CN112538452A - 基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗及其制备方法 - Google Patents
基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗及其制备方法，涉及基因工程领域，本发明以减毒单增李斯特菌Lemo‑C07为背景，该菌株的毒力因子LLO蛋白携带了关键的两个突变氨基酸位点，使其毒力大大降低，但仍保留了部分在细胞内增殖能力。本发明疫苗利用该减毒李斯特菌为基础，利用分子生物学技术将宫颈癌特异性抗原E7全长基因整合至李斯特菌LLO基因下游，构建获得含肿瘤特异性抗原E7的重组减毒单增李斯特菌，该发明具有递呈特异性抗原并激活机体抗肿瘤细胞免疫的能力，具有显著的肿瘤治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗及其制备方法。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～ 55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。近几十年宫颈细胞学筛查的普遍应用，使宫颈癌和癌前病变得以早期发现和治疗，宫颈癌的发病率和死亡率已有明显下降。治疗癌症的传统方法主要是手术切除、放疗、化疗和治疗性疫苗。手术切除、放疗、化疗易出现转移和复发等弊端，相比之下疫苗疗法的优点是对机体的伤害小、毒性低。
目前针对肿瘤使用的疫苗主要是传统的灭活疫苗及亚单位疫苗，存在免疫周期长、免疫效果差等缺点。近些年来越来越多研究表明基于细菌为载体的疫苗用作外源抗原传递具显著优势，包括生产成本低、遗传稳定性高、安全性较好且和具有高效的抗肿瘤作用。
因此，基于活载体肿瘤免疫治疗疫苗能有效解决传统疫苗等治疗方法面临的技术缺陷，能更好的提高免疫治疗效果，缩短免疫周期，提高癌症患者的存活率，将来可发展成为癌症免疫治疗的关键技术和手段。
发明内容
解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗及其制备方法，解决背景技术所提出的至少一个问题。
技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
第一方面：提供基于新型重组减毒单増李斯特菌，所述重组减毒单增李斯特菌以减毒单增李斯特菌为载体，携带HPV 16型E7融合抗原表位肽基因而得；所述重组减毒单增李斯特菌的保藏编号为：19833，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
且，所述减毒单増李斯特菌为Lemo-C07。
第二方面，提供基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，所述疫苗包含上述权利要求1所述的基于新型重组减毒单増李斯特菌。
优选的，所述疫苗用于治疗由HPV 16型引起的宫颈癌。
第三方面，还提供基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成HPV 16型E7基因的完成开放阅读框序列；
(2)构建同源重组质粒pSL1854；
(3)制备减毒单增的李斯特菌感受态细胞；
(4)利用所述步骤(2)制备的重组质粒对所述步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；
(5)筛选得到宫颈癌治疗性疫苗。
优选的，所述步骤(1)具体包括：
从NCBI上下载HPV 16型E7基因的开放阅读框序列，长度为297bp。
优选的，所述步骤(2)具体包括：
利用PCR技术扩增Lemo-C07的hly基因C端498bp以及hly基因下游500bp 分别作为片段A和片段B；
同时扩增HPV 16 E7基因全长序列，通过重叠SOE-PCR技术将三个片段连在一起获得A-E7-B的目的片段；
以KpnⅠ和PstⅠ为酶切位点，经酶切、酶连至李斯特菌穿梭质粒pKSV7，获得重组质粒pSL1854。
优选的，所述步骤(3)具体包括：
将减毒单增李斯特菌Lemo-C07接种于新鲜无菌的100mL BHI液体培养基中，37℃振荡培养至OD600nm值约为0.18-0.25；加入青霉素G，使其终浓度为 20μg/mL，37℃振荡培养2h；收集菌体，加入适量含1mM HEPES和0.5M蔗糖的洗涤缓冲液，洗涤两次；弃上清，向沉淀中加入1mL的洗涤缓冲液，重悬菌体；分装，置于-80℃冰箱备用。
优选的，所述步骤(4)具体包括：
将步骤(2)所得重组质粒电转入步骤(3)所得减毒单増李斯特菌感受态细胞中，加入预热的1mL BHI液体培养基中，充分混匀，置于30℃恒温培养箱2-3 h；将转化液涂布于氯霉素抗性的BHI固体培养基中，置于37℃培养。
优选的，所述步骤(5)具体包括：
挑取所述步骤(4)中获得的单菌落，在BHI液体培养基扩大培养，进行PCR 验证；将验证的阳性菌株置于42℃进行同源重组以及30℃连续传代丢质粒，最后经PCR筛选和基因测序验证后得到所述疫苗，将测序正确的菌液和60％甘油1:1 混合，放入-80℃冰箱保存。
有益效果
本发明提供了基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗及其制备方法。与现有技术相比，具备以下有益效果：
单增李斯特菌感染宿主细胞后能够显著激活机体特异性细胞免疫反应。毒力因子LLO含有富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基(PEST域)，其两侧是含有带正电残基的簇，这些簇能够诱导与LLO融合表达的外源肿瘤特异性抗原至蛋白酶体降解，并通过MHC I类分子呈递，激活抗肿瘤细胞免疫，达到治疗肿瘤的效果。
本发明以减毒单增李斯特菌Lemo-C07为背景，该菌株的毒力因子LLO蛋白携带了关键的两个突变氨基酸位点(N478AV479A)，使其毒力大大降低，但仍保留了部分在细胞内增殖能力。本发明疫苗利用该减毒李斯特菌为基础，利用分子生物学技术将宫颈癌特异性抗原E7全长基因整合至李斯特菌LLO基因下游，构建获得含肿瘤特异性抗原E7的重组减毒单增李斯特菌(LADS-Echo7)，该发明具有递呈特异性抗原并激活机体抗肿瘤细胞免疫的能力，具有显著的肿瘤治疗效果。
含有HPV 16型E7肿瘤抗原的重组减毒李斯特菌在小鼠宫颈癌模型上具有非常显著的治疗效果，具体具有以下效果：
1、稳定性：本发明将肿瘤特异性抗原基因整合至减毒李斯特菌基因组中，使抗原基因能够稳定表达，不易丢失。
2、安全性：本发明使用的减毒株Lemo-C07与野生株相比，毒力降低了近10000 倍(符合疫苗的生物安全级别)；该重组疫苗不含抗性质粒，无抗生素耐药风险。
3、特异性：本发明携带并表达肿瘤特异性抗原E7能够激活机体特异性抗肿瘤细胞免疫并激发肿瘤杀伤效应，且不损伤正常细胞。
4、高效性：本发明将肿瘤特异性抗原E7与李斯特菌自身毒力基因LLO融合表达，能显著激活机体的抗肿瘤免疫机制，具有高效的肿瘤杀伤机制。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为用于构建本发明疫苗LADS-Echo7的同源重组质粒(pSL1854)图谱，包含由减毒；
单增李斯特菌Lemo-C07菌株hly基因C端部分序列(498bp，去除hly终止密码子)、E7基因完整ORF以及hly基因下游500bp组成的同源重组片段；
图2为利用Western blotting检测LADS-Echo7表达重组肿瘤抗原E7蛋白情况；
图3为C57BL/6小鼠宫颈癌模型的构建及利用LADS-Echo7免疫治疗的策略；
图4为LADS-Echo7治疗小鼠宫颈癌模型的效果评价；
图5为LADS-Echo7治疗小鼠宫颈癌模型的T淋巴细胞分布情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的目的是提供基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗及其制备方法，所述重组减毒单增李斯特菌以新型减毒单增李斯特菌为载体，携带型E7融合抗原表位肽基因而得；该重组减毒单增李斯特菌(ALDS-Echo7) 的分类名称为单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，保藏日期为： 2020年05月18日；保藏编号为：19833，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：中国北京。
其中，所使用的背景载体为减毒单増李斯特菌Lemo-C07，该减毒单増李斯特菌(Lemo-C07)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101)，社会公众可根据其规定自行获取，保藏编号为18647；
进一步的，本发明实施例还提供基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，所述疫苗包含上述基于新型重组减毒单増李斯特菌。
一实施例中，所述疫苗用于治疗由HPV 16型引起的宫颈癌。
再进一步的，本发明实施例还提供上述重组减毒单増李斯特菌疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成HPV 16型E7基因的完成开放阅读框(ORF)序列；
(2)构建用于本发明的同源重组质粒pSL1854；
(3)制备减毒单增的李斯特菌d感受态细胞；
(4)利用步骤(2)制备的重组质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；
(5)本发明疫苗(LADS-Echo7)的筛选。
一实施例中，所述步骤(1)具体包括：
从NCBI上下载HPV 16型E7基因的ORF序列，长度为297bp，并委托苏州金唯智生物科技公司合成该序列。
一实施例中，所述步骤(2)具体包括：
利用PCR技术扩增Lemo-C07的hly基因(含氨基酸突变位点N478AV479A) C端498bp(去除hly终止密码子)以及hly基因下游500bp分别作为片段A和片段B；同时扩增HPV 16 E7基因全长序列，通过重叠PCR(SOE-PCR)技术将三个片段连在一起获得“A-E7-B”的目的片段，以KpnⅠ和PstⅠ为酶切位点，经酶切、酶连至李斯特菌穿梭质粒pKSV7，获得重组质粒pSL1854，并经质粒电转、同源重组、质粒丢失等过程获得能够稳定表达E7抗原的重组减毒李斯特菌疫苗。
一实施例中，所述步骤(3)具体包括：
将减毒单增李斯特菌Lemo-C07接种于新鲜无菌的100mL BHI液体培养基 (含0.5M蔗糖)中，37℃振荡培养至OD600nm值约为0.18-0.25；加入青霉素G (已过滤除菌)，使其终浓度为20μg/mL，37℃振荡培养2h；收集菌体，加入适量含1mM HEPES和0.5M蔗糖的洗涤缓冲液(已预冷)，洗涤两次；弃上清，向沉淀中加入1mL的洗涤缓冲液，重悬菌体；分装，置于-80℃冰箱备用。
一实施例中，所述步骤(4)具体包括：
将步骤(2)所得重组质粒电转入步骤(3)所得减毒单増李斯特菌感受态细胞中，加入预热的1mL BHI液体培养基中(含0.5M蔗糖)，充分混匀，置于30℃恒温培养箱2-3h；将转化液涂布于氯霉素抗性的BHI固体培养基中，置于37℃培养。
一实施例中，所述步骤(5)具体包括：
挑取步骤(4)中获得的单菌落，在BHI液体培养基(氯霉素抗性)扩大培养，进行PCR验证；将验证的阳性菌株置于42℃进行同源重组以及30℃连续传代丢质粒，最后经PCR筛选和基因测序验证后得到本发明所述的重组减毒李斯特菌疫苗(LADS-Echo7)，将测序正确的菌液和60％甘油1:1混合，放入-80℃冰箱保存。
下面结合附图，对发明的实施例进行详细的描述。
首先介绍本发明实施例中所使用的菌株、试剂与仪器：
主要菌株：
本发明所用的减毒单増李斯特菌背景菌株(Lemo-C07)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101)，社会公众可根据其规定自行获取，保藏编号为18647。本发明所获得的重组减毒单增李斯特菌治疗宫颈癌疫苗的保藏编号为：19833，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
主要试剂
LB培养基、琼脂糖H、agar均购于上海生工生物工程公司，BHI培养基购自英国Oxoid公司，PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自惠晶生物科技，质粒提取试剂盒、细胞总RNA提取试剂盒均购自天根生化各级有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天，PCR相关试剂购自南京诺唯赞，DNA连接酶(Ligation high ver.2)购自Toyobo，限制性内切酶购自NEB，氨苄霉素和卡那霉素购自Sangon，反转录试剂盒购自TOYOBO，DMEM、FBS、PBS、蛋白maker均购自赛默飞，流式荧光抗体、Transcription Factor Buffer Set和Stain BufferFBS购自美国BD公司。
主要仪器
摇床(HZ-9211K)、涡旋振荡器(ZEALWAY GI541)、多功能酶标仪(BioTekSynergyTM H1)、梯度PCR仪(Eppendorf)、凝胶成像系统(UVP)、金属浴(Thermo)、生物安全柜(BSC-II)、电击转化仪(BTX ECM 630)蛋白电泳仪(BIORAD)、细胞二氧化碳培养箱(Thermo)。
实施例1重组李斯特菌疫苗LADS-Echo7的构建
1、合成HPV 16型E7全长基因序列及同源重组质粒的构建
从Genbank数据库下载HPV 16型E7基因的完整开放阅读框(ORF)序列(如 SEQ IDNO.1所示)，并委托苏州金唯智生物科技公司合成该序列。利用PCR以 Lemo-C07全基因组DNA为模板扩增分别含酶切位点KpnⅠ和PstⅠ的片段A(498bp，扩增引物为P2和P3)和B(500bp，扩增引物为P4和P5)；同时以合成的E7 基因完整序列为模板扩增得到片段E7(扩增引物为P6和P7)。在此基础上，通过重叠PCR技术(SOE-PCR)将三个片段连在一起获得“A-E7-B”的目的片段(序列如SEQ ID NO.2所示)。以KpnⅠ和PstⅠ为酶切位点，经酶切、连接克隆至李斯特菌穿梭质粒pKSV7，获得同源重组质粒pSL1854，测序验证正确后保存于-20℃。相关引物见表1：
表1重组质粒pSL1854构建所需引物
注：P1为李斯特菌基因组上距离A片段上游208bp用于验证重组质粒的引物； P2为扩增A片段的上游引物；P3为扩增A片段的下游引物；P4为扩增B片段的上游引物；P5为扩增B片段的下游引物；P6为扩增E7片段的上游引物；P7为扩增E7片段的下游引物。
具体操作：用P2和P3引物扩增A片段，用P4和P5扩增B片段，用P6和 P7扩增E7片段，通过SOE-PCR技术将三个片段连在一起获得“A-E7-B”的目的片段，用KpnⅠ和PstⅠ对目的片段和载体(pKSV7)进行双酶切，按照试剂盒说明书进行酶切产物纯化。将6μL目的片段、4μL载体和10μL DNA连接酶混合后置于16℃金属浴进行酶连，得到重组质粒pSL1854(构建图谱如图1所示)。
2、减毒单增李斯特菌感受态细胞的制备
使用接种环蘸取减毒单增李斯特菌Lemo-C07冻存菌液，在BHI固体平板培养划线，37℃培养过夜，获取单菌落。挑取单菌落接种于5mL BHI液体培养基， 37℃培养过夜。取过夜培养菌液以1:100的比例转接1mL至100mL BHI的培养基(含0.5M蔗糖)中，37℃振荡培养至OD600nm值约为0.18-0.25；加入终浓度为20μg/mL的青霉素G(过滤除菌)，继续培养2h；3500rpm，10min，4℃收集菌体，弃上清，加入适量预冷的缓冲液(含1mM HEPES和0.5M蔗糖)，洗涤两次；离心，弃上清后向沉淀中加入洗涤缓冲液，重悬菌体，分装，置于-80℃冰箱备用。
3、电击转化(电转)
将1μg重组质粒(pSL1854)通过电转仪电转入上述制备的感受态细胞中(电转设置条件为2500V、200Ω、25μF)，电击后，迅速加入1mL预热的BHI液体培养基(含0.5M蔗糖)，充分混匀后移至新的1.5mL EP管中，置于30℃恒温培养箱中静置培养2-3h，离心(6000rpm，2min)重悬后的菌体涂布于含氯霉素抗性的BHI固体培养基中，置于37℃恒温培养箱培养24-48h，培养出单克隆。
4、同源重组及筛选获得重组李斯特菌疫苗LADS-Echo7
挑取将上述获得的单克隆落接种于BHI液体培养基(氯霉素抗性)中，置于 37℃震荡过夜培养。用P2和P5引物进行菌液PCR验证，约在1319bp处有明显条带认定为含重组质粒的克隆。将对应克隆接种于BHI液体培养基(氯霉素抗性) 中置于42℃条件下传代培养进行同源重组，在适当代数进行菌液划线获得单克隆，用P1和P5引物进行菌落PCR验证，筛选出大片段(1500bp左右)的克隆(认定为同源重组整合成功)。将筛选出的单克隆接种于不含抗性的BHI液体培养基中于30℃条件下传代以丢掉同源重组后的质粒，在适当代数划线挑取单克隆进行抗性筛选获得无抗性的克隆(质粒已丢失)，最后经基因测序验证正确后获得表达LLO-E7融合蛋白的重组减毒单増李斯特菌(即本发明所述的LADS-Echo7)，重组李斯特菌以1：1加入60％甘油并冻存于-80℃冰箱。
实施例2重组李斯特菌疫苗LADS-Echo7治疗小鼠宫颈癌模型的效果评价
1.LADS-Echo7表达重组肿瘤抗原E7蛋白的验证
挑取单菌落于5mL BHI液体培养基中，置于37℃摇床过夜培养。取1mL过夜培养菌液转接至100mL BHI液体培养基中于37℃摇床震荡培养8-9h，离心后过滤上清；将过滤后的上清用三氯乙酸沉淀过夜，12000rpm，20min，4℃离心弃上清，用1mL 1M NaOH将沉淀重悬，离心取上清，即为分泌蛋白；离心后沉淀用50mM PBS洗涤后用1mL李斯特裂解液重悬，匀浆仪破碎，离心取上清，即为胞质蛋白。将分泌蛋白和胞质蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒测浓度并定量后，加入蛋白质上样缓冲液(4×Loading Buffer)煮沸6-7min，完成蛋白样品的制备，进行Western blotting验证蛋白表达情况。如图2所示，与对照Lemo-C07相比， LADS-Echo7能融合表达LLO-E7蛋白，且E7蛋白只在LADS-Echo7中表达。
2.小鼠宫颈癌模型的构建及利用LADS-Echo7免疫治疗的策略
选择6～8周龄的C57BL/6雌鼠左侧腹部皮下注射约2×105个TC-1肿瘤细胞，约6-7天后肿瘤直径达约5mm即可开展下一步的肿瘤治疗试验。分别在第8天和第15天通过尾静脉注射本发明疫苗LADS-Echo7(每只小鼠的注射量约为108 CFU)进行免疫治疗，治疗期间观察测量肿瘤大小的变化情况，同时在第22天取肿瘤细胞和小鼠脾细胞进行后续分析。具体免疫治疗策略如图3所示。
3.LADS-Echo7治疗小鼠宫颈癌模型中的效果评价
分别在第8、11、15、18和22天利用游标卡尺测量腹部肿瘤大小，依照公式 (L×W2)/2测算肿瘤体积(L和W分别为长和宽)。如图4所示，在整个治疗阶段，注射本发明疫苗LADS-Echo7的小鼠肿瘤显著变小且该治疗组在第22天有3 只小鼠的肿瘤已经完全被消除；同时注射PBS和Lemo-C07(注射量约为108CFU) 对照组中小鼠的肿瘤生长趋势完全没有被抑制，肿瘤大小持续增长。该试验表明本发明疫苗LADS-Echo7对于小鼠宫颈癌模型具有非常显著的治疗效果。
4.LADS-Echo7治疗小鼠宫颈癌模型中的T淋巴细胞分布情况检测
第22天取小鼠脾脏，用研钵充分研磨，加入PBS后用滤网过滤，获得小鼠脾细胞。使用抗荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的抗CD3、藻红蛋白(PE)标记的抗CD4、抗藻蓝蛋白(APC)标记的抗CD8、荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的抗CD4、藻蓝蛋白(APC)标记的抗CD25以及藻红蛋白(PE)染色标记的FoxP3 等抗体通过流式细胞仪分析T淋巴细胞的变化。如图5所示，与对照组PBS比较，本发明疫苗LADS-Echo7治疗后小鼠脾脏中的CD4+和CD8+ T淋巴细胞的分布显著增多，而通过主动调节方式抑制机体内T细胞活化与增殖的调节性T淋巴细胞(Tregs)的分布显著降低，该结果表明LADS-Echo7能够通过激活效应T淋巴细胞和抑制调节性T淋巴进而抑制小鼠机体中肿瘤的生长并杀伤肿瘤，从而达到治疗肿瘤的效果。
需要说明的是，在本文中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.基于新型重组减毒单増李斯特菌，其特征在于，所述重组减毒单增李斯特菌以减毒单增李斯特菌为载体，携带HPV 16型E7融合抗原表位肽基因而得；所述重组减毒单增李斯特菌的保藏编号为：19833，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
且，所述减毒单増李斯特菌为Lemo-C07。
2.基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，其特征在于，所述疫苗包含上述权利要求1所述的基于新型重组减毒单増李斯特菌。
3.根据权利要求2所述的基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，其特征在于，所述疫苗用于治疗由HPV 16型引起的宫颈癌。
4.根据权利要求2或3所述基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成HPV 16型E7基因的完成开放阅读框序列；
(2)构建同源重组质粒pSL1854；
(3)制备减毒单增的李斯特菌感受态细胞；
(4)利用所述步骤(2)制备的重组质粒对所述步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；
(5)筛选得到宫颈癌治疗性疫苗。
5.根据权利要求4所述基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：
从NCBI上下载HPV 16型E7基因的开放阅读框序列，长度为297bp。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：
利用PCR技术扩增Lemo-C07的hly基因C端498bp以及hly基因下游500bp分别作为片段A和片段B；
同时扩增HPV 16E7基因全长序列，通过重叠SOE-PCR技术将三个片段连在一起获得A-E7-B的目的片段；
以KpnⅠ和PstⅠ为酶切位点，经酶切、酶连至李斯特菌穿梭质粒pKSV7，获得重组质粒pSL1854。
7.根据权利要求4所述基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：
将减毒单增李斯特菌Lemo-C07接种于新鲜无菌的100mL BHI液体培养基中，37℃振荡培养至OD600 nm值约为0.18-0.25；加入青霉素G，使其终浓度为20μg/mL，37℃振荡培养2h；收集菌体，加入适量含1mM HEPES和0.5M蔗糖的洗涤缓冲液，洗涤两次；弃上清，向沉淀中加入1mL的洗涤缓冲液，重悬菌体；分装，置于-80℃冰箱备用。
8.根据权利要求4所述基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括：
将步骤(2)所得重组质粒电转入步骤(3)所得减毒单増李斯特菌感受态细胞中，加入预热的1mL BHI液体培养基中，充分混匀，置于30℃恒温培养箱2-3h；将转化液涂布于氯霉素抗性的BHI固体培养基中，置于37℃培养。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)具体包括：
挑取所述步骤(4)中获得的单菌落，在BHI液体培养基扩大培养，进行PCR验证；将验证的阳性菌株置于42℃进行同源重组以及30℃连续传代丢质粒，最后经PCR筛选和基因测序验证后得到所述疫苗，将测序正确的菌液和60％甘油1:1混合，放入-80℃冰箱保存。
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