CN105483128A - 一种微生物可诱导基因表达调控系统 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种诱导型启动子、基于该启动子的基因诱导表达调控系统、以及基于该表达调控系统开发的改良微生物遗传操作工具。采用L-阿拉伯糖为诱导剂，阿拉伯糖是一种自然界普遍存在的碳源，对细胞生长无抑制作用。该诱导表达系统能够使基因表达水平上调最高达到800倍，且具有较好的严谨性，可以用于梭菌属或其它微生物细胞中目标基因的可控表达，以及用于现有遗传改造技术的优化及新工具的开发。

Description

一种微生物可诱导基因表达调控系统

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微生物基因表达调控方法。

背景技术

基因在转录水平上的调控是微生物主要的基因表达调控方式，也是当前微生物代谢工程的研究热点。转录调控受到多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调控制，其中启动子是重要的顺式作用元件，它基本决定一个基因是否表达、何时和何处表达。启动子通常位于功能基因的5’端上游，能够与RNA聚合酶以及其他蛋白辅助因子等反式元件相结合，从而控制基因转录的起始和效率。微生物的启动子可分为组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子能在所有细胞中，不分时间和空间地启动转录；诱导型启动子则能在某些特定的物理、化学和生物信号（诱导物）的刺激下，可以大幅度增加目的基因的转录水平。诱导型启动子具有广阔的基因工程应用前景，它可根据需要在细胞特定的生长阶段或生长环境下，快速诱导基因转录的“开”与“关”，实现对基因表达的预想调控，从而实现控制微生物生理代谢的目的。

以纤维素降解梭菌的应用为例，梭菌属含有多种纤维素降解菌株，如解纤维梭菌（Clostridiumcellulolyticum）和热纤梭菌（Clostridiumthermocellum）等，他们能够高效降解纤维素合成乙醇，是潜在的通过整合生物加工技术实现木质纤维素高效利用的生产菌株。然而，野生型菌株尚不能满足木质纤维素转化的工业化要求，必须进行系统的代谢工程改造，这需要对目标内源或外源基因及相关代谢或调控途径功能的精确控制。

采用可诱导转录系统是常用的实现基因功能可控的方法。目前已报道一些以化合物或射线为诱导剂的可诱导表达系统(ApplEnvironMicrobiol2014;80:2410-6;MetabEng2012;14:59-67;ApplEnvironMicrobiol2003;69:4985-8;ApplEnvironMicrobiol2011;77:471-8;GeneTher2001;8:1197-201)。其中，诱导系统Pcm-2tetO1具有最高的诱导效率及严谨性，及在有诱导剂脱水四环素存在的条件下，基因表达水平可以上调313倍。但是，高浓度脱水四环素对细胞生长有害，因此该诱导系统不能在具有高剂量诱导剂的最优化条件下工作(MetabEng2012;14:59-67)。因此，需要进一步开发诱导剂不抑制生长且更为高效和严谨的诱导表达调控系统。

基于二类内含子的Targetron、Clostron基因靶向操作方法具有操作简单、周期短、效率高、无需抗性筛选、对转化效率要求低等优点，能够弥补同源重组方法的缺点，已广泛的应用于基础研究和工程菌株的改造（CshPerspectBiol2011;3.；JMicrobiolMethods2007;70:452-64）。二类内含子基因失活的原理是RNA“归巢（retrohoming）”效应，以Ll.LtrB内含子为例，二类内含子的基因失活分两阶段进行：1）Ll.LtrB内含子（核酶）自我切割形成“套索”结构；2）自我剪切形成“套索”结构的二类内含子与具有反转录酶活性的IEP（intron-encodedprotein）蛋白结合，形成RNP复合体。RNP复合体识别特定的DNA序列，并将内含子RNA序列插入识别位点的DNA正义链。IEP部分消化反义链，并以内含子RNA为模板，剩余反义链DNA为引物，逆转录出与内含子RNA互补的cDNA序列。随后内含子RNA被胞内RNA酶消化，最后DNA正义链缺口被胞内DNA修复系统修复，完成基于二类内含子的基因失活过程。然而二类内含子基因靶向操作技术的特异性依赖于RNP复合体对特定序列的识别，而识别序列较短，通常为几个到十余个碱基，导致非特异性识别频率（即脱靶率）较高，严重影响了其在精确基因靶向操作方面的应用。缩短二类内含子元件在胞内的作用时间和强度有可能改善脱靶率高这一技术难题，然而该技术需要与严谨高效的诱导表达调控系统相结合。

为了解决以上对高效严谨且诱导剂价廉对细胞无害的诱导表达调控系统的需求，本发明人开发了一种基于阿拉伯糖诱导的基因诱导表达调控系统，在微生物基因工程改造中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导型启动子、基于该启动子的基因诱导表达调控系统、以及基于该表达调控系统开发的改良微生物遗传操作工具及方法。采用L-阿拉伯糖为诱导剂，阿拉伯糖是一种自然界普遍存在的碳源，对细胞生长无抑制作用。该诱导表达系统能够使基因表达水平上调最高达到800倍，且具有较好的严谨性，可以用于梭菌属或其它微生物细胞中目标基因的可控表达，以及用于现有遗传改造技术的优化及新工具的开发。

本发明涉及：

（1）一种L-阿拉伯糖诱导的启动子DNA，具有序列表中SEQIDNO：2所示的序列。

（2）DNA还包括具有SEQIDNO：2所示的序列的DNA的功能等价体，即具有SEQIDNO：2的变异序列的DNA，其仍旧能够指导连接在其下游的核酸在阿拉伯糖诱导条件下表达。变异序列包括在严格条件下能够与具有SEQIDNO：2所示的序列DNA杂交的DNA序列。本文中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mMNaCl、40mMPIPES（pH6.4）和1mMEDTA的杂交液中于60℃杂交12-16小时，然后在65℃下用含0.1SDS、和0.1%SSC的洗涤液洗涤15-60分钟。

（3）变异序列还包括与SEQIDNO：2所示序列有至少90%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同一性的DNA序列。其中，序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

（4）诱导表达系统的组成：该诱导表达系统包含诱导剂L-阿拉伯糖、反馈抑制蛋白AraR(SEQIDNO:1)和可与反馈抑制蛋白结合的启动子P_ara(SEQIDNO:2)。

（5）诱导表达系统的构建：构建该诱导表达系统需要通过PCR扩增获得反馈抑制蛋白AraR的结构基因及其启动子区P_araR(SEQIDNO:3)和终止子区T_araR(SEQIDNO:4)，通过PCR获得具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子P_ara；通过基因克隆的方法将上述元件整合到一个具有抗性基因的质粒骨架上，并在具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子区下游设计酶切位点，用于目标基因的克隆；将具有诱导表达系统的质粒转化到微生物细胞中，通过质粒复制或者同源重组基因组整合的形式实现诱导表达系统在微生物细胞中发挥功能，调控P_ara下游的目标基因的表达。

（6）该诱导表达系统可以广泛适用于革兰氏阳性及阴性微生物，尤其适用于梭菌属（clostridia）微生物，包括解纤维梭菌（Clostridiumcellulolyticum）、丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）、热纤梭菌（Clostridiumthermocellum）、粪堆梭菌(Clostridiumstercorarium)。

（7）诱导表达系统特征分析：利用绿色荧光蛋白作为报告基因分析该诱导系统的可用性，当有诱导剂存在时检测到绿色荧光，无诱导剂存在时无绿色荧光；利用葡萄糖醛酸酶作为报告基因分析该诱导系统的工作效率和严谨性，有诱导剂存在时葡萄糖醛酸酶酶活提高倍数越多，效率越高。

（8）诱导表达系统的应用：本发明中涉及的诱导表达系统可以应用于微生物细胞中目标基因的可控表达，构建微生物的反向基因筛选系统，以及降低基于二类内含子的基因靶向操作技术的脱靶率，具体步骤参见相应的实施例。

本发明的有益效果：

该诱导系统可以有效的调节目标基因的表达，在阿拉伯糖诱导剂存在的条件下，基因的表达量最大可提高800倍。利用该系统，可以构建一个灵敏的反向基因筛选系统（与mazF、pyrF等毒性基因配合），证明该系统诱导表达的严谨性。利用该系统对已知的二类内含子工具进行改进，可将脱靶频率从大于50%降低到0，实现了目的基因的精确靶向操作。

附图说明

图1为本发明诱导表达系统及相关质粒图谱。

图2为厌氧荧光蛋白PpFbFPm诱导表达结果。利用胞内荧光成像检测解纤维梭菌H10的pPTK-PpFbFPm(A)或pARA-PpFbFPm(B)转化子中厌氧荧光蛋白PpFbFPm的表达。1,3，细胞形态；2,4相关的荧光成像；1,2未诱导细胞；3,4诱导细胞

图3为葡萄糖醛酸酶诱导表达结果。A.通过X-glu底物的显色反应检测H10::pARA-GusA菌株中GusA基因的诱导表达，深色的反应混合物代表了GusA的表达。离心管的编号，1，不含粗酶液的负对照；2，H10::pARA-PpFbFPm；3，未添加阿拉伯糖的H10::pARA-GusA；4-6，阿拉伯糖的添加量分别为0.1,1和10。B.以MUG为底物测定GusA的酶活(0-6h)，以1g/L的阿拉伯糖诱导剂。C.诱导剂量对GusA酶活的影响。底物为MUG，诱导时间2h。

图4为解纤维梭菌H10菌株碳源利用及生长发酵分析。碳源为0.5％的L-阿拉伯糖或混合碳源(L-阿拉伯糖+纤维二糖，L-阿拉伯糖+D-木糖或L-阿拉伯糖+D-葡萄糖)。通过测定600nm处的吸光值监测细胞的生长状况(方块)。HPLC检测培养基中残余碳源。三角，L-阿拉伯糖；菱形，纤维二糖；圆圈，木糖；十字，葡萄糖。平均值和标准差通过三次重复实验获得。

图5为诱导剂特异性分析及诱导系统抑制性分析。以终浓度为0.1%(w/v)的不同种类的糖，包括L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-半乳糖及D-甘露糖，为诱导剂测定本发明诱导系统的诱导特异性。以0.1%的L-阿拉伯糖与0.1%或1%的其它糖类的混合物作为诱导剂分析诱导系统抑制性。以未添加诱导剂的空白组作为对照，所有样品的数值均为扣除空白对照的标准化值。诱导时间为2小时，平均值和标准差通过三次重复实验获得。

图6为反向筛选标记MazF效果分析。H10::pARA-MazE/F(A)和H10::pARA-PpFbFPm(B)涂布于含有红霉素或阿拉伯糖的GS-2固体培养基上（以+或-上标代表红霉素或阿拉伯糖的添加与否）。

图7为诱导型ClosTron系统工作流程图。基因敲除和质粒消除方法按照文献报道的两步法进行(ApplMicrobiolBiotechnol2014;98:313-23)。每一步中分别包含4个或3个具体操作方法。绿色虚线表示出本发明设计的阿拉伯糖诱导表达系统。

图8为解纤维梭菌H10转化子PCR检测结果。携带质粒pARA-PyrF-mspI或pARA-PyrF-cipC的H10转化子的PCR验证（详见图6中的构建步骤1-4）。转化子首先在无抗生素培养基中生长到对数中期，而后添加1g/L的阿拉伯糖，诱导后分别培养0、1、2和4小时。箭头代表含有完整内含子的突变体。300-400bp的条带代表野生菌株。M，DNAmarker（从上到下分别是，5000、3000、2000、1500、1000、800、500和300bp）

图9为解纤维梭菌菌株H10ΔpyrFΔmspI(A)和H10ΔpyrFΔcipC(B)突变体的PCR验证。携带质粒pARA-PyrF-mspI或pARA-PyrF-cipC的H10ΔpyrF转化子培养在不含抗生素的GS-2液体培养基中（详见图7step1-3），加入阿拉伯糖诱导4小时后，涂布在FOA平板上以消除质粒（详见图7step2-1）.每个重组菌株挑取48个单克隆进行菌落PCR(详见图7step2-2).完整内含子产物如箭头所示（约1.3Kb），野生菌株的条带大小约为0.4或0.3Kb。H10ΔpyrF::pARA-PyrF-mspI菌株48个克隆中3个为目标突变体H10ΔpyrFΔmspI，H10ΔpyrF::pARA-PyrF-cipC菌株48个克隆中6个为目标突变体H10ΔpyrFΔcipC。M，DNAmaker（从上到下分别为5000、3000、2000、1500、1000、800、500和300bp）

图10为解纤维梭菌H10突变株DNA印迹检测结果。(A)mspI突变株；（B）cipC敲除突变体。H10ΔpyrF为负对照NC。2-4,6,7，利用诱导型ClosTron方法获得的H10ΔpyrFΔmspI突变株；9-11,13,14，利用诱导型ClosTron方法获得的H10ΔpyrFΔcipC突变株。1,5，利用已报道的ClosTron方法构建的H10::MspI297s；8,12，利用已报道的ClosTron方法构建的H10ΔpyrF::CipC117a菌株。6,7,13,14，预先在含红霉素的GS-2液体培养基中培养再进行阿拉伯糖诱导；2-4,9-11，阿拉伯糖诱导前未在含红霉素的GS-2液体培养基中培养。L-阿拉伯糖的诱导时间分别为0小时（2,6,9,13），2小时（3,10）或4小时（4,7,11,14）。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1.构建阿拉伯糖诱导系统

我们选择丙酮丁醇梭菌磷酸转酮酶启动子和AraR抑制子表达框来构建阿拉伯糖诱导系统。选择磷酸转酮酶基因上游370bp作为启动子以保证囊括AraR结合区。araR表达框使用了经过预测的自身启动子和终止子，并可实现自我调控。

该阿拉伯糖诱导系统的构建包括：

1）通过PCR扩增获得反馈抑制蛋白AraR的结构基因(SEQIDNO:1)及其启动子区P_araR(SEQIDNO:3)和终止子区T_araR(SEQIDNO:4)；

2）通过PCR扩增获得具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子元件P_ara(SEQIDNO:2)；

3）通过基因克隆的方法将上述元件整合到一个具有抗性基因的质粒骨架上，并在具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子区下游设计酶切位点，用于目标基因的克隆，从而获得具有诱导表达系统的质粒pARA（图1，SEQIDNO:5）。

4）通过基因克隆将目标基因连接到pARA上P_ara(SEQIDNO:2)下游设计的酶切位点上，获得特异性诱导表达目标基因的重组质粒。

实施例2.解纤维梭菌的电转化

根据文献(JMicrobiolMethods2012;89:201-8)报道，转化方法为：解纤维梭菌菌体在100mLGS-2液体培养基中34℃条件下生长到OD600=0.4-0.8，3000g，10分钟离心收集菌体，使用电转缓冲液（0.275mol/L蔗糖，5mmol/LK₂HPO₄）洗2次后定容到1mL，取200μL菌液与1μg质粒混合放入0.2cm电转杯进行电击。电转仪参数设置为：电压1200，频率2000，占空比10%，电击次数40。电转化后的菌液加入到5mL新鲜的GS-2培养基中，34℃复苏培养6小时。复苏后的菌体经离心涂布于含有红霉素抗生素的GS-2固体平板上，在34℃厌氧条件下培养，直至长出菌落（约4-6天）。该菌落即为阳性转化子

实施例3.厌氧荧光蛋白PpFbFPm在解纤维梭菌中的诱导表达

我们选择PpFbFPm作为报告基因（JMicrobiolMethods2012;89:201-8）来证明阿拉伯糖诱导系统在解纤维梭菌H10菌株中可用。

PpFbFPm通过NheI和SalI两个酶切位点连接到pARA质粒的P_ara下游，获得质粒pARA-PpFbFPm。通过基因克隆的方法，将质粒pARA-PpFbFPm上的AraR的结构基因及其启动子区P_araR和终止子区T_araR去掉，即获得质粒pPTK-PpFbFPm。包含有P_ara -PpFbFPm和AraR表达框的pARA-PpFbFPm质粒被用来证明阿拉伯糖诱导系统调控的PpFbFPm在解纤维梭菌中的表达。对照组质粒pPTK-PpFbFPm没有AraR表达框，用来组成型表达PpFbFPm(图2A)。质粒pARA-PpFbFPm和pPTK-PpFbFPm的转化同实施例2，阳性转化子记为H10::pARA-PpFbFPm或H10::pPTK-PpFbFPm。

携带有pPTK-PpFbFPm或pARA-PpFbFPm质粒的转化子H10::pARA-PpFbFPm或H10::pPTK-PpFbFPm在添加或不添加L-阿拉伯糖的GS-2液体培养基中培养，PpFbFPm的胞内表达通过绿色荧光成像来检测。使用BX51TRF荧光显微镜（奥林巴斯公司，日本）成像，成像条件为Ex=460-490nm，Em=520nm。

不管是否有L-阿拉伯糖，转化子H10::pPTK-PpFbFPm都能观察到强烈的荧光（图2A)。与之相反，H10::pARA-PpFbFPm在没有L-阿拉伯糖诱导时不会产生绿色荧光(图2B)，说明araR是抑制子而不是激活子。在添加有L-阿拉伯糖时，H10::pARA-PpFbFPm细胞产生的绿色荧光强度与H10::pPTK-PpFbFPm相似，说明L-阿拉伯糖可以强烈的诱导PpFbFPm的表达。以上结果显示该诱导系统能够很好的控制目标蛋白在解纤维梭菌中的表达。

实施例4葡萄糖醛酸酶GusA诱导表达

我们选择GusA作为报告基因（MetabEng2012;14:59-67）来验证阿拉伯糖诱导系统在解纤维梭菌H10菌株中的诱导效率及严谨性。GusA通过NheI和SalI两个酶切位点连接到pARA质粒的P_ara下游，获得质粒pARA-GusA。质粒pARA-GusA通过电转化的方法转化进入解纤维梭菌，获得转化子H10::pARA-GusA，电转化条件同实施例2。

转化子H10::pARA-GusA的粗酶液通过GusA活性实验来检测阿拉伯糖诱导系统在解纤维梭菌中的诱导效率。GusA活性实验所用底物为显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸环己胺盐（X-gluc）和荧光底物4-甲基伞型酮-β-D-葡糖苷酸（MUG），转化子H10::pARA-PpFbFPm作为对照。

转化子H10::pARA-GusA的粗酶液制备方法：30mL解纤维梭菌培养液在冰水混合物中放置20分钟，在4°C下5000g离心10分钟。获得的菌体用30mL预冷的TE缓冲液（10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0）洗2次，重悬在GusA缓冲液中（50mM磷酸钠，1mMEDTA，pH7.0）。重悬的细胞进行超声破碎：30%占空比，3秒超声处理/3秒停顿，10分钟（Scientz-IID，宁波新芝公司）。获得的细胞裂解液在4°C下8000g离心15分钟，取上清。该上清液即为转化子的粗酶液。粗酶液的总蛋白含量用Bradford法测定(AnalBiochem1976;72:248-54）。

GusA的显色反应：20μL粗酶液与1mLX-gluc反应液（GusABuffercontaining0.086mMX-gluc）混合，37°C显色2小时(PNAS,1986;83:8447-51）。

当以X-gluc作为底物时，如果没有L-阿拉伯糖的诱导，转化子H10::pARA-GusA和H10::pARA-PpFbFPm的粗酶反应混合液都没有出现颜色反应，说明GusA没有表达。而经过L-阿拉伯糖诱导的H10::pARA-GusA粗酶液使得反应混合液由无色变成了深蓝色（图3A）。以上结果说明阿拉伯糖诱导系统在解纤维梭菌中有较好的诱导效率和严谨性。

GusA的荧光反应：0.2mL经稀释的粗酶液与1.8mL37°C预热的MUG反应缓冲液（50mM磷酸钠，1mMEDTA，4mMMUG，pH7.0）混合并加入到石英比色皿中（光路=1厘米）。荧光的强度由荧光分光光度计（F-4600，日立公司）在37°C下测定，荧光动力曲线采用时间扫描的模式记录，扫描条件为：Ex=365nm，Em=455nm，PMT电压=700V，时间=10分钟。扫描获得的曲线斜率与样品的总蛋白含量的比值即为GusA活性（U/mg）(MetabEng2012;14:59-67)。

当MUG为底物时，如果没有L-阿拉伯糖诱导，转化子H10::pARA-GusA的MUG活性为106.1±8.7U/mg，而对照组H10::pARA-PpFbFPm的MUG活性为26.4±2.8U/mg。L-阿拉伯糖诱导0.5小时后，转化子H10::pARA-GusA的MUG活性提高了100倍，说明阿拉伯糖诱导系统在解纤维梭菌中有较高的诱导效率并带有很轻微的泄漏表达。

为了进一步确定诱导时间对阿拉伯糖诱导系统在解纤维梭菌中诱导的影响，我们测定了以1g/LL-阿拉伯糖为诱导剂，诱导一定时间（0-6小时）后转化子H10::pARA-GusA的GusA活性。结果发现，经过L-阿拉伯糖诱导，GusA活性迅速增高，并在诱导2小时后达到峰值（约9.0×10⁴U/mg）(图3B)。在此基础上，确定了诱导剂L-阿拉伯糖的使用浓度对诱导效果的影响。实验条件为：诱导时间2小时，L-阿拉伯糖的添加浓度为0-10g/L。如图3C所示，当诱导浓度高于0.1g/L（最高到10g/L）时，GusA的活性比不诱导时高出约800倍。因此，确定阿拉伯糖诱导系统在解纤维梭菌中的最佳诱导条件为0.1g/LL-阿拉伯糖，诱导2小时。这说明该系统有较高的可诱导性和效率。考虑到解纤维梭菌能够利用L-阿拉伯糖为碳源(图4)，诱导剂的使用浓度在之后的试验中均为1g/L。

实施例5.解纤维梭菌H10菌株碳源利用及生长发酵分析

生长及发酵分析方法：

1)解纤维梭菌接种到100mLGS-2液体培养基中，34℃厌氧培养。

2)GS-2液体培养基的碳源为5g/LL-阿拉伯糖或L-阿拉伯糖与5g/L纤维二糖、D-木糖、D-葡萄糖的混合糖。

3)每6小时或12小时取样测定菌液OD600吸光值（紫外分光光度计）和剩余单糖的量（PLoSOne2013;8:e69032）。

解纤维梭菌H10菌株接种到以5g/LL-阿拉伯糖为唯一碳源的GS-2液体培养基中，在60小时内L-阿拉伯糖即被代谢完全，并且菌的生长没有受到任何抑制作用（图4）。当以L-阿拉伯糖与纤维二糖、D-木糖、D-葡萄糖混合糖为碳源培养解纤维梭菌时，虽然没有典型的碳代谢抑制二次生长现象，我们依然检测到L-阿拉伯糖的代谢比D-木糖、D-葡萄糖的代谢要慢，但比纤维二糖稍快。添加D-木糖、D-葡萄糖后，L-阿拉伯糖的代谢速率明显减慢，并在80h后不再代谢。而纤维二糖对L-阿拉伯糖的代谢影响很小。以上结果说明L-阿拉伯糖完全可以作为解纤维梭菌的无害诱导剂。

实施例6.诱导剂特异性分析及诱导系统抑制性分析

诱导剂特异性及诱导系统抑制性分析方法：

1)诱导特异性分析时，解纤维梭菌首先在以纤维二糖为碳源的GS-2液体培养基中培养至对数生长中后期，然后分别加入1g/L的L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖进行诱导，2小时后测定GusA活性（测定方法见实施例3）以确定诱导效果。

2)诱导系统抑制性分析时，解纤维梭菌首先在以纤维二糖为碳源的GS-2液体培养基中培养至对数生长中后期，然后分别加入1g/L的L-阿拉伯糖与1g/L或10g/L的其它单糖一同诱导，2小时后测定GusA活性（测定方法见实施例3）以确定诱导效果。

结果显示，除了L-阿拉伯糖外，其他的一些单糖D-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖用来检测阿拉伯糖诱导系统在解纤维梭菌中的诱导特异性。经过各种单糖诱导的转化子H10::pARA-GusA的GusA活性被用来衡量诱导效果。除了D-阿拉伯糖，其他单糖都可以被解纤维梭菌代谢。在所有的单糖中，L-阿拉伯糖诱导活力比其他糖高出约1000倍，显示出阿拉伯糖诱导系统对L-阿拉伯糖识别的特异性(图5)。但是，添加D-木糖，D-葡萄糖，D-半乳糖，D-甘露糖能够很明显的抑制L-阿拉伯糖的诱导活性，使之降低约40-500倍。而D-果糖只有很轻微的抑制效果。鉴于解纤维梭菌H10菌株对各种碳源的利用情况（实施例5），其他单糖与L-阿拉伯糖的竞争性转运或利用可能导致了其对阿拉伯糖诱导系统抑制效果的出现。

实施例7.反向筛选标记MazF的构建

MazF是ACA特异性的内切核糖核酸酶，它可以切割mRNA抑制细胞生长(ApplEnvironMicrobiol2012；78:8112-21)。利用阿拉伯糖诱导系统诱导表达mazF可以在解纤维梭菌中建立反向筛选标记。MazE是MazF的抗毒素，它可以抑制MazF的毒性作用。由于阿拉伯糖诱导系统在大肠杆菌中有泄漏现象，因此，我们首先构建了质粒pARA-MazE，可以在大肠杆菌中由T7启动子控制表达MazE以确保质粒pARA-MazE/F的成功构建。MazE通过NarI单酶切连接到pARA上，获得质粒pARA-MazE。在pARA-MazE的基础上，再用MluI和SalI双酶切将MazF连接到P_ara下游，获得质粒pARA-MazE/F。

质粒pARA-MazE/F通过电转化的方法转化进入解纤维梭菌，获得转化子H10::pARA-MazE/F，电转化条件同实施例2。获得的转化子H10::pARA-MazE/F涂布含有红霉素抗生素的GS-2平板或含有L-阿拉伯糖的GS-2平板或两者都有的GS-2平板以检测可诱导的MazF在解纤维梭菌中的反向筛选作用，菌株H10::pARA-PpFbFPm作为对照。对照组的三个平板都可以正常生长，而菌株H10::pARA-MazE/F在含有红霉素和L-阿拉伯糖的平板上不能生长（图6），说明MazF在解纤维梭菌中被成功的诱导表达，并抑制了细胞的生长。而且，在只含有L-阿拉伯糖的平板上生长的菌株，经随机挑选，红霉素培养基传代鉴定，其含有的质粒已经丢失。由以上结果可以说明构建的pARA-MazE/F质粒可以在解纤维梭菌中用来作为高效的反向筛选标记。

实施例8.诱导型ClosTron系统的构建

由于基因组中相似序列的存在及内含子基因的持续表达，造成了ClosTron系统脱靶现象。因此，我们可以通过使用诱导表达系统调节内含子相关基因的表达来达到降低ClosTron系统脱靶效率的目的。

为了证明这个假说，我们用阿拉伯糖诱导系统替换了之前报道中的两个质粒pSY6-mspI(JMicrobiolMethods2012;89:201-8)和pGZ-PyrF-cipC(ApplMicrobiolBiotechnol2014;98:313-23)的磷酸丁酰转移酶（phophotransbutyrylase）强启动子，获得了pARA-PyrF-mspIandpARA-PyrF-cipC两个质粒。这两个质粒的靶基因分别为mspI和cipC。将新构建的两个质粒转化底盘细胞H10ΔpyrF（ApplMicrobiolBiotechnol2014;98:313-23），目标菌株H10ΔpyrFΔmspI和H10ΔpyrFΔcipC通过两步筛选获得（图7）。首先转化子需要在没有抗生素的培养基中生长，并用L-阿拉伯糖进行诱导，控制内含子RNA的表达。诱导效果用菌落PCR进行验证，结果显示，两种转化子都含有野生株条带和突变株条带（图.8），说明菌落是野生株和突变株的混合物。但是，突变株条带会随着诱导时间的延长而加深，这说明阿拉伯糖诱导系统能够调控二类内含子元件的表达。

实施例9.诱导型ClosTron系统打靶效率分析

转化子H10::pARA-PyrF-mspI和H10::pARA-PyrF-cipC经过L-阿拉伯糖0、2、4小时的诱导后在含有5-氟乳清酸（FOA）的GS-2平板上筛选，每种转化子随机挑选48或96个菌落进行PCR验证，只含有单一PCR条带的克隆即是本轮筛选的目标突变菌株（图9）。目标突变菌株的数量与挑选菌株的总数量的比值为敲除效率。质粒pARA-PyrF-mspI的敲除效率为4.2-6.3%，并且基本不受L-阿拉伯糖及诱导时间的影响。但是，诱导时间从0小时延长到4小时后，质粒H10::pARA-PyrF-cipC的敲除效率提高了4倍，从3.1%升高到了12.5%。

实施例10.诱导型ClosTron系统打靶效率优化

为了提高内含子的插入效率，转化子H10::pARA-PyrF-mspI和H10::pARA-PyrF-cipC在筛选前先在含有红霉素的液体GS-2培养基中传代，通过L-阿拉伯糖0、2、4小时的诱导后在含有5-氟乳清酸（FOA）的GS-2平板上筛选，每种转化子随机挑选48或96个菌落进行PCR验证，只含有单一PCR条带的克隆即是本轮筛选的目标突变菌株（图9）。目标突变菌株的数量与挑选菌株的总数量的比值为敲除效率。质粒pARA-PyrF-mspI的敲除效率基本没有受到传代的影响，而质粒pARA-PyrF-cipC的敲除效率却有了一定的提高。在没有L-阿拉伯糖诱导时，其敲除效率提高到了10.4%；在经过L-阿拉伯糖诱导4小时后，敲除效率提高到了16.7%。

实施例11.诱导型ClosTron系统打靶特异性分析

为了确认诱导型ClosTron系统的打靶特异性，所有经过实施例9和10的PCR验证的突变株进行了DNA印迹杂交实验，实验步骤与文献相同（JMicrobiolMethods2012;89:201-8），结果显示只有一个插入条带的突变株即为最终目标突变菌株。最终目标突变菌株的数量与总突变株的数量的比值为敲除特异性。之前报道中获得的突变株H10::MspI297s和H10ΔpyrF::CipC117a作为DNA印迹杂交实验的对照（JMicrobiolMethods2012;89:201-8;ApplMicrobiolBiotechnol2014;98:313-23）。

结果显示，尽管之前报道中的ClosTron系统具有更高的敲除效率（JMicrobiolMethods2012;89:201-8），但是其脱靶效率在mspI和cipC两个敲除基因中都为100%。使用诱导型ClosTron系统进行基因敲除，不管有没有L-阿拉伯糖的诱导，菌株H10ΔpyrFΔmspI都没有发现脱靶现象（图10A）。而对于菌株H10ΔpyrFΔcipC，没有在含有红霉素的培养基中传代时，其脱靶效率为0-33%；而当其在含有红霉素的培养基中传代时，所有的菌株都为多插入菌株（脱靶效率为100%）（图10B）。以上结果说明利用诱导型ClosTron系统可以明显降低脱靶效率，获得较高的敲除特异性。

实施例12.热纤梭菌的电转化

根据文献(PloSOne.2013;8:e69032)报道，转化方法为：热纤梭菌菌体在100mLGS-2液体培养基中55℃条件下生长到OD600=0.5-0.8，3000g，10分钟离心收集菌体，使用电转缓冲液（15%甘油）洗2次后定容到1mL，取60μL菌液与1μg质粒混合放入0.1cm电转杯进行电击。电转仪参数设置为：电压1500V，频率2000，占空比10%，电击次数40。电转化后的菌液加入到5mL新鲜的GS-2培养基中，51℃复苏培养6小时。复苏后的菌体经离心涂布于含有甲砜氯霉素抗生素的GS-2固体平板上，在51℃厌氧条件下培养，直至长出菌落（约5-7天）。该菌落即为阳性转化子。

实施例13.厌氧荧光蛋白PpFbFPm在热纤梭菌中的诱导表达

将质粒pPTK-PpFbFPm或pARA-PpFbFPm转化进入热纤梭菌DSM1313菌株中，转化方法同实施例12。转化子DSM1313::pARA-PpFbFPm或DSM1313::pPTK-PpFbFPm在添加或不添加L-阿拉伯糖的培养基中培养，PpFbFPm的胞内表达通过绿色荧光成像来检测。不管是否有L-阿拉伯糖，转化子DSM1313::pPTK-PpFbFPm都能观察到强烈的荧光，证明来源于丙酮丁醇梭菌的磷酸转酮酶启动子不会被热纤梭菌内源的蛋白所识别和干扰。与之相反，DSM1313::pARA-PpFbFPm在没有L-阿拉伯糖诱导时不会产生绿色荧光，说明araR是抑制子而不是激活子。在添加有5g/LL-阿拉伯糖时，DSM1313::pARA-PpFbFPm细胞产生的绿色荧光强度与DSM1313::pPTK-PpFbFPm相似，说明L-阿拉伯糖可以强烈的诱导PpFbFPm在热纤梭菌中的表达。以上结果显示阿拉伯糖诱导系统能够很好的控制目标蛋白在热纤梭菌中的表达。

实施例14.厌氧荧光蛋白PpFbFPm在粪堆梭菌中的诱导表达

将质粒pPTK-PpFbFPm或pARA-PpFbFPm转化进入粪堆梭菌中，方法同实施例12。转化子在添加或不添加L-阿拉伯糖的培养基中培养，PpFbFPm的胞内表达通过绿色荧光成像来检测。不管是否有L-阿拉伯糖，携带有pPTK-PpFbFPm的转化子都能观察到强烈的荧光，证明来源于丙酮丁醇梭菌的磷酸转酮酶启动子不会被粪堆梭菌内源的蛋白所识别和干扰。与之相反，携带有pARA-PpFbFPm的转化子在没有L-阿拉伯糖诱导时不会产生绿色荧光，说明araR是抑制子而不是激活子。在添加有5g/LL-阿拉伯糖时，携带有pARA-PpFbFPm的转化子产生的绿色荧光强度与含有pPTK-PpFbFPm的转化子相似，说明L-阿拉伯糖可以强烈的诱导PpFbFPm在粪堆梭菌中的表达。以上结果显示阿拉伯糖诱导系统能够很好的控制目标蛋白在粪堆梭菌中的表达。

SEQUENCELISTING

<110>中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120>一种微生物可诱导基因表达调控系统

<130>2014

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>362

<212>PRT

<213>Clostridiumacetobutylicum

<400>1

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Claims (10)

1.一种L-阿拉伯糖诱导的启动子，其特征在于：该启动子的核苷酸序列是序列表SEQIDNO:2所示的序列。

2.含有权利要求1中所述启动子的重组载体、表达盒或重组菌。

3.一种微生物的可诱导基因表达调控系统，其特征在于：包括诱导剂L-阿拉伯糖、序列表SEQIDNO:1的反馈抑制蛋白AraR和具有反馈抑制蛋白AraR结合位点的启动子P_ara；所述启动子P_ara的序列表为SEQIDNO:2。

4.根据权利要求3所述的一种微生物的可诱导基因表达调控系统，其特征在于：所述微生物为梭菌属。

5.根据权利要求4所述的一种微生物的可诱导基因表达调控系统，其特征在于：所述梭菌属包括解纤维梭菌、丙酮丁醇梭菌、热纤梭菌或粪堆梭菌。

6.一种微生物的反向基因筛选系统，其特征在于：包括诱导剂L-阿拉伯糖、序列表SEQIDNO:1的反馈抑制蛋白AraR、具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子元件P_ara以及毒性基因；所述启动子P_ara的序列表为SEQIDNO:2；所述毒性基因为mazF基因、pyrF基因、hpt基因、tdk基因、codA基因、sacB基因和galK基因中的一个或多个。

7.根据权利要求6所述的一种微生物的反向基因筛选系统，其特征在于：所述微生物为梭菌属。

8.根据权利要求7所述的一种微生物的反向基因筛选系统，其特征在于：所述梭菌属包括解纤维梭菌、丙酮丁醇梭菌、热纤梭菌或粪堆梭菌。

9.一种降低基于二类内含子的基因靶向操作技术的脱靶率的方法，其特征在于：以L-阿拉伯糖为诱导剂，利用反馈抑制蛋白AraR和具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子元件P_ara，对二类内含子元件进行可控诱导表达。

10.根据权利要求9所述的一种降低基于二类内含子的基因靶向操作技术的脱靶率的方法,其特征在于：所述基于二类内含子靶向操作技术包括Clostron、Targetron或Thermotargetron。