CN110373422A - 重组裂解猪霍乱沙门菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组裂解猪霍乱沙门菌及其构建方法和应用。重组裂解猪霍乱沙门菌，其基因组中引入有以下元件：mazE表达元件：包括抗毒素基因mazE及其上游的启动子PBAD，编码启动子PBAD的正负调控子基因araC；lacI表达元件：包括基因lacI及其上游的启动子PBAD，编码启动子PBAD的正负调控子基因araC；mazF表达元件：包括毒素基因mazF及其上游的启动子Plac。本发明还公开了其构建方法和应用。本发明将阿拉伯糖启动子调控基因技术与MazEF系统相结合改造沙门菌载体，使其完成免疫刺激后发生程序性死亡，安全性好，为沙门菌成为生物安全可控的递送外源抗原的多价疫苗载体提供了保障。

Description

重组裂解猪霍乱沙门菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于动物细菌基因工程技术领域，特别涉及一种重组裂解猪霍乱沙门菌及其构建方法和应用。
背景技术
随着分子生物学的发展，将病原菌经过基因修饰，作为其本身的预防疫苗或者同时递送外源抗原的疫苗研究已经见于诸多报道。其中沙门菌对宿主具备较强的侵袭性，其携带质粒表达的异源蛋白可对宿主持续刺激，能更好的引起黏膜、细胞和体液免疫反应。因此减毒沙门菌作为疫苗载体有着无比的优越性，国内外已将其广泛用于病毒、细菌、寄生虫等二联基因工程减毒疫苗的研制。但是沙门菌是活的重组菌，一方面存在毒力返强的风险，另一方面存在被免疫动物排毒出的载体菌污染环境的缺陷。这也是沙门菌作为疫苗载体的瓶颈。最近20年，众多科学家不断努力寻找新的技术试图突破这些瓶颈。如Wei K.等通过阿拉伯糖调控沙门菌染色体上的murA基因的表达，使沙门菌载体在免疫宿主后21天，利用宿主体内没有阿拉伯糖的特性，使沙门菌发生了程序性裂解，同时将合成的外源抗原释放到宿主淋巴组织细胞的外环境中，该技术使沙门菌载体在完成诱导宿主产生针对自身和携带的外源抗原的免疫应答的任务后，发生程序性裂解，确保了作为活的疫苗载体需要的生物安全特性。但是该技术产生的载体菌仍然可以在宿主体内存活21天。因此需要建立一种方法，使沙门菌载体存活的时间足够诱导免疫应答后发生程序性裂解，这个时间通常为2周。
许多细菌编码毒素-抗毒素系统，该系统由两部分组成：一个是影响细菌生长和死亡的稳定毒素，另一个是可以抑制毒素活性的不稳定的抗毒素。在大肠杆菌中，MazEF系统就是一种毒素-抗毒素系统。在这个系统中，MazE是不稳定的抗毒素；而MazF是与之对应的细菌毒素，是一种ACA序列特异的核糖核酸内切酶，几乎可切割所有含有ACA序列的细菌，从而抑制细菌生长。在自然条件下，MazF只能调节细菌的生长，导致细菌暂时性的生长停滞，此时产生MazF的细菌在各种代谢途径中仍是有活性的，当产生足够的MazE中和MazF毒素时，细胞可恢复其生长特性。相反，当控制抗毒素MazE表达时，累积合成的MazF就会酶切细菌染色体中含有ACA序列的mRNA，最终导致细菌的程序性裂解。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种重组裂解猪霍乱沙门菌，首次将阿拉伯糖启动子调控基因技术与MazEF系统相结合改造沙门菌载体，使其完成免疫刺激后发生程序性死亡，以解除活的沙门菌载体含有的毒力返强和污染环境的风险；本发明的另一目的是提供该重组裂解猪霍乱沙门菌的构建方法和应用。
技术方案：本发明所述的重组裂解猪霍乱沙门菌，其基因组中引入有以下元件：
mazE表达元件：包括抗毒素基因mazE及其上游的启动子PBAD，编码启动子PBAD的正负调控子基因araC；
lacI表达元件：包括基因lacI及其上游的启动子PBAD，编码启动子PBAD的正负调控子基因araC；
mazF表达元件：包括毒素基因mazF及其上游的启动子Plac。
本发明使用araC PBAD激活启动子技术在猪霍乱沙门菌中引入araC PBAD调控的mazE基因，使MazE蛋白的表达受到阿拉伯糖的调控，MazE蛋白能够抑制MazF蛋白；在猪霍乱沙门菌中分别引入lacI表达元件和mazF表达元件，使lacI蛋白的表达受到阿拉伯糖的调控，而lacI蛋白抑制Plac，进而抑制Plac调控的MazF蛋白的表达。本发明在体内体外评估了重组裂解猪霍乱沙门菌的裂解能力，在体外存在阿拉伯糖的情况下，MazE蛋白和lacI蛋白表达，同时抑制MazF蛋白的表达，使含有裂解系统的猪霍乱沙门菌在体外可以像野生菌一样正常生长并入侵动物机体；而在动物体内，随着阿拉伯糖浓度的减少和消失，MazE蛋白和lacI蛋白的表达量逐渐减少，而MazF蛋白的表达量逐渐增多，MazF切割细胞mRNA，使重组裂解猪霍乱沙门菌的发生程序性裂解并减毒。
引入元件的位置处于endA、cysG、relA基因中的一个或几个，进一步的，每个表达元件对应一个上述的一个引入基因位置，如mazE表达元件引入位置在endA基因，mazF表达元件引入位置在cysG基因。
进一步，mazE表达元件包括：SEQ ID NO.2所示片段2与SEQ ID NO.3所示片段3连接得到的序列；
mazF表达元件包括：SEQ ID NO.6所示的片段6。
本发明还提供了一种重组裂解猪霍乱沙门菌的构建方法，包括：向猪霍乱沙门菌的基因组中引入以下元件：
mazE表达元件：包括毒素基因mazE及其上游的启动子PBAD，编码启动子PBAD的正负调控子基因araC；
lacI表达元件：包括基因lacI及其上游的启动子PBAD，编码启动子PBAD的正负调控子基因araC；和，
mazF表达元件：包括毒素基因mazF及其上游的启动子Plac。
可通过同源重组的方法引入所述元件。
方法包括：分别构建含各自表达元件的同源重组结构序列，所述同源重组结构序列在表达元件的上下游为用于敲除相应基因的同源臂；将同源重组结构序列分别连入自杀载体，转入asd基因缺失的大肠杆菌工程菌中；通过同源重组作用，将各表达元件依次转入猪霍乱沙门菌中。
通过构建阿拉伯糖调控的含mazE、mazF基因的自杀载体，随后通过自杀载体同源重组的方法，在野生型猪霍乱沙门菌中引入上述表达元件，进一步，可选地，具体包括如下步骤：
(1)ΔendA::araC PBAD mazE TT自杀载体的构建
扩增并依次连接SEQ ID NO.1所示的片段1、SEQ ID NO.2所示的片段2、SEQ IDNO.3所示的片段3及SEQ ID NO.4所示的片段4，得到ΔendA::araC PBAD mazE TT结构序列，并将ΔendA::araC PBAD mazE TT序列连接自杀载体，转化asd基因缺失的大肠杆菌工程菌；
(2)ΔcysG:Plac mazF自杀载体的构建
扩增并依次连接SEQ ID NO.5所示的片段5、SEQ ID NO.6所示的片段6以及SEQ IDNO.7所示的片段7，得到ΔcysG:Plac mazF结构序列，并将ΔcysG:Plac mazF序列连接自杀载体，转化asd基因缺失的大肠杆菌工程菌；
(3)同源重组方法，在猪霍乱沙门菌C78-3中引入突变ΔendA::araC PBAD mazE TT突变，获得猪霍乱沙门菌C78-3(ΔendA::araC PBAD mazE TT)；
(4)同源重组方法，在猪霍乱沙门菌C78-3(ΔendA::araC PBAD mazE TT)中引入ΔrelA::araC PBAD lacI TT突变，构建猪霍乱沙门菌rSC0117；具体方法参照专利ZL201410647735.3具体实施方式公布的方法；
(5)同源重组方法，在猪霍乱沙门菌rSC0117中引入ΔcysG:Plac mazF突变，构建猪霍乱沙门菌rSC0118，即重组裂解猪霍乱沙门菌。
上述含有裂解系统的猪霍乱沙门菌疫苗载体是在强毒株C78-3上构建的，这种含有裂解系统的猪霍乱沙门菌含ΔendA::araC PBAD mazE TT，ΔrelA::araC PBAD lacI TT，ΔcysG:Plac mazF三个突变，命名为rSC0118。
本发明还提供了一种调控猪霍乱沙门菌程序性裂解的方法，包括：
构建所述的重组猪霍乱沙门菌，调节其培养环境中阿拉伯糖的含量，调控程序性裂解。利用阿拉伯糖启动子调控MazE的表达，使载体菌在体外生长时合成MazE抗毒素中和MazF，使沙门菌在体外像野生菌一样生长；而当进入宿主细胞后，由于阿拉伯糖浓度的稀释和消失，不能合成MazE抗毒素，导致合成表达的MazF越来越多，只有无ACA序列的外源抗原不断被合成，而含有ACA序列mRNA的载体菌渐渐被MazF酶切，最后载体菌发生程序性死亡。
本发明还提供了所述的重组猪霍乱沙门菌在制备疫苗中的应用。使作为载体的猪霍乱沙门菌在完成递送外源抗原，诱导宿主免疫应答的任务后，发生程序性死亡(裂解)，以解除活的沙门菌载体含有的毒力返强和污染环境的风险。
定义：
基因mazE：大肠杆菌TA系统的抗毒素基因；
基因mazF：大肠杆菌TA系统的毒素基因；
启动子PBAD：大肠杆菌araBAD基因簇的启动子；
基因araC：大肠杆菌ara操纵子中的araC基因，其产物转录因子araC调控araA、araB、araD基因的表达；
启动子Plac：大肠杆菌乳糖操纵子的启动子；
基因lacI：大肠杆菌乳糖操纵系统的阻遏基因；
asd基因：沙门氏菌中编码天冬氨酸β半乳糖脱氢酶的基因。
有益效果：
1)本发明使用阿拉伯糖启动子araC PBAD调控含MazEF裂解系统的猪霍乱沙门菌，即：利用动物体内没有阿拉伯糖的特性，在体外培养重组猪霍乱沙门菌时可以人为加入一定浓度的阿拉伯糖，重组猪霍乱沙门菌中的MazE蛋白和lacI蛋白能完全被表达，抑制MazF蛋白的表达，使重组猪霍乱沙门菌在入侵宿主的初期具有像野生型菌株一样的入侵能力；而重组猪霍乱沙门菌进入宿主体内，随着细菌的复制，体外人工加入的阿拉伯糖浓度不断被稀释，重组猪霍乱沙门菌中MazE蛋白和lacI蛋白的浓度不断减少，MazF蛋白的浓度不断增加，使重组猪霍乱沙门菌发生程序性裂解，提高了生物安全性；本发明首次将MazEF系统引入猪霍乱沙门菌的构建，将阿拉伯糖启动子调控基因技术与MazEF系统相结合改造沙门菌载体，使其完成免疫刺激后发生程序性死亡，以保障人类生态环境的安全性。
2)重组猪霍乱沙门菌减毒：在强毒猪霍乱沙门菌C78-3中引入ΔendA::araC PBADmazE TT，ΔrelA::araC PBAD lacI TT，ΔcysG:Plac mazF三个突变，与原始菌株C78-3相比毒力显著减弱，提高了生物安全性；
3)通过定居实验，猪霍乱沙门菌裂解株在动物体内定居15d后消失。
附图说明
图1是ΔendA::araC PBAD mazE TT的构建图；
图2是sprt基因片段的扩增图，M：DL2000，1-6：sprt基因扩增的阳性结果；
图3是T4ipIII-mazE基因片段的扩增图，M：DL2000，1-4：T4ipIII-mazE基因扩增的阳性结果；
图4是araC PBAD基因片段的扩增，M：DL2000，1-6：araC PBAD基因扩增的阳性结果；
图5是yggj基因片段的扩增图，M：DL2000，1-6：yggj基因扩增的阳性结果；
图6是sprt和T载体连接的双酶切鉴定图，M：DL5000，1-3：sprt和T载体连接的双酶切鉴定阳性结果；
图7是T4ipIII-mazE和T载体连接的酶切鉴定图，M：DL5000，1-3：T4ipIII-mazE和T载体连接的双酶切鉴定阳性结果；
图8是araC PBAD和T载体连接的酶切鉴定图，M：DL5000，1-5：araC PBAD和T载体连接的酶切鉴定阳性结果；
图9是yggj和T载体连接的酶切鉴定图，M：DL5000，1-5：yggj和T载体连接的酶切鉴定阳性结果；
图10是sprt-mazE和T载体连接的酶切鉴定图，M：DL5000，1-5：sprt-mazE和T载体连接的酶切鉴定阳性结果；
图11是araC PBAD-yggj和T载体连接的酶切鉴定图，M：DL5000，1-2：araC PBAD-yggj和T载体连接的酶切鉴定阳性结果；
图12是χ7213(ΔendA::araC PBAD mazE TT)重组质粒的PCR鉴定，M：DL5000，1-6：χ7213(ΔendA::araC PBAD mazE TT)重组质粒PCR鉴定的阳性结果；
图13是χ7213(ΔendA::araC PBAD mazE TT)重组质粒的酶切鉴定图，M1：DL5000，M2：DL10000，1-4：χ7213(ΔendA::araC PBAD mazE TT)重组质粒酶切鉴定的阳性结果；
图14是ΔcysG:Plac mazF的构建图；
图15是nirC基因片段的扩增，M：DL2000，1-5：nirC基因扩增的阳性结果；
图16是Plac-mazF基因片段的扩增，M：DL5000，1-6：Plac-mazF基因扩增的阳性结果；
图17是yfhL基因片段的扩增，M：DL5000，1-5：yfhL基因扩增的阳性结果；
图18是nirC和T载体连接的酶切鉴定图，M：DL5000，1-5：nirC和T载体连接的酶切鉴定阳性；
图19是Plac-mazF和T载体连接的酶切鉴定图，M：DL5000，1-6：Plac-mazF和T载体连接的酶切鉴定阳性；
图20是yfhL和T载体连接的酶切鉴定图，M：DL5000，1-6：yfhL和T载体连接的酶切鉴定阳性；
图21是nirC-PlacmazF-yhfL和T载体连接的酶切鉴定图，M：DL5000，1-5：nirC-PlacmazF-yhfL和T载体连接的酶切鉴定阳性；
图22是χ7213(ΔcysG:Plac mazF)重组质粒的PCR鉴定，M：DL5000，1-5：χ7213(ΔcysG:Plac mazF)重组质粒PCR鉴定的阳性结果；
图23是χ7213(ΔcysG:Plac mazF)重组质粒的酶切鉴定图，M1：DL10000M2：DL5000，1-5：χ7213(ΔcysG:Plac mazF)重组质粒酶切鉴定的阳性结果；
图24是χ7213(△cysG：PLAC mazF，PYA232)质粒的酶切鉴定，1，2，3：χ7213(△cysG：PLAC mazF，PYA232)(kpnI，sacI)的酶切鉴定；4，5：χ7213(△cysG：PLAC mazF，PYA232)(hindIII，EcoR I)的酶切鉴定；
图25是ΔendA::araC PBAD mazE TT突变的PCR鉴定图，M：DL5000，1-5：ΔendA::araC PBAD mazE TT突变PCR鉴定的阳性，6：阴性对照；
图26是ΔrelA::araC PBAD lacI TT突变的PCR鉴定图，M：DL5000，1-3：ΔrelA::araC PBAD lacI TT突变PCR鉴定的阳性，4：阴性对照；
图27是ΔcysG:Plac mazF突变的PCR鉴定图，M：DL5000，1-6：ΔcysG:Plac mazF突变PCR鉴定的阳性；
图28是mazF，mazE基因片段的扩增图，M：DL5000，1-3：mazF阳性结果，4-7：mazE阳性结果；
图29是mazF，mazE重组表达质粒的酶切鉴定图，M：DL5000，1-4：mazF阳性，5-6：mazE阳性；
图30是SDS-PAG检测pET28a(mazE)，pET28a(mazF)纯化蛋白图，M：蛋白Marker；1-2：MazE蛋白；3-4：MazF蛋白；
图31是Western-blot检测pET28a(mazE)，pET28a(mazF)纯化蛋白图，M：蛋白Marker；1-2：MazE蛋白；3-4：MazF蛋白；
图32是试验株在LB培养基中的生长曲线图，***：p<0.001：rSC0117和rSC0118的生长速率与C78-3比较差异显著；##：p<0.01，###：p<0.001：rSC0117的生长速率与rSC0118比较差异显著；
图33是试验株在NB培养基中的生长曲线图，***：p<0.001：rSC0117和rSC0118的生长速率与C78-3比较差异显著；##：p<0.01，###：p<0.001：rSC0117的生长速率与rSC0118比较差异显著；
图34是rSC0118(含0.02℅阿拉伯糖)传代的OD600值变化图。***：p﹤0.0001：rSC0118(LB-0.02％阿拉伯糖)和rSC0118(NB-0.02％阿拉伯糖)传代的OD600变化差异极显著；
图35是rSC0118(含0.02℅阿拉伯糖)传代的细菌数变化图，***：p﹤0.0001，**：p<0.01，*：p<0.05：rSC0118(LB-0.02％阿拉伯糖)和rSC0118(NB-0.02％阿拉伯糖)传代的细菌数变化差异极显著；
图36是rSC0118(含0.2℅和0.1℅阿拉伯糖)传代的OD600值变化图，***：p﹤0.0001，**：p<0.01，*：p<0.05:rSC0118(NB-0.2％阿拉伯糖)和rSC0118(NB-0.1％阿拉伯糖)传代的OD600变化差异显著；
图37是rSC0118(含0.2℅和0.1℅阿拉伯糖)传代的细菌数变化图，***：p﹤0.0001，rSC0118(NB-0.2％阿拉伯糖)和rSC0118(NB-0.1％阿拉伯糖)传代的细菌数变化差异极显著；
图38是rSC0118的定居能力图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
实施例1
在本实施例中，构建了阿拉伯糖调控的含MazEF裂解系统的猪霍乱沙门菌rSC0118。
其具体步骤包括：
1.1构建阿拉伯糖araC PBAD激活启动子调控的mazE自杀载体(ΔendA::araCPBADmazE TT)
根据Genbank中发布的猪霍乱沙门菌的全基因序列，找到其中endA基因序列(Genbank登录号为AE017220)及其上下游序列，根据该基因上下游基因设计引物，以上下游基因的500bp左右的片段为同源臂，敲除ΔendA基因，总共1700bp，插入裂解系统抗毒素基因mazE和araC PBAD激活启动子序列共计1592bp(图1)；
具体步骤如下：
以猪霍乱沙门菌C78-3为模板，由引物P1和P2经PCR扩增得到endA上游基因sprt同源臂基因序列511bp，称为片断1(图2)；以大肠杆菌Escherichia coli K-12为模板，由引物P3和P4经PCR扩增得到基因T4ipIII和mazE序列348bp，称为片断2(图3)；以大肠杆菌Escherichia coli K-12为模板，引物P5和P6经PCR扩增得到araC PBAD序列1250bp，称为片断3(图4)；引物P7和P8经PCR扩增得到endA下游基因yggj同源臂基因序列513bp，称为片断4(图5)；片段1-片段4的核苷酸序列如下。
片段1(SEQ ID NO.1)
GGTACCagctcgatagacattatccggagccgaaactggtgtatacgcaacgcggcacctcggcgggcaccgcctggctggagagctacgaaatccgcctcaacccggtgttactgctggaaaacatcgacacctttatagcagaggtcgtgccgcatgaactggcgcatctgttggtgtggaagcacttcggacgcaaggctccgcatggcaaggaatggaagtggatgatggaaagcgtgctgggcgttccggccagacgtactcatcaatttgcgctgcaatccgtacggcgcaatacctttccctaccattgccaatgccagcaacatcaactcaccgtccgccgtcataaccgcgtagtacgcggcgaagcggtttatcgttgcgttcgctgcggcaaaccactggtcgccgggtagtttcccgaaacgtccgggaactttcctgagcggactgattgcatacagacacaactttcgttacgttgcgggctcgttttgctAGATCT
片段2(SEQ ID NO.2)
AGATCTtttattattctatcctagaattgtgataatatattcacaattctaggagttgtaaactgcttttatttaCTGCAGattaccagacttccttatctttcggctctccccagtcgatattctcgtggaggttttccggcgtgatgtcgttgaccagttcagcaagcgtaaatacgggctctttacgcactggctcaataattaatttgccatccaccaggtcaatcttcacttcatcatcaatattcagattgagcgcctgcattaacgtagccgggatccgcaccgccggtgaatttccccaacgctttacgctactgtggatcataaccctttcctCTCGAG
片段3(SEQ ID NO.3)
CTCGAGccaaaaaaacgggtatggagaaacagtagagagttgcgataaaaagcgtcaggtaggatccgctaatcttatggataaaaatgctatggcatagcaaagtgtgacgccgtgcaaataatcaatgtggacttttctgccgtgattatagacacttttgttacgcgtttttgtcatggctttggtcccgctttgttacagaatgcttttaataagcggggttaccggttgggttagcgagaagagccagtaaaagacgcagtgacggcaatgtctgatgcaatatggacaattggtttcttctctgaatggtgggagtatgaaaagtatggctgaagcgcaaaatgatcccctgctgccgggatactcgtttaacgcccatctggtggcgggtttaacgccgattgaggccaacggttatctcgatttttttatcgaccgaccgctgggaatgaaaggttatattctcaatctcaccattcgcggtcagggggtggtgaaaaatcagggacgagaatttgtctgccgaccgggtgatattttgctgttcccgccaggagagattcatcactacggtcgtcatccggaggctcgcgaatggtatcaccagtgggtttactttcgtccgcgcgcctactggcatgaatggcttaactggccgtcaatatttgccaatacgggtttctttcgcccggatgaagcgcaccagccgcatttcagcgacctgtttgggcaaatcattaacgccgggcaaggggaagggcgctattcggagctgctggcgataaatctgcttgagcaattgttactgcggcgcatggaagcgattaacgagtcgctccatccaccgatggataatcgggtacgcgaggcttgtcagtacatcagcgatcacctggcagacagcaattttgatatcgccagcgtcgcacagcatgtttgcttgtcgccgtcgcgtctgtcacatcttttccgccagcagttagggattagcgtcttaagctggcgcgaggaccaacgcattagtcaggcgaagctgcttttgagcactacccggatgcctatcgccaccgtcggtcgcaatgttggttttgacgatcaactctatttctcgcgagtatttaaaaaatgcaccggggccagcccgagcgagtttcgtgccggttgtgaagaaaaagtgaatgatgtagccgtcaagttgtcataattggtaacgaatcagacaattgacggcttgactgTCTAGA
片段4(SEQ ID NO.4)
TCTAGAtaacctacactagcgggattcttgttaacccatgccctggatagccaaacgccggggccatgacgcggatttttttattatgcgtattccccgcatttatcaccctgaattgttgacgtccggtacgcagatttcgttatgcgaagatgcggccaaccatattggtcgtgtactgcgcatgggaccgggacaagcgttacagctgtttgacggcagcaatcaggtattcgatgctgaaatcattagcgccagtaagaaaagcgttgaagtgcaagtgatgaaaggcgaaatcgacgatcgtgaatcgccgctacatatccatctgggccaggtgatgtcgcgcggtgaaaaaatggaatttactatccagaaatcgatcgaactaggtgtaagcctcattacgccactgttctctgagcgctgtggcgttaaactggataatgaacgtctgaacaaaaagcgccagcagtggcaaaagatcgccatcgccgcctgcgaacaGAGCTC
其PCR反应体系的总体积为25μL，包括：8.5μL灭菌蒸馏水(SW)、1μL上游引物、1μL下游引物、1μL模板和12.5μL Supermix。其反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度为58℃1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
随后，将以上4个片段分别克隆到pM18T载体(promega公司)中，经相应的酶酶切(图6～9)，将片段1和片段2连接，片段3和片段4连接，之后分别将连接的sprt-mazE，araCPBAD-yggj克隆至pM18T，酶切(图10～11)，使sprt-mazE和araC PBAD-yggj连接，产生ΔendA::araC PBAD mazE TT结构序列，将sprt-mazE-araC PBAD-yggj连接产物连接到具有氯霉素和蔗糖筛选标记的自杀载体pRE112(由Dr.Curtiss Roy III惠赠，Arizona StateUniversity，并不限于此，也可采用其他同源重组载体)中，转化到工程菌χ7213(由Dr.Curtiss Roy III惠赠，Arizona State University，并不限于此，也可采用其他同源重组载体)中。经过PCR、酶切及测序鉴定χ7213(ΔendA::araC PBAD mazE TT)，阳性片段大小为2604bp，证明χ7213(ΔendA::araC PBAD mazE TT)构建成功(图12～13)，鉴定正确的χ7213(ΔendA::araC PBAD mazE TT)于-20℃保存备用。
表1：构建ΔendA::araC PBAD mazE TT裂解系统自杀载体的引物
1.2构建阿拉伯糖araC PBAD激活启动子调控的lacI自杀载体(ΔrelA::araC PBADlacI TT)：由本实验室前期研究获得，具体构建方法和过程参见授权专利201410647735.3，一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法的具体实施方式部分(实施例1：3.构建ΔrelA::araC PBAD lacI TT基因突变自杀载体)。
1.3构建Plac调控的mazF自杀载体(ΔcysG:Plac mazF)
根据Genbank中公布的猪霍乱沙门菌的全基因序列，找到其中cysG基因(Genbank登录号为AE017220)及其上下游序列，根据该基因上下游基因设计引物，以上下游基因500bp左右的片段为同源臂，敲除ΔcysG基因，总共2300bp，插入裂解系统毒素基因mazF和Plac启动子序列共计444bp(图14)；
具体步骤如下：以猪霍乱沙门菌C78-3为模板，由引物P9和P10经PCR扩增得到cysG上游基因nirC同源臂基因序列513bp，称为片断5(图15)；以大肠杆菌Escherichia coli K-12为模板，由引物P11和P12经PCR扩增得到基因mazF和Plac启动子序列444bp，称为片断6(图16)；以猪霍乱沙门菌C78-3为模板，由引物P13和P14经过PCR扩增得到cysG下游基因yhfL同源臂序列513bp，称为片断7(图17)；片段5-片段7的核苷酸序列如下。
片段5(SEQ ID NO.5)：
GGTACCatcctgccgcaaacctggctcggcaacctggtcggttccgtgtttgtcgccctgctttacagctggggcggcggcagtttgttgccggtcgataccagcatcgttcactcagtcgcgctggcgaaaaccaccgcgcccgccacggtactgttcttcaaaggcgcgctgtgtaactggctggtttgtctggcaatctggatggcaatccgcaccgaaggcacggcaaaatttcttgctatctggtggtgtctgctggcgtttatcgcttccggctacgagcactccgtcgcgaatatgacgctgttcgccctctcctggtttggtcatcacagcgacgcctataccctgtccggaatcggacacaacctgttatgggtcactctgggtaatactttgtccggcgtcgtgttcatgggattgggttattggtatgctacgccgaaatcggagcgtcctgttccgcaaaaaaccaaccaaattaaggttacagccaaccattaaAGATCT
片段6(SEQ ID NO.6)：
AGATCTactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaattCTCGAGaggaagtctggtaatggtaagccgatacgtacccgatatgggcgatctgatttgggttgattttgacccgacaaaaggtagcgagcaagctggacatcgtccagctgttgtcctgagtcctttcatgtacaacaacaaaacaggtatgtgtctgtgtgttccttgtacaacgcaatcaaaaggatatccgttcgaagttgttttatccggtcaggaacgtgatggcgtagcgttagctgatcaggtaaaaagtatcgcctggcgggcaagaggagcaacgaagaaaggaacagttgccccagaggaattacaactcattaaagccaaaattaacgtactgattgggtagTCTAGA
片段7(SEQ ID NO.7)：
TCTAGAtaattaaaataaagccctgaataacagggctttattttacaactactcgtaatctcaaattatttttacttaaaagtgaattaagaaatcaactttaaatacaccagaaaaattcaaatagtaataattctgcctaaaaacccttttattcgtcaaattcacctcttattaattcatacaataaataacaccgttaagcactcaatttgacctgacctggttatcgggtgataaaataaacactaaagcataatttttctgctggccatttcatcattgcctgtatcgctctctgcatatgtttatgcacgcaaggaaaatattaattaaggatgaaccctatgcaaaagaaaaaacttatttctatcgctatcgctttaacgctacaaagttattacattccggccatcgccgcagaaaataacgatgatgaaaaagaatgtcccagtaatatctcctccctgcctaaagaaaaacgcgcaaaactctcaccgacctgccGAGCTC
其PCR反应体系的总体积为25μL，包括：8.5μL灭菌蒸馏水(SW)、1μL上游引物、1μL下游引物、1μL模板和12.5μL Supermix。其反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度为55℃1min，72℃延伸1：30min，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
随后，将以上3个片段分别克隆到pM18T载体(promega公司)中，然后经相应的酶酶切(图18～20)，使片段5，片段6，片段7连接，将连接产物nirC-PlacmazF-yhfL克隆至pM18T载体，酶切(图21)，产生ΔcysG:Plac mazF结构序列，将阳性送至南京擎科测序，获得正确序列后，将酶切产物连接到具有氯霉素和蔗糖筛选标记的自杀载体pRE112(由Dr.Curtiss RoyIII惠赠，Arizona State University)中，转化到工程菌χ7213中。经过PCR、酶切及测序鉴定，χ7213(ΔcysG:Plac mazF)阳性片段大小为1458bp，证明χ7213(ΔcysG:Plac mazF)构建成功(图22～23)将鉴定正确的χ7213(ΔcysG:Plac mazF)于-20℃保存备用。
表2：构建ΔcysG:Plac mazF自杀载体的引物
1.4χ7213(ΔcysG:Plac mazF)中引入质粒pYA232
为了防止MazF在体外培养时对菌株χ7213(ΔcysG:Plac mazF)的切割，将质粒pYA232(也可以采用其他表达lcaI的质粒，目的是为了表达lacI蛋白)电转化至感受态细胞χ7213(ΔcysG:Plac mazF)中，之后挑取3个单菌落进行培养，提取质粒，分别标记为样品1、样品2、样品3：χ7213(ΔcysG:Plac mazF，pYA232)，进行酶切鉴定，结果显示样品1、样品2、样品3：χ7213(ΔcysG:Plac mazF，pYA232)经kpnI，SacI(质粒pYA232中无kpnI，SacI的酶切位点)酶切后，ΔcysG:Plac mazF自杀载体的阳性片段大小为1458bp，pER112大小为5173bp；质粒pYA232的大小为10.20kb，含一个hindIII位点，两个EcoRI位点，故样品1、样品2经hindIII，EcoRI酶切后出现三条带，第一个条带的大小约为1500bp，第二个条带的大小在2000bp～3000bp之间，第三个条带的大小大于载体pER112(5173bp)，因此证明质粒pYA232转化到χ7213(ΔcysG:Plac mazF)感受态细胞中(图24)。
1.5构建含ΔendA::araC PBAD mazE TT突变的猪霍乱沙门菌C78-3(ΔendA::araCPBAD mazE TT)
在ΔendA::araC PBAD mazE TT突变的结构中，阿拉伯糖调控MazE蛋白的表达，即在阿拉伯糖存在(体外培养)的情况下，MazE蛋白能够正常表达；不存在阿拉伯糖(动物机体内)时，就无法表达；MazE蛋白的表达可以抑制猪霍乱沙门菌裂解系统中MazF毒素蛋白的表达，进而抑制细菌细胞的裂解。
在受体菌C78-3引入ΔendA::araC PBAD mazE TT，构建猪霍乱沙门菌C78-3(ΔendA::araC PBAD mazE TT)株。
其具体步骤如下：
1.5.1供体菌和受体菌的结合：
在2mL的LB培养液中加入受体菌C78-3，37℃过夜培养，同时在含50ug/mL的2，6-二氨基庚二酸(2，6-diaminopimelic acid，DAP)，25ug/mL Cm(氯霉素，Chloramphenicol)的2mL的LB培养液中加入供体菌χ7213(ΔendA::araC PBAD mazE TT)，37℃过夜培养，使受体菌和供体菌结合。
1.5.2ΔendA::araC PBAD mazE TT突变株的筛选
将结合菌在LB(含25ug/mL的Cm)上划单菌落，取单菌落于LB液体培养基中培养至云雾状；吸取100ul该菌，10倍稀释至合适的浓度涂布于LB平板(含质量分数5％蔗糖)中室温培养2～3天，至长出单菌落。
1.5.3C78-3(ΔendA::araC PBAD mazE TT)突变株的PCR鉴定
将在5％蔗糖的LB固体培养板上长出的菌落，分别于LB板、含Cm的LB(含25ug/mL的Cm)、含Cm和DAP的LB板中鉴别培养，挑取只在LB中生长的单菌落，用前面所述引物P1和P8进行菌落PCR鉴定。ΔendA::araC PBAD mazE TT阳性菌的PCR片段大小为2604bp，阴性菌的PCR片段大小为1500bp(图25)。
1.6构建含ΔrelA::araC PBAD lacI TT突变的猪霍乱沙门菌rSC0117突变株C78-3(ΔendA::araC PBAD mazE TT，ΔrelA::araC PBAD lacI TT)
在ΔrelA::araC PBAD lacI TT突变的结构中，通过阿拉伯糖调控lacI蛋白的表达，lacI蛋白对Plac进行负调控，从而对裂解系统中的MazF蛋白进行调控，即当有阿拉伯糖存在(宿主体外)时，lacI蛋白能够正常表达，表达的lacI蛋白通过抑制Plac进而抑制MazF蛋白的表达；而在宿主体内，由于没有阿拉伯糖的存在，lacI蛋白不能表达，MazF蛋白就会不断地表达，在ACA序列处切割mRNA，使细菌细胞发生程序性裂解；在受体菌C78-3(ΔendA::araC PBAD mazE TT)中引入ΔrelA::araC PBAD lacI突变，构建猪霍乱沙门菌rSC0117株。
具体构建方法和过程参见授权专利201410647735.3，一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法的具体实施方式部分。
含有ΔrelA::araC PBAD lacI TT突变的C78-3(ΔendA::araC PBAD mazE TT，ΔrelA::araC PBAD lacI TT)阳性菌的PCR片段大小为1592bp，阴性菌的PCR片段大小为0bp(图26)。
1.7构建含ΔcysG:Plac mazF突变的猪霍乱沙门菌rSC0118突变株C78-3(ΔendA::araC PBAD mazE TT，ΔrelA::araC PBAD lacI TT，ΔcysG:Plac mazF)
在ΔcysG:Plac mazF突变的结构中，阿拉伯糖间接调控MazF蛋白的表达，使猪霍乱沙门菌裂解株rSC0118在动物体内不存在阿拉伯糖的情况下，大量表达MazF毒素蛋白，MazF在菌体基因组ACA序列处不断地切割细胞mRNA，使细菌细胞发生程序性裂解，防止细菌释放到环境中。
构建具体步骤参照1.5.1，1.5.2和1.5.3。
含有ΔcysG:Plac mazF突变的C78-3(ΔendA::araC PBAD mazE TT，ΔrelA::araCPBAD lacI TT)阳性菌的PCR片段大小为1458bp(图27)。
表3：构建rSC0118突变株所用的引物
其中，每个突变片段的PCR的反应体系和条件都是一样，具体为：
PCR扩增体系的总体积为25μL，包括：SW 8.5ul、上游引物P1 1ul、下游引物P81ul、模板2ul、SuperMix 12.5ul；其反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度为58℃1min，72℃延伸2：30min，共34个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
实施例2
在本实施中，构建了重组原核表达载体pET28a-mazE、pET28a-mazF并制备了针对MazE、MazF蛋白的多抗血清，以检测猪霍乱沙门菌裂解株rSC0118中MazE、MazF蛋白的表达情况。
具体步骤为：
2.1原核表达菌BL21(pET28a-mazE)和BL21(pET28a-mazF)的构建
用大肠杆菌中mazE，mazF基因序列及pET-28a载体序列设计同源引物，即mazE-F，mazE-R，mazF-F，mazF-R，以大肠杆菌Escherichia coli K-12为模板扩增mazE，mazF基因(图28)；XhoI、EcoRI酶切pET-28a，用同源重组酶使mazE，mazF基因和pET-28a进行连接，取单菌落进行PCR、酶切(图29)及测序鉴定，鉴定正确的菌株-70℃保存备用。
表4：大肠杆菌mazE和mazF的扩增引物
2.2pET28a(mazE)和pET28a(mazF)的表达和蛋白纯化
诱导pET28a(mazE)、pET28a(mazF)表达，用适量的LE缓冲液收集菌体，超声波裂解至透亮，离心，收集上清，SDS-PAGE鉴定MazE、MazF蛋白条带(图30)；用针对His标签的抗鼠单抗作为一抗，Mouse-IgG-HRP作为二抗，常规Western-Blot检测MazE、MazF蛋白的表达(图31)，MazE蛋白大小为13kDa，MazF蛋白大小为15kDa，与预期相符。
2.3制备针对MazE和MazF融合蛋白兔多抗血清并检测其效价
取鉴定正确的MazE、MazF纯化蛋白分别与等体积的佐剂混匀，皮下多点注射免疫新西兰大白兔，制备多抗血清；以pET28a(mazE)，pET28a(mazF)重组蛋白为抗原，以免疫前兔血清为阴性对照，运用间接ELISA方法测定血清中MazE，MazF蛋白的抗体效价，效价见表5。
表5：间接ELISA检测抗体血清效价
实施例3
在本实施例中，对阿拉伯糖调控的rSC0118裂解株的相关特性(如体外传代生长特性、体外MazE、MazF蛋白表达的动态变化、LD50、定居能力)进行评估，为构建生物安全性的猪霍乱沙门菌疫苗载体提供新思路。
3.1阿拉伯糖调控下rSC0118传代的生长表型鉴定
为了检测在不同培养基中阿拉伯糖对rSC0118裂解能力的调控，将C78-3、rSC0117分别于LB、NB培养基中传代，rSC0118分别于含0.2﹪、0.1﹪、0.02﹪(质量分数)阿拉伯糖的LB、NB培养基中传代，检测OD600值并进行平板计数。
3.1.1rSC0118在含0.02﹪阿拉伯糖的LB和NB培养基中传代
具体步骤为，取C78-3、rSC0117分别于LB、NB培养基中传代，rSC0118分别于含0.02﹪阿拉伯糖的LB、NB培养基中传代，在第一代的2，4，6，8，10，12h测量OD600值，结果显示，在LB和NB培养基中，rSC0118的生长速率都显著慢于C78-3和rSC0117株(表6，图32～33)；传至第6代，C78-3、rSC0117的OD600和细菌数量(CFU/mL)均没有变化，rSC0118在0.02﹪阿拉伯糖的NB培养基中传代的过程中，OD600值从1.009下降到0.273(第6代)，细菌数量从9.7×109减少到1.8×103(第5代)，并保持103不变；而rSC0118在0.02﹪阿拉伯糖的LB培养基中传代的过程中，OD600值从2.231下降到0.847(第6代)，细菌数量从1.6×1010减少到1.6×107(第6代)(表7～8)，即随着阿拉伯糖浓度的减少，rSC0118在LB、NB培养基(含0.02﹪阿拉伯糖)传代的OD600值和细菌数量均下降，并且在NB培养基(含0.02﹪阿拉伯糖)中下降的速率显著快于LB培养基中(含0.02﹪阿拉伯糖)(图34～35)；以上结果说明了rSC0118在阿拉伯糖的调控下发生裂解，使细菌数减少，并且在营养缺陷培养基中的裂解速度更快。本实验重复2次，结果为2次实验的平均值。
表6：试验株在含0.02℅阿拉伯糖的LB和NB培养基中的生长情况
表7：试验株在含0.02℅阿拉伯糖的LB及NB培养基中传代的OD600值变化
表8：试验株在含0.02℅阿拉伯糖的LB及NB培养基中传代的细菌数变化
3.1.2rSC0118在含0.2﹪和0.1﹪阿拉伯糖的NB培养基中传代
具体步骤为，取rSC0118分别于含0.1﹪阿拉伯糖、0.2﹪阿拉伯糖的NB培养基中传代，C78-3、rSC0117于NB培养基中传代，测量OD600值，进行平板计数；结果显示，和C78-3、rSC0117相比，rSC0118在0.2﹪阿拉伯糖的NB培养基中传代的过程中，OD600值从1.256下降到0.345(第40代)，细菌数量从9.6×109减少到5.7×103(第43代)，之后无明显变化；rSC0118在0.1﹪阿拉伯糖的NB培养基中传代的过程中，OD600值从1.234下降到0.340(第34代)，细菌数量从9.7×109减少到5.6×103(第37代)，之后无明显变化(表9～10)；随着阿拉伯糖浓度的减少，rSC0118在0.1﹪阿拉伯糖的NB培养基中传代的下降速率快于在0.2﹪阿拉伯糖的NB培养基传代的下降速率(图36～37)，以上结果说明rSC0118的裂解速率受到阿拉伯糖浓度的影响，高浓度的阿拉伯糖会显著降低rSC0118的裂解速率。然而，rSC0118在0.2﹪阿拉伯糖、0.1﹪阿拉伯糖的NB培养基中传代的裂解速度均显著低于在0.02﹪阿拉伯糖的NB培养基中传代的裂解速度，我们怀疑是rSC0118在含0.2﹪阿拉伯糖、0.1﹪阿拉伯糖的NB培养基传代的过程中阿拉伯糖浓度累积所致。本实验重复2次，结果为2次实验的平均值。
表9：试验株在含0.2℅和0.1℅阿拉伯糖的NB培养基中传代的OD600变化
表10：试验株在含0.2℅和0.1℅阿拉伯糖的NB培养基中传代的细菌数变化
3.3不同阿拉伯糖浓度的rSC0118与野毒株C78-3的毒力比较
为了评价不同阿拉伯糖浓度调控rSC0118菌株裂解的差异，分别用C78-3、不同阿拉伯糖浓度下rSC0118株经口服感染6周龄ICR小鼠，比较毒力的变化。
具体实施为，取猪霍乱沙门菌野毒株C78-3、裂解系统构建株rSC0118的单菌落分别于5mL的LB液体培养基及5mL含0.02﹪阿拉伯糖、0.1﹪阿拉伯糖、0.2﹪阿拉伯糖的LB液体培养基中静置过夜；次日按照1：50的比例分别转接种于50mL对应的LB液体培养基中，37℃震荡培养，至OD600达到0.85-0.9时，8000rpm离心10min收集菌体，加入PBS重悬，用无菌PBS倍比稀释，选取合适的稀释度口服进行攻毒，测定LD50，54只雌性6周龄ICR小鼠随机分成18小组，每小组3只小鼠。5小组用于野毒株C78-3的LD50的测定，稀释度分别是10-3，10-4，10-5，10-6和10-6；5小组用于rSC0118(0.2℅阿拉伯糖)的LD50的测定，稀释度分别是原液，10-1，10-2，10-3和10-4；4小组用于rSC0118(0.1℅阿拉伯糖)的LD50的测定，稀释度分别是原液，10-1，10-2，10-3；4小组用于rSC0118(0.02℅阿拉伯糖)的LD50的测定，稀释度分别是原液，10-1，10-2，10-3；观察30天，在观察阶段，记录小鼠存活和死亡的情况(表11)，并依据Reed-Muench公式计算菌株的LD50。结果显示，0.2℅阿拉伯糖浓度下rSC0118的LD50为1.0×107CFU、0.1℅阿拉伯糖浓度下rSC0118的LD50为3.2×107、0.02℅阿拉伯糖浓度下rSC0118的LD50为2.9×108CFU、强毒株C78-3的LD50为2.6×104CFU。结果表明，与野毒株C78-3相比，0.1℅阿拉伯糖、0.2℅阿拉伯糖下rSC0118的毒力减弱103倍(P<0.01)，而0.02℅阿拉伯糖rSC0118的毒力和C78-3相比减弱104倍(P<0.01)；且和0.2℅阿拉伯糖、0.1℅阿拉伯糖的rSC0118相比，0.02℅阿拉伯糖rSC0118的毒力减弱10倍(P<0.01)；说明含有阿拉伯糖启动子调控的MazEF裂解系统的rSC0118株，在没有阿拉伯糖的小鼠体内明显减毒，并且随着阿拉伯糖浓度的降低，毒力也降低。本实验重复3次，结果为3次实验的平均值。
表11：实验菌株C78-3和rSC0118的LD50结果
3.4rSC0118的定居实验
为了评估rSC0118在小鼠体内裂解的动态变化，将含0.02℅阿拉伯糖浓度的rSC0118口服接种7周龄的BALB/c小鼠，在攻毒后的第3d、7d、11d、15d、21d、28d无菌取小鼠肝、脾和肠道派伊尔氏淋巴结组织进行滴板计数。
具体实施为，从-70℃超低温冰箱中取出实验菌株，无菌划线培养于LB固体培养平板上，37℃静置培养过夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培养液中，37℃静置培养18h；取其中的2.5mL置于47.5mL的LB培养液中；用于培养rSC0118株的LB培养液加入0.2％的阿拉伯糖；等细菌浓度达到OD值为0.8～0.9时，取出菌株培养液，离心，将细菌浓度调节到107CFU。
60只7周龄BALB/c小鼠口服攻毒进行rSC0118的定植实验；每只小鼠口服107CFU/20ul细菌悬液；每菌株分别在接种后第3d、7d、14d、21d和28d取3只小鼠的肝脏、脾脏和肠道的派伊尔氏淋巴小结(payer′s patches)，经称重和无菌研磨，涂布于麦康凯培养基中分离细菌，计算组织的细菌量。本实验重复3次，结果为3次实验的平均值。
实验结果显示，随着时间的延长，rSC0118在脾上的定居量最多，且在第7d、11d达到高峰，之后逐渐减少；在肝、派耶尔氏淋巴结中的定居能力弱于脾，同样在第7d、11d达到高峰，随后逐渐减少；在定居15d后，肝、脾和派耶尔氏淋巴结中均检测不到细菌(图38)，表明rSC0118可以在小鼠体内定居足够的时间，且最终通过程序性裂解，避免细菌释放到环境中。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 重组裂解猪霍乱沙门菌及其构建方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 511
<212> DNA
<213> 猪霍乱沙门氏菌(Salmonella enterica subsp. Enterica Leminor etpopoff)
<400> 1
ggtaccagct cgatagacat tatccggagc cgaaactggt gtatacgcaa cgcggcacct 60
cggcgggcac cgcctggctg gagagctacg aaatccgcct caacccggtg ttactgctgg 120
aaaacatcga cacctttata gcagaggtcg tgccgcatga actggcgcat ctgttggtgt 180
ggaagcactt cggacgcaag gctccgcatg gcaaggaatg gaagtggatg atggaaagcg 240
tgctgggcgt tccggccaga cgtactcatc aatttgcgct gcaatccgta cggcgcaata 300
cctttcccta ccattgccaa tgccagcaac atcaactcac cgtccgccgt cataaccgcg 360
tagtacgcgg cgaagcggtt tatcgttgcg ttcgctgcgg caaaccactg gtcgccgggt 420
agtttcccga aacgtccggg aactttcctg agcggactga ttgcatacag acacaacttt 480
cgttacgttg cgggctcgtt ttgctagatc t 511
<210> 2
<211> 348
<212> DNA
<213> 大肠杆菌 K-12(Escherichia coli str. K-12)
<400> 2
agatctttta ttattctatc ctagaattgt gataatatat tcacaattct aggagttgta 60
aactgctttt atttactgca gattaccaga cttccttatc tttcggctct ccccagtcga 120
tattctcgtg gaggttttcc ggcgtgatgt cgttgaccag ttcagcaagc gtaaatacgg 180
gctctttacg cactggctca ataattaatt tgccatccac caggtcaatc ttcacttcat 240
catcaatatt cagattgagc gcctgcatta acgtagccgg gatccgcacc gccggtgaat 300
ttccccaacg ctttacgcta ctgtggatca taaccctttc ctctcgag 348
<210> 3
<211> 1250
<212> DNA
<213> 大肠杆菌 K-12(Escherichia coli str. K-12)
<400> 3
ctcgagccaa aaaaacgggt atggagaaac agtagagagt tgcgataaaa agcgtcaggt 60
aggatccgct aatcttatgg ataaaaatgc tatggcatag caaagtgtga cgccgtgcaa 120
ataatcaatg tggacttttc tgccgtgatt atagacactt ttgttacgcg tttttgtcat 180
ggctttggtc ccgctttgtt acagaatgct tttaataagc ggggttaccg gttgggttag 240
cgagaagagc cagtaaaaga cgcagtgacg gcaatgtctg atgcaatatg gacaattggt 300
ttcttctctg aatggtggga gtatgaaaag tatggctgaa gcgcaaaatg atcccctgct 360
gccgggatac tcgtttaacg cccatctggt ggcgggttta acgccgattg aggccaacgg 420
ttatctcgat ttttttatcg accgaccgct gggaatgaaa ggttatattc tcaatctcac 480
cattcgcggt cagggggtgg tgaaaaatca gggacgagaa tttgtctgcc gaccgggtga 540
tattttgctg ttcccgccag gagagattca tcactacggt cgtcatccgg aggctcgcga 600
atggtatcac cagtgggttt actttcgtcc gcgcgcctac tggcatgaat ggcttaactg 660
gccgtcaata tttgccaata cgggtttctt tcgcccggat gaagcgcacc agccgcattt 720
cagcgacctg tttgggcaaa tcattaacgc cgggcaaggg gaagggcgct attcggagct 780
gctggcgata aatctgcttg agcaattgtt actgcggcgc atggaagcga ttaacgagtc 840
gctccatcca ccgatggata atcgggtacg cgaggcttgt cagtacatca gcgatcacct 900
ggcagacagc aattttgata tcgccagcgt cgcacagcat gtttgcttgt cgccgtcgcg 960
tctgtcacat cttttccgcc agcagttagg gattagcgtc ttaagctggc gcgaggacca 1020
acgcattagt caggcgaagc tgcttttgag cactacccgg atgcctatcg ccaccgtcgg 1080
tcgcaatgtt ggttttgacg atcaactcta tttctcgcga gtatttaaaa aatgcaccgg 1140
ggccagcccg agcgagtttc gtgccggttg tgaagaaaaa gtgaatgatg tagccgtcaa 1200
gttgtcataa ttggtaacga atcagacaat tgacggcttg actgtctaga 1250
<210> 4
<211> 513
<212> DNA
<213> 猪霍乱沙门菌(Salmonella enterica subsp. Enterica Leminor et popoff)
<400> 4
tctagataac ctacactagc gggattcttg ttaacccatg ccctggatag ccaaacgccg 60
gggccatgac gcggattttt ttattatgcg tattccccgc atttatcacc ctgaattgtt 120
gacgtccggt acgcagattt cgttatgcga agatgcggcc aaccatattg gtcgtgtact 180
gcgcatggga ccgggacaag cgttacagct gtttgacggc agcaatcagg tattcgatgc 240
tgaaatcatt agcgccagta agaaaagcgt tgaagtgcaa gtgatgaaag gcgaaatcga 300
cgatcgtgaa tcgccgctac atatccatct gggccaggtg atgtcgcgcg gtgaaaaaat 360
ggaatttact atccagaaat cgatcgaact aggtgtaagc ctcattacgc cactgttctc 420
tgagcgctgt ggcgttaaac tggataatga acgtctgaac aaaaagcgcc agcagtggca 480
aaagatcgcc atcgccgcct gcgaacagag ctc 513
<210> 5
<211> 513
<212> DNA
<213> 猪霍乱沙门菌(Salmonella enterica subsp. Enterica Leminor et popoff)
<400> 5
ggtaccatcc tgccgcaaac ctggctcggc aacctggtcg gttccgtgtt tgtcgccctg 60
ctttacagct ggggcggcgg cagtttgttg ccggtcgata ccagcatcgt tcactcagtc 120
gcgctggcga aaaccaccgc gcccgccacg gtactgttct tcaaaggcgc gctgtgtaac 180
tggctggttt gtctggcaat ctggatggca atccgcaccg aaggcacggc aaaatttctt 240
gctatctggt ggtgtctgct ggcgtttatc gcttccggct acgagcactc cgtcgcgaat 300
atgacgctgt tcgccctctc ctggtttggt catcacagcg acgcctatac cctgtccgga 360
atcggacaca acctgttatg ggtcactctg ggtaatactt tgtccggcgt cgtgttcatg 420
ggattgggtt attggtatgc tacgccgaaa tcggagcgtc ctgttccgca aaaaaccaac 480
caaattaagg ttacagccaa ccattaaaga tct 513
<210> 6
<211> 444
<212> DNA
<213> 大肠杆菌K-12(Escherichia coli str. K-12)
<400> 6
agatctactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt 60
ggaattgtga gcggataaca attctcgaga ggaagtctgg taatggtaag ccgatacgta 120
cccgatatgg gcgatctgat ttgggttgat tttgacccga caaaaggtag cgagcaagct 180
ggacatcgtc cagctgttgt cctgagtcct ttcatgtaca acaacaaaac aggtatgtgt 240
ctgtgtgttc cttgtacaac gcaatcaaaa ggatatccgt tcgaagttgt tttatccggt 300
caggaacgtg atggcgtagc gttagctgat caggtaaaaa gtatcgcctg gcgggcaaga 360
ggagcaacga agaaaggaac agttgcccca gaggaattac aactcattaa agccaaaatt 420
aacgtactga ttgggtagtc taga 444
<210> 7
<211> 513
<212> DNA
<213> 猪霍乱沙门菌(Salmonella enterica subsp. Enterica Leminor et popoff)
<400> 7
tctagataat taaaataaag ccctgaataa cagggcttta ttttacaact actcgtaatc 60
tcaaattatt tttacttaaa agtgaattaa gaaatcaact ttaaatacac cagaaaaatt 120
caaatagtaa taattctgcc taaaaaccct tttattcgtc aaattcacct cttattaatt 180
catacaataa ataacaccgt taagcactca atttgacctg acctggttat cgggtgataa 240
aataaacact aaagcataat ttttctgctg gccatttcat cattgcctgt atcgctctct 300
gcatatgttt atgcacgcaa ggaaaatatt aattaaggat gaaccctatg caaaagaaaa 360
aacttatttc tatcgctatc gctttaacgc tacaaagtta ttacattccg gccatcgccg 420
cagaaaataa cgatgatgaa aaagaatgtc ccagtaatat ctcctccctg cctaaagaaa 480
aacgcgcaaa actctcaccg acctgccgag ctc 513

Claims (10)

1.一种重组裂解猪霍乱沙门菌的构建方法，其特征在于，包括：向猪霍乱沙门菌的基因组中引入以下元件：
mazE表达元件：包括抗毒素基因mazE及其上游的启动子PBAD，编码启动子PBAD的正负调控子基因araC；
lacI表达元件：包括基因lacI及其上游的启动子PBAD，编码启动子PBAD的正负调控子基因araC；
mazF表达元件：包括毒素基因mazF及其上游的启动子Plac。
2.根据权利要求1所述的重组裂解猪霍乱沙门菌的构建方法，其特征在于，通过同源重组的方法引入所述元件。
3.根据权利要求1所述的重组裂解猪霍乱沙门菌的构建方法，其特征在于，引入元件的位置处于endA、cysG、relA基因中的一个或几个。
4.根据权利要求1所述的重组裂解猪霍乱沙门菌的构建方法，其特征在于，包括：分别构建含各自表达元件的同源重组结构序列，所述同源重组结构序列在表达元件的上下游为用于敲除相应基因的同源臂；将同源重组结构序列分别连入自杀载体，转入asd基因缺失的大肠杆菌工程菌中；通过同源重组作用，将各表达元件依次转入猪霍乱沙门菌中。
5.一种重组裂解猪霍乱沙门菌，其特征在于，其基因组中引入有以下元件：
mazE表达元件：包括抗毒素基因mazE及其上游的启动子PBAD，编码启动子PBAD的正负调控子基因araC；
lacI表达元件：包括基因lacI及其上游的启动子PBAD，编码启动子PBAD的正负调控子基因araC；
mazF表达元件：包括毒素基因mazF及其上游的启动子Plac。
6.根据权利要求5所述的重组裂解猪霍乱沙门菌，其特征在于，引入元件的位置处于endA、cysG、relA基因中的一个或几个。
7.根据权利要求5所述的重组裂解猪霍乱沙门菌，其特征在于，
mazE表达元件包括：SEQ ID NO.2所示片段2与SEQ ID NO.3所示片段3连接得到的序列；
mazF表达元件包括：SEQ ID NO.6所示的片段6。
8.根据权利要求5所述的重组裂解猪霍乱沙门菌，其特征在于，根据权利要求1～4任一项所述方法制备。
9.一种调控猪霍乱沙门菌程序性裂解的方法，其特征在于，包括：
构建权利要求5～8任一项所述的重组裂解猪霍乱沙门菌，调节其培养环境中阿拉伯糖的含量，调控程序性裂解。
10.根据权利要求5～8任一项所述的重组猪霍乱沙门菌在制备疫苗中的应用。
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