｂ２、Ｒｃ３、Ｒｄ４、Ｒｅ５又 はＲｆ６基、又はＲｇ７、Ｒｈ８、Ｒｉ９、Ｒｊ１０、Ｒｋ１１又はＲｌ１２基 は存在せず、Ｒａ〜ｆ１〜６基が存在しないとき不存在のＲａ〜ｆ１〜６基を持 つＣｙｓ残基の硫黄原子はシスチンジスルフィド結合を形成し、一方、もしａ〜 ｆ又はｇ〜ｌのいずれか一つの値が１なら対応するＲａ〜ｆ１〜６又はＲｇ〜ｌ ７〜１２基が存在し；Ｒａ〜ｆ１〜６基の各々は、Ｃｙｓ残基の硫黄原子に結合 された互に同じ又は異る基であり、水素、１〜約４個の炭素原子を含むアルキル 基及び２〜約４個の炭素原子を含む置換アルキル基より成る群から選ばれ； Ｒｇ〜ｌ〜１２は、互に同じ又は異り、式に示される各々直前のＣｙｓ残基に対 する代替アミノ酸残基であり、中性の側鎖を持つアミノ酸残基の群から選ばれ； 少くともａ〜ｆの四つ及びｇ〜ｌの四つはゼロである。〕に対応するポリペプチ ド配列を含む第二のポリペプチド繰返し単位を更に含むランダムネットワークコ ポリマーであり；最初に挙げたポリペプチド配列し単位と、上記のポリペプチド 繰返し単位が１：１０〜１０：１のモル比でコポリマー中に存在し； 最初に挙げたポリペプチド繰返し単位と上記のポリペプチド繰返し単位が、該繰 返し単位の各々に存在するＣｙｓ残基の酸化により形成されたシスチンジスルフ ィド結合により互に結合されているところの請求の範囲第９項記載のポリマー。
13. １３．ポリマーが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書い て、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ここでカッコ内のＡｓｎ及びＴｙｒアミノ酸残基は各々、式の配列における直 前のアミノ酸残基に対する代替物であり；ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆ、及びｇ、 ｈ、ｉ、ｊ、ｋ及びｌは各々ゼロ又は１の整数であり、但し、ａ〜ｆ又はｇ〜ｌ のいずれかの値がゼロなら対応するＲａｌ、Ｒｂ２、Ｒｃ３、Ｒｄ４、Ｒｅ５、 又はＲｆ６基、又はＲｇ７、Ｒｈ８、Ｒｉ９、Ｒｊ１０、Ｒｋ１１又はＲｌ１２ 基は存在せず、Ｒａ〜ｆ１〜６基が存在しないとき不存在のＲａ〜ｆ１〜６基を 持つＣｙｓ残基の硫黄原子はシスチンジスルフィド結合を形成し、一方、もしａ 〜ｆ又はｇ〜ｌのいずれか一つの値が１なら対応するＲａ〜ｆ１〜６又はＲ７〜 １２ｇ〜ｌ基が存在し；Ｒａ〜ｆ１〜６基の各々は、Ｃｙｓ残基の硫黄原子に結 合された互に同じ又は異る基であり、水素、１〜約４個の炭素原子を含むアルキ ル基及び２〜約４個の炭素原子を含む置換アルキル基より成る群から選ばれ； Ｒｇ〜ｌ７〜１２は、互に同じ又は異り、式に示される各々直前のＣｙｓ３残基 に対する代替アミノ酸残基であり、中性の側鎖を持つアミノ最残基の群から選ば れ； 少くともａ〜ｆの四つ及びｇ〜ｌの四つはゼロである。〕に対応する第二のポリ ペプチド繰返し単位を更に含むランダムネットワークコポリマーであり； 最初に挙げたポリペプチド繰返し単位と、上記のポリペプチド繰返し単位が１： １０〜１０：１のモル比でコポリマー中に存在し； 最初に挙げたポリペプチド繰返し単位と上記のポリペプチド繰返し単位が、該繰 返し単位の各々に存在するＣｙｓ残基の酸化により形成されたシスチンジスルフ ィド結合により互に結合されているところの請求の範囲第９項記載のポリマー。
14. １４．ａ〜ｆ及びｇ〜ｌがゼロである請求の範囲第１３項記載のポリマー。
15. １５．ポリマーが多数の繰返し単位を含むネットワークポリマーであり、該繰返 し単位は第二のポリペプチドにペプチド結合された約１０〜約３５アミノ酸残基 ポリペプチド配列を含んで、約２５〜約５５アミノ酸残基を含む複合ポリペプチ ド繰返し単位を形成し、該複合ポリペプチドは、左から右へかつアミノ末端から カルボキシ末端の方向に書いて、式（Ｘ）ｎ−（Ａ）ｏ−（Ｚ）ｒ−（Ｚ）ｓ− （Ａ）ｐ−（Ｙ）ｍ〔ここでＸ、Ｙ及びＺが存在する場合には、これらは（ａ） Ｌｙｓ及びＡｒｇ残基より成る群から選ばれる、又は（ｂ）Ａｓｐ及びＣｌｕ残 基より成る群から選ばれる、アミノ酸残基であり、 ｎ及びｍは、０、１、２、３又は４の整数であって、ｎとｍの一方又は両方がゼ ロであるとき各Ｘ及びＹは存在せず、ｎ及びｍの一方又は両方がゼロでないとき には各Ｘ及びＹ残基は存在し、ポリペプチド当りのＸ及びＹ残基の平均数は各々 Ｘ及びＹの値に等しく； ｒ及びｓは、０、１又は２の整数であって、ｒ及びｓの一方又は両者がゼロのと き各Ｚは存在せず、ｒ及びｓが存在するとき各Ｚは存在し、複合ポリペプチド繰 返し単位当りのＺ残基の平均数はｒ又はｓの値に等しく、但し、ｒ又はｓの一方 がゼロより大きいときにはｒ又はｓの他方はゼロであり、そのｒ又はｓがゼロで あるところの各Ｚは存在せず；ｏ及びｐは０又は１の整数であって、ｏ及びｐの 一方がゼロであるとき対応するＡは存在せず、但し、ｏ及びｐの両者が同じ値を 持つことはなく； Ａは、最初に挙げた約１０〜約３５アミノ酸残基ポリペプチド配列であり；そし て Ｂは、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ここでカッコ内のＡｓｎ及びＴｙｒアミノ酸残基は各々、式の配列における直 前のアミノ酸残基に対する代替物であり；ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆ、及びｇ、 ｈ、ｉ、ｊ、ｋ及びｌは各々ゼロ又は１の整数であり、但し、ａ〜ｆ又はｇ〜ｌ のいずれかの値がゼロなら対応するＲａ１、Ｒｂ２、Ｒｃ３、Ｒｄ４、Ｒｅ５又 はＲｆ６基、又はＲｇ７、Ｒｈ８、Ｒｉ９、Ｒｊ１０、Ｒｋ１１又はＲｌ１２基 は存在せず、Ｒａ〜ｆ１〜６基が存在しないとき不存在のＲａ〜ｆ１〜６基を持 つＣｙｓ残基の硫黄原子はシスチンジスルフィド結合を形成し、一方、もしａ〜 ｆ又はｇ〜ｌのいずれか一つの値が１なら対応するＲａ〜ｆ１〜６又はｇ〜ｌ７ 〜１２基が存在し；Ｒａ〜ｆ１〜６基の各々は、Ｃｙｓ残基の硫黄原子に結合さ れた互に同じ又は異る基であり、水素、１〜約４個の炭素原子を含むアルキル基 及び２〜約４個の炭素原子を含む置換アルキル基より成る群から選ばれ； Ｒｇ〜ｌ７〜１２は、互に同じ又は異り、式に示される各々直前のＣｙｓ残基に 対する代替アミノ酸残基であり、中性の側鎖を持つアミノ酸残基の群から選ばれ ；そして 少くとも３〜ｆの四つ及びｇ〜ｌの四つはゼロである。）に対応するアミノ酸配 列を含む上記の第二のポリペプチドである。〕に対応し、 該複合ポリペプチド繰返し単位は、該繰返し単位中にあるＣｙｓ残基の酸化によ り形成されたシスチンジスルフィド結合により互に結合されているところの請求 の範囲第９項記載のポリマー。
16. １６．複合ポリペプチド繰返し単位が、左から右へかつアミノ末端からカルボキ シ末端の方向に書いて、 （ａ）【配列があります】， （ｂ）【配列があります】， （ｃ）【配列があります】， （ｄ）【配列があります】， （ｅ）【配列があります】， （ｆ）【配列があります】， （ｇ）【配列があります】， （ｈ）【配列があります】， （ｉ）【配列があります】，及び （ｊ）【配列があります】 より成る群から選ばれる請求の範囲第１５項記載のポリマー。
17. １７．多数のポリペプチド繰返し単位を含むネットワークポリマーにおいて、該 繰返し単位が繰返し単位のＣｙｓ残基の間に形成されたポリペプチド間シスチン 結合により結合され、該繰返し単位が、左から右へかつアミノ末端からカルボキ シ末端の方向に書いて、式 【配列があります】 〔ここで、Ｘ及びＹが存在するとき、これらは（ａ）Ｌｙｓ及びＡｒｇ残基より 成る群から選ばれる、又は（ｂ）Ａｓｐ及Ｇｌｕ残基より成る群から選ばれるア ミノ酸残基であり； ｎ及びｍは、０、１、２、３又は４の整数であって、ｎとｍの一方又は両者がゼ ロであるときには各Ｘ及びＹは存在せず、ｎとｍの一方又は両者がゼロでないと きには各Ｘ及びＹは存在し、ポリペプチド繰返し単位当りのＸ及びＹ残基の平均 数は各々Ｘ及びＹの値に等しく；そして カッコ内のアミノ酸残基は各々、式の配列において直前のアミノ酸残基に対する 代替物である。〕 に各々対応するところのネットワークポリマー。
18. １８．ｎが２であり； ＸがＬｙｓであり；そして ｍがゼロである ところの請求の範囲第１７項記載のネットワークポリマー。
19. １９．ｎ及びｍが共にゼロである請求の範囲第１７項記載のネットワークポリマ ー。
20. ２０．大腸菌の熱不安定腸毒素のＢ−サブユニットのアミノ末端から約位置３５ 〜約位置９５に配列において対応する約１０〜約３５アミノ酸残基を含む合成ポ リペプチドの有効量を活性成分として含む接種物において、上記位置数は上記毒 素の２１残基シグナルペプチドを含んでおり、上記ポリペプチドは接合体として 又はポリマーの繰返し単位として担体に結合されており、かつ生理学的に許容で きる希釈剤中に存在し、該接種物は宿主哺乳動物に単位投与量で導入されたとき に上記Ｂ−サブユニットと免疫反応する抗体の生産を誘発できるものであるとこ ろの接種物。
21. ２１．ポリペプチドが接合体として担体に結合されて存在する請求の範囲第２０ 項記載の接種物。
22. ２２．ポリペプチドがポリマー繰返し単位として存在する請求の範囲第２０項記 載の接種物。
23. ２３．上記宿主を大腸菌の熱不安定腸毒素から保護することができる請求の範囲 第２２項記載の接種物。
24. ２４．大腸菌の熱不安定腸毒素のＢ−サブユニットと免疫反応する抗体において 、該抗体は大腸菌の熱不安定腸毒素のＢ−サブユニットのアミノ末端から約位置 ３５〜約位置９５に配列において対応する約１０〜約３５アミノ酸残基を含む合 成ポリペプチドの有効量を宿主哺乳動物に導入することにより誘発されたもので あり、ここで上記位置数は上記毒素の２１残基シグナルペプチドを含んでおり、 上記ポリペプチドは宿主哺乳動物に導入されるとき接合体として担体に接合され て又はポリマーの配列し単位として接種物中に存在するところの抗体。
25. ２５．左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、 （ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】 （ｄ）【配列があります】 （ｅ）【配列があります】 （ｆ）【配列があります】 （ｇ）【配列があります】 （ｈ）【配列があります】 （ｉ）【配列があります】 （ｊ）【配列があります】 （ｋ）【配列があります】 （ｌ）【配列があります】 （ｍ）【配列があります】 （ｎ）【配列があります】 （ｏ）【配列があります】 （ｐ）【配列があります】 （ｑ）【配列があります】 （ｒ）【配列があります】，及び （ｓ）【配列があります】 より成る群から選ばれた上記ポリペプチドに対して誘発された請求の範囲第２４ 項記載の抗体。