CN104402974B - 一种具有粘膜免疫佐剂活性的多肽及其在制备粘膜免疫佐剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有粘膜免疫佐剂活性的多肽及其在制备粘膜免疫佐剂中的用途。本发明多肽，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明多肽是良好的粘膜免疫佐剂，其粘膜免疫佐剂活性与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB相当，同时，无毒副作用，安全有效，可以和目前广泛使用的疫苗抗原联合应用，临床应用前景良好。

Description

一种具有粘膜免疫佐剂活性的多肽及其在制备粘膜免疫佐剂 中的用途

技术领域

本发明涉及免疫学、预防医学领域，具体涉及一种具有粘膜免疫佐剂活性的多肽及其在制备粘膜免疫佐剂中的用途。

背景技术

粘膜免疫系统(mucosal immune system,MIS)是全身免疫系统的重要组成部分，包括肠粘膜相关淋巴组织、鼻咽粘膜相关淋巴组织、泌尿生殖道粘膜相关淋巴组织等，作为机体免疫屏障的第一道防线，MIS可有效抵抗各种微生物的入侵。与皮下或肌肉注射免疫相比，粘膜免疫比传统的免疫方式更具有优势。首先是免疫途径的差异，粘膜免疫主要采用口服、滴鼻或生殖道接种的方法，这种新型的免疫方式可避免针剂对机体刺激，减少针尖对皮肤损伤引起的炎症反应，且可多次重复接种。其次在机体的生殖道、消化道等部位广泛存在有共同粘膜免疫组织，基于此，如果某个部位的粘膜组织发生抗原提呈后产生的免疫反应通常可以刺激诱导较远的粘膜免疫应答。研究发现，粘膜免疫不仅能诱导粘膜组织分泌特异性sIgA中和表面毒素，还能同时诱导体液免疫应答，产生针对抗原的特异性抗体。

鼻粘膜的淋巴组织主要由双侧咽峡管、双侧咽淋巴环、鼻咽扁桃体、腭扁等结构组成，统称为鼻粘膜相关淋巴组织(nasal mucosal-associated lymphoid tissue，NALT)。NALT中定居有树突细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和M细胞等免疫细胞。研究表明，NALT是诱导局部和广泛粘膜免疫应答的重要组成部分。鼻腔免疫是一种方便高效的免疫方法。鼻腔粘膜免疫的优势在于：(1)鼻腔中蛋白酶含量较少，鼻腔免疫抗原需求量少，佐剂量小；(2)无酸性环境和酶对疫苗产生影响；(3)鼻腔免疫操作简单,不需购买专门器械,而且可避免注射引起病菌感染，特别是对于群聚人群来讲，此种免疫方法可增加建立群体免疫的机会。另外，鼻腔免疫可诱导体液免疫和细胞免疫，并引起广泛的粘膜免疫应答。

目前报道的鼻粘膜免疫的佐剂主要为细菌毒素，如，大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)和霍乱毒素(cholera toxin，CT)是有效的粘膜免疫佐剂。但他们存在的毒性限制了临床应用例如，美国于2003年上市的一种流感疫苗以LT为佐剂，接种后中发现其可产生贝尔麻痹等严重副作用而停止使用。

为了避免毒性，人们试图将CT和LT的B亚单位用做佐剂，不过，由于LTB和CTB都含有100多个氨基酸，分子量较大，只能通过基因工程生产，工艺复杂，制备成本高。而且，由于对其安全性的担忧，FDA至今没有批准用于临床。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的具有粘膜免疫佐剂活性的小分子多肽及其用途。

本发明多肽，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了前述多肽在制备免疫佐剂中的用途。

其中，所述免疫佐剂是具有粘膜免疫佐剂活性的佐剂。

本发明还提供了一种免疫佐剂，它是氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽，加上药学上可接受的辅助形成分制备而成的制剂。

发明人偶然发现本发明小分子多肽，其仅仅含有8个氨基酸，分子量约880Da，远远小于LTB和CTB，然而，其粘膜免疫佐剂活性却与大分子LTB相当，取得了意料不到的技术效果。

同时，本发明小分子多肽无毒副作用，安全有效，可以和目前广泛使用的疫苗抗原联合应用，并且，由于是小分子肽，可以自动化合成，性能更加稳定，质量容易控制，人用安全性高，成本低廉。

综上，本发明小分子多肽安全、有效、稳定、可控，有望用于人体，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本发明中粘膜免疫佐剂活性及其量效关系检测结果，所测样本为血清中的EVP1特异性抗体滴度，EVP1组与EVP1+PT10，EVP1+PT20组间差异显著(p<0.05)。PT代表本发明的粘膜免疫佐剂多肽。数字代表多肽含量(μg/只)。

图2本发明中粘膜免疫佐剂活性与LTB比较的检测结果，所测样本为血清中的EVP1特异性抗体滴度，EVP1组与EVP1+PT，EVP1+LTB组间差异显著(p<0.05)。EVP1+PT，与EVP1+LTB组间在24日的数据差异不显著(p>0.05)，PT代表本发明的粘膜免疫佐剂多肽。

图3本发明中粘膜免疫佐剂活性检测结果，所测样本为肺粘膜洗液中的EVP1特异性抗体滴度,EVP1组与EVP1+PT，EVP1+LTB组间差异显著(p<0.05)。PT代表本发明的粘膜免疫佐剂多肽。

具体实施方式

实验材料和试剂：

pBEX-LTB质粒由重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室构建；原核表达载体pET32a，E.coli TOP10、E.coli BL21(DE3)由重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室保存；雄性裸鼠由重庆医科大学实验动物中心提供。T4连接酶，Taq普通酶，SalⅠ，BamHⅠ，蛋白质Marker，DNA Marker，Plasmid Mini kit I，Cycle-Pure Kit，胶回收试剂盒，IPTG，卡那霉素，氨苄青霉素，BCA蛋白浓度测定试剂盒，PMSF等试剂。

实施例1本发明具有粘膜免疫佐剂活性的多肽的制备

本发明具有粘膜免疫佐剂活性的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，固相法合成，即得。

SEQ ID NO：1:HIDSQKKA。

经NCBI/BLAST检索，该多肽序列与大肠杆菌2788150株等大肠杆菌的不耐热肠毒素B亚单位(heat-labile enterotoxin B chain,LTB)的第21-28位氨基酸序列完全相同(GenBank NO:EMW30130.1)，同时也与霍乱弧菌O1血清型El Tor株等霍乱弧菌(Vibriocholerae serotype O1biotype El Tor)的霍乱肠毒素B亚单位(cholera enterotoxin Bsubunit,CTB)的第45-52位氨基酸序列完全一致(GenBank NO:AAY43121.1)。经PUBMED检索发现该序列是临近CTB的T细胞抗原表位(PMID:8921943)和LTB的T-细胞和B-细胞抗原表位(PMID:8606092)。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验材料EVP1、LTB的制备：

1、重组表达

1.1pET32-LTB、pET32-EVP1基因克隆与表达

a、合成重组目的基因：

(1)手足口病病毒EV71VP1基因：化学合成方法合成GenBank号为AB204852.1的EVP1基因，其核苷酸序列如SEQ NO：2所示：

atgggggacagagtggcagatgtgattgagagctctataggagatagtgtgagtaaggccctcacccaagctttacctgcacccacaggccaaaacacccaagtgagcagtcatcgcttagacactggaaaagtaccagcacttcaagccgccgaaatcggagcttcgtcgaatgctagtgatgagagtatgattgagactcggtgtgttcttaactcacatagcacagctgaaaccacccttgatagtttcttcagtagagcaggcttagttggggagatagatcttcctctaaagggcaccaccaatccgaacgggtatgccaactgggacatagacataaccggttatgcgcagatgcgcagaaaagtggaactattcacctatatgcgctttgacgcagagttcacttttgtcgcgtgcacacctaccggagaggtcgttccacagctgcttcaatacatgtttgttccacccggggcccccaaaccagactccagagactctttggcttggcaaacggccacgaacccctcagtttttgtcaaattatccgacccaccagcacaagtctcagtgccatttatgtcacctgcaagcgcataccaatggttttatgacggataccctacatttggagagcacaagcaagagaaggatctcgagtatggggcatgcccgaataacatgatgggcacattctcagtgcggactgtgggatcgtcacagtcaaaatatcccttagtcatcagaatatacatgagaatgaagcacgtcagagcgtggatacctcggccgatgcgcaatcagaactatttgttcaaatccaacccaaactatgctggtaattccattaaaccaactggtaccagccgaacggcaatcactacgctctga

(2)大肠杆菌LTB蛋白的克隆，其参考GenBank号为EU113252的序列设计的PCR引物序列为，pLTBF:tactcggatccatgaataaagtaaaatg,pLTBR:tagagcgtcgacgttttccatactgattg；其扩增核苷酸序列如SEQ NO：3所示：

atgaataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgttactatcctctctatgtgcatacggagctccccagtctattacagaactatgttcggaatatcgcaacacacaaatatatacgataaatgacaagatactatcatatacggaatcgatggcaggcaaaagagaaatggttatcattacatttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagactcccaaaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgagaccaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatcagtatggaaaactag

b、构建重组表达载体

分别将上述两个基因片段的用BamHI和SalI双酶切,然后将它们克隆到pET32载体中，分别命名为pET32-tk和pET32-evp1。

c、转化大肠杆菌，制备重组菌

(1)将20μl上述pET32-tk和pET32-evp1质粒DNA分别与50μl E.coli.Top10感受态细胞混合，冰上放置30分钟；

(2)42℃热休克90秒，立即冰浴1分钟；

(3)取50μl上述转化菌液混匀后均匀涂布于LB(100ug/mL Amp)培养板，在恒温培养箱中37℃倒置培养过夜。

(4)在LB培养板上挑选大小适中的菌落，通过菌落PCR初步筛选阳性克隆，之后提取重组质粒用BamHⅠ和SalⅠ做双酶切鉴定。

(5)鉴定正确的质粒公司测序。

1.2重组大肠杆菌的诱导表达

(1)接种上述重组菌的单克隆于LB培养基(100μg/ml Amp)，37℃250r/min摇床培养12h；

(2)将该菌液按1：100的接种量转接至新鲜的LA培养基，在37℃摇床中继续培养，转速为200r/min，用分光光度计进行实时检测，当菌液OD₆₀₀值达到0.6～0.8(细菌对数生长期)时加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达5h。

(3)诱导表达的菌液在13000g下离心10min，弃掉上清，用细菌裂解液充分重悬菌体，在室温下裂解处理30min。

(4)通过离心分别收集菌液上清和沉淀，裂解处理后的标本通过12％SDS-PAGE进行分析。

1.3分离纯化

(1)用His-tag磁珠纯化试剂盒(苏州海狸纳米科技公司)中的试剂分别裂解上述三个重组蛋白表达菌，2000rpm离心10min，上清液分别与1ml磁珠混合，室温下作用30min,置于磁性分离器分离，弃去上清液，用洗涤液洗磁珠10min,弃上清，用洗脱液洗涤磁珠5min,2000rpm离心10min，取上清，即为纯品EVP1或LTB，-20℃保存备用备用。

实验例1本发明具有粘膜免疫佐剂活性的多肽的安全性检测

1、实验方法

以BALB/c小鼠为动物模型，在小鼠腹腔注射本发明实施例1制备的具有粘膜免疫佐剂活性的多肽，检测其安全性：

a)从重庆医科大学实验动物中心领取体重为3-4周龄的健康雄性小鼠6只。

b)将实施例1制备的具有粘膜免疫佐剂活性的多肽用PBS缓冲液溶解。

c)将0.50ml浓度依次为1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml、50.0μg/ml、100.0μg/ml的具有粘膜免疫佐剂活性的多肽(没有进行外源性内毒素检测和处理)经腹腔注射到上述a)所述的小鼠体内，3日内观察实验兔与对照之间的体征差异(如活动能力、取食能力、是否有震颤、竖毛、粪便拉稀等)，和存活情况，3日内共进行3次注射。

d)将第3次注射后的动物8小时后麻醉处死，取心脏、肝脏、脾脏、肾脏进行病理学检测，同时以正常家兔的上述组织做对照。

2、实验结果

(1)注射后3小时内实验小鼠没有发现活动能力和取食能力的变化，也没有震颤、竖毛和粪便拉稀等其他体征差异和变化，更没有死亡个体。

(2)该多肽进入动物体内后对心脏等主要的脏器无病理损害。

实验结果说明，本发明SEQ ID NO：1所示小分子多肽用于体内使用是安全的。

实施例2本发明具有粘膜免疫佐剂活性的多肽的有效性检测

1、实验方法

用实施例1制备的具有粘膜免疫佐剂活性的多肽的不同浓度与一定浓度的EVP1组合，检测该多肽发挥免疫佐剂活性的最佳浓度。

将实施例1制备的具有粘膜免疫佐剂活性的多肽和/或的EVP1蛋白用PBS缓冲液溶解。a)在重庆医科大学动物试验中心购买裸鼠24只(雄性)，随机分为4组，每组6只。

b)将实施例1制备的粘膜免疫佐剂多肽按照A组5.0μg/只、B组10.0μg/只、C组20.0μg/只的浓度分别与实施例2制备的EVP1蛋白(10.0μg/只)组合，D组仅为EVP1蛋白(10.0μg/只)，作为阴性对照组，对乙醚麻醉的小鼠实施滴鼻免疫。

c)用等量的PBS滴鼻，作为空白对照组(E组)。

d)初次免疫后的第10日进行上述b)-c)的相同的第二次加强免疫，第21日进行第三次加强免疫，每次加强免疫前先要采集血液和粪便样本，-80℃保存备用。第24日采集第三次加强免疫后的血液和粪便标本，并将全部实验动物麻醉处死，洗涤肺粘膜采集标本，-80℃保存备用。

2、实验结果

如图1所示：

1、与仅仅给予抗原EVP1的阴性对照组(D组)相比，混合了本发明粘膜免疫佐剂多肽的A组、B组和C组动物的EVP1特异性抗体表达均显著增加，同时，说明本发明粘膜免疫佐剂多肽可以有效增强机体对抗原的免疫应答，具有明显的粘膜免疫佐剂活性。

2、A组、B组和C组相比，给予10.0μg/只和20.0μg/只的多肽的佐剂效果好于5.0μg/只组，10.0μg/只和20.0μg/只的多肽的佐剂效果几乎相当，考虑到成本因素，以10.0μg/只最佳。

实验结果说明，本发明SEQ ID NO：1所示小分子多肽可以有效增强机体对抗原的免疫应答，具有粘膜免疫佐剂活性，可以作为粘膜免疫佐剂使用。

实施例3粘膜免疫佐剂多肽的免疫增效活性比较

1、实验方法

用实施例1合成的具有粘膜免疫佐剂活性的多肽与EVP1按照一定比例组合，检测该多肽的免疫佐剂活性。同时，以LTB于EVP1组合，作为试验的阳性对照。

a)在重庆医科大学动物试验中心购买裸鼠24只(雄性)，随机分为4组，每组6只。

b)将实施例1制备的粘膜免疫佐剂多肽按照A组10.0μg/只与EVP1蛋白(10.0μg/只)组合，对乙醚麻醉的小鼠实施滴鼻免疫。同时，将EVP1蛋白(10.0μg/只)与LTB(10.0μg/只)组合，对乙醚麻醉的小鼠实施滴鼻免疫，作为阳性对照(B组)。

c)EVP1蛋白(10.0μg/只)作为C组，对乙醚麻醉的小鼠实施滴鼻免疫，作为阴性对照。

e)用等量的PBS滴鼻，作为空白对照组(D组)。

f)初次免疫后的第10日进行上述b)到e)的相同的第二次加强免疫，第21日进行第三次加强免疫，每次加强免疫前先要采集血液和粪便样本，-80℃保存备用。第24日采集第三次加强免疫后的血液和粪便标本，并将全部实验动物麻醉处死，洗涤肺粘膜采集标本，-80℃保存备用。

2、实验结果

如图2～3所示：

1、与空白对照组和EVP1单独免疫组相比，混合了本发明粘膜免疫佐剂多肽的A组动物的EVP1特异性抗体表达均显著增加。

2、与阳性对照组相比，混合了本发明粘膜免疫佐剂多肽的A组动物产生的EVP1特异性抗体水平几乎与阳性对照C组相当。

实验结果说明，本发明SEQ ID NO：1所示小分子多肽具有粘膜免疫佐剂活性，且活性与LTB相当。

综上，本发明小分子多肽的粘膜免疫佐剂活性与LTB相当，并且，由于其是小分子肽，性能更加稳定，可以自动化合成，质量容易控制，人用安全性高，生产更加方便快捷、成本更低，应用前景良好。

Claims (3)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的所述多肽在制备免疫佐剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述免疫佐剂是具有粘膜免疫佐剂活性的佐剂。

3.一种免疫佐剂，其特征在于：它是以氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成的制剂。