JPS61500664A - 大腸菌の熱不安定な腸毒素の一部に対応する合成ポリペプチド、その組成物及びそれによる方法 - Google Patents
大腸菌の熱不安定な腸毒素の一部に対応する合成ポリペプチド、その組成物及びそれによる方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
大腸菌の熱不安定な腸毒素の一部に
対応する合成ポリペプチド、その組
成物及びそれによる方法
説明
関連出願の対照
本出願は、1983年12月12日出願の係属中の出願シリアル■559.46
9の一部継続出願であり、■559.469は、1983年1月3日出願の係属
中の出願シリアル″V1455.265の一部継続出願である。
背景
大腸菌の腸毒素原性株(E、coli又はETEC)による小腸の一時的集落形
成による急性下痢症は、ヒト及び家畜育成のいずれにとっても地球的観点の大き
な健康問題の一つである。これら生物は、ロータウィルス及びカムピロバタクー
ジェジュニ(Campylobacter jejuni: C,jejun
i)と共に・開発途上国に住む幼児及び新生児動物、とくに子羊及び小隊におい
て多い、しばしば致命的なセ、性下痢の主な原因でる。ETEC株はまた、熱帯
に旅行する温暖な地方からの人における急性下痢の通常の原因であり、温暖な又
は熱帯の地域に住む子供及び大人における下痢の散在的又は流行的な発生の原因
となりうる。
ETECによりひき起されるこの病気は、二つの腸毒素(腸管前、エンテロトキ
シン)の一つ又は二つの放出により伝達される。
ヒト又はブタ起源のETEC株により作られた低分子量の熱安定な毒素(ST)
は、最近、精製分離された。STの調製物は、比較的高含量の半シスチンを含み
、グアニル酸環化酵素を刺激することにより分泌をひき起し、大分子量の担体に
結合された毒素で免疫化された動物における抗毒素反応を起すその能力により証
明されるようにハプテン的である。
大分子量の抗原性の熱不安定な毒素(LT)は、均質な程度まで精製分離された
。そのサブユニット構造は、(11全体毒素(完全な毒素)を粘膜表面上の特定
のGM、ガングリオシド受容体に付着させる5つのB−サブユニット、及び(2
)細胞内7デニル酸環化訂素活動を刺激する即ち体液及び電解質分泌を起こさせ
る一つのA−サブユニットとして特徴づけられてきた。
生物的LT、生物的LT B−サブユニット、又は生物的ST毒素のいずれかに
よる免疫化は、実験動物において、免疫化のために用いられた特定の毒素を作る
株の対応(homologous)及び非対応(heterologous)血
清タイプに対して保護する抗毒素反応を誘発する。
すなわち、LT全体毒素又はそのB−サブユニットによる免疫化は、この毒素の
みを作る成育しうる非対応株(LT” /ST−)に対する保護を与える又はS
Tも一緒に作るそれ(LT”/ST”)に対する保護を与えるが、STのみを作
るもの(LT−/ST” )に対して保護を与えない。
同様に、生物的STでの免疫化は、成育しうる非対応ST産出n (+、r−/
ST−及びLT−/sT” )による直接的攻vに対して保護を与えるが、LT
産出株に対して保護を与えない。
しかし、この生物的毒素又はB−サブユニットは、それらの毒性、他の毒素形を
作る・株に対する保護を与えてないこと及びバブテン的な生物的37分子を免疫
原性とするた゛めに用いられてきた大分子量担体が典型的にはi=トでの使用に
不適当であるという事実の観点から、単独で用いられるとき、免疫化のために適
当でない、従って、ETECで誘発される下痢の防止の最も実際的なアプローチ
は、LT及び5TII!毒素の一方又は双方を作る非対応ETEC血清タイプに
対する保護を与え、不適切な担体分子を用いないところの免疫プログラムであろ
う。
クリプスタイン(Xl’+pstein)の米国特許第4,411,880号及
びクリプスタイン等のJ、Infec、Dis、 147: 318−326(
1983)は、なかんずく、カルボジイミド反応によって天然又は合成のST毒
素をL”l素の生物的B−サブユニット(LTB)に接合することにより作られ
たワクチンの開発を報告する。この反応の結果、合成STは、大分子量LTB担
体に結合されたとき免疫原性を獲得し、LTBはその免疫原性の殆んどを維持し
、一方、架橋された物質の両者は、それらの毒性(分泌誘発性)の殆んどを失う
。そのようにして作られたワクチンで免疫化されたラットは、LT又は生物的S
Tによる攻撃に対して、ならびにこれら毒素を作る生育しうるETEC株による
攻撃に対して強く保護されたと報告されている。
このワクチンのために用いられたL T B 調製物は、組換え法で得られた。
この調製法は、有用な結果を生むが、比較的高価である。なぜなら、得られた絹
換えLTBは、STと組合せて有用なワクチン接種剤へと調合される前に毒性物
質を除去するために高変に精製されなければならないからである。組換えLTB
はまた、可溶性カルボジイミド、グルタルアルデヒド又はジメチルスベリミデー
トのような共有結合剤によりSTに結合(カップル)され゛ なければならず、
これら剤はヒトで用いられる最PEN製物では許容されない、最後に、LTBの
サイズが、LT/ST免疫原処方の調製において過剰のSTの使用を必要とし、
これが従ってコストを増加させる。
リチャードA、レーナー(Richard A、Lerner)及び共同研究者
達は、そのアミノ酸残基配列が蛋白質の一部のそれに対応するところの合成ポリ
ペプチドが、完全な蛋白質をL2諏する抗体を誘発するために用いられることを
示した。総説として、スッチクリフ(Sutcliffe)ら、サイエンス(S
cience) 219: 660−666 (1984)を参照されたい、レ
ーナーらの初期の研究に続く設計された合成ポリペプチドは、前記の合成57分
子の調製のために成功裡に用いられた。
ヒト及びブタに感染する(各々LTh及びL TP ) E、coliからのL
TB蛋白質をコードするヌクレオチド配列が決定されている。
ヌクレオチド配列のアミノ酸配列への翻訳は、その最大の形が124のアミノ酸
残基を含みうる蛋白質をもたらす、ダラス(Dallas)及びファルコウ(F
alkow) 、ネイチア(Nature) 288:499−501(198
0) 、及び白木ら、ジャーナル オブ バクテリオロジイ(J、 Bacte
riol、) 155: 728−733 (1983)参照。
124の残基の蛋白質は、ときにシグナルペプチドと呼ばれるところのものの中
のアミノ末端に21のアミノ酸残基を含む0文献に報告されたLTBのアミノ酸
残基位置数は、報告される研究の著者がその位置ナンバリング法において21の
残基のシグナルペプチドを含むか除くかに依存して、位置が21だけ異る。
本発明の概要
本発明は、いくつかの局面を持つ、いくつかの局面は、大腸菌の熱不安定な腸毒
素のB−サブユニット(LTB)のアミン末端からほぼ位置35〜はぼ位置95
のアミノ酸残基配列に配列において対応する約lO〜約35のアミノ酸残基を含
む合成ポリペプチドを意図する;位置数は、B−サブユニットの21の残基のシ
グナルポリペプチドを含む、特に好ましい態様において、合成ポリペプチドは、
配列においてB−サブユニットのアミノ末端からほぼ位置55〜はぼ位置85に
対応する約15〜約30の残基を含む、ここで再び位置数は、21の残基のシグ
ナルポリペプチドを含む、最も好ましくは、この合成ポリペプチドは、配列にお
いて、熱不安定な腸毒素のB−サブユニットの7ミノ末端からほぼ位置60〜は
ぼ位置85に対応する約20〜約25のアミノ酸残基を含む、ここで再び位置数
は、このサブユニー/ )の21の残基のシグナルポリペプチドを含む。
本発明の別の局面は、互にペプチド結合された二つのアミノ酸残基配列を含む約
25〜約55のアミノ酸残基を含む複合LT/STポリペプチドを意図する。こ
れらアミノ酸残基配列の一つは、配列において、大腸菌の熱安定な腸毒素(ST
)の少くともカルボキシ末端14残基に対応し、一方、第二の配列は、大腸菌の
熱安定なN&毒素(LTB)のB−サブユニットのアミノ末端から位置約35〜
約95に対応する。ここで後者の位置数はB−サブユニットの21残基シグナル
ポリペプチドを含む。
好ましい態様において、このポリペプチドの初めに挙げたアミノ酸残基配列部分
は、大!!閏の熱安定な腸毒素の18残基配列、及び大l!苗の熱不安定な腸毒
素のB−サブユニットの一部に対応する前述のより好ましい配列を含む。
最も好ましくは、意図されるポリペプチドは、熱安定な腸毒素の18残基配列、
及び大腸菌の熱不安定な腸毒素のB−サブユニットの一部に対応する前記の約2
0〜約25残基配列を含む、複合LT/STポリペプチドを構成する二つの配列
は好ましくは、一つの配列のカルボキシ末端残基と他の配列のアミノ末端残基の
間のペプチド結合により互に結合される。
本明細書で複合LT/STポリペプチドと呼ぶ上述のポリペプチドはまた、−又
は両末端に結合された1〜約4の追加的なアミノ酸残基、ならびにこの複合体を
構成する二つのポリペプチド配列の間の1〜約2の追加的アミノ酸残基を含むこ
とができる。これら追加的残基の各々は、空腸のpH(約pH6,5)において
イオンTL荷を持つことのできる酸性又は塩基性@鎖を持つ。
これら追加的残基が一つより多(存在する場合、追加的アミノ酸残基の側鎖の各
々は空腸pH(Uで同じイオン電荷を持つことができる。末端の一方又は両者に
及び構成要素ポリペプチドの間に結合されることができる好ましい追加的アミノ
酸残基は、リジン(Lys)及びアルギニン(Arg)残基より成る群から選ば
れ、又はアスパラギン酸(Asp)及びグルタミン酸(G 1 u)残基より成
る群かみ選ばれる。
本発明のこの態様の複合LT/STポリペプチドはまた、左から右にかつアミノ
末端からカルボキシ末端の方向に、下記式に対応する化合物として表わすことが
できる:(X)a−(A)O−(Z)、−B−(Z)s−(A)、−(Y)、こ
こでX、Y及びZが存在する場合には、これらは+at Lys及びArg残基
より成る群から選ばれた、又は(bi Asp及びG1u残基より成る群から選
ばれた、配列に対する追加的アミノ酸残基であり;n及びmは、0.1.2.3
又は4の整数であって、nとmの一方又は両方がゼロであるときにX及びYの各
々は存在せず、nとmの一方又は両方がゼロでない値を持つときに各X及びY残
基は存在し、ポリペプチド当り存在するX及びY残基の平均数はX及びYの各々
の値に等しく;
「及びSは、0.1又は2の整数であって、rとSの一方又は両方がゼロである
ときに各Zは存在せず、「及びSが存在するときに各Zは存在し、複合LT/S
Tポリペプチド分子又は繰返し単位当りの2残基の平均数はr又はSの値に等し
く、但しr又はSの一方がゼロより大きいときにr及びSの他方はゼロであり、
そのr又はSがゼロである各Zは存在せず;0及びpは0又は1の整数であって
、0及びpの一方がゼロの値を持つとき対応するAは存在せず、但し。及びpが
同し値を持つことはなく;
Aは、大腸菌の熱不安定腸毒素のB−サブユニットのアミノ末端から駒位置35
〜約位置95のアミノ酸残基配列に配列において対応する約lθ〜約35のアミ
ノ酸残基を含むポリペプチドであり、ここで位置数はB−サブユニットの21残
基シグナルポリペプチドを含んでおり、そして
Bは、大腸菌の熱安定腸毒素の少くともカルボキシル末端14残基に配列におい
て対応する18までのアミノ酸残基を含むポリペプチドである。
本発明においてまた、大腸菌の熱安定腸毒素のB−サブユニットのアミン末端か
ら駒位置35〜約位置95のアミノ酸残基配列に配列において対応する約lO〜
約35のアミノ酸残基を含む多数のポリペプチド繰返し単位を含むところのポリ
マーが意図され、ここで位置数はB−サブユニットの21残基シグナルペプチド
を含む。これらポリマーは、接種物としての生理学的に許容できる希釈剤中に溶
解又は分散し、有効量で宿主哺乳動物に導入したときに、天然のIli毒素B−
サブユニットと免疫反応する抗体の土庄を誘発することができる。
一実施態様において、本発明のポリマーの繰返し単位は、繰返し単位末端に付加
されたCys’A%の酸化により形成されたシスチンジスルフィド結合によって
互に結合されており、Cys残基は、酸化前に繰返し単位ポリペプチドのアミノ
末端及びカルボキシ末端の両者に存在する。そのような繰返し単位は、非酸化形
で、ジCys−LTポリペプチドと呼ばれる。このポリマーは、ポリマー形成酸
化の間に他の七ツマー状繰返し単位が存在しなければ、線状ホモポリマーである
。
14カルボキシ末端アミノ酸残基に対応する第二のポリペプチド繰返単位の両者
を用いて酸化的重合を行うとき、ランダムな三次元ネットワークコポリマーが得
られる。ネットワークポリマーが望まれる場合、STポリペプチドの少くとも三
つ、最も好ましくは六10 つ総てのCys残基が存在する。完全な18残基S
Tポリペプチド配列を用いることも好ましい。
多数の複合L T/S Tポリペプチド繰返し単位を含むネ7)ワークポリマー
は、本発明のポリマーの更に別の一局面であると考えられる。左から右へかつア
ミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いてポリペプチド繰返し単位は、それぞ
れに、前述の複合LT/STポリペプチドの式に対応する。左から右へかつアミ
ノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、特に好ましいネットワークポリマー
の繰返し単位は、それぞれに、下記式に対応する=(X)llMetValll
elleThrPheMeL(Lys)SerGlyGlu(A Ia) Th
rPheG InVa IG IuVa 1ProG I ySerG lnH
is I 1eAspserG I nkys
AsnThrPheTyrCysCysGluLeuCysCysTyr(As
n)ProA]aCysAIaGlyCysAsn(Tyr) (’/)mここ
でX及びYが存在するとき、これらは(al Lys及びArg残基より成る群
から選ばれる、又はfbl Asp及びGlu残基より成る群から選ばれるアミ
ノ酸残基であり;
n及びmは、0、l、2.3又は4の整数であって、nとmの一方又は両者がゼ
ロの値のときには各X及びYは存在せず、nとmの一方又は両者がゼロでないと
きには各X及びYは存在し、ポリペプチド繰返し単位当りのX及びY残基の平均
数は各々X及びYの値に等しく;
カッコ内のアミノ酸残基は各々、弐の配列において直前のアミノ酸残基二二対す
る代替物であり;
繰返単位は、繰返単位の酸化されたCys1A基の間に形成された分子内、ポリ
ペプチド間シスチン結合により互に結合される。
本発明においてまた、診断法及び合成に用いられる抗体を発生させるためにを用
な、又は大腸菌の熱不安定な又は熱不安定な及び熱安定な腸毒素からヒトを含む
動物を保護できるワクチンとして有用な接種物が意図される。この接種物は、生
理学的に許容できる希釈剤中に上述したLTBポリペプチド接合体、複合LT/
STポリペプチド接合体又はネットワークポリマーの存効量を含む、この接種物
は、たとえば注射又は経口的に宿主哺乳動物に一単位投与量で導入されたとき、
少くとも大腸菌の熱不安定腸毒素のB−サブユニットと免疫反応する抗体の生産
を誘発できる。より好ましい態様では、そのように誘発された抗体は、大腸菌の
熱不安定腸毒素及びりさ安定腸毒素の両者と免疫反応する。そのような接種物は
、ヒト、ブタ又は実験動物たとえばラットのような宿賜菌力・ら宿主を保護する
。
図面の簡単な説明
七記載の一部を成す図面において、
第1図は、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端へ書かれた大腸菌のブ
タ(LTP )及びヒ)(LTh)の熱不安定腸毒素のB−サブユニットの翻訳
されたアミノ酸残基配列を示す。
アミノ酸残基を結合するペプチド結合は、ノ\イフンで示されている。21の残
基のシグナルペプチド配列のアミノ酸残基は、小文字で示され、蛋白質の主要部
分の残基は大文字で示される。小斜線(1)は、シグナルペプチド配列を残りの
配列から分ける。
LTb配列(LTrCe列の下の)におけるダッシュは、二つの配列において同
し残基が存在することを示す。配列りこはって異る残基が表示されている。LT
P配列の数字は、7ミノ末端から測った残基位置を示す。この配列は、ダラス及
びファルコウ、ネイチy2BB :499−501 (1980) 、白木ら、
J、Bacteriol。
152:506−509 (1982)及び白木ら、J、Bacteriol。
155ニア28−733 (1983)により報告された。
第2図は、材料及び方法の部に記述するB/B ELISA法により測定された
研究されたLTP関連ポリペプチドの三つの抗原性を示すグラフであり、天然の
LThB−サブユニー/ )の抗原性に対するパーセントとして示しである。e
軸は、天然LT、B−サブユニット抗原性のパーセントである。横軸は、LTF
B−サブユニット蛋白質上の配列位置を示す、 L Tr B関連ポリペプチド
華独の抗原性は、斜線ハンチングを囲む相形により示される。
閉じられたハツチングの密度は読みやすいためであって、測定における実験誤差
を示すためではない、5Tlbhポリペプチドのアミノ末端残基にペプチド結合
され、酸化的に重合されたLTs関連ポリペプチドの抗原性は、点線で囲った錯
形により示される。
第3図は、第一の腸管外菟疫化(IP)及び続く二回の経口(PO)免疫化によ
るラットの免疫化結果を示すグラフである。
纒−は、減少された腸分泌の%を示し、横軸はLTh B−サブユニソ) (B
)抗原単位での経口全投与量を示す0段階分けした抗原単位投与量は、天然のL
Tl、B−サブユニット(・−・;天然B、)、又は1B残isT Ibhポリ
ペプチドにペプチド結合されたLTPB−サブユニット関連ポリペプチドのモノ
マー形(複合LT/STポリペプチド)単独(Δ:BFllAG ST華独)又
はブタ免疫グロブリンG(PIG)に接合されたもの(o−o;B□ac−S
Tx P I G、)のいずれかを活性成分(免疫原)として含むワクチンを用
いて導入された。ラットは、生育しうるLT”/ST−大腸菌株PB258で攻
撃された。結果は、同様に攻撃された対照と比べての、免疫化ラットにおける平
均上SEMの減少された分泌として示される。データ点の上又は下の数字は、こ
れらの点に対する粘膜1gA抗毒素力価を示す。
第4図は、第一の腸管外免疫比重P)及び続く二回の経口(PO)免疫化による
ラットの免疫化の結果を示すグラフである。
段階分けした抗原単位投与量は、天然L”rhs−サブユニットに化学的に架橋
された合成の18残基ST Ibhポリペプチド〔・−・;ST (S)XB)
、及び左方の図に示す繰返し卑位として第3図の複合LT/STポリペプチド
を持つネットワークポリマLO・・o i BFIAG−3T〕及び右方の図に
示す天然LTbB−サブユニットて・−・;天然Bゎ〕を活性成分(免疫原)と
して含むワクチンを用いて導入された。攻撃は、左方の図では生育しうる大腸菌
LT’ /ST−株Tx452、右方の図では生育しうる大l!!菌LT’ /
ST−株PB25Bを用いて行った。両図における縦重鱈よ、第3図と同しであ
る。横軸は、左方の図及び右方の図で各々、ST (S)及び天然r−TゎB−
サブユニ7)抗原単位での合計P○投与量を示す。横軸の抗原単位に対応する免
疫原のミリグラム(mg)故も示されている。他の結果は、第3図と同様に示さ
れている。
第5図は、繰返し単位として第3図の複合LT/STポリペプチドを含むネット
ワークポリマー〔Δ及びム:ワクチン〕、天然LTkB−サブユニ、ト〔・−・
;Bサブユニット〕、又は天然LTbB−サブユニットに架橋された前述の合成
ST (0・・・OS ST (S)XB3を活性免疫原として含むワクチンの
4回の逓倍のPO免疫化(PO/PO)を与えられたう7)の免疫化の結果を示
すグラフ(右方)である、攻撃及び結果の表示は、第3図と同様であるが、但し
、ワクチン中の免疫原のミリグラムは、投与された抗原単位の数と同様に横軸に
示される。
本発明は、い(つかの利益及び利点を提供する0本発明の一つの利益は、それが
大腸菌の熱不安定な及び熱安定な腸毒素の両者を生産する株に対する一元的な完
全に合成のワクチンを提供することである。
別の利益は、この一元的ワクチンが、免疫化された宿主において腸分泌を実質上
全く誘発しないことである。すなわち、本発明に従い作られたワクチンは、どち
らの腸毒素の不都合な分泌誘発作用をも実質上台まない。
本発明の一つの利点は、そのLT B−サブユニット関連ポリペプチドが標準的
実験室合成法により合成的ζ=作られ、それによって望ましくない生物学的汚ン
物を含まないことである。
本発明の別の利点は、そのポリペプチドが、生物学的又は組換えDNAの技術に
比べて比較的安価に調製及び精製されることである。
さらに別の利益及び利点は、以下の詳細な説明から当業者には明らかであろう。
本発明の詳細な説明
本発明ユよ、大腸菌の熱不安定な腸毒性のB−サブユニ、トのアミノ末端から駒
位置35〜約位置95に配列において対応するVフlO〜約35のアミノ酸残基
を含む合成ポリペプチドを意図する。
ここで位置数は、B−サブユニットの21残暴シグナルペプチドを含む。そのよ
うなポリペプチドを含む接合体、複合LT/STポリペプチド及びポリマー、な
らびに接合されたポリペプチド、複合LT/STポリペプチド又はポリマーの有
効量を含む接種物、該接種物により誘発された抗体及びこ机らに関係する方法も
また、意図される。
1、LTBポリペプチド
LT、及びLTbのB−サブユニットの翻訳されたアミノ酸残基配列が第1図に
示される。箪−配列として左から右ヘアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書
いて配列位置35から配列位置95まで(ここで位置数は21残基シグナルポリ
ペプチドを含む)の大腸菌の熱不安定腸毒素のB−サブユニットのアミノ酸残基
配列は、下記式Iにより示される。
式I
AsnThrG I n I I eTyr丁hrI 1eAsnAspLys
I IeLeuSerTyrThrG l userle tA laG I
yLysArgG luMetVa l T le I IeThrPheM
e t (LysjSet
GlyGIu(Ala)ThrPheGInValGIuValProGIyS
erGln旧5lleAspserG I nLysLysA la jl e
Gl uArgMetLysAspThrLeuArgI leここで、カッコ
内のアミノ酸残基は、各々、式の配列中の直前の残基すなわちカッコ付きの残基
の左側の残基に対応する代替物である。特定の残基の上の数字は、7ミノ末端か
ら測り、シグナルペプチド配列を含めた配列中のアミノ酸位置を示す。
式Iの配列は、二つの代替的アミノ酸残基を含むことに留金しなければなるない
。これら残基は、アミノ末端から位置64及び6τに位置する。特記なき限り、
LTBの一部に対するアミノ酸残M&列を含む本発明のポリペプチド(LTBポ
リペプチド)を本明細書で云うとき、複合配列としてL T t、及びL T
Pポリペプチド配列の両者を包含すること、すなわちfa+位置64にLys又
はMet残基、そしてへ)位置67にGlu残基又はAffia残基を含むアミ
ノ酸残基配列を包含することを意味する。すなわち、位置64〜67に下記の四
つの配列を含むLTBポリペプチドが、LTBポリペプチド又はLTBと云うこ
とによって意味される:(A ) MetSerGlyGlu
(B ) LysSerGlyGIu
(C) MetSerGlyAla
(D ) LysSerGIyAIa
下記で検討するデータは、配列において熱不安定腸毒素のB−サブユニ、)(L
TB)の位置35〜約95に対応する約lO〜約350アミノ酸残基を含む合成
ポリペプチドが、大腸菌により生産される熱不安定腸毒素(LT)の存在を診断
するのに有用であろう抗体の生産を誘発する免疫原として有用であることを示す
。
より好ましくは、本発明のポリペプチドは、接種物における免疫原として用いら
れる。これら使用において、ポリペプチドが約15〜約30のアミノ酸残基を含
むこと、及びポリペプチドの配列が位置約55〜約位置85のLTB配列に対応
することが好ましい。
最も好ましくは、約20〜約25の残基を含むポリペプチドが用いられ、このポ
リペプチドの配列は、LTBの駒位置60〜約位置85の配列に対応する。その
ように用いられるポリペプチドは、担体にカップリングされたポリペプチド接合
体として典型的に用いられる。接合されていないポリペプチドもまた、抗しTB
ポリペプチド又は抗天然LT抗体のための抗原又は競争リガンドとじて診断にお
いて有用である。
n、LTB配列を含む複合L T / S Tポリペプチド本発明の特にを用な
実施態様は、約25〜約55のアミノ酸残基番含む複合ポリペプチドであり、第
一の配列のカルボキシ末端残基と第二の配列のアミノ末端残基の間のペプチド結
合により互に結合された二つのアミノ酸残基配列より成る。この複合ポリペプチ
ドの二つのアミノ酸残基配列は、そのアミノ酸残基配列がLTBのアミノ末端か
ら約35〜約95の位置に対応する前述の合成ポリペプチドを含む。第二の配列
は、大腸菌の熱安定腸毒素(以下では一般にSTと云う)の少くともカルボキシ
末端14アミノ酸残基に対応する。そのようなポリペプチドは、以下では、複合
LT/STポリペプチドと呼ばれる。
複合LT/STポリペプチドを構成する二つのアミノ酸残基配列の間のペプチド
結合は、ST配列のアミノ末端残基とLTB配列のカルボキシ末端残基の間に、
又はLTB配列のアミノ末端残基とST配列のカルボキシ末端残基の間に形成さ
れることができる。yi合LT/STポリペプチドを構成するポリペプチド配列
はまた、頭尾結合されていると云われることもできる。
複合LT/STポリペプチドO熱安定(ST)部分に対応するアミノ酸配列がS
T分子の18残基(18−mer)配列を含むことが特に好ましい。
STの少くとも二つのタイプが、その物理特性により同定されている。STIと
して知られる第一タイプ(ST、とも呼ばれる)は、メタノール可溶であり、幼
児マウスモデルにおいて活性である。第二のタイプ、5TII (ST、とも呼
ばれる)は、メタノール不溶であり、幼児マウスモデルにおいて活性でなく、し
かし結さくしたブタ回腸ループにおいて活性である。STIポリペプチドがここ
で興味あり、ここで言及される唯一のSTポリペプチドタイプであろう。
STIポリペプチドのうち、少くとも二つの類似のポリペプチド、又はこれらポ
リペプチド決定子f+J!域が同定されており、それらのアミノ酸残基配列が決
定されている。STIのこれら二つのタイプは、本明細書で
(i)ウシ大li!@株において初めに見い出され、その一部がブタ株において
もコードされているSTT、、及び(11)大腸菌のヒト分離物からの指定され
たS T 1 bと呼しぼれる。
ST 1.ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が決定されている。ヌク
レオチド配列のポリペプチドアミノ酸配列への翻訳は、カルボキシ末端でチロシ
ン基により封鎖された72のアミノ酸を含むポリペプチドを与える〔ソー(So
)ら、Proc、〜atl。
Acad、 Sci、USA、77: 4011−4015(1980)〕、
S T Ibポリペプチドは、僅か18のアミノ酸を含むと作告され〔チャン(
Chan)ら、J、 Biol、 Chew、256: 7744−7746(
1981) ) 、これら18残基は、STTのヌクレオチド配列によりコード
される18カルボキシ末端残基と相同である。
最近の証拠は、5TIbについて初めに報告されたアミノ酸残基配列は誤りであ
ったことを示す。初めに報告されたカルボキシ末端アスパラギン(Asn)残基
は今では、チロシン(Tyr)残基であると信じられ、一方、18−raerの
アミノ末端から位置11の初めに報告されたTyrは今では、Asn残基である
と信じられている。検討の容易のために、チャンら(前出)により報告された元
の配列にその【こ列が対応するところのポリペプチドは、ここで5TIbhと呼
ばれ、改正された配列に対応するポリペプチドは、ST Ibpと 呼ばれるで
あろう。
ST Ibhポリペプチドの18のアミノ酸(18−per )は、ST Ia
のポリペプチドの55〜72と番号を付されるアミノ酸と大きな同種性を示す。
ST Ibhの同種の、はとんど同一の領域は、5TIaの及びST Ibpの
報告された配列と共に、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に
、5TIaポリペプチドのアミノ酸数55から始めて下記に示される:ST I
a :AsnThrPheTyrCysCysGluLeuCysCysAsn
ProAlaCysAlaGIyCysTyrST Ibh:AsnThrPh
eTyrCysCysGluLeuCysCysTyrProAIaCysAI
aGlyCysAsnST Ibp:AsnThrPheTyrCysCysG
luLeuCysCysAsnProAlaCysAlaGIyCysTyr見
られるように、ST IaとST Ibpの18残基配列は同しである。
上述の三つ(二つの異る)18アミノ酸残基ポリペプチド配列の検討はまた、六
つの半シスチン(Cys)残基が存在することを表わす。これら半シスチン残基
を、天然腸毒素における分子内、ポリペプチド内ジスルフィド結合を含むシスチ
ン残基へ酸化することは、この物質に観察される熱安定性を与えると考えられる
。
しかし、シスチンジスルフィド結合は天然ST中に存在すると知られているが、
半シスチン残基のどのペアーが結合して天然ST分子中に存在する三つのジスル
フィド結合を形成するのが知られていないことにさらに留意しなければならない
、これら三つのジスルフィド結合は、理論的に、存在する六つのCys残基の1
5の異る組合せから形成されうる。
ステーブルズ(Staples)ら、J、 Biol、 Chew、 255:
4716−4721(1980)は、生物的STのジスルフィド結合が毒素の
生理学的活性のために必要であることを示した。すなわち、半シスチンを形成す
る化学的還元又はシスティン酸への過ギ酸酸化は、毒素の生理学的活性を破壊す
ることが示された。加えて、チャンら(前出)は、ST Ibpの上述の配列の
相同な18のアミノ酸のアミノ末端から最初の四つの残基が生理学的活性のため
に必要でないことを報告している。すなわち、生理学的活性は、上述のカルボキ
シ末端14アミノ酸及びそれらのジスルフィド結合を含む、アミノ酸含をポリペ
プチドから得られた。
アイモト、ら、Biochem、 Biophys、 Res、’ Che++
、 112: 320−326(1983年4月15日)は、彼らがTS、と呼
ぶ物質のカルボキシ末端14アミノ酸残基の合成について報告している。その合
成分子は、幼児マウス評価を用いて、分子基準で天然S T bの2〜5倍の生
理学的活性を持つと報告された。
ダフロント(Du’flot)らによる1982年8月29日の口頭表示、プロ
シージンゲス ヨーロピアン ペプチド シンポジウム(Proceeding
s European Peptide Symposium) : 683
686において、これら研究者は、Cysメルカプト基がアセタミドメチル基で
ブロックされた(S−ブロックされた)ブタ及びヒトST18−setポリペプ
チドの合成を報告した。これらアミノ酸残基配列は、報告されるところによると
ソーら(前出)によりST Iaについて報告された、またチャンら(前出)に
よりST Ibhについて報告された配列と同じである。しかし、ダフロ7トら
により報告された配列のアミノ末端から第7番目のアミノ酸残基はグリシン(G
fy)であったが、一方、前述した配列におけるその残基はグルタミン酸残基(
Glu)である。
ダフロントらは、天然又は合成毒素を等しく認識した抗体を作った破傷風トキソ
イド又はオバルブミンにカンプリングされたS−ブロックされたブタST毒素に
よるマウス又はラビットの免疫化を報告した。S−ブロックしたブタ合成ポリペ
プチド毒素にっ。
いて、幼児マウス評価においてほとんど全く生理学的活性は報告されなかった。
これら著者は、S−ブロックされた分子における分子内ジスルフィドの不存在に
よるべき生理学的活性の欠除を報告し、これはステーブルズら(前出)の先の報
告と符合する。
ここで考慮されるSTポリペプチドは、ST Ibh及びST Ibp(ST
Ia )の少くともカルボキシ末端14残基を含む、このポリペプチドはまた、
ST配列の六つのCys残基に対する、四つまで、好ましくは三つ以下、最も好
ましくは二つ以下の代替的アミノ酸残基を含みうる。また、Cys残基が存在す
る場合、存在するCys残基の四つまで、好ましくは三つ以下、最も好ましくは
二つ以下の硫黄原子がアルキル化されることができる。
有用なSTポリペプチドは、少くとも一つの分子内シスチンジスルフィド結合を
含む、結局、Cys残基に対する一以上の代替的アミノ酸残基O存在、及び−以
上のアルキル化Cysメルカプタン基の存在は、STポリペプチドが少くとも一
つの分子内シスチンジスルフィド結合を形成できるという前提に従う。
左から右へかつアミン末端からカルボキシ末端の方向に書いてSTOカルボキシ
末端14残基に対応する有用な14残基STポリペプチド配列は、下記の式■に
対応する。
弐B
ここでカンコ内の二つの特定のアミノ酸残基(Asn及びTyr)は各々、式の
配列における直前のアミノ酸残基に対する代替物であり;
a、b、c、d、e及びrca−f)、及びg、h、i、Lk及びl(g−1)
は各々ゼロ又は1の整数であり、但し、a〜ジスルフィド結合を形成し、一方、
もしa −f又はg〜lのいず又は異る基であり、水素、1〜約4個の炭素原子
を含むアルキル基たとえばメチル、エチル、イソプロピル及び第ニブチル基、及
び2〜約4個の炭素原子を含む置換アルキル基たとえばカルボキシメチル、カル
バモイルメチル、カルボキシエチル及びカルバモイルエチル基より成る群から選
ばれ;
基に対する代替アミノ酸残基であり、中性の側鎖を持つアミノ酸残基たとえばア
ラニンCA1a”)及びセゾン(Set)の群から選ばれ;そして
少くともa w rの二つ及びg−1の二つはゼロであり、二つの隣接しないC
ys残蟇が存在し、但し、複合LT/STポリペプチドの合成STポリペプチド
部分が、存在する少くとも二つのCys残基から形成される少くとも一つの分子
内シスチンジスルフィド結合を形成する能力を持つこと。
モノマー形のとき、上述の少くとも一つのジスルフィド結合は、STポリペプチ
ド中に存在する少くとも二つのCys’A基の間に形成された分子内、ポリペプ
チド内シスチンジスルフィドである。
STポリペプチドが、多数のLTポリペプチド含有繰返し単位を含むポリマー形
であるとき、上述の少くとも一つのジスルフィド結合は、各STポリペプチド繰
返し単位中に存在する少くとも二つのCys残基の間に形成された分子内、ポリ
ペプチド内シスチンジスルフィドでありうる。
この少くとも一つのジスルフィド結合はまた、第一のST含有繰返し単位中に存
在する少くとも二つのCys残基の一つと第二のST含有繰返′一単位中に存在
する少くとも二つのCys残基の別の一つ又は別のポリペプチド繰返し単位中に
存在することができるCys残基の一つとの間に形成された分子内、ポリペプチ
ド間シスチンジスルフィド結合であることもできる。従って、分子内シスチンジ
スルフィド結合は、STのモノマー状及びポリマー状複合形の両者の中に存在す
ることが理解される。モノマー状ST含有複合体において、そのシスチンジスル
フィド結合はポリペプチド内結合であり、一方、繰返し単位中にSTポリペプチ
ド配列を含むポリマーにおいて、ジスルフィドはポリペプチド間又はポリペプチ
ド内結合であることができる。
式■の上述のSTポリペプチドに関して、合成STポリペプチドのモノマー及び
ポリマー形についてのより好ましい態様において:
aが0のときeは0であり、
bがOのときdは0であり、そして
Cが0のときfはOであり、そして
aが0のときg及びkの各々が0であり、bがOのときh及びjの各々がOであ
り、そしてCがOのときi及びlの各々が0である。
二つの特定の代替的アミノ酸及びW換の代替的R基なしの式■に示される配列は
、ST Ibhのカルボキシ末端14アミノ酸残基配列に対応する。 ST I
aのアミノ酸59〜72を含む14アミノ酸残基(ST IbpOカルボキシ末
端14残基)は、位置65において(アスパラギン(Asn)残基がST Ib
hの7ミノ末端から11の位置(カルボキシ末端から残基位置8)において千ロ
ジン(Tyr)残基を置き代える場合)、及びST lbpのアミノ末端から位
1118(カルボキシ末端)においてチロシン残基が示されているアスパラギン
基を置き代える場合)、その代替アミノ酸及びR基なしの式Hに示される配列と
異る。
すなわち、アミン末端から第四のCys残基(ST IaのTyr−65)のす
ぐ右のTyr残基は、上述の式■においてカッコ内のAsn残基により置き代え
られることができる。逆に、示されているカルボキシ末′pJA s nは、最
後のTyr残基のカッコにより示されるようにTyrで置き代えられることがで
きる。
18残基ST Ibh及びSτTbp分子の配列中に存在する四つのアミノ酸残
基の少くとも一つがまた、複合LT/STポリペプチドの合成37部分中のその
天然の位置的配列に、又はSTポリペプチドを含む任倉の他のものの中に存在す
ることが特に好ましい、これら追加的アミノ酸の四つの総てが、それらがST
Ibh及びST Ibp中に存在する同じ天然の位置的配列中の合成ST部分に
存在することが更に好ましい。
STポリペプチドのアミノ末端における好ましい四つの追加的アミノ酸は、ST
Iaのアミノ酸位置数55〜58 (ST Ibpの位置1〜4)に対応し、
ST lbhにおけるこれら四つのアミン末端アミノ酸と同じである。
好ましい実施態様における式■の合成STのアミノ末端に追加的に存在する4ア
ミノ酸ポリペプチド(4−mar)は、左から右へかつアミノ末端からカルボキ
シ末端の方向に、下記の弐mに示される配列を持つ:
六回
AsnThrPheTyr
すなわち、好ましいSTポリペプチドは、先に示したST Ibh又はST T
bp (ST Ta )の配列に同じ18残基のCご列を持つ0通常のSTポリ
ペプチドはまた、カルボキシ末端にAsn残基、及びST Ibhのアミノ末端
かる11の位置にAsnを含むことができる。
逆に、二つの残基がTyr残基であることができる。そのように定義された四つ
の有用な5T18残基配列は、前述したように書いて弐■に示される。
弐■
(A) AsnThrPheTyrCysCysGluLeuCysCysAs
nProAlaCysAlaGIyCysTyr(B) Asn丁hrPheT
yrCysCysGIuLeuCysCysTyrProAIaCysAlaG
IyCysTyr(C) AsnThrPheTyrCysCysGIuLeu
CysCysTyrProAIaCysAIaGIyCysAsn(D) As
nThrPheTyrCysCysGIuLeuCysCysAsnProAl
aCysAIaGlyCysAsn弐■の四つの配列は、カッコ内の代替残基を
用いて一つの配列として書くことができる。前述のように書いて、代替残基の基
礎としてST Ibhのアミノ酸残基配列を用いて、−緒にしたSTポリペプチ
ド配列は、下記の式Vにより表わされる。
式■
AsnThrPheTyrCysCysGluLeuCysCysTyr(As
n)Pr。
AlaCysAIaGlyCysAsn(Tyr)ここで、特定のカッコ内アミ
ノ酸残基:;!、式に示される直前の残基の各々に対する代替物である。
本明細書で特記なき限り、ST又はSTポリペプチドというときには、代替アミ
ノ酸残基を包含するST関連ポリペプチドアミノ酸残基配列を云う、これは、1
4残基ポリペプチド、18残基ポリペプチド及び15〜17残基を含むものに対
して妥当する。
左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、弐■
述した通りである。
このモノマー状の複合LT/STポリペプチドは、少くとも一つの分子内、ポリ
ペプチド内ジスルフィド結合、より好ましくは二つの分子内、ポリペプチド内ジ
スルフィド結合、そして最も好ましくは三つの分子内、ポリペプチド内ジスルフ
ィド結合を含む。
このジスルフィド結合は、a 4 fがゼロの値を持つとき、R1とのCys残
基の対の間に形成されると考えられる。
しかし、R1とR1のCys残基、ならびにR1とR’のこれらは、jA接の門
り合う対である。従って、一つのジスルフィド結合を含む複合LT/STポリペ
プチドは、この箪−・のジスルフィド結合がR1とRs又はR2とR5のCys
残基の間に形成されているかどうかに拘わりなく、はぼM(IIの二次構造及び
免疫原性を持つことができる。類伯の結果は、R2とR6などではなくてR1と
R4のCys残基の間のジスルフィド形成により形成される二次構造に関係する
。
分子内、ポリペプチド内ジスルフィド結合の酸化的形成に先立って合成される複
合LT/STポリペプチドは、少くとも二つのCys残基を含む、従ってg−1
の少くとも二つの値はゼロであり、イド結合の形成により与えられる二次構造の
類似性の観点で、R3及びRe 、R′、0 、 Re 、R1及びR1;及び
R9、R16及びR+zに先行するCys残基より成る群から選ばれる。8丁含
有物の37部分におけるアミノ酸残基位置に関して、合成37部分における隣り
合わないCys残基の対は、5T18残基ポリペプチド部分のアミノ末端から、
5又は6及び9又は10.5又は6及び14、及び9又は10及び17の位置の
これらから成る群から選ばれる。
複合LT/STポリペプチド、及び繰返し単位として複合LT/STポリペプチ
ドを含むネットワークポリマーは、LTB−サブユニット(ならびに全LT毒素
)及び生物的天然STの両者により誘発された血清(抗体)に対する抗原である
。そのような抗原性は、下記の結果の部■で詳しく検討する。
しかし広くは、合成ST配列ならびにLTB配列を含む複合LT/STポリペプ
チドの抗原性のパーセント値は、合成STをL!Rする(それに結合する)抗生
物的ST抗体の量の、同じ抗生物的ST抗体により認識される生物的STに比べ
ての相対的尺度、及び合成LTBポリペプチド部分をLp 76する(それに結
合する)同様に測定された抗LTB抗体の量の、同し抗LTB抗体によりLQ
PされるLTBに比べての相対的尺度である。抗原性の計算は、用いられた抗原
の重量に基づいており、評価される抗原が七ツマー形かポリマー形かに関係しな
い。
好ましいLTBポリペプチド、複合LT/STポリペプチド、及びLTBポリペ
プチド繰返し単位たとえば複合LT/STポリペプチド繰返し単位を含むネット
ワークポリマーは、天然LTB−サブユニー/ トの抗原性の少(とも5%を示
す、複合LT/STポリペプチド、及び複合LT/STポリペプチド繰返し単位
を含むネットワークポリマーはまた好ましくは、天然STの抗原性の少くとも約
10%を示す。
適当な抗原性及び免疫性はまた、Cys残基の硫黄原子がシスチンジスルフィド
結合以外の結合部分を含むところの合成ST含有分子についても見い出された。
この事実の故に、複合ポリペプチドの合成37部分のための式■及び■の上述の
配列のCys残基は、しかし、少くとも一つの分子内、ポリペプチド内シスチン
ジスルフィド結合がモノマー状合成STにおける抗原活性及び生理学的活性(も
し望まれるなら)のために必要なので、水素以外のR1′″″基の六つの総てが
一つの合成STポリペプチド中に存在してはならないことに留意せねばならない
、むしろ、せいぜいこれら基の僅か四つが任意の一分子中に存在することができ
る。すなわち、たとえば、R’及びR5のCys蔑基が組合わさって分子内、ポ
リペプチド内シスチンジスルフィド結合を形成している場合、六つのCys残基
の間に形成されるシスチン残基の−、二又は三つの分子内ジスルフィド結合の存
在を説明するために、R5l〜6の各々は、下付き文字のaxfをも付された。
各々の下付き文字は、0又はlの整数を示す。より好ましい態様において、aが
0のときeはOであり、bが0のときdは0であり、Cが0のときfはOである
という条件及び3、b又はCの少くとも一つは0でな;すればならないという別
の条件、及びジスルフィド結合が、一つのゼロの下付き文字が別の下付き文字が
ゼロであることを必要とするところのCys残基の各月の間に存在することとい
う条件が加えろれる。
合成ST中に存在するR’〜6基の各々は、水素であることができる。その場合
、R1〜6基が結合されているCys残基は、水素がCys残基の硫黄原子に結
合される通常の基であるので、置換されていない、システィンの硫黄原子に結合
された水素の存在は、本明細書で表示Cys又はCysHにより表わされる。
R’〜6基はまた、1〜約4個の炭素原子を含むアルキル基であることもできる
。そのようなR1−6%の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n
−ブチル、第ニブチルなどである。
R1〜6基はさらに、2〜約4個の炭素原子を含む置換アルキル基であることが
でき、ここで置換基としてはヒドロキシ、カルボキシ、及びカルボキサミドが包
含される。そのような置換アルキル基の例は、2−ヒドロキシエチル、2−ヒド
ロキシプロピル、カルボキシメチル(−CM2CO□H)、カルボキサミトメチ
ル(−C)1.C0NI(Z)、カルボキシエチル(−CHzCthCOzH)
、及びカルボキサミドエチル(−CHzCHzCONHz)である。
R1−、b7Jは、複合LT/STポリペプチド分子中に離されて存在すること
ができ、又はR1″′6基の混合が一つのポリペプチド又はポリペプチド繰返単
位中に存在することができる。七ツマー状STポリペプチド含有物の下付き文字
a % fの総てがゼロの値を持つとき、R1〜6基は存在せず、三つの分子内
、ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合が、酸化されたポリペプチド中に存
在する。
に存在せず、ここで、繰返し単位の合成STポリペプチド含存部分の二つ及び/
又は三以上の間の分子内、ポリペプチド間シスチンジスルフィド結合が存在する
。繰返し単位部分の合成ST含有部分内の分子内、ポリペプチド内シスチンジス
ルフィド結合はまた、ネットワークポリマー中に存在することもできる。
平均して、ネットワークポリマー中のSTポリペプチド繰返し単位は、繰返し単
位当り少くとも約二つのそのようなポリペプチド間シスチン結合を含む。従って
、好ましい態様において、少くともa = fの四つ及びg−1の四つがそのよ
うなポリペプチド繰返し単位のためにゼロの値を待ち、少く己も四つのR1〜6
基及び形成の故に存在しない。
抗原性及び免疫原性はまた、ジスルフィド結合に含まれないCys残基が同し又
は異る代替アミノ酸残基たとえばSer残基により置き代えられるとき、ST
Ibh又はST Ibpポリペプチド部分のアミノ末端から各々、位置5及び1
0,6及び14、及び9及び17に対応するとR−とR5,R2とR4、又はR
3とR6に結合されるような、式■及び■で示されているもののようなCys残
基対の間の少くとも一つの分子内、ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合を
含む複合LT/STポリペプチドを用いて得ることができる。
弐n及び■のCys残基に対する好ましい代替アミノ酸残基は、中性側鎖を含む
、すなわち、生理的p)l値の水性溶液に合成ポリペプチドカ9容解されたとき
に合成ポリペプチドにイオン電荷を与えない;すなわち、好ましい代替アミノ酸
残基は、複合LT/STボ°Jペプチドの部分が水性iWM中にあるときに、イ
オン電荷を有さない。アミノ酸蔑基アラニン(Affia)及びセリン(Set
)は、Cys残基を置き代えるために有用な好ましい代替アミノ酸の例である。
非ジスルフィド結合するCys5に対する代替アミノ酸残基は、残基(アミノ末
端の方向へ隣接するCys残基)を置き代えることができ、そしてここで下付き
文字g−1は0又は1の値を持つ整数である。好ましい合成STポリペプチドに
おいて、もしaが〇ならg及びkは各々0であり;もしbが0ならh及びjは各
々0であり;そしてもしCがOならi及びlは各々0である。
部分を含む複合LT/STポリペプチドに、及びその配列が弐〜]に示される1
8アミノ酸残基を含むより好ましい合成ST含を複合LT/STポリペプチドに
等しくあてはめうる。その開示はまた、そのアミノ酸残基配列がSTOカルボキ
シ末端14残基に対応し、かつさらにそのアミン末端に、示されたようなその天
然に生じる配列中の14残基ポリペプチドのアミノ末端に結合された弐mに示さ
れた配列のカルボキシ末端から1.2又は3つの残基を含むところの複合L T
/S Tポリペプチドにあてはめうる。すなわち、上述の開示はまた、そのアミ
ノ酸残基配列が14カルボキシ末端ST残基プラス14残基ST配列のアミノ末
端に結合された追加的Tyr、PheTyr又はThrPhaTyrペプチドに
対応する複合LT/STポリペプチドにもあてはめうる。
本発明の複合LT/STポリペプチドは、STポリペプチドのアミノ末端又はカ
ルボキシ末端に結合されたそのLTBポリペプチド部分を持つことができる。
1複合LT/″STポリペプチド」という表現は、LTポリペプチド部分に関係
するLTポリペプチド部分の再配置を包含することを意味される。
複合LT/STポリペプチドの二つのポリペプチド部分は、互に直接にペプチド
結合される。すなわち、一つのポリペプチド部分のカルボキシ末端残基:よ、他
のポリペプチド部分のアミノ末端残基にペプチド結合される。実際、複合LT/
STポリペプチドは好ましくは、単一のポリペプチド調製において合成される。
アミノ末端及びカルボキシLTBポリペプチドの両者を含む複合ポリペプチドは
、以下に示される。
他の実施Beにおいて、ST及びLTBポリペプチド部分は、複合ポリペプチド
、又はそれが一部分をなす接合体、又は複合LT/STポリペプチドが繰返し単
位であるネットワークポリマーの溶解性を改善するために典型的に加えられる−
又は二つのペプチド結合された追加的アミノ酸残基によりへだてられる。 LT
B及びSTポリペプチド部分をへたてる追加的アミノ酸残基は、LTB又はST
配列中には存在せず、空腸のpH値すなわち約pl(6,5において複合LT/
STポリペプチドにイオン電荷を与える側鎖を持つものである。すなわち、その
ようなアミノ酸残基は、酸性又は塩基性側鎖を含み、各々、Asp又はG11u
、及びLys又はArgにより例示される。
二つの追加的アミノ酸残基が複合LT/STポリペプチドのLTB及びSTポリ
ペプチド部分をへだでるとき、二つの残基が同しである必要はなく、しかしこれ
ら残基は、pH6,5で複合LT/STポリペプチドに同じイオン電荷を与える
べきである。すなわち、二つの07!u残基、二つのAsp残基、又は一つのG
lu残基と一つのAsρ残基が一緒に用いられることができる。同様に、二つの
Lys残基、二つのArg残基、又は一つのArg残基と一つのLys残基が一
緒に用いられうる。しかし、たとえば一つのGluと一つのArg、又は一つの
AspとLysは一緒に用いられない。
(al担体に結合された場合の接合体としての、(1))遊離の、(cl又は最
も好ましくはネットワークポリマーの繰返し単位としての複合L T/S Tポ
リペプチドのアミン及び/又はカルボキシ末端はまた、前述したような約四つま
での追加的な、イオンを荷を与える(酸性又は塩基性側鎖を備える)アミノ酸残
基を含むことができる。好ましくは、二つのそのような追加的残基が用いられ、
そして再び、これら残基は好ましくは塩基性側鎖すなわちArg及びLysを含
むものである。
本発明の複合LT/STポリペプチドは、すなわち、下記の式%式%
式■
(X) 、、−(A)、−(Z)、−B−(Z)、−(A)、+ (Y)。
ここで、X、Y及びZが存在するときは、これらはfal Lys及びArg残
基より成る群から選ばれる、又は
(bl Asp及びGlu残基より成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、
n及びmは、Oll、2.3又は4の整数でありで、nとmの一方の又は両者が
ゼロのとき各X及びYは存在せず、n及びmの一方又は両者がゼロでないときに
は各X及びY残基は存在し、ポリペプチド当りのX及びY残基の平均数は各々X
及びYの値に等しく ;
r及びSは、0.1又は2の整数であって、r及びSの一方又は両者がゼロのと
き各Zは存在せず、r及びSが存在するとき各Zは存在し、複合LT/STポリ
ペプチド分子又は繰返し単位当りのZ残基の平均数はr又はSの値に等しく、但
し、r又はSの一方がゼロより大きいときにはr又はSの他方はゼロであり、そ
のr又はSがゼロであるところの各Zは存在せず;0及びpは、O又は1の整数
であって、0及びpの一方がゼロであるとき対応するAは存在せず、但し、0及
びpの両者が同じ値を持つことはなく;
Aは、大腸菌の熱不安定腸毒素のB−サブユニットのアミン末端から駒位置35
〜約位置95のアミノ酸残基配列に配列において対応する約10〜約35のアミ
ノ酸残基を含むポリペプチドであり、ここで位置数はHG B−サブユニットの
21残基シグナルポリペプチドを含み;そして
Bは、大腸菌の熱安定腸毒素の少くともカルボキシ末端14残基に配列において
対応する18までのアミノ酸残基を含むポリペプチドである。
弐■においてAが示されるポリペプチド配列は、本明細書で開示されるLTBポ
リペプチドのいずれであってもよい、しかし前述したように、好ましいLTBア
ミノ酸残基配列は、LTB−サブユニットのアミノ末端から駒位置55〜約位置
85に配列において対応する約15〜約30残基を含む。最も好ましいLTB配
列は、LTB−サブユニットのアミノ末端から駒位置60〜約位置85に配列に
おいて対応する約20〜約25アミノ酸残基を含む。
例示的LTBポリペプチドは、後記の結果の部(Vl)で示され式■においてB
が示されるポリペプチド配列は、本明細書で開示されるSTポリペプチドのいず
れであってもよい、好ましくは、前述したように、STポリペプチド部分は、S
T Iaゲノムによりコードされる72残基配列がST Ibpの同じ18残基
配列で終了するので、STポリペプチドのカルボキシ末f?418残基とも定義
されうる、ST Ibh又はST Ibpの18残基配列を含む、また、好まし
いSTポリペプチド部分は、ゼロであるところの少くともa x fの四つ及び
g−pの四つを含む。最も好ましくは、STポリペプブチド繰返し単位において
Cys残基のほぼ総ては、モノマー状複合LT/STポリペプチドにおいて分子
内、ポリペプチド内ジスルフィド結合を形成する又は繰返し単位として複合LT
/STポリペプチドを含むネットワークポリマーにおいて分子内、ポリペプチド
間ジスルフィド結合を形成するシスチン残基のような酸化形で存在する。すなわ
ち、最も好ましくは、a −r及びg−1の総てがゼロである。
モノマー状複合LT/STポリペプチドは典型的には、約0.5ミリグラム/ミ
リリツトル(mg/m1)より低い濃度でポリペプチドを含む、還元されたLT
/STポリペプチド含有酸化媒体の空気酸化により作られる。より好ましくは、
この濃度は約0.1〜約0.25+og/m fである。より低い濃度が用いら
れることができるが、しかし典型的には、多くの目的に有用であるためにはあま
りに少しのモノマー状の酸化されたLT/STポリペプチドしか作らない。モノ
マー状ポリペプチドの量の減少は、約0.25+g/m1より上の濃度で起る。
環境空気中に存在する酸素が、酸化剤として好ましく用いられる。他の酸化剤た
とえば過酸化水素及びフェリシアニドイオンを用いることができるが、好ましい
ものではない。
酸化は、T!離のメルカプタン基がエルマンテスト〔エルマン(εllaman
)、Arch、 Biochem Biophys、 82 : 7O−77(
1959))によりもはや検出されなくなるまで、おだやかな攪拌下に、又は攪
拌なしで行なわれる。この酸化は、典型的には1〜約24時間にわたって行われ
、そして三つの分子内、ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合が形成される
場合、−mに約8時間後に完了する。
二つ又は一つの分子内、ポリペプチド内結合は、典型的には約8時間未満で形成
される。
還元された複合LT/STポリペプチドは、約7.5〜約10.5のpH値を持
つ酸化媒体中に溶解又は分散される。空気酸化は、約7.0〜約9.5のpHで
好ましく行われる。より好ましくは、酸化は約7.5〜約8.0OpH値で行わ
れる。酸化二よ典型的には、環境室温で行われるが、好ましくは約o℃〜約25
℃で行われる。
酸化反応完了後に、酸化された複合LT/STポリペプチドは典型的には、たと
えば凍結真空乾燥により集められる。このように集められた乾いた物質は、その
まま用いられるが、又はたとえば静止相としてイオン交換樹脂又はゲル除去マト
リックスを用いるカラムクロマトグラフィにより精製される。
先の研究は、モノマー状合成ST中の分子内、ポリペプチド内シスチンジスルフ
ィド結合が、アミノ末端から第一と第五、第二と第四、及び第三と第六のCys
残基の間に形成されることが見い出されることを示した;これらCys残基は、
アミノ末端がらそれぞれ位置6と10.5(!:14、及び9 ト170)ST
Ibh(7)残基ニ対基STポリペプチド中のカルボキン末端からの位置は、
式nに示される14残基ポリペプチド中のカルボキシ末端位置と同様である。
モノマー状合成STポリペプチドのための分子内、ポリペブチから番号を付けて
、ジスルフィド結合形成の順序は、位置6と10のCys残基、次に位置9と1
7、続いて5と14のCys残基の間であった。
モ/ ?−状合成ST Ibhの一次及び二次構造は、従って、アミノ末端から
カルボキシ末端へと下記の通りであった:ここでCys残基を結ぶ線は、これら
残基の間に形成された分子内、ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合を示す
。
ST関連アミノ酸残基配列の同定、本発明のST含有複合LT/STポリペプチ
ドと先に作られた非置換STモノマー状ポリペプチドにより示されるST抗原性
の1W(U性の観点がら、モノマー状複合LT/STポリペプチドの37部分の
二次構造は、先に作られたSTポリペプチドのそれとほぼ同じであると考えられ
る。
従って、三つの分子内、ポリペプチド内シスチン結合を含む例示的複合LT/S
Tポリペプチドは、下記の弐■a及び■bより示される一次及び二次構造を持つ
と考えられる。
弐■a
ここで、LTB−は、STIbhのアミノ末端に又はST Ibpのカルボキシ
末端にペプチド結合された前述のLTBポリペプチドの任意のものであり、Cy
s残基を結ぶ線は、これらCys残基の間に形成された分子内、ポリペプチド内
シスチンジスルフィド結合を示す。
同様に、二つの分子内、ポリペプチド間シスチンジスルフィドつと考えられる。
弐■
Tyr(Asn)ProAlaCysAIaGlyCysAsn(Tyr)S
ここで、LTB−1Cys残基を結ぶ線、カッコ付きのAsn及び一つの分子内
、ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合ヲ含弐X
Tyr(Asn)ProAIaCysAIaGIyCysAsn(Tyr)ここ
で、LTB−5Cys残基を結ぶ線、カッコ付きのAsn及びLTBポリペプチ
ドは複合LT/STポリペプチドのST配列部分のカルボキシ末端に結合されう
ろこと、及びpn6.sで電荷を持つ側鎖を持つ二つまでの追加的残基は複合体
のLTBと37部分の間にあることができること、及びpH6,5で同しイオン
電荷を与える1〜4つの追加的な酸性又は塩基性側鎖残基が複合体のLTB及び
37部分の一方又は双方の末端に結合されることができることに留意すべきであ
る。
111、LTBポリペプチド繰返し単位を含むポリマー前述したLTBポリペプ
チド繰返し単位を含むポリマーは、本発明の特に好ましい実施態様である。
ポリマーは、類似のモノマー状複合LT/STポリペプチド又はLTBポリペプ
チドのモノマー形に比べていくつかの利点を持つ、第一に、免疫原として用いら
れるとき、ポリマーは担体蛋白質を必要としない、第二に、ポリマーは一般に、
STが含まれるポリマー状繰返し単位であるときに、天然に生じるLTB−サブ
ユニット又はST毒素のいずれの生物学的活性をもほとんど示さない。第三に、
LTB及びSTポリペプチド繰返し単位の両者がポリマー中に存在するととき、
このポリマーの両繰返し単位の免疫原性は、同じ配列の類領のモノマー状物質よ
り良く、とくにポリマーの37部分に関して典型的に改善される。
A、線形ポリマー
線形ポリマーは、LTBポリペプチド繰返し単位を含む意図されるポリペプチド
の一群を包含する。そのような物質は、繰返し単位として、先述したLTBポリ
ペプチドの多数を含む、還元された七ツマー形において、各LTBポリペプチド
は、そのアミン末端に結合された追加的Cys残基、及びカルボキシ末端に結合
された追加的Cys残基を含む、そのように構成されたポリペプチドは、ジCy
s−LTポリペプチドと呼ばれる。
後記するジCys−LTポリペプチドの酸化は、多数のLTBポリペプチド繰返
し単位を含む線形ポリマーを与える。そのようなポリマーの繰返し単位は、LT
Bポリマー繰返し単位にペプチド結合された末@Cys残基の酸化により形成さ
れた分子内、ポリペプチド間シスチンジ入ルフィド結合により互に結合される。
重合媒体がジCys−LTポリペプチドのみを含むとき、ホモポリマーが得られ
る。もし、Cys残基の四つに対する代替物として四つのSer残基を含む先述
のSTポリペプチドのように、僅か二つのメルカプタン含有Cys’A基を含む
別のポリペプチドが重合媒体中に混入されるなら、コポリマーが得られる。
そのLTBポリペプチド繰返単位がアミノ酸残基配列においてLTBの位置58
〜83に対応したジCys−LTポリペプチド(ジCys LTs*−++s
)の酸化により作ったポリマーを用いて、予備研究が行われた。これら研究の結
果は、後述するように、同しLTB配列の複合LT/STポリペプチドを用いて
得たのと類似の免疫反応性を示した。
B、ネットワークポリマー
先述のLTBポリペプチド及びSTポリペプチド繰返し単位を含むネットワーク
ポリマーは、本発明の特に意図される実施態様である。
これらポリマーは、ネットワークポリマーと呼ばれる。なぜなら、このポリマー
は、分子内、ポリペプチド内シスチンジスルフィド及びポリペプチド間シスチン
ジスルフィド結合の両者を形成しうる、即ち架橋した三次元ネットワークを形成
しうる六つのCys残基を好ましくは含むST含有ポリペプチドの酸化により作
られるので、著しく架橋されるからである。
(1)複合LT/STポリペプチド繰返し単位本発明の一つのネットワークポリ
マーは、繰返し単位として、先述の複合LT/STポリペプチドの多数を含む。
この繰返じ単位は、酸化されたシスチン(Cys)残!4こより与えろれる分子
内、ポリペプチド間シスチンジスルフィド結合により互に結合される。
ネットワークポリマーは、環境空気中の分子酸素により酸化された先述の複合L
T/STポリペプチドの還元(システィン含有)形から作られる。複合LT/S
Tポリペプチドは約0.5 mg/ m 1より高い濃度、より好ましくは約1
〜約5mg/m1の?;度又は複合LT/STポリペプチドの酸化媒体への溶解
限界までの濃度で酸化される。
やはり、酸化は、おだやかな攪拌下又は攪拌なしで行われ、溶液(酸化媒体)と
酸化剤空気の間の接触は、約1〜約24時間、より好ましくは約8時間、または
先述したエルマン法で測定してT1刈メルカプタンモノマーが存在しな(なるま
で続けられる。複合LT/STポリペプチドの還元形の濃度を除いて、モノマー
状複合LT/STポリペプチドを形成するため又は繰返し単位として多数の酸化
された複合LT/STポリペプチドを持つネットワークポリマーを形成するため
の酸化は、はぼ同じである。
本発明のネットワークポリマーの分子量は、広く変りうる。平均分子量は、約2
0,000ダルトン(20kd)から百方ダルトン以上にわたる。
+21 L T Bポリペプチド及びSTポリペプチド繰返し単位本発明のネッ
トワークポリマーの別の実施Qpは、先述したような第一のジCys−LT繰返
し単位の多数なちびに先述したような第二のSTポリペプチド繰返し単位の多数
(ここでSTポリペプチドは式■で示されたようなSTの少くとも14カルボキ
シ末端残基を含み、ペプチド結合されたLTBポリペプチドを含まない)を含む
、すなわち、このポリマーは最初に挙げた及び第二のポリマー繰返し単位が、繰
返し単位の各々に存在するCys残基の酸化により形成されたところのシスチン
ジスルフィド結合により互に結合される。
この二種の繰返し単位は、約lO:1〜約1:10のモル比でポリマー中に存在
できる。好ましくは、繰返単位は、約5:1〜約1:5のモル比で存在する。最
も好ましくは、ジCys−LT対ST繰返し単位のモル比は、約l:l〜約3:
1である。なぜなら、LT、B−サブユニットの位置58〜83に対応するよう
な好ましいLTBポリペプチドは、天然のLTB−サブユニー/ )の約1/2
〜1/3の免疫原性を持つことが見い出され、一方、STポリマーは典型的には
天然STと同等に又はより高く免疫原性であるからである。
STポリペプチド繰返し単位がCysメルカプクンに結合されたブチド繰返ル華
位たとえば複合LT/STポリペプチド繰返し単位を含む他のポリマーの調製の
ために木明18書で述べられるように、存在することが好ましい、なぜなら、少
くとも一つの分子内ポリペプチド内シスチンジスルフィド結合を持つことが好ま
しく二つのCys残基が線形重合のために必要であるからである。すなわち、二
つのCys残基が、ネットワークポリマーの架橋の形成のために利用できる。
これらネットワークコポリマーは、繰返単位の還元形から、ポリマーの!II製
について後述の■部の手順に従って作られる。
(3)追加的LTBポリペプチド含有不フトワークポリマーLTBポリペプチド
含有ポリマーのさらに別の群は、(i)ジCys−LTポリペプチド及び(ii
)複合LT/STポリペプチドより成る繰返し単位を含むコポリマーである。
これらポリマーは後述の酸化手順に従って、ジCys−LTポリペプチド及び複
合LT/STポリペプチドの還元形を含む酸化媒体(溶液又は分散物)と環境中
の分子酸素を接触させることにより作ることができる。そのようなコポリマーの
繰返し単位はまた、還元されたポリペプチド中に存在する酸化されたCys5M
7Lのシスチンジスルフィド結合により互に結合される。
これらコポリマーは、ジCys−LTポリペプチドにより与えられるLTBポリ
ペプチド繰返し単位、及び複合LT/STポリペプチドにより与えられるLT/
ST繰返し単位を約0.25:1〜約5:1のモル比で含むことができる。より
好ましくは、用いられるモル比は、上述した順で約1:l〜約2:lである。す
なわち、そのようなポリマーにおけるLTBポリペプチド含有繰返し華位合計対
STポリペプチド繰返し単位のモル比は、約1.25:1〜約6;1、より好ま
しくは約2:l〜約3:1である。
二つのLTBポリペプチド含有繰返し単位におけるLTBポリペプチド配列は同
じである必要はない、しかし好ましくは、両者は同しであり、先に述べた特に好
ましいLTBポリペプチド配列に対応する。
■、ST含有ポリペプチドを酸化するため及びポリマーを調製するための一般的
合成手順
STポリペプチドたとえば複合LT/STポリペプチドを含むモノマー状物質を
作るため、及びLTBポリペプチド繰返し単位を含むポリマーを作るための、後
述の結果及びいくつかの他の測定に基づく一般的合成手順は、下記の通りである
。
(11還元性のCysrA基を含む七ツマー状の第一のポリペプチドは、酸化剤
の実質的不存在下で作られる。第一のポリペプチドは、前述した追加的アミノ酸
残基を有する又は存さない、本発明のLTBポリペプチドのアミノ酸残基配列た
とえばジCys−1−Tポリペプチド又は複合LT/STポリペプチドを含み、
分子内シスチンジスルフィド結合を実質上台まない。
(2)そのようにして作られた第一のポリペプチドが用意され、ポ/m1未満の
濃度、最も好ましくは約1mg/m1〜約0.5mg/mllの濃度で;そして
モノマー状複合LT/STポリペプチドを作るために約0.5 mg/ m 1
未満、より好ましくは約0.25〜約0、1 mg7 m lで水性酸化媒体中
に溶解又は分散される。第一のポリペプチドがその中に溶解される又は分散され
る酸化媒体のpH値は、好ましくはアルカリ性であり、約1O85未満、より好
ましくは約7.5〜約10.5である。
(3)第一のポリペプチドを含む酸化媒体は、その後、酸化剤としての空気中分
子酸素と接触させられる。酸化の間の媒体のpi(値は、好ましくは約7.0〜
約9.5、より好ましくは約7.5〜約9、最も好ましくは約7.5〜約8.0
である。媒体は好ましくは、おだやがな攪拌あり又はなしで、環境空気と接触さ
せられる。
(4)酸化媒体と空気の間の接触は、存在するCys (CysH)残基から少
くとも一つの分子内、ポリペプチド内又はポリペプチド間シスチンジスルフィド
結合を形成するために、約1〜約24時間、より好ましくは約2〜約8時間続け
られる。モノマー状複合LT/STポリペプチドに関しては、少くとも一つのシ
スチンジスルフィド結合が分子内、ポリペプチド内結合であり、一方、ポリマー
に関しては少くとも一つのシスチンジスルフィドが分子内、ポリペプチド間結合
である。ポリマーの各STポリペプチド含を繰返し単位が平均約二つのポリペプ
チド内シスチンジスルフィド結合を形成して、二より多い複合LT/STポリペ
プチド繰返し単位を持つポリマーが形成されることが好ましい。
モノマー状複合LT/STポリペプチドの好ましい実施態様において、各々ST
Tbh又はST ibp分子のアミノ末端から5と14.6とlOl及び9と
17の残基の位置に対応する、式■及び■のの間に、ジスルフィド結合が形成さ
れる。より好ましい態様において、分子酸素と溶液の間の接触は、二つのジスル
フィド結合を好ましくは上述のCys残基対の間に形成するため、及びより好ま
しくは三つのジスルフィド結合をやはり好ましくは上述のCys残基対の間に形
成するために十分な時間、維持される。
酸化は、好ましくは約り℃〜約25℃で行われる。
(5)酸化反応の完了後に、合成モノマー状複合LT/STポリペプチド又はポ
リマーは、典型的には、たとえば凍結真空乾燥により集められ、カラムクロマト
グラフィにより精製される。
■ 免疫化及び抗体
本発明のポリペプチド接合体、複合LT/STポリペプチド接合体又はポリマー
は、生理学的C二許容される希釈剤中の有効量のポリペプチド接合体、複合LT
/STポリペプチド接合体又はポリマーを有する単位投与量接種物として哺乳動
物宿主に導入されると、LTB−サブユニット単独又はLTB−サブユニットな
らびにSTポリペプチドに免疫反応する宿主咄乳動物中で抗体の生産を誘発する
ことができ、そして好ましくは宿主動物をこれら毒素を分泌する大腸菌によりひ
き起されるインビボ感染から保護す華位投与量中のポリペプチド接合体、複合L
T/STポリベブチド接合体又はポリマーの「有効量」は、多数の因子に依存す
る.これら因子としては、免疫化される動物の体重及び用いられるよう望まれる
接種回数が含まれる.個々の華位投与接種は、典型的には、噛乳動物宿主の体重
1kg当り約10μg〜約5+egのポリペプチド、複合LT/STボリペプチ
ド又はネットワークポリマーを含む.通常用いられる単位投与量は、宿主体重1
kg当り約0.5+igを含む.抗体の生産及び生育しうるETECに攻撃され
たときの保護のためにラビット及びラットにおける接種法及び量は、各々、後に
記載される.
ポリマーの繰返し華位でないポリペプチドは、担体に共存結合されたポリペプチ
ドハプテンの接合体として投与される.ここで用いられる有用な担体は、プク免
疫グロブリンG(PIG)、破傷風トキソイド(T T)及びキイホールリンベ
ノトヘモシアニン(K L H)である.他の存用な担体としては、ウシ血清ア
ルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、ピーナソッ凝集素、オバ
ルブミン、クルクビン(curcubin) 、ボリL−(Lys:Glu)な
どが挙げられる。
生理学的に許容できる希釈則は、従来周知である.そのような希釈剤の例は、萎
留水又は脱イオン水、通常の食塩溶液及びリン酸塩で緩衝した食塩(P B S
)溶液である.免疫化組成物つまり接種物は、公知法を用いて、経口的に又は静
脈内、皮下又は腹膜内注射などにより宿主中に導入されうる.補荊たとえば完全
フロインドの補則(CFA) 、不完全フロインドの補則(IFA)、みょうば
ん、破傷風トキソイド及び免疫学分野で周知の他のものなどが、生理学的に許容
できる希釈剤の一部として接種物に含められることもできる。促進注射もまた、
宿主の血清において望む抗体力価を得るために、望まれるなら与えることができ
る.
正確な投与量は、動物及び用いられるポリペプチド接合体、複合LT/STポリ
ペプチド又はポリマーに依存し、公知の攻撃法を用いて決定できる.
本明細書で「接種物」という言葉は、何らかの免疫化組成物を意味するものとし
て用いられる.従って、この言葉はまた、腸毒素生産性大腸菌株に対するインビ
ボ保護を与えるための、ヒト及び噛乳動物で有用なワクチンをも含意する.所与
のワクチンと接種物とは、ヒト以外の補乳動物が関係する場合には同一でありう
るが、しかレヒトが意図される宿主であるときには典型的には異る.この異るこ
との理由は、CFAのような補則はヒトでは用いられず、もし何らかの補則がヒ
トワクチン中に存在すべきであるなら他の補則を用いなければならないことであ
る.「単位投与量」という言葉は、動物のための単位の投与量として適当な物理
的に分割された単位を云い、各華位は、必要な希釈剤又はビヒクルとの関係で望
む治療効果をうるべく計算された所定量の作用物質を含む.本発明の新規な単位
投与単位のための処方は、(al免疫原の特存の特性及び達成されるべき特定の
治療効果、及び山)動物における治療的使用のためのそのような作用物質を配合
することに固有の技術的制限により指示されかつ直接に依存する.
本発明のポリペプチド、複合LT/STボリペプチド又はポリマーに対する抗体
は、ETEC感染を評価する又は処置するために用いうる.この抗体は、そのま
まの抗体全体として直接に用いることができ、又はFab又はF(ab’)t部
分(これらの総てが生理学的に活性である)をうるために加工することができる
.「抗体」という言葉は、そのままの抗体全体、又は生理学的に活性でありその
抗原リガンドすなわち完全なLT毒素、その日−サブユニット及び/又は適当で
ある天然STと免疫反応できるすなわち結合できる、抗体のイディオタイプ含有
ボリアミド部分を示す.抗体を作るために、前述の免疫化接種物はたとえば注射
により宿主動物に導入される.この宿主は、抗体が誘発されるに十分な時間、通
常1〜約4ケ月間維持される.誘発された望む抗体は、その後、宿主体液から集
められる.そのように誘発された抗体そのものを直接用いることができ、又はそ
れらは周知のようにペプシン又はパパインにより開裂されて、使用されるF(a
h’)z又はFab部分を提供することができる.作られた抗体はまた、受動的
免疫的予防法のための処置剤として用いることもできる.■.結果
A.LTBポリペプチドの抗原性
LTBサブユニットの124アミノ酸配列の種々の領域からのアミノ酸の種々の
長さを含む一連のポリベブチドを合成した.B/B ELISA(材料及び方法
の部で述べる)により測定して天然のB−サブユニットの抗原性の約5%超を持
つ三つの例示的ポリペプチドを第1図に図示的に示す. GM+ / B E
L I S A(材料及び方法の部で述べる)により測定された値は、各例にお
いて、B/B ELISAにより得た値と極めて類似した.二つのLTBポリペ
プチドが、複合LT/STポリペプチドを形成するために、ST ’ Ibhの
18アミノ酸残基配列のアミノ末端から配列的に一緒に合成された.繰返し単位
として複合LT/STポリペプチドを持つネットワークポリマーを得るための複
合LT/STボリペプチドの酸化は、B−サブユニットポリペプチド部分の抗原
性を高めた.つまり、LTBの位置35〜位置55に対応する配列のB−サブユ
ニット抗原性は約49%に高まり、位置58〜位置83に対応する配列のそれは
天然B−サプユニ−/ }のそれの約95%に高まった(第1図).二つの複合
LT/STボリペプチドの配列は、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末
端の方向に、各々式Xla及び式Xlbにより下記に示される:式Xla
AsnThrGInlleTyrThrlleAsnAspLyslleLeu
SerTyrThrGluSerMetA1aGIyLysAsnThrPhe
T yrCysCysG I uLeuCysCysTyrProA IaCy
s A l aG lycysAs n式Xlb
MetVallleTleThrPheMetSerGlyGluThrPhe
GlnValGIuValProGlySerG1nHislleAspSer
G InLysAsnThrPheTyrCysCysG luLeucysc
ysTyrProAlaCys^laG lycysAsn式XTbの複合LT
/STボリペプチドが、単独で、接合体として及びネットワークの繰返し単位と
して担体に結合されてさらに評価されるために選ばれた.
B.モノマー状複合LT/STポリペプチドの免疫原性式Xlbの複合LT/S
Tボリペプチドの免疫原性は初めに、この物質単独又は大分子量抗体(ブタ免疫
グロブリンG(PIG))マー形について評価された.このポリペプチドは、カ
ンプリング剤としてグルグルアルデヒドを用いて、ポリペプチド対11G比−2
,35:1(重量比)でPIGに接合された。得た接合体は、複合LT/STT
/ペプチドを58重量%含んだ、複合LT/STT/ペプチドの抗原性は、接合
反応により影響されなかった。
従って接合体の1ミリグラム(mg)は、580B−サブユニット抗原単位(A
ll)を含んだ。
ラットは、天然のB−サブユニット又は複合LT/STT/ペプチドの200A
Uによる腹膜内(IP)第一免疫化を与えられ、次に段階分けしたAU投与量の
2回の経口CPO’)促進を受けた。第3図に示すように、接合されたポリペプ
チドは、天然B−サブユニットにより達成されるのと比べて、B−サブユニット
に対する腸IgA抗毒素の同じ力価を生じ、僅かにのみ低い程度の、生育しうる
LT°/ST−株による攻撃に対する保護を与えた。
予期されるために、低分子量の接合されていない複合LT/STT/ペプチドに
よる免疫化は、抗毒素反応を生じる又は保護を与えることに失敗した。接合体に
よるこれら有望な結果が、重合された形の複合LT/STT/ペプチドの製造及
び特性の把握へと導いた。
C1複合LT/STポリペプチド繰返し単位を含むネットワークポリマーの特性
(1)抗原性 複合LT/STT/ペプチドの配列式Xlbに対応する繰返し単
位を持つもう一つのネットワークポリマーの抗原性は、GM、/B ELISA
で測定して天然B−サブユニットのそれの57%、B/B ELISAで測定し
て54%であった;そのST抗原性は、ST/ST EL I SA (材料及
び方法の部で述べる)で測定して、合成STのそれの47%であった。
(2)毒性 このネットワークポリマーは、チャイニーズハムスター卵巣(CH
O)評価〔グーラント(GuerranL) t Infect、 Imaun
。
10 : 320−327(1974))において、この評価法における陰反応
を引き出すために必要なLTの最小投与量(20ナノグラム(ng) )の5百
万倍である100マイクログラム(8g)の最大テスト投与量において陰反応を
示した。このネットワークポリマーは、幼児マウス評価〔ギアネラ(Giann
ella)、 Infect、 Immun、 14 : 95−99. (1
976) )において、この評価法における天然又は合成上ツマー状STの最小
有効投与量5ngの2万倍である100μgの最大テスト投与量において陰反応
を示した。
このネットワークポリマーのlagの滴下は、結さくしたラット回腸ループ〔ク
リブスティン(Klipstein)、 Infect、 lm5un、 40
:924−929(1983) )において体液分泌を誘発するのに失敗した。
この値は、LTのEDs*(最大分泌を与える投与量の半分) (170ピコグ
ラム(pg) )の5.9百万倍であり、この評価法におけるSTのED、。投
与量(20g)の50万倍である。
(3)免疫原性 ワクチンにおける免疫原としてネットワークポリマーによるラ
ットの免疫化の結果は、天然のB−サブユニット又は天然のB−サブユニットに
化学的に結合された合成STによる免疫化により達成されるそれと比較された。
これらの結果を第4図に示す。
EL I SA測定法に基づいて、ネットワークポリマー含有ワクチンは、ST
及びB−サブユニットの両者の500AIJを含むと考えられた。総てのラブド
は、200AUによるIP第一免疫化を受け、次に段階分けしたAU投与量によ
る2回のPO促“進免疫化を受ける。
ネットワークポリマー含有ワクチンの4000STAUの合計PO投与量は、化
学的に結合された合成ST/天然天然チーサブユニット接合体T (S)XB)
における3000STAUの合計投与量により達成されるのと同じレベルの腸1
gAST抗毒素力価を生し、かつ生育しうるLT/ST’による攻撃に対して同
じ程度の保護を与えた。しかしネットワークポリマー含存ワクチンの6000B
−サブユニットAυの合計PO投与量が、天然B−サブユニットの200OAL
lと同等の抗毒素反応及びLT” /ST−株での攻撃に対する保護を得るため
に必要であった。これらのvL察は、ネットワークポリマー免疫原のSTポリペ
プチド部分の免疫原性は合成ST単独のそれとほぼ同じであったこと、しかしネ
ットワークポリマー免疫原のLTBポリペプチド部分のそれは天然B−サブユニ
ットのそれの1/2〜1/3であったことを示した。
ネットワークポリマー含有ワクチンの免疫原性はまた、専らPOルートで各4週
ごとに免疫化されたラットにおいて評価された。
ラットは、腸管外第一免疫化なしで毒素又は架橋されたトキソイドワクチンのよ
り多いPO投与量を必要とする点で、ラビットに典型的に異る〔クリブステイン
(Klipstein)とエンゲルト(Engert)、TnrecL、 Tt
stsu口、 31 : 252−260(1981) :において、クリプス
テインらrnfect、fmun、 40 : 924−929(1983)及
びクリプステインら、Infect、Immun、 40 : 888−893
(1983)) −腸1gA抗毒素力価128に上げラットにおいて強い保護を
与えるために必要なこのアプローチによる合計PO投与量は、4000Allの
合成ST(天然B−サブユニットに化学的に架橋された)及び5000AUのB
−天然サブユニット、つまりIP/Poアプローチにより必要とされるものの約
二倍であった。これは、第5図のデータから判る。
この発明、及びネットワークポリマーのLTBポリペプチド部分が天然B−サブ
ユニットのそれの約半分であったという事実に基づいて、ラットはST及びB−
サブユニットの10.000Allを含む合成ワクチンの合計PQ投与量20■
で免疫化された。これは、合成ST又は天然B−サブユニットでの免疫化より得
られるのと同し抗毒素反応及び保護程度を達成した。
ネットワークポリマー免疫原のLTBポリペプチド部分が天然B−サブユニット
より低免疫原性であるという発明は驚ろくべきことである。なぜなら、従来の結
果は、EL I SAで測定された抗原性が実験動物における免疫化への反応に
より測定される免疫原性と密接に関係することを示したからである〔クリプステ
インら、Infect、Imaun、 40 : 924−929(1983)
;及びクリプステインら、Infect、I+aa+un、 44 : 26
8−273(1983) ) 、この相違の理由は不確かであるが、しかし、比
較的に低下された免疫原性は免疫原のLTBポリペプチド部分のアミノ酸残基配
列がブタローサブユニットについて述べたものに基づいており(ダラス(Dal
las)とファルコウ(Falkow) 、ネイチア(Nature)、 27
7:406−407(1979))、一方、免疫化されたラットはヒ)LT生産
大腸菌株により攻撃されたという事実によることが疑われる。
第一に、ブタとヒトのB−サブユニットのアミノ酸残基配列は、僅か六つのアミ
ノ酸により異っており、位置58〜位置83の領域における唯一の違いは、ブタ
ローサブユニットにおけるMet及びヒトB−サブユニ、トにおけるLysを含
む位置64にある〔中本ら、J、 Bacteriol、 152 : 506
−509(1982) ) 、 ’J−二に、ブタ及びヒトLTは、同じかつ顕
著に抗原性の決定子を含み〔ホンダ(Honda)ら、Tnfect、[s+s
un、 34 : 337−340(1981)) 、違いはB−サブユニット
にある〔クレメン゛ン(Clements) 、Infect、夏m5un。
38 : 806−809(1982))が、ヒト又はブタの天然B−サブユニ
ットによる免疫化は、対応又は非対応LT毒素又はこれら毒素を作る生育しうる
株に対する同じ程度の保護を与えたことが報告された〔クリプステインら、Tn
fect、l+uaun、 40 : 924−929(1983) ;及びク
リブステインら、Infect、I+usun、 43 : 811−816(
1983)) 。
観察された相違が他の要因によることが、よりありそうなことである、これら要
因の一つは、合成ワクチンのポリマー形の立体配置でありうるi18アミノ酸残
基ST分子の立体化学がその免疫原性に深く影響し〔クリプスティンら、Inf
ect、Immun、 44 :268−273(1984) ) 、位置58
〜位開位置のアミノ酸を含むB−サブユニットポリペプチドの免疫原性は、それ
が単独であるがSTに結合されているか、また免疫原全体がモノマー形がポリマ
ー形かにより変化されてきた。
可能性のある第二の要因は、ワクチンの免疫原の最適でない溶解特性である。ネ
ットワークポリマーは、ある例における十二指腸、空腸の内容物より少しアルカ
リ性である、7.0未満OpH値において不溶性になる。
予備研究は、合成ワクチンの免疫原性が、それを、十二指腸のアルカリ性を増す
ために重炭酸塩を伴って投与することにより高められうろことを示した。また、
本明細書で述べるように、合成の複合LT/STポリペプチドのアミノ酸残基配
列は、腸管において合成免疫原を可溶化することを助けるために、空腸のpi(
値(約6.5)でイオン電荷を備える、LTB又はSTポリペプチド配列中には
存在しない酸性又は塩基性側鎖含有残基の付加により変えられうる。
D、別の抗原性研究
下記の表1のデータは、アミノ末端から駒位置35〜約位置95のLTB蛋白質
配列の部分に対応する(位置数には21残基シグナルペプチドを含む)合成ポリ
ペプチドの抗原性を例示する。
データは、ブタLTBポリペプチドの
(al 単独の場合、又は
(1)) ネットワークポリマーの複合LT/STポリペプチド繰返し単位とし
ての場合(ポリマー)
についてのものである、抗原性は、LTBポリペプチドのためのB/B及びCM
、/B ELISA評価法、及び後記の材料及び方法の部で述べるST/ST
ELISA評価法を用いて測定された。
表1 抗原性1
旦工旦抜兇a ST抗原性
37−75 ポリマー 31 22 4864−75 ポリマー 32 25
4858−83 単独 21 27 −−
ポリマー353−126 53−98 −−63−83 ポリマー 52 47
5369−83 ポリマー 13 12 2876−83 ポリマー 27
25 351: 抗原性は、天然LTB−サブユニット又は合成ST−1bhモ
ノマーの活性のパーセントとして表現される。
2:LTPB−サブユニット蛋白質のアミノ末端がらのアミノ酸残基位置、各ポ
リペプチドにおけるアミノ酸残基は、第1図又は後述の節!中の表6に示される
配列を参照して決定されうる。
3: 三つのネットワークポリマー調製物についてのELISA測定した抗原性
の範囲。
上の結果は、ポリペプチド、及び繰返し単位として複合LT/STポリペプチド
を含む種々のぶフトワークポリマーの抗原有効性を示す。
E 免疫原性/抗原性研究
別の抗原性研究が、担体としての破傷風トキソイド(TT)及びキイホールリン
ペットヘモシアニン(K L H)に接合されたLT、Bポリペプチドより成る
免疫原に対して生じた抗体についても行われた。ここで、生理学的に許容される
希釈剤中に分散された免疫原性接合体はワクチンとして、宿主動物としてのラビ
ットに単位投与量で導入された。
宿主動物は、LT、Bポリペプチドに対する抗体を誘発するのに十分な時間、約
4〜約5週間、維持された0次の動物は出血され、免疫原性ポリペプチドに対す
る抗体含有抗血清が得られた。
各抗血清について、最高結合の172の力価が、抗原としてポリペプチド免疫原
又は天然LTPB−サブユニ7)を用いてEILISAにより評価された。用い
られた手順の詳細は、後の材料及び方法の部に記載される。担体として破傷風ト
キソイドを用いたこれら評価の結果は、下記の表2に示される。
表2
LTPBポリペプチド/破傷風トキソイド接合体の抗原性3LT、B 抗ボリベ
ブチド力価3 抗天然LTkB力価4ヱlム役位12
35−55 320;1280 360−64043−63 1280 10よ
り小
48−57 1280より大 20
48−63 1280より大、640 10より小54−72 1280より大
40;80−16058−83 1280 ; 1280より大 320;1
0より小58−83’ 32,000;2000 620−1280;80−1
6061−77 32.000 320−64063−93 16,000 ;
32.000 800−160071−87 3200−6400 ; 25
,000 160−320 ; 40−8077−94 1280より大 10
より小;3205B−83/5T−1bh’ 1280より大? 1280 1
60 ; 640−128048−57/5T−1bh’ 1280より大;
1280 10より小表2の結果は、本発明のポリペプチド及び複合LT/ST
ポリペプチドが免疫原性であり、また抗原性であることを示している。
これらポリペプチドは、それらが天然LTkB−サブユニット蛋白質と免疫反応
する(結合する)抗体の生産を誘発できる点で免疫原性である。これらポリペプ
チドは、それらが誘発した抗体と免疫反応する点で抗原性である。
開襟の研究が、複合LT/STポリペプチドのための担体としてのKLHを含む
接合体を用い、しかし宿主哺乳動物として一匹だけのラビットを用いて行われた
。その研究結果を、下記の表3に示す。
表3
−LT、Bポリペプチド/KLH接合体の抗原性1LT、Bア 抗ポリペプチド
力価3 抗天然t、ThB力価41左筐亘!2
35−55 32.000−64.0000 80004 B −6316,0
00−32,00020−4054−728,000−16,00020−40
58−834,000−8,0008058−83’ 4,000−8.000
8061−77 16.000−32.000 40−8063−93 16
.000−32,000 80−16071−87 32.000−64,00
0 80−160? ? −9432,000−64,00040−801〜5
:表2の脚注1〜5を参照
上の結果から判るように、担体としてのKLHの使用は、TTに比べて、免疫化
ポリペプチドのための誘発された抗体の抗原性を改善し、一方、天然LT、B−
サブユニットに対する抗体の抗原性を低減する。
表2及び表3の結果は、表1又は第2図の結果と重要に異っていることに留意さ
れなければならない6表2及び3の結果は、本発明のポリペプチド接合体及び複
合LT/STポリペプチド接合体により誘発された抗体と天然LT、B−サブユ
ニット蛋白質分子との直接的相互反応を示す0表1及び第2図に示す抗原性は、
天然LT、B−サブユニット蛋白質に対して生じた抗体とポリペプチド又は複合
LT/STポリペプチドとの免疫反応性を示す。
完全な無欠の蛋白質に対して生じた抗体がしばしば、この蛋白質の抗原的決定子
にアミノ酸残基配列において対応するポリペプチドに結合しないことが知られて
いる。たとえば、シンニング(Shinnick)ら、Ann、 Rev、門1
crobio1.37:425:446(1983)参照。
すなわち、G M + / BまたはB/B ELISA研究において結合を示
さないこと又は低い結合力価は、完全な天然t、”rk13−サブユニット全体
により誘発された抗体が本発明のポリペプチド又は複合LT/STポリペプチド
を認識しないことを単に示しているにすぎない。
免疫化法及びEL I SA研究の詳細は、材料及び方法の部に示される。
F、ワクチンの再現性
別の研究が、許容される希釈側に分散された本発明のネットワークポリマーを用
いて作られたワクチンを用いて得られた結果の再現性を評価するために行われた
。用いられたネットワークポリマーは、複合体のST Ibhポリペプチド配列
のCys残基により与えられた分子内、ポリペプチド間シスチンジスルフィド結
合により互に結合された多数の複合LT/STポリペプチドを含むポリマーの二
つの調製物であった。複合LT/STポリペプチドのLTポリペプチド部分は、
LT、B−サブユニットの位置58〜83に配列において対応した。
一つのポリマー状免疫原及びワクチン(以下ではロット001と云う)の結果を
、後記の0部で延べ、第4及び5図に示す、この物質はまた、第4及び5図でB
□AGSTワクチンと呼ばれる。
このポリマー状免疫原の第二のFA調製物、以下でロット002と呼ばれる。こ
のロフトは、B/B及びGM、/B評価による天然LTB抗原性の53及び53
%の抗原性、及びS T/S T評価によるST抗原性の48%を示した。
ロット001により示された毒性欠除は、先に述べた。ロット002は、二匹の
マウスの各々に100マイクログラムの投与量での幼児マウス評価において陰反
応を示した。ロット002は、2匹のラットの各々に、i、oooマイクログラ
ムの投与量でラットの結さくした回腸ループにおいて体液分泌を誘発するのに失
敗した。従って、両鋼製物は、生物学的活性は実質上示されなかった。
ロット001及びロフト002の各々を含んで作られたワクチンが、ラットを免
疫化するために用いられた。免疫化法は、ワクチン中の600μgの免疫原の第
一の腸管外注射及び続く二つのロフトの各々の各4mgの2回のPO促進を用い
た。
平均腸rgAを評価したとき、宿主動物の抗毒素力価は、両ワクチンについて、
STに対して64、LTB−サブユニットに対して128であった。このように
免疫化されたラットの、5T(ST” /LT−)又はLT (ST−/LT”
)Kn毒素を生産する生育しうるETEC株による攻撃に対する保護は、下記
の表4に示される。
表4
腸毒素生産性大腸菌による攻撃
ロフト番号 STツLT−に対する保護I 鉦シC二且旦工ゑ尿履1001 8
4±2 69±1
002 79±2 72±3
1:数値は、免疫化されず攻撃された対照ラットに比べての免疫化されたラット
における分泌減少のノで一セントである。
表4のデータから判るように、ワクチンは、分泌を低減し、大%I&菌の攻撃株
から免疫化宿主動物を保護するにおいて、はとんど同等である。
ネットワークポリマーから作られたワクチンロフト002は、宿主動物において
何らかの悪い副作用が観察されるかどうか確かめるために、通常用いられるより
も高いレベルでも投与された。
ここで、各200〜250g体重の2匹のモルモット及び12〜15g体重の2
匹のマウスの各々に15mgの腹膜的注射を与えた。
動物の体重及び全般的状況を、7日間にわたって研究した。モルモットは、40
.1及び47.6g体重が増え、一方、マウスは、5.3及び8.8g増えた。
どの動物においても悪い副作用は観察されなかった。
G 種々のLTポリペプチド鎖長による抗原性/免疫原性複合LT/STポリペ
プチドのLTBポリペプチドの部分のポリペプチド鎖長の影響を評価するために
、担体としての破傷風トキソイド(TT)に結合された一連の複合LT/STポ
リペブチ・ドを用いて、さらに別の研究を行った; LTBポリペプチドは、L
TB−サブユニットの位置58〜83の領域からであり、位置数は21残基シグ
ナルペプチド配列を含む、これら研究は、先述のVIE部及び表2に述べたよう
に行われた。結果を、下記の表5に示す。
表5
L Ts*−sz / S T/ TT接合体の抗原性1LT、Bアミノ 抗複
合体 抗天然LTFB 抗LTse−si畝亘L−−力−員二一 −カー囁a−
一 −カー債り一58−83/ST 16,000−32.000 8,000
−16.00058−83/ST’ 12.800 60−80 8,000−
16.00061−83/ST 6,400 80−160 3.200−6.
40063−83/ST 6,400−12.800 80−160 3.20
0−6.40069−83ノST 6,400−12.800 60−80 、
400−80073−83/ST 6.400−12.800 60−80
200−4005B−83’ −−16,000−32,000LTB 1,6
00−3.200 64.000 640−1,2801〜4:表2の脚注1〜
4参照
5:複合LT/STポリペプチドの第二調製物6 : LTP Bの位置58〜
83に対応する遊離ポリペプチドに対する力価
7:sTポリペプチド部分なしの位1t58〜83に対応するLTBポリペプチ
ドがTTに接合されて用いられた。
8:LT、B−サブユニットが全体分子免疫原として用いられた。
上述の結果は、11〜36残基を含み、LTポリペプチド部分の位置58〜83
に対応するアミノ酸残基配列を持つテストされた複合LT/STポリペプチドの
総てが、天然LThB−サブユニ、トと免疫反応する抗体を生産するにおいて同
様に有効な免疫原であったことを示す。
上述の複合LT/STポリペプチド接合体により誘発された抗体の免疫反応がま
た、5TIbh及び5TIbpに対して評価された。
複合体のSTポリペプチド部分は変らずであったがLTポリペプチド部分におけ
る約20〜25残基を含む複合LT/STポリペプチドにより、改善された力価
がまた観察された。誘発された抗体は、5TIbh及び5TIbpの両者と免疫
反応し、5TIbhに対する力価はs”rtbpに対するよりも数倍大きかった
。
H0追加的ポリペプチド
5TIbhのアミノ末端にペプチド結合されたt、Tps−サブユニットの位置
48〜位置57 (シグナルペプチドを含め番号をつけて)の残基を含む複合L
T/STポリペプチドを作った。(このポリペプチドの位置数字は、もしシグナ
ルペプチドアミノ酸残基を含めないなら、位置27〜位開位置に対応する。)そ
してポリペプチドは、二重酸化手順を用いて0.5 M重炭酸アンモニウム緩衝
液中のQ、 l a+g/ m 1.1.0 mg/ m 1.及び5.0 B
/ m Ilの濃度で、及び0.1 M酢酸アンモニウム中でpH8で0.1
yag/ m 1及び0、2 B/ m 1の濃度テ酸化さレタ。
0.1及び0.2 mg/ m i tlx度は、主にモノマー状の複合LT/
STポリペプチドを含むと考えられる。 1.0 mg/ m 1での酸化は、
繰返し華位として複合1.、、 T / S Tポリペプチドを含む主にネット
ワークポリマーを与えると考えられる。 5.0 mg/ m Il 調製物は
、はとんどポリマーのみを含んだ。
材料及び方法の部で述べるsr/s’ri亨価を用いて評価された抗原性は、(
a)重炭酸アンモニウム緩衝液中の0.1 mg/ m 1酸化で31.5及び
68.1%;酢酸アンモニウム緩衝液中で0.1及びQ、 ”l wag /
m 1で各々32.9及び41.9%;(C)重炭酸アンモニウム中で1.0
IRg/ m l a化で103.3及び350.0 % i及び(d)重炭酸
アンモニウム中で5.0+g/m1酸化で98.4及び262.5%の免疫原性
を与えた。パーセント値は、天然5TIbpとほぼ同等の抗原性を持つモノマー
状5TIbhポリペプチドにより示される抗原性に基づいたものである。
もう一つの複合LT/STポリペプチドを用いて、同様の研究を行った。そのポ
リペプチドの配列は、5TIbhのアミノ末端に直接ペプチド結合されたLTp
B−サブユニットの位置58〜83(シグナルペプチドを含め)に対応した。(
このポリペプチドの配列位置は、シグナルペプチド残基を除いて位置37〜62
に対応する。)
前述したような環境空気での酸化は、0.5M重炭酸アンモニア中で0.185
mg/m 1.0.25 mg/ m j!、0.50mg/ m j!及び0
、523vag/m 1で行われた。酸化はまた、O,l M酢酸アンモニウム
中でp+s、oで0.25mg/m 1及び1.25mg/m j!で行われた
。
上述のようにして測定された抗原性は、各々、205.446.208.236
.42及び13%であった。
上の二つの研究の結果は、研究された酸化条件の総ての有用性を示す、これら結
果はまた、酸化緩衝系として酢酸アンモニウムに比べて、重炭酸アンモニウム中
での酸化により、改善された抗原性を持つ物質が得られたことを示す。
5Tlbhポリペプチドのカルボキシ末端に直接ペプチド結合されたLTpB−
サブユニットの位置35〜55にアミノ酸残基配列において対応するLTBポリ
ペプチドを含む、及び5Tlbhポリペプチドのアミノ酸末端にペプチド結合さ
れたLTpB−サブユニットの位置58〜83に配列において対応するLTBポ
リペプチドを含みそしてさらにLTBポリペプチドのアミノ末端にペプチド結合
された二つの追加的Lys残基を含む複合LT/STポリペプチドも作られた。
従って、これらポリペプチドの最初に挙げたもの(ST−−LTxs〜ss)は
、式■において、
n、o、r、s及びゼロであり;
pが1であり;
Bが大腸菌の熱安定腸毒素のカルボキシ末端18残基に配列において対応する1
8アミノ酸残基を含むポリペプチド;すなわち5TIbhポリペプチドであり;
そしてAが大腸菌の熱不安定腸毒素のB−サブユニットのアミノ末端から位置3
5〜55のアミノ酸残基配列に配列において対応する21アミノ酸残基を含むポ
リペプチド(シグナルポリペプチドを含め);すなわちLTpB−サブユニット
であるところの化合物に一致する。
これらポリペプチドの第二のもの(Lys Lys LTsy−ss−5T)は
、式■において、
nは2であり;
pは1であり:
rSs、o及びmはゼロであり;
XはLysであり;
y及び2は存在せず;
Aは、大腸菌の熱不安定腸毒素のB−サブユニ7)のアミノ末端から位置58〜
位頁位置の配列に配列において対応する27アミノ酸残基を含むポリペプチドで
あり(シグナルペプチドを含め);そして
Bは、直上で述べたSTポリペプチドであるところの化合物に一致する。
Lys Lys LTsy−e*−−5Tm返し単位の多数を持つネットワーク
についての初めの研究は、LTB及びSTポリペプチドの同じ配列を持ちしかし
追加的Lys残基を持たない複合LT/STポリペプチドから同様に作られたポ
リマーに比べて溶解度が改善されたことを示した;二つのポリマーの免疫反応性
は、実質上同じである。
接合体として又はネットワークポリマーの繰返し単位としての特定の結果を本明
細書で述べられるところの残る複合LT/STポリペプチドは、式■において、
n、「、s、p及びmがゼロであり;
x、y、及び2が存在せず;
Oが1であり;
Aが、大腸菌の熱不安定+ii素のB−サブユニットのアミノ末端から約位置3
5〜約位置95のアミノ酸残基配列に対応する8〜31アミノ酸残基を含むポリ
ペプチドであり、ここで位置数は、21残基シグナルペプチドを含み:そしてB
が、上述したような大腸菌の熱安定Il!毒素のカルボキシ末端18残基に配列
において対応する18アミノ酸残基を含むポリペプチドである
ところの化合物に一致する。
19作られたLTBポリペプチドの配列下記の表6は、ここで述べたLTB含有
ポリペプチドの配列を与える。各ポリペプチドは、LT B−サブユニットのア
ミノ末端から数えた(21残基シグナルペプチドを含めて)下付き文字の配列位
置を示す略記及びポリペプチド配列がLTBポリペプチドのみに対応するが複合
LT/STポリペプチドに対応するかを示す略記により表に示される。アミノ末
端にLTBポリペプチドを持つ複合LT/STポリペプチドは、略記LT下付文
字−−STにより示され、一方、アミノ末端にSTポリペプチドを持つポリペプ
チドは、5T−−LT 下付文字 により略記される。
各略記に対応するアミノ酸残基配列は、略記の右側に示され、左から右へかつア
ミノ末端からカルボキシ末端の方向に書がれる。
下記の各STポリペプチド配列は、5TIbhのそれである。
表6 作られたLTBポリペプチド
LTBポリペプチド ±ユ丘1±工父剋LTB配列位置
L T B 3s−ss AsnThrGlnlleTyrThrlleAsn
AspLyslleLeuSerTyrThrGluSerMetAIaGly
LysL T B a 3− hx AspLysl IeLeuSerTyr
ThrG]uSerMetA!aGIyLysArgGIuMetVallle
llehrPhe
L T B 、*−s。
TyrThrGIuSerMetAIaGIyLysArglu
L T B 、、、、 TyrThrGluSerMetAlaGlyLysA
rgGluMetValllerleThrPheL T Bs、−tz GI
yLysArgGIuMetValllelleThrPheMetSerGl
yGluThrPheGInValGluL T Bs@−ax MetVal
llelleThrPheMetSerGIyGIuThrPheGlnVal
GluValProGlySerGlnHislleAspSerGInLys
L T B &+−?711eThrPheMetSerGlyGIuThrP
heGInValGluValProGlySerGInL T B by−q
s PheMetSerGlyGluThrPheGlnValGIuValP
roGIySerGInHislleAspSerGInLysLysAIal
leGluArgMetLysAsphrLeu
L T B 、l−*、ValGIuValProGlySerGlnHisl
leAspSerGlnLysLysAIaTIeGluL T B q7−q
m G1nH45lleAspSerGIn1.ysLysAlalleGlu
ArgMetLysAspThrLeuArgdicys−LTsw−e、 C
ysMetVallleTIeThrPheMetSerG1yGluThrP
heGInValGluValProGlySerGInHislleAspS
erG1nLysCys複合LT/STポリペプチド
L T B 5s−ss −−ST AsnThrGlnTleTyrThrr
leAsnAspLyslleLeuSerTyrThrGluSerMetA
IaG IyLysAsnThrPheTyrCysCysG IuLeuCy
sCysTyrProAlaCysAlaGlyCysAsnL T B ff
ff−?5−5T GInlleTyrThrTleAsnAspLyslle
LeuSerTyr↑hr[;IuSerMetAIaGlyLysArgGI
uMetVall lelleThrPheMetserGIyGluThrP
heGlnValGluValProGlyAsnThrPheTyrCysC
ysG 1uLeucyscysTyrProAIaCysAlaGlyCys
AsnL T am−st −−5T TyrThrG1uSerMetAla
GIyLysAsnThrPheTyrCysCysGluLeuCysCys
TyrProA1aCysAIaGIyCysAsnLTs*−sz −−3T
MetValllerleThrPheMetSerGIyGluThrPh
eGlnValGluValProGIySerglnHisl IeAspS
erGlnLysAsnThrPheTyrCysCysG IuLeuCys
CysTyrProA l aCysAIaGIyCysAsn
LTLystygs@−ms−5T LysLysMetValllelleT
hrPheMetSerGIyGluThrPheGlnValGluValP
roGlySerGInHislleAspSerGInLysAsnThrP
heTyrCysCysG 1 uLeuCysCysTyrPr。
AIaCysAIaGIyCysAsnL T ha−−rs −−St Me
tSerG1yGluThrPheG1nValGtuValProGIyAs
nThrPheTyrCysCysGluLeuCysCys丁yrProAI
aCysAIaGlyCyssn
L T、3−B −−5T PheMetSerGlyGIuThrPheGI
nValGluValProGIySerGlnHislleAspSerGl
nLysAsnThrPheTyrCysCysG1ut、euCysCysT
yrProAlaCysAIaGlyCysAsnLTiq−ms −−5T
PheGlnValGluValProGlySerGlnHis I 1eA
spserG InLysAsnThrPheTyrCysCysGluLeu
CysCysTyrProA1aCys^1aGlyCysAsn
L Ty*−at −−5T 5erGIn旧5lleAspserGlnLy
sAsnThrPheTyrCysCysG l uLeuCysCysTyr
ProAIaCysAIaGlyCysAsnST −−LTls−ss As
nThrPheTyrCysCysGIuLeuCysCysTyrProAl
aCysAlaGIyCysAsnAsnThrClnlleTyrThrl
1eAsnAsp1.yslleLeuSerTyrThrGluSerMet
AlaGlyL、ys■、材料及び方法
A、腸毒素生産
天然LT、毒素B−サブユニットは、大腸菌株pDF87、ヒト大lea H−
10407のB−サブユニットプラスミドを持つ形質転換されたに一1211g
体〔クレメンフら、1nfec1.、Iam−on、40 :653−658
(1983))のバンチ培養物からクロマトグラフ法〔クレメンツら、Infe
ct、Iwun、29 : 91−97 (1980))により精製された。そ
の配列がヒトSTについてチャン及びギアネラにより記載される〔チャン及びギ
アネラ、J、Bial、Chem、 256:7744−7746 (1981
))1Bアミノ酸酸残基列に基づくところの合成5TIbhは、本明細書で述べ
られるように固相法により作られた;単独であってLTBポリペプチドに結合さ
れていないこのポリペプチドは、天然STと同じ生物学的特性及び免疫原性を持
つが、薄層クロマトグラフィー特性及び電気泳動特性において異る。同様の方法
で、別の合成ST含有分子を作った。
合成STは、クリプステインら、JAnfect、 Dis、 l 47 :
318−326 (1983)に記載のように接合剤として水溶性のカルボジイ
ミドを用いて、天然B−サブユニットに化学的に架橋された。ワクチンにおいて
用いられた天然及び合成の免疫原の量は、ロウリイ (Lowry)ら、J、
Biol、Chem、193 : 265 275(1951)の方法により測
定されるそれらの蛋白質温度に基づく。
B、ポリペプチドの合成
ポリペプチドは、ダラス及びファルコウ、゛ネイチア、288:499−501
(1980)に記述されるブタ熱不安定腸毒素B−サブユニット(LTp B
)配列中の種々の領域からの種々の長さのアミノ酸残基を含んで作られた。これ
らポリペプチドは、単′独に調製されるか、又は複合LT/STポリペプチドを
形成するためにSTアミノ酸残基配列のアミノ又はカルボキシ末端上に合成され
た。
ポリペプチドは、ヒエ−テン(Houghten)ら、Int、 J、 Pep
t。
Prot、Res、16:311 320 (1980)及びメリフィールド(
Merrifield)、J、 A+*、 Chew、 Soc、85 : 2
149−2154 (1983)、により一般的に記載され、ここで述べるよう
に変更された固相法により作られた。サム(Sag) II自動化ペプチド合成
機(バイオリサーチ社、サンラフアニル、カリフォールニア)又はベックマン(
[1ecka+an)モデル990Bペプチド合成機(ベックマン インストル
メンツ社、バークレイ、カリフォールニア)が合成のために用いられた。
下記の検討は、そのようなポリペプチドの合成として複合LT/STポリペプチ
ドの調製に特に関係し、また複合LT/STポジCys−ポリペプチドも下記の
ように作られたが、但し、ブロックされたCys残基はポリペプチドの第−及び
最後の残基であった典型的には、フッ化水素で開裂してカルボキシ末端STアス
パラギンを与るためにα−0−ベンジル−BOC−アスパラギン酸のような特定
配列の保護されたカルボキシ末端アミノ酸残基がカップリングされるベンズヒド
リルアミン樹脂(1グラム当り0.57ミリ当1: meq/g)から合成を始
めた。これ及び続くカンブリングは、カンプリングするペプチド結合形成剤とし
てジシクロへキシルカルボジイミドを用いて、10(6モル過剰のアミノ末端ア
ミン保護されたアミノa(N−t−ブチル−オキシカルボニル;BOC)により
行った0両剤の2モル過剰もまた用いられた。
通常用いられるアミノ酸側鎖保護基が用いられたが、下記の通ルオキシカルボニ
ル)、スレオニンのためにO−ベンジル、グルタミン酸及びアスパラギン酸のた
めにベンジルエステル、システィンのためにS−メトキシベンジル、ヒスチジン
のためにジニトロフェニル、及びアルギニンのためにトシル(もしこれら基が存
在すれば)。
保護されたアスパラギンが存在するカンブリングのために、当モル量のN−ヒド
ロキシ−ベンゾトリアゾールが反応混合物に加えられ、ジメチルホルムアミド(
DMF)が溶媒として加えられた。ギシン(Gisin)、 Anal、 Ch
ew、^ct、58 : 298−249(1972)のピクリン酸テストによ
り、カフプリングは典型的には99%を越えて完了したことが見い出された。保
護されたアミノ酸は、薄層クロマトグラフィーにより単一のスポットを与えるよ
う、使用前に適当な溶媒から再結晶された。ヒスチジン保護基は、DMF中で1
%チオフェノールによる硫黄分解的(thioly−tic)開裂による樹脂か
らの開裂の前に除去された。アミノ末端BOC基もまた、フン化水素開裂段階の
間メチオニンのアセチル化を除くために最終的三フフ化酢酸保護除去段階による
樹脂からの開裂前に除去された。
ブロックされたアミノ酸は、順次的に樹脂にカップリングされた。最後にカップ
リングされたアミノ酸のアミノ末端BOC基は、望むポリペプチドが樹脂にリン
クされ(結合され)で合成されるまで、次のブロックされたポリペプチドの付加
前に除かれた。樹脂に結合したポリペプチドは次に開裂されて、樹脂及びポリペ
プチドを与えた。
それらの樹脂からのポリペプチドの開裂及び残る保i[の除去は、ポリペプチド
−樹脂〔0,5グラム(g)〕を0.5ミリリットル(rnl)のアニソール及
び20mff1の無水フン化水素で(又はボリペプチドー樹脂をその二倍重量の
アニソール及び重量に比例するその体積の40倍の無水フン化水素で)4℃で1
時間処理することにより達成された。
初めNt流で、最後に水流減圧でフン化水素を気化させた後に、残虐を無水エー
テルで三度抽出してアニソールを除去し、水流減圧下、次に真空下で乾燥した。
真空乾燥した物は、最初に5%酢酸水溶液(各50m1で三度)で抽出し、次に
50%酢酸水溶液(50mj!で四度)で抽出した。
第一抽出は低分子量ポリペプチド及びチロシンを除去し、これはある調製におい
てCysメルカプタン基を保護するために用いられた。第二抽出は、樹脂から遊
離のポリペプチドを分けた。10〜20%酢酸の濃度まで水で希釈した後に、得
た溶液を凍結真空乾燥して、モノマー状の酸化されていない最初のポリペプチド
を得た。
この粗ポリペプチドは、その還元状態を保つために3倍モル過剰のジチオスレイ
トールと混合され、溶離剤としてのO,1モル濃度(M)の重炭酸アンモニウム
(pH8,0)で5ephadex G −50ゲル濾過(ファーマシア ファ
イン ケミカルズ社、ビス力タウエイ、ニューシャーシー)により部分的に精製
された。カラムの空隙体積中の第一分画(−調製物の63重量%)は凍結真空乾
燥され、又はスルフヒドリル基が存在するときは制御できない酸化を防ぐために
、集めた直後に用いられた。このような物質のアミノ酸組成が測定され、理論値
の±10%であることが見い出された。
合成STポリペプチドに結合されない合成LTBポリペプチドのyns物は、典
型的には、上述のゲル濾過精製後に用いられた。
複合LT/STポリペプチドのiIiIM物は、下記のように更に処理された。
一つの調製において、B−サブユニット残基58〜83を含む44アミノ酸残基
複合LT/STポリペプチド配列は、LTB残基83のカルボキシ末端Lys残
基と合成37部分の7ミノ末端Asn残基の間にペプチド結合によりST合成の
18アミノ酸残基配列に直接に結合されて作られた。繰返し単位として用いられ
るこのモノマー状複合LT/STポリペプチドは、0.1 M重炭酸アンモニア
(pH8,0)の1m1当り典型的には1.0■gで存在する還元形LT/ST
複合ポリペプチドを含む水性酸化媒体と、環境空気中の分子酸素(0□)を接触
させることにより酸化されて、ポリペプチド間シスチンジスルフィド結合により
互に結合された複合LT/STポリペプチド繰返し単位を持つネットワークポリ
マーを形成した。遊離のスルフヒドリル基は、エルマン反応〔エルマン、Arc
h、 Biochem、 Biophys、82 : 70−77 (1959
) )で測定して無視できる程であった。他のLTポリペプチド配列を含むネッ
トワークポリマーが、特記なきときは同様にして作られた。
酸化形モノマーを形成するための複合LT/STポリペプチドの調製は、他の点
では同様の酸化条件を用いて典型的には0.1〜0゜25−g / m 1!で
行われた。
を用なモノマー状及びネットワークポリマー状複合LT/STポリペプチドを形
成するための酸化はまた、0.5M炭酸アンモニウム及び0.1 M酢酸アンモ
ニウムを用いても行われた。この酸化媒体のpo値はまた、pH6,0とpH1
0,0の間で変えられた。
このポリマー状物質の部分的精製は、0.1M重炭酸アンモニウム(p)18.
0)で平衡化された5ephadex G −50(ファーマシア社)カラムに
通すことにより行われた。空隙物質が集められ、凍結真空乾燥された。 5ep
hacryl S 200 (ファーマシア社)の分級(sizing)カラム
は、約22,000ダルトンの分子量のそのように作られた一つのネットワーク
ポリマーの単一ピークを示した。
C9毒性の評価
VI C(21で横針したネットワークポリマー免疫原の毒性は(1)LT活性
のためにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)組織培養評価法〔グエラント(
Guerran t)ら、Infect、 T+smun、 10 :320−
327 (1974)]、(iiiST分泌活性のための幼児マウス評価法〔ギ
アネラ、 Infect、 Ima+un、14 : 95 199(1976
))及び(iii )分泌活性のための結さくしたラット回腸ループ中への滴下
〔クリブスティンら、Infect、 Immun、 40 :924−929
(1983))によりテストされた。
D、抗原性の評価
合成ポリペプチドの抗原性は、四相/第二抗体のために、GM。
ガングリオシド(シグマケミカム社、セントルイス、ミズリー)/抗LT B−
サブユニット過免疫抗血清(CM、/B) 、又はB−サブユニットに対する重
複種(double 5pecies)過免疫抗血清(B/B) 、及び合成S
Tに対する重複挿過免疫(ST/ST)を用いて、先に記載されるように〔クリ
ブスティンら、J、 Infect。
Dis、I47:318−326 (1983)及びクリプスティンら、Inf
ect、 Immun、44 : 268 273 (1984) )、ダブル
サンドイッチtγ素結合免疫吸着体評価法(ELISA)により行われた。
簡華に云うと、LTB又はST又はガングリオシドに対して生じた一つの動物種
からの抗体が、固体支持体としてのマイクロ滴定プレートくぼみ上に吸着され、
過剰の結合しなかった物質があれば除去される。適当な抗原(LTポリペプチド
、ST又はLTB)が次に固体支持体と混合され、抗体又はガングリオシドと抗
原との間に結合が起るのに十分な時間接触を保ち、何らかの過剰の結LTB又は
STに対して生じた第二の動物種(又はGM、/B評価のための第一の種)から
の抗体が、固体支持体と結vした抗原と混合された。この混合物を、混合された
抗体が免疫反応するのに十分な時間維持した後、何らかの過剰の、免疫反応しな
かった抗体は、すすぎにより除去された。固体支持体と結合した抗原と免疫反応
した最後に加えられた抗体の量が次に測定され、この最後に加えられた抗体の研
究れれるポリペプチドに対する結合と対照抗原たとえば天然LTB−サブユニッ
トに対する結合とが比較された。
E、担体としての破傷風トキソイドにカンブリングされたLT及び複合LT/S
Tポリペプチドの接合体複合LT/STポリペプチド調製物が秤量され、等量の
破傷風トキソイド(TT)と混合された。このポリペプチド及びTTは、リン酸
塩緩衝食塩水(PBS)(pH7,2)中に溶解され、2−87m1の担体の最
終濃度まで希釈された。
グルタルアルデヒド架橋剤(GA)は、25%貯蔵溶液として初めに作られた。
貯蔵溶液の200u1.をPBSの13mA’と混合して、実用GA溶液を形成
した。この実用GA溶液は冷蔵された。この実用溶液を、1mlの担体−ポリペ
プチド溶液当り124μlの量で混合した。
実用GA溶液/担体−ポリペプチド溶液混合物を環境室温で約18時間撹拌した
。この反応混合物を次に、蒸留水又は脱イオン水に対して6時間透析し、次に凍
結真空乾燥した。
乾いた、凍結真空乾燥された物質は、経験がら担体の90%回収量を含むと推測
される。このカンブリングされ、架橋されたポリペプチドは、典型的に、全回収
物質の約40重量%を構成する。
類似のtlil製物は、クリプスティンら、J、 Infect、 Dis、1
47 :318−326 (1983)に述べられている。
F、l旦体としてのキイホールリンペットヘモシアニンにカソフ。
リングされたLT及び複合LT/STポリペプチドの接合体
表2のLTBポリペプチドがまた、担合体を形成するために、キイホールリンペ
ットヘモシアニン(K L H)にカップリングされた。アミノ末端Cys残基
が、その配列がそのような残基を含まないところのポリペプチドに付加された。
KLHは、10mMリン酸塩緩衝液(pH7,2)に対して透析され、その濃度
は使用前に20■g / m 1に調節された。カップリングされるべきポリペ
プチドの溶液は、5+g/m1の濃度で調製された。5mgのポリペプチドに対
して4mgのKLHのカンブリング濃度が利用された。
上述のK L H溶液の望む体積が選ばれ、そして上述のリン酸塩緩衝液の55
μlが4mgのKLH当り加えられた。DMF中に6mg / m j! T:
78解されたニーマレイミドベンゾイル N−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル(MBS)を含む溶液が次に、40:lのMBS : KLHモル比を与え
るべ(4+++gのKLH当り85μlの体積で加えられた。得られた反応混合
物は次に、環境室温で30分間攪拌された。
30分間たった後に、反応溶液を、約15m1の床体積を含む5ephadex
G −25(ファーマシ7社)に通した。カラムの調製のために用いられた緩
衝液は、6.0のpi(の50mMリン酸塩であった・
1mlずつの分画を、NtSカラムから集めた。各分画は、どの分画に得られた
MBS活性化KLH(KLI(MB)があるかを確かめるために、280nmの
波長の光で読まれた。そしてKLH−MB含存分百を一緒にした。この手順で、
KLH−MBの80重重景の回収が推定される。
集められ、−諸にされたKLH−MB含存溶液は次に、貯蔵溶液として用いられ
、これはポリペプチドの各々にカンブリングするために利用された。上述したポ
リペプチド含有溶液(5mg/ml)の量は、4mgのKLH−MBを含む反応
混合物を与えるように、回収されたKLH−MB含有溶液の量に加えられた。
反応混合物のpH値は、適当なNaOH又はHClにより7.0〜7.5に調節
され、そして環境室温で3時間攪拌された。その後、反応溶液を凍結し、用いる
まで凍結貯蔵した。
G、免疫原及び抗原としてのポリペプチド接合体表2及3の@Qi及び結果と関
係して用いられた免疫化及びELISA手順は、下記の通りであった。
約0.75 m j!の完全フロイントの補液(CFA)及び7.2のpH値を
持つリン酸塩緩衝した食塩水(P B S)の0.75ml1中の分散された、
上述で作ったTT又はKLH接合体のll1gを含むワクチンで、ラビットを第
0日に皮下(SQ)注射した。この動物は、0.75mj!の不完全フロイント
の補’e+0.15m1のPBS中に含まれる同じ量の接合したポリペプチド又
は複合LT/STポリペプチドを含むワクチンの促進皮下注射を第14日に受け
、次に第21日に二番目に挙げたワクチンの第二の腹膜内(IP)促進注射を受
けた。免疫化されたラビットからの血清サンプルを、第−免疫化後第28及び3
5日に耳静脈から得た。
二匹のラビットが各TT接合体について用いられ、一方、−四のラビットが各K
LH接合体測定のために用いられた。
天然LThB−サブユニット抗原は、pH4,0のTEAN緩衝液(Tris、
B D T八、アジ化ナトリウム、塩化ナトリウム)中に溶解され、1mg/
mlを含む貯蔵溶液を与えた。この貯蔵溶液は次に、8.0のpH値を持つ炭酸
塩/重炭酸塩緩衝液で希釈されて、lOピコモル150μlの濃度で天然LTh
B−サブユニフトを含む第二の貯蔵溶液を与えた。
第二の貯Wi溶液の50μlを、マイクロ滴定プレートの(ぼみに置き、各くぼ
み当り10ピコモルの抗原を与えた0次にプレートを、環境室温で18時間、湿
潤チャンバー中でインキュベート(incubate) した。
次にくぼみを、0.07%のPo1ysorbate 20 (T W E E
N (商Ijt)20;ICIユナイテッド ステーツ社、ウイルミントン、
プラウエア)を含むpBst8ifflで三度洗い、次に脱イオン水で二度洗っ
た。PBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)(1%BSA/PBS)の1
00μlを次に各くぼみに加えて、非特異的結合の部位をブロックし、このBS
A含有溶液を37℃で1時間、くぼみの中に維持した(インキュベートした)。
結合されなかったBSAを含む18液をプレートから振って落した。最初にプレ
ートを乾燥せずに、1% BSA/PBSの90μlをくぼみの最上列の各くぼ
みに加え、一方、プレートの残りのくぼみの各々に1% BSA/PBSの50
μkを加えた。その後、抗血清の10μlを、くぼみの最上列の各々に加え、そ
のようにして作った混合物を混合した。最上列の各くぼみからの抗血清含有溶液
の50μlは次に、その下のくぼみの中の1%B S A/P B Sの50μ
lを加えられ混合して、二倍希釈物を与えた。同様に連続的二倍希釈が、プレー
トの残りのくぼみに対して続けられた。総ての希釈が行われた後に、希釈された
抗血清含有くぼみを、37℃で1時間インキニーベートした。その後、くぼみの
中の液体を除き、くぼみを上述のようにすすいだ。
ペルオキシダーゼ(ジムド ラボラトリーズ、バーリンガム、カリフォールニア
)でラベルされたヤギ抗ラビット血清を、1%BSA/PBSで11000体積
比に希釈した。得た希釈された抗体含有溶液50μlを、各くぼみに加えた。そ
のように調製したくぼみを、37℃に1時間維持しくインキュベートシ)、次に
上述のように洗った。オルトフェニレンジアミン(OP D)の溶液が、6ml
の脱イオン水にOP D 5ubstrate (ビッツマン・ムーア社、ワシ
ントンクロシング、ニューシャーシー)の−錠を溶解することにより作られ、こ
れに3%過酸化水素の一滴も加えられた。得た溶液の100μlをマイクロ滴定
プレートの(ぼみの各々に加えた。くぼみにおける発色を環境室温で進展させ、
各くぼみに4r[Hの25μlを加えることにより、20分後に停止させた。各
くぼみ中に存在する色の量を、その中の液体の光学密度を492nnで測定する
ことにより決定した。
プレート上のLTB抗原の1/2を飽和するのに必要な、ラビット血清中の抗体
量をその後、標準的方法を用いて計算した。
H0免疫化手順
第3〜5図に示したデータのための免疫化手順は、下記の通りである。スプラグ
ーーダウレイ (Sprague−Dawley)ラド(150〜175g)は
、フロイントの完全補液を用いて第一免疫化を腹膜内(IP)に与えられ、次に
4日間隔で経口的(PO)に二回の促進免疫化を与えられた。経口免疫化は、胃
酸分泌を除去するために、シメチジン(TAGAMET ) (商標)ニスミス
クラインアンド フレンチ ラボラトリーズ、カロリナ、プエルトリコ)の5
05g/kg体重の投与量での経口投与後2時間後に胃内チューブを経由して与
えられた。
化学的に架橋された5T−−B−サブユニット接合体、及び複合L T / S
Tポリペプチド繰返し単位含有ネットワークポリマーの投与量は、mg当りの
抗原単位(A U)で表現される。そのような投与!(AUで)は、ELrSA
によって、天然の毒素に対する接合体の抗原性のパーセント値をめ、この値に1
000を掛けることにより導かれた。IAUは、弱められていない天然毒素の1
μgに等価の抗原性を持つ。
■、攻V手順
上述の免疫化ラビットは、最後の促進免疫化の4〜6日後に、先に述べられてい
るように〔クレプスティンら、J、 Infect、 Dis。
147:318−326 (1983)及びクレプスティンら、Infect、
l5sun、40 : 924−929 (1983) ) 、大腸菌LT−
/ST”株TX452 (078:HI3)又は大腸菌LT”/ST−株PB2
58 (015:H−)の、1m1当り10’+71生育しうる菌を含む肉汁培
養物の0.1 m lを18時間、ディサル(disal)回腸の一つの10(
Jの結さくしたループ中に滴下することにより攻撃した。各データ点は、4〜6
匹の免疫化ラットにおいて測定され、報告された結果は、5匹の同様に攻撃され
た非免疫化対照における値と比べての、免疫化ラットにおける平均(SEM)分
泌減少パーセントの平均上標準誤差として示される。50%より小さい減少され
た分泌は、二つの独立な平均値のためのスチューデントの検定によると、免疫化
動物及び対照動物における値の間の存意な(0,001より小さいP)差を意味
する。
J、抗毒素反応
ST及びB−サブユニットに対する腸分泌1gA抗毒素カ価は、先に述べられた
ようにダブルサントイフチELISAにより測定された〔クレプスティンら、J
、 Infect、 Dis、147 : 31 B−326(1983))、
各群における平均力価の逆数は、データ点の上又は下の数字として第3.4及び
5図に示される。
■0診断評価及び方法
LTBポリペプチド、複合LT/STポリペプチド、及び多数のLTBポリペプ
チド繰返し単位を含むポリマー、ならびに上述のLTBポリペプチド、複合LT
/STポリペプチド及びポリマーに対して生じた抗体及び抗体結合部位(受容体
)、及び本発明の方法は、免疫評価(イムノアツセイ)のような診断テストのた
めにも有用である。そのような診断法としては、たとえば酵素イムノア7セイ醇
素マルチプルドイムノアツセイ(EMIT)、酵素結合免疫吸着体(EL I
SA) 、ラジオイムノアンセイ(R1^)。
螢光イムノア7セイ、シングル又はダブル抗体法、又は受容体又は抗原がある検
出しうる目印又は指示手段をラベルされる他の方法が挙げられる。
−i的には、マギオ(Maggio) 、エンザイム、イムノアツセイ、CRC
プレス、クリーブランド、オハイオ(1981);ゴールドマン(Gald鋼a
n>、M、、フルオレセント アンチボディメソッド、アカデミ、ツクプレス、
ニューヨーク、ニューヨーク(1980)を参照されたい、そのような評価法及
び、これら方法を実施するために有用な系の特定の例を、下記に述べる。
体サンプル中の天然しT腸毒素又はそのB゛−サブユニットの存在を評価する方
法が、ここ全意図される。一般的方法において、評価されるべき体サンプルたと
えば便サンプルが用意され、その中に存在するバクテリアが好ましくは培養され
る。培養されたバ′クチリアサンプル又は便サンプル自体が、本発明のLTBポ
リペプチド含存含量分子えば前述のネットワークポリマーの一つにより誘発され
た抗体結合部位を含む受容体分子と混合される。混合物は、受容体が培養物中に
存在する腸毒素と免疫反応するのに十分なWの時間維持される。この免疫反応の
量が次に、腸毒素分子が被評価体サンプル中に存在するかしないかを決めるため
に測定される。
体サンプル中に存在するLTI!毒素を検出するために有用な、本発明の一面を
具現化するキットの形の例示的診断系は、本発明のポリペプチドにより誘発され
た本発明の受容体分子を一つの容器に含む、そのような受容体の例は、抗体、抗
体のほぼ全体、又は生した抗体部分Fab及びF(ab’)zのような抗体結合
部位である。
この系はまた、受容体と抗原の間の免疫反応の存在を知らせるための指示手段を
含む。
典型的な指示手段としては、放射性同位元素たとえば目s1及び1ffl l、
酵素たとえばアルカリホスファターゼ、ホースラディノンユ ペルオキシダーゼ
、β−D−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ、及び螢光染料たとえ
ばフルオレセイン及びローダミンが挙げられる。指示手段は、本発明の受容体に
直接に結合されることができる。指示手段はまた、別途の分子たとえば第二抗体
、抗体結合部位又は本発明の受容体と反応する(結合する)黄色ブドウ球菌(5
,aureus)蛋白質入に結合されることもできる。別途の分子の指示手段の
特定の例は、+tJでラベルした黄色ブドウ球菌蛋白質A及びペルオキシダーゼ
を結合したヤギ抗ラビット抗体である。
この指示手段は、免疫反応生成物を検出すること可能にし、本発明の受容体に直
接結合されないときには、受容体と別けて包装される。バクテリア培養サンプル
と混合されたとき、受容体分子はLT腸毒素と免疫反応して免疫反応物を形成し
、そして存在する指示手段が免疫反応生成物の形成を知らせる。
LT腸毒素診断法の−B様は、免疫螢光評価法である。そのような評価法におい
て、バクテリア細胞培養物塗抹が、固体支持体としてのきれいな顕微鏡スライド
に固定される0本発明に従って、たとえばラビットにおいて生じられた(受容体
)抗体の一部が、周知法を用いてスライドと接触される。受容体及びバクテリア
細胞は、受容体が免疫反応するのに十分な時間、LTと接触を維持される。
本発明の何らかの免疫反応しなかった受容体をすすいで除いた後に、スライド上
の何らかの非特異的結合部位は典型的に、もし望むなら、ウシ血清アルブミン(
BSA)のような蛋白質でブロフクされる。第二の反応剤(増幅剤)、たとえば
補体、又は抗免疫グロブリン抗体たとえばモルモット補体が次に混合され、反応
が起るのに十分な時間、受容体結合細胞と接触を維持される(インキユベートさ
れる)ことができる。
この第二インキュベーシッン後に、何らかの未反応の増幅剤をたとえば、評価ス
ライド上の最初に挙げた抗体に結合された増幅剤をすすぎ去ることにより除去す
る。第三の反応剤(指示手段)、たとえばヤギ抗モルモット補体のような抗体を
次に、スライド及びその結合物質と接触させ、そして反応が起るに十分な時間、
結合された増幅剤と接触を維持する(インキユベートする)、第三の反応剤は、
たとえばフルオレセインインチオシアネー) (FITC)、ローダミンB イ
ソチオシアネート(RITI)、テトラメチルローダミン イソチオシアネート
(TRITC) 、4.4“−ジイソチオシアノスチルベン−2,2゛−ジスル
ホン酸(DIOS)などとの反応により、周知のように螢光染料に結合されてラ
ベルされる。
何らかの未反応の第三反応剤を、この第三インキュベーション後にすすぎ、スラ
イド上の補体に結合する何らかの螢光ラベルされたヤギ抗モルモット補体抗体を
除く、螢光染料ラベルされた第三反応剤の存在は、螢光顕微鏡を用いて検出され
、それにより、大腸菌のLT生産株による感染の存在を知らせることができる。
この評価はまた、第二及び/又は第三反応剤を用いずに行うこともできる。ここ
で、本発明の抗−LT受容体は、螢光染料に直接結合されることができ、この指
示手段含有受容体は直接用いられる。
上述の評価法を行うのに有用な、好ましくはキットの形の、好ましい診断系は、
別々の包装中に、(al天然LTエンドトキシンと免疫反応する本発明の受容体
(抗体) 、(bl受容体と反応する第二の増幅剤、たとえば補体たとえばモル
モット補体、抗免疫グロブリン抗体、又は黄色ブドウ球菌蛋白質A、そして(c
l (i )増幅手段に直接結合、されうる、(11)増幅剤と反応する抗体又
は抗体部分のような別途の分子の一部でありうる、又は(tii )抗−LT受
容体に直接結合されうる指示手段を含み、この場合、キットは唯一の免疫反応性
剤を含むことを必要とする。指示手段は、受容体分子及びLTエンドトキシンの
免疫反応を、好ましくは増幅剤の介在を通して、間接的に知らせる。
ここで述べる任意の診断系の受容体分子及び別途の指示手段、ならびに上述の増
幅剤は、液体分散物のような溶液として、又は実質上乾燥した粉末たとえば凍結
真空乾燥した形で用意されることができる。指示手段が増幅剤とは別れた別途の
分子である場合、指示手段は別に包装されることが好ましい、指示手段が酵素で
ある場合、酵素の基Aは系の別れた包装中に用意されることもてきる。前述した
顕微鏡スライドのような固体支持体、−又はそれ以上の緩衝剤及びアセトンは、
本診断評価系において別に包装された要素として含められることもできる。
診断系との関係でここで述べた包装及び容器は、診断系で通常用いられているも
のである。そのような包装は、ガラス及びプラスチック(たとえばポリエチレン
、ポリプロピレン及びポリカーボネート)ボトル、小ビン、プラスチック製又は
プラスチック箔を積層された包みなどである。
全体の、完全な、生物学的に活性な抗体の使用は、上述した免疫螢光評価法のよ
うな多くの診断系では必要がない、むしろ、抗体分子の免疫学的に活性な、イデ
ィオタイプを含有する、抗原結合及び認識受容体部位、すなわち抗体結合部位の
みを用いることができる。そのような抗体結合部位の例は、当該分野で周知のよ
うに、パパイン又はペプシンを用いる蛋白質分解により作られたFab及びF
(ab’)z抗体部分のような公知のものである。
本発明のもう一つの診断の641は、競争評価法でとくに有用であり、この系は
、好ましくはキットの形で、第−反応剤及び第二反応剤を別々の容器に含む、固
体又は液体の形の緩衝剤塩、マイクロ滴定プレート、指示手段基質などがまた、
それら自身の容器に含まれることができる。
第一反応剤は、抗原として本発明の抗原性LTBポリペプチドたとえば複合LT
/STポリペプチド繰返し部位を含むネットワークポリマーを含む、第二反応剤
は、前述したような天然LTB−サブユニットと免疫反応する受容体たとえば抗
体を含む、抗原と受容体の間の免疫反応の存在を指示する手段は、さらに抗受容
体、+tJのような放射性元素、フルオレセインのような螢光染料又はペルオキ
シダーゼのような酵素のような目印に結合された受容体により知らされる。指示
手段は、独立した容器中にたとえばペルオキシダーゼを結合されたヤギ抗ラビッ
ト抗体中に含められ、その基質(たとえば0−フェニレンジアミン)のために別
の独立した容器を伴い、あるいはたとえば放射性元素が受容体分子に結合される
場合には第二反応剤の一部であることができる。指示手段はまた、別途に供給さ
れることができる。
便サンプルのような被評価サンプル又は便サンプルからのバクテリア培養物の所
定量の存在下で第−及び第二反応剤の所定量の混合物は、指示手段でシグナルさ
れる免疫反応の景を与える。免疫反応の量は、腸毒素又はそのB−サブユニット
が被評価サンプル中に存在すると、既知の免疫反応の量と異る。
通常、第一反応剤としてのLTBポリペプチド含有抗原は、固体支持体たとえば
マイクロ通定プレート又はニトロセルロース浸漬棒に結合される。固体支持体上
の非特異的結合の部位は、無関係な蛋白質たとえばBSAにより周知法で結合さ
れる。
バクテリア培養物及び第二反応剤の所定量は、水性媒体に加え混合される。混合
物を、存在するかも知れないLTエンドトキシンと第二反応剤が免疫反応するの
に十分な時間、維持する。
その後、固体支持体に結合された第一反応剤、及びバクテリア培養物及び第二反
応剤を含む水性媒体を混合して、固/液相混合物を形成する。この混合物は、液
相中に存在する第二反応剤が固相に結合された第一反応剤と免疫反応するのに十
分な時間、維持される。
固相と液相はその後、分離されて、固相に結合された免疫反応物を与える1次に
、固相に結合された免疫反応物の量を測定し、+してこの量は、既知量のLTI
毒素が同じ方法で評価されるときに起る免疫反応の量と比較される。
全部の、完全な、生物学的活性な抗体の使用はやはり、直上で述べた競争評価法
のような多くの診断系において必要でない、むしろ、抗原性LTBポリペブチF
′に結合する抗体分子の生物学的に活性なイディオタイプ含有アミド部分のみが
、前述したように必要でありうる。
以上は、本発明を例示するものであって、制限するものではない、多数の変化及
び変更が、本発明の真の精神及び本発明の新規な概念の範囲を離れることなく行
われることができよう。
浄書(内容に変更なし)
LTh −舅−−−a 冨3− −−−・ −・ −−合へ〇−ザブユニットフ
ラグ゛メントのa虎」t分計#10殺楊子 (1ル嫁1権X103)手続補正書
(方式)
%式%
3、補正をする者
事件との関係 出願人
名 称 スクリップス クリニック アンド(氏 名) リサーチ ファウンデ
ーション5、補正命令の日付 昭和60年12月24日国際調査報告
m+e+w+−aI1mlA114111111mS1C::r!IJSG+、
/r))6”、n
Claims (25)
- 1.大腸菌の熱不安定な腸毒素のB−サブユニットのアミノ末端からほぼ位置3 5〜ほぼ位置95に配列において対応する約10〜約35のアミノ酸残基を含む 合成ポリペプチド(ここで上記の位置数は、該B−サブユニットの21の残基の シグナルポリペプチドを含む)。
- 2.該ポリペプチドが、該B−サブユニットのほぼ位置55〜ほぼ位置85に配 列において対応する約15〜約30のアミノ酸残基を含む請求の範囲第1項記載 の合成ポリペプチド。
- 3.ポリペプチドが、B−サブユニットのほぼ位置60〜ほぼ位置85に配列に おいて対応する約20〜約25のアミノ酸残基を含む請求の範囲第1項記載の合 成ポリペプチド。
- 4.約25〜約55のアミノ酸残基を含む合成の複合ポリペプチドであって、該 複合ポリペプチドがペプチド結合により互に結合された二つのアミノ酸残基配列 を含み、この二つの配列は(a)大腸菌の熱安定な腸毒素の少くともカルボキシ 末端14残基に対応するアミノ酸残基の配列、及び(b)大腸菌の熱不安定な腸 毒素のB−サブユニットのアミノ末端から残基位置約35〜95に対応するアミ ノ酸残基の配列であり、位置数はB−サブユニットの21残基シグナルポリペプ チドを含むところの複合ポリペプチド。
- 5.二つの配列が、上記熱安定腸毒素配列のアミノ末端残基と上記熱不安定腸毒 素B−サブユニット配列のカルボキシ末端残基と間に形成されたペプチド結合に より互に結合される請求の範囲第4項記載の複合ポリペプチド。
- 6.左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、式 【配列があります】 (ここでカッコ内のアミノ酸残基は各々、式の配列中の直前のアミノ酸残基に対 する代替物である)に対応する請求の範囲第5項記載の複合ポリペプチド。
- 7.左から右にかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、式 (X)n−(A)o−(Z)r−(Z)s−(A)p−(Y)m〔ここでX、Y 及びZが存在する場合には、これらは(a)Lys及びArg残基より成る群か ら選ばれた、又は(b)Asp及びGlu残基より成る群から選ばれた、追加的 アミノ酸残基であり; n及びmは、0、1、2、3又は4の整数であって、nとmの一方又は両方がゼ ロであるときに各X及びYは存在せず、nとmの一方又は両方かゼロでない値を 持つときに各X及びY残基は存在し、ポリペプチド当り存在するX及びY残基の 平均数はX及びYの各々の値に等しく; r及びsは、0、1又は2のの整数であって、rとsの一方又は両方がゼロであ るときに各Zは存在せず、r及びsがゼロでないときに各Zは存在し、複合ポリ ペプチド分子当りのZ残基の平均数はr及びsの値等しく、但しr又はsの一方 がゼロより大きいときにr及びsの他方はゼロであり、そのr又はsがゼロであ るところの各Zは存在せず;o及びpは0又は1の整数であって、o及びpの一 方がゼロの値を持つとき対応するAは存在せず、但しo及びpが同じ値を持つこ とはなく; Aは、大腸菌の熱不安定腸毒素のB−サブユニットのアミノ末端から約位置35 〜約位置95のアミノ酸残基配列に配列において対応する約10〜約35のアミ ノ酸残基を含むポリペプチドであり、ここで位置数はB−サブユニットの21残 基シグナルポリペプチドを含んでおり、そしてBは、大腸菌の熱安定腸毒素の少 くともカルボキシル末端14残基に配列において対応する18までのアミノ酸残 基を含むポリペプチドである。〕 に対応する合成ポリペプチド。
- 8.nが2; XがLys; oが1; n、s、p及びmがゼロであり; Aが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、式 【配列があります】 に対応するポリペプチドであり、そしてBが、左から右へかつアミノ末端からカ ルボキシ末端の方向に書いて、式 【配列があります】 に対応するポリペプチドであり、 ここで、上記ポリペプチドの各々におけるカッコ内のアミノ酸残基は該配列中の 直前のアミノ酸残基に対する代替物であるところの請求の範囲第7項記載のポリ ペプチド。
- 9.大腸菌の不熱安定腸毒素のB−サブユニットのアミノ末端から約位置35〜 約位置95のアミノ酸残基配列に配列において対応する約10〜約35のアミノ 酸残基を含むポリペプチド繰返し単位の多数を含むポリマー、(但し、ここで位 置数はB−サブユニットの21残基シグナルペプチドを含む)。
- 10.繰返し単位が、酸化前の繰返し単位ポリペプチドのアミノ末端及びカルボ キシ末端の両所に存在するCys残基の酸化により形成されたシスチンジスルフ ィド結合により互に結合される請求の範囲第9項記載のポリマー。
- 11.ポリマーが線形ホモポリマーである請求の範囲第10項記載のポリマー。
- 12.ポリマーが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書い て、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ここでカッコ内のAsn及びTyrアミノ酸残基は各々、式の配列における直 前のアミノ酸残基に対する代替物であり;a、b、c、d、e及びf、及びg、 h、j、j、k及びlは各々ゼロ又は1の整数であり、但し、a〜f又はg〜l のいずれかの値がゼロなら対応するRal、Rb2、Rc3、Rd4、Re5又 はRf6基、又はRg7、Rh8、Ri9、Rj10、Rk11又はRl12基 は存在せず、Ra〜f1〜6基が存在しないとき不存在のRa〜f1〜6基を持 つCys残基の硫黄原子はシスチンジスルフィド結合を形成し、一方、もしa〜 f又はg〜lのいずれか一つの値が1なら対応するRa〜f1〜6又はRg〜l 7〜12基が存在し;Ra〜f1〜6基の各々は、Cys残基の硫黄原子に結合 された互に同じ又は異る基であり、水素、1〜約4個の炭素原子を含むアルキル 基及び2〜約4個の炭素原子を含む置換アルキル基より成る群から選ばれ; Rg〜l〜12は、互に同じ又は異り、式に示される各々直前のCys残基に対 する代替アミノ酸残基であり、中性の側鎖を持つアミノ酸残基の群から選ばれ; 少くともa〜fの四つ及びg〜lの四つはゼロである。〕に対応するポリペプチ ド配列を含む第二のポリペプチド繰返し単位を更に含むランダムネットワークコ ポリマーであり;最初に挙げたポリペプチド配列し単位と、上記のポリペプチド 繰返し単位が1:10〜10:1のモル比でコポリマー中に存在し; 最初に挙げたポリペプチド繰返し単位と上記のポリペプチド繰返し単位が、該繰 返し単位の各々に存在するCys残基の酸化により形成されたシスチンジスルフ ィド結合により互に結合されているところの請求の範囲第9項記載のポリマー。
- 13.ポリマーが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書い て、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ここでカッコ内のAsn及びTyrアミノ酸残基は各々、式の配列における直 前のアミノ酸残基に対する代替物であり;a、b、c、d、e及びf、及びg、 h、i、j、k及びlは各々ゼロ又は1の整数であり、但し、a〜f又はg〜l のいずれかの値がゼロなら対応するRal、Rb2、Rc3、Rd4、Re5、 又はRf6基、又はRg7、Rh8、Ri9、Rj10、Rk11又はRl12 基は存在せず、Ra〜f1〜6基が存在しないとき不存在のRa〜f1〜6基を 持つCys残基の硫黄原子はシスチンジスルフィド結合を形成し、一方、もしa 〜f又はg〜lのいずれか一つの値が1なら対応するRa〜f1〜6又はR7〜 12g〜l基が存在し;Ra〜f1〜6基の各々は、Cys残基の硫黄原子に結 合された互に同じ又は異る基であり、水素、1〜約4個の炭素原子を含むアルキ ル基及び2〜約4個の炭素原子を含む置換アルキル基より成る群から選ばれ; Rg〜l7〜12は、互に同じ又は異り、式に示される各々直前のCys3残基 に対する代替アミノ酸残基であり、中性の側鎖を持つアミノ最残基の群から選ば れ; 少くともa〜fの四つ及びg〜lの四つはゼロである。〕に対応する第二のポリ ペプチド繰返し単位を更に含むランダムネットワークコポリマーであり; 最初に挙げたポリペプチド繰返し単位と、上記のポリペプチド繰返し単位が1: 10〜10:1のモル比でコポリマー中に存在し; 最初に挙げたポリペプチド繰返し単位と上記のポリペプチド繰返し単位が、該繰 返し単位の各々に存在するCys残基の酸化により形成されたシスチンジスルフ ィド結合により互に結合されているところの請求の範囲第9項記載のポリマー。
- 14.a〜f及びg〜lがゼロである請求の範囲第13項記載のポリマー。
- 15.ポリマーが多数の繰返し単位を含むネットワークポリマーであり、該繰返 し単位は第二のポリペプチドにペプチド結合された約10〜約35アミノ酸残基 ポリペプチド配列を含んで、約25〜約55アミノ酸残基を含む複合ポリペプチ ド繰返し単位を形成し、該複合ポリペプチドは、左から右へかつアミノ末端から カルボキシ末端の方向に書いて、式(X)n−(A)o−(Z)r−(Z)s− (A)p−(Y)m〔ここでX、Y及びZが存在する場合には、これらは(a) Lys及びArg残基より成る群から選ばれる、又は(b)Asp及びClu残 基より成る群から選ばれる、アミノ酸残基であり、 n及びmは、0、1、2、3又は4の整数であって、nとmの一方又は両方がゼ ロであるとき各X及びYは存在せず、n及びmの一方又は両方がゼロでないとき には各X及びY残基は存在し、ポリペプチド当りのX及びY残基の平均数は各々 X及びYの値に等しく; r及びsは、0、1又は2の整数であって、r及びsの一方又は両者がゼロのと き各Zは存在せず、r及びsが存在するとき各Zは存在し、複合ポリペプチド繰 返し単位当りのZ残基の平均数はr又はsの値に等しく、但し、r又はsの一方 がゼロより大きいときにはr又はsの他方はゼロであり、そのr又はsがゼロで あるところの各Zは存在せず;o及びpは0又は1の整数であって、o及びpの 一方がゼロであるとき対応するAは存在せず、但し、o及びpの両者が同じ値を 持つことはなく; Aは、最初に挙げた約10〜約35アミノ酸残基ポリペプチド配列であり;そし て Bは、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ここでカッコ内のAsn及びTyrアミノ酸残基は各々、式の配列における直 前のアミノ酸残基に対する代替物であり;a、b、c、d、e及びf、及びg、 h、i、j、k及びlは各々ゼロ又は1の整数であり、但し、a〜f又はg〜l のいずれかの値がゼロなら対応するRa1、Rb2、Rc3、Rd4、Re5又 はRf6基、又はRg7、Rh8、Ri9、Rj10、Rk11又はRl12基 は存在せず、Ra〜f1〜6基が存在しないとき不存在のRa〜f1〜6基を持 つCys残基の硫黄原子はシスチンジスルフィド結合を形成し、一方、もしa〜 f又はg〜lのいずれか一つの値が1なら対応するRa〜f1〜6又はg〜l7 〜12基が存在し;Ra〜f1〜6基の各々は、Cys残基の硫黄原子に結合さ れた互に同じ又は異る基であり、水素、1〜約4個の炭素原子を含むアルキル基 及び2〜約4個の炭素原子を含む置換アルキル基より成る群から選ばれ; Rg〜l7〜12は、互に同じ又は異り、式に示される各々直前のCys残基に 対する代替アミノ酸残基であり、中性の側鎖を持つアミノ酸残基の群から選ばれ ;そして 少くとも3〜fの四つ及びg〜lの四つはゼロである。)に対応するアミノ酸配 列を含む上記の第二のポリペプチドである。〕に対応し、 該複合ポリペプチド繰返し単位は、該繰返し単位中にあるCys残基の酸化によ り形成されたシスチンジスルフィド結合により互に結合されているところの請求 の範囲第9項記載のポリマー。
- 16.複合ポリペプチド繰返し単位が、左から右へかつアミノ末端からカルボキ シ末端の方向に書いて、 (a)【配列があります】, (b)【配列があります】, (c)【配列があります】, (d)【配列があります】, (e)【配列があります】, (f)【配列があります】, (g)【配列があります】, (h)【配列があります】, (i)【配列があります】,及び (j)【配列があります】 より成る群から選ばれる請求の範囲第15項記載のポリマー。
- 17.多数のポリペプチド繰返し単位を含むネットワークポリマーにおいて、該 繰返し単位が繰返し単位のCys残基の間に形成されたポリペプチド間シスチン 結合により結合され、該繰返し単位が、左から右へかつアミノ末端からカルボキ シ末端の方向に書いて、式 【配列があります】 〔ここで、X及びYが存在するとき、これらは(a)Lys及びArg残基より 成る群から選ばれる、又は(b)Asp及Glu残基より成る群から選ばれるア ミノ酸残基であり; n及びmは、0、1、2、3又は4の整数であって、nとmの一方又は両者がゼ ロであるときには各X及びYは存在せず、nとmの一方又は両者がゼロでないと きには各X及びYは存在し、ポリペプチド繰返し単位当りのX及びY残基の平均 数は各々X及びYの値に等しく;そして カッコ内のアミノ酸残基は各々、式の配列において直前のアミノ酸残基に対する 代替物である。〕 に各々対応するところのネットワークポリマー。
- 18.nが2であり; XがLysであり;そして mがゼロである ところの請求の範囲第17項記載のネットワークポリマー。
- 19.n及びmが共にゼロである請求の範囲第17項記載のネットワークポリマ ー。
- 20.大腸菌の熱不安定腸毒素のB−サブユニットのアミノ末端から約位置35 〜約位置95に配列において対応する約10〜約35アミノ酸残基を含む合成ポ リペプチドの有効量を活性成分として含む接種物において、上記位置数は上記毒 素の21残基シグナルペプチドを含んでおり、上記ポリペプチドは接合体として 又はポリマーの繰返し単位として担体に結合されており、かつ生理学的に許容で きる希釈剤中に存在し、該接種物は宿主哺乳動物に単位投与量で導入されたとき に上記B−サブユニットと免疫反応する抗体の生産を誘発できるものであるとこ ろの接種物。
- 21.ポリペプチドが接合体として担体に結合されて存在する請求の範囲第20 項記載の接種物。
- 22.ポリペプチドがポリマー繰返し単位として存在する請求の範囲第20項記 載の接種物。
- 23.上記宿主を大腸菌の熱不安定腸毒素から保護することができる請求の範囲 第22項記載の接種物。
- 24.大腸菌の熱不安定腸毒素のB−サブユニットと免疫反応する抗体において 、該抗体は大腸菌の熱不安定腸毒素のB−サブユニットのアミノ末端から約位置 35〜約位置95に配列において対応する約10〜約35アミノ酸残基を含む合 成ポリペプチドの有効量を宿主哺乳動物に導入することにより誘発されたもので あり、ここで上記位置数は上記毒素の21残基シグナルペプチドを含んでおり、 上記ポリペプチドは宿主哺乳動物に導入されるとき接合体として担体に接合され て又はポリマーの配列し単位として接種物中に存在するところの抗体。
- 25.左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて、 (a)【配列があります】 (b)【配列があります】 (c)【配列があります】 (d)【配列があります】 (e)【配列があります】 (f)【配列があります】 (g)【配列があります】 (h)【配列があります】 (i)【配列があります】 (j)【配列があります】 (k)【配列があります】 (l)【配列があります】 (m)【配列があります】 (n)【配列があります】 (o)【配列があります】 (p)【配列があります】 (q)【配列があります】 (r)【配列があります】,及び (s)【配列があります】 より成る群から選ばれた上記ポリペプチドに対して誘発された請求の範囲第24 項記載の抗体。
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