CN103374542A - 一种提高拜氏梭菌木糖消耗率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高拜氏梭菌木糖消耗率的方法。通过敲除拜氏梭菌木糖转录调控因子xylR，敲除拜氏梭菌araR和/或增强木糖转运蛋白的活力，使得梭菌能将培养基中更高浓度的木糖和/或阿拉伯糖消耗完，从而能产更高浓度的产物，比如丁醇，丙酮和乙醇。

Description

一种提高拜氏梭菌木糖消耗率的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种提高拜氏梭菌木糖和/或阿拉伯糖消耗率的方法。
背景技术
由于石油资源的有限性以及国际原油价格的波动性，利用可再生资源制造生物能源已受到世界各国的普遍重视。丁醇由于其优良的燃烧特性及较乙醇更优的储存运输特性，有望在将来成为新一代生物燃料。自二战以来随着石油工业的发展，生物丁醇发酵由于其较高的原料成本，其大规模发酵一直处于停滞状态，而且随着近年来粮食价格的不断上涨及国家相关粮食安全战略的制定，采用粮食发酵生产燃料丁醇已受到严格限制。
拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）是能够发酵产生丁醇的四种梭菌之一[1]，在发酵过程中产生丁醇、丙酮、乙醇以及少量的乙酸和丁酸[2]。拜氏梭菌除了能利用葡萄糖外，还能利用木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖醇等多种碳源[3]。由于葡萄糖和木糖分别是纤维素和半纤维素水解后的主要成分，因而拜氏梭菌可以利用纤维素和半纤维素水解液为原料进行生物丁醇发酵。纤维素和半纤维素在自然界中占到植物界碳素的50%以上，利用纤维素和半纤维素水解液进行生物丁醇发酵，有望大大降低原料成本。和其它很多细菌不一样的是，拜氏梭菌在葡萄糖存在条件下，仍能顺利代谢木糖等五碳糖，说明该菌不存在碳代谢物阻遏效应（carbon cataboliterepression，CCR）。但是无论是葡萄糖还是木糖发酵，该菌均存在糖消耗率低的问题[4]，在木糖发酵中这一现象尤为明显。因此，提高木糖消耗率成为木质纤维素原料应用于拜氏梭菌丙酮丁醇发酵的关键技术之一。
拜氏梭菌属于革兰氏阳性菌，GC含量30%，2007年完成全基因组测序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000721），其中含有预测可能的木糖转录调控蛋白的xylR基因，该基因在NCBI核酸数据库查询号为gi:149903712。在革兰氏阳性菌中，XylR对木糖代谢基因进行转录负调控[5,6]。有报道在低浓度木糖存在下，敲除xylR能增强突变株中木糖代谢相关基因的酶活[7]，但是当木糖浓度较高时，xylR缺失株的木糖代谢相关基因的酶活和野生型处于相当水平，xylR的转录负调控可被彻底解除[8,9]。例如，在另一种产溶剂梭菌—丙酮丁醇梭菌Clostridiumacetobutylicum ATCC824中，敲除xylR(CAC3673)并未提高该菌在较高木糖浓度下的木糖的消耗率，说明XylR在该菌的木糖代谢途径改造中不具备研究价值。微生物中经由木糖异构酶催化的木糖代谢主要包括：1）木糖通过转运蛋白从胞外向胞内运输；2）胞内木糖通过两步（木糖异构酶和木酮糖激酶）催化反应生成5-磷酸-木酮糖；3）5-磷酸-木酮糖进入磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway）进行代谢，最后的代谢流则进入糖酵解途径。在拜氏梭菌中，尚没有木糖或阿拉伯糖代谢途径以及调控基因的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高拜氏梭菌木糖和/或阿拉伯糖消耗率的方法，从而能高效利用水解液中的葡萄糖-木糖或葡萄糖-木糖-阿拉伯糖发酵生产丁醇、丙酮和乙醇。
本发明通过抑制拜氏梭菌xylR基因表达，抑制araR基因表达和/或增强木糖转运蛋白的活力实现。
根据本发明的一个优选实施例，通过在拜氏梭菌xylR基因中插入外源DNA片段以使xylR基因表达被抑制，在拜氏梭菌araR基因中插入外源DNA片段以使araR基因表达被抑制，和/或过表达xylT基因（例如导入pIMP1-ptb-xylT）可实现本发明。
本发明还有一个目的在于，提供其xylR基因表达被抑制，araR基因表达被抑制和/或其xylT基因过表达的拜氏梭菌（C.beijerinckii）重组菌株。
根据本发明的一个优选实施例，本发明提供的拜式梭菌重组菌株的基因组中xylR基因中已插入外源DNA片段，araR基因中已插入外源DNA片段和/或过表达xylT基因。
本发明还有一个目的在于，提供该重组菌株用于高效利用葡萄糖-木糖或葡萄糖-木糖-阿拉伯糖混合糖发酵生产丁醇、丙酮和乙醇的应用。
本发明还有一个目的在于，提供一种提高拜氏梭菌利用葡萄糖-木糖或葡萄糖-木糖-阿拉伯糖混合糖发酵生产丁醇、丙酮和乙醇能力的方法，该方法通过抑制拜氏梭菌xylR基因表达，抑制araR基因表达和/或过表达xylT基因实现。
本发明还提供一种消耗木糖和/或阿拉伯糖的方法，该方法包括在含有木糖和/或阿拉伯糖的物质中加入本文所述的拜氏梭菌重组菌株，并在适合所述菌株发酵的条件下进行发酵，从而使所述物质中的木糖和/或阿拉伯糖被消耗。
因此，本发明提供一种提高拜氏梭菌木糖和/或阿拉伯糖消耗率的方法，该方法包括抑制拜氏梭菌xylR蛋白的活性和/或其编码基因的表达，抑制拜氏梭菌araR蛋白的活性和/或其编码基因的表达和/或提高木糖转运蛋白（例如xylT蛋白）的活力和/或其编码基因的表达，从而提高所述拜氏梭菌的木糖和/或阿拉伯糖消耗率。
本发明提供一种制备木糖和/或阿拉伯糖消耗率提高的拜氏梭菌的方法，所述方法包括抑制拜氏梭菌xylR蛋白的活性和/或其编码基因的表达，抑制拜氏羧菌araR蛋白的活性和/或其编码基因的表达和/或提高木糖转运蛋白（例如xylT蛋白）的活力和/或其编码基因的表达，从而制备得到木糖和/或阿拉伯糖消耗率提高的拜氏梭菌。
本发明的提高拜氏梭菌木糖和/或阿拉伯糖消耗率的方法或制备木糖和/或阿拉伯糖消耗率提高的拜氏梭菌的方法包括对拜氏梭菌进行基因工程化改造的步骤，以相对于野生型拜氏梭菌而言抑制拜氏梭菌xylR基因表达和/或xylR蛋白的活性，抑制拜氏梭菌araR基因表达和/或araR蛋白的活性，和/或过表达木糖转运基因（例如xylT基因）和/或提高木糖转运蛋白（例如xylT蛋白）的表达或活力。
在本发明的提高拜氏梭菌木糖和/或阿拉伯糖消耗率的方法或制备木糖和/或阿拉伯糖消耗率提高的拜氏梭菌的方法中，通过选自下组的一种或多种方式抑制拜氏梭菌xylR基因表达：在所述拜氏梭菌基因组的xylR基因中插入外源DNA片段、通过同源重组敲除全部或部分所述xylR基因、和采用反义核酸技术抑制xylR基因的表达；通过选自下组的一种或多种方式抑制拜氏梭菌araR基因表达：在所述拜氏梭菌基因组的araR基因中插入外源DNA片段、通过同源重组敲除全部或部分所述araR基因、和采用反义核酸技术抑制araR基因的表达
在另外一种实施方式中，可通过引入xylR基因表达抑制剂来实现拜氏梭菌xylR基因表达的抑制。
在另外一种实施方式中，可通过引入araR基因表达抑制剂来实现拜氏梭菌araR基因表达的抑制。
在一具体实施例中，所述xylT基因的序列如SEQ ID NO:3所示，或与SEQ ID NO:3的序列具有90%以上（例如95％、97％、98％或以上）同源性的分子。
提高木糖转运蛋白（例如xylT蛋白）的活力和/或其编码基因的表达可通过选自下组的一种或多种方式实现：在拜氏梭菌基因组中导入额外的木糖转运蛋白、引入提高木糖转运蛋白的表达或活力的突变；或提供瞬时表达木糖转运蛋白的表达载体。
在一具体实施例中，采用targetron技术将外源DNA片段插入xylR基因中。
在一具体实施例中，所插入的外源DNA片段长度为100bp到1000bp。
在一具体实施例中，使用质粒pWJ1-xylR插入外源DNA片段。
在一具体实施例中，采用targetron技术将外源DNA片段插入araR基因中。
在一具体实施例中，所插入的外源DNA片段长度为100bp到1000bp。
在一具体实施例中，使用质粒pWJ1-araR插入外源DNA片段。
在一具体实施例中，使用过表达重组质粒载体携带xylT基因转入菌种进行表达，实现xylT基因的过表达。
本发明中，所述xylT基因编码如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。在一具体实施例中，xylT基因含有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或由其组成。
本发明中，所述xylR基因编码如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。在一具体实施例中，xylR基因含有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或由其组成。
在一具体实施例中，所述过表达重组质粒载体含有来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824ptb基因的启动子和拜氏梭菌NCIMB8052xylT基因。
在一具体实施例中，所述过表达重组质粒载体是pIMP1-xylTptb。
在一具体实施例中，所述木糖转运蛋白是来自于可利用木糖的生物体的、用于木糖转运的蛋白或其生物活性片段，或是所述蛋白或其生物活性片段经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成仍具有转运木糖功能的氨基酸序列。
在一具体实施例中，所述木糖转运蛋白由xylT基因编码。
在一具体实施例中，所述xylT基因的序列如SEQ ID NO:4所示，或与SEQ IDNO:4的序列具有90%以上（例如95％、97％、98％或以上）同源性的分子。
在一具体实施例中，使用一种或多种下述质粒转化所述拜氏梭菌：pWJ1-xylR（SEQ ID NO:1）、pIMP1-ptb-xylT（SEQ ID NO:2）和pIMP1-xylTthl（SEQ ID NO:39），对其进行基因工程化改造。
在一具体实施例中，所述拜氏梭菌是NCIMB8052。
本发明提供采用本发明所述的方法制备得到的重组拜氏梭菌。
在一具体实施例中，本发明的重组拜氏梭菌与野生型拜氏梭梭菌相比，其xylR基因表达和/或xylR蛋白的活性被抑制，araR基因表达和/或araR蛋白的活性被抑制和/或木糖转运基因（例如xylT基因）过表达和/或木糖转运蛋白（例如xylT蛋白）的表达或活力提高。
在一具体实施例中，所述重组拜氏梭菌是对NCIMB8052进行基因工程化改造得到的。
在一具体实施例中，所述重组拜氏梭菌选自：拜氏梭菌8052xylR、8052xylR-xylTptb、8052xylR-xylTthl、8052xylRaraR、8052xylR-xylTptb-araR.
在一具体实施例中，所述拜氏梭菌基因组中xylR基因中插入了长100bp到1000bp的外源DNA片段。
在一具体实施例中，所述拜氏梭菌基因组中xylR基因第1位到第798位碱基之间插入了外源DNA片段。
在一具体实施例中，所述拜氏梭菌基因组中xylR基因第1位到第171位碱基之间插入了外源DNA片段，或在第240和第798位之间插入了外源DNA片段。在一具体实施例中，所述拜氏梭菌基因组中xylR基因第30位到第171位碱基之间插入了外源DNA片段，或在第787和第788位之间插入了外源DNA片段。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：在araR基因第1位到第1074位碱基之间插入外源DNA片段；较佳地，在araR基因第15位到第219位碱基之间，或第252位到第1005位碱基之间插入外源DNA片段。
在一具体实施例中，所述重组拜氏梭菌导入了用于过表达xylT基因的重组质粒载体。
在一具体实施例中，所述过表达重组质粒载体含有来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824ptb基因的启动子和拜氏梭菌NCIMB8052xylT基因。
在一具体实施例中，所述过表达重组质粒载体是pIMP1-xylTptb。
在一具体实施例中，所述重组拜氏梭菌导入了一种或多种下述质粒转化所述拜氏梭菌：pWJ1-xylR（SEQ ID NO:1）、pIMP1-xylTptb（SEQ ID NO:2）和pIMP1-xylTthl（SEQ ID NO:39）。
本发明包括保藏号为CCTCC M2012014的重组拜氏梭菌。
本发明还提供一种消耗木糖和/或阿拉伯糖的方法，所述方法包括，使本发明的重组拜氏梭菌与含有木糖和/或阿拉伯糖的物料接触，和在适合所述重组拜氏梭菌发酵的条件下进行发酵，从而消耗物料中的木糖和/或阿拉伯糖。
本发明还提供一种丁醇制备方法，所述方法包括，使本发明重组拜氏梭菌与含有木糖和/或阿拉伯糖的物料接触，和在适合所述重组拜氏梭菌发酵的条件下进行发酵，从而消耗物料中的木糖和/或阿拉伯糖，产生丁醇。
本发明还提供一种丙酮乙醇丁醇发酵方法，所述方法包括，使本发明重组拜氏梭菌与含有木糖和/或阿拉伯糖的物料接触，和在适合所述重组拜氏梭菌发酵的条件下进行发酵。
在一具体实施例中，所述物料还含有葡萄糖。
在一具体实施例中，所述物料是直接使用木糖配制获得的木糖物料，或是发酵或水解高分子化合物获得的含木糖物料。
在一具体实施例中，所述包含木糖的原料选自：纤维素或半纤维素的水解液、粮食、棉花等。
本发明还包括本发明基因工程化拜氏梭菌在丁醇、丙酮和/或乙醇的生产中的用途。
附图说明
图1A所示为3%葡萄糖:3%木糖XHP2发酵0-72hr的拜氏梭菌NCIMB8052的残糖含量检测结果；图1B所示为3%木糖XHP2发酵0-72hr的拜氏梭菌NCIMB8052的残糖含量检测结果。
图2为xylR中断菌株的菌落PCR鉴定的凝胶电泳检测结果，其中，WT所用的模板为C.beijerinckii NCIMB8052基因组，xylR突变体的模板分别为转化子8052ΔxylR1-2，标记为1kb DNA ladder。
图3为8052xylR和8052在中性碳源培养下木糖代谢各基因的转录分析。
图4为6%木糖XHP2发酵0-81hr的8052xylR和8052的发酵各项指标。A：残糖；B：生长曲线；C：pH曲线；D：丁醇和ABE浓度曲线。
图5为6%木糖XHP2发酵96hr的8052xylT,8052-xylTthl和8052的木糖消耗量检测结果。
图6为6%木糖XHP2发酵96hr的8052，8052xylR,8052xylR-xylTptb和8052xylR-xylTthl的木糖消耗量检测结果。
图7为5.5%木糖母液XHP2发酵0-72hr的8052和8052xylR-xylTptb的发酵各项指标。A：残糖；B：生长曲线；C：pH曲线；D：丁醇和ABE浓度曲线。
图8为插入内含子的xylR基因测序结果。
图9显示二类内含子的结构，在该内含子的IV结构域处可插入任何DNA片段。
图10显示了xylRaraR中断菌株的菌落PCR鉴定结果，其中，泳道2所用的模板为C.beijerinckii NCIMB8052基因组，泳道3-6的模板为的xylRaraR突变体，泳道1为1kb DNA ladder。
图11显示了使用Sigma-Aldrich的TargetronTM Gene Knockout
System(TA0100)试剂盒进行PCR扩增araR-targetron片段的结果。
图12显示了构建的pWJ1-araR重组质粒载体大肠杆菌转化子的菌落PCR鉴定结果。泳道Marker为1kb DNA ladder，泳道1-9为待鉴定的pWJ1-araR重组质粒载体转化子。
图13显示了araR中断菌株的菌落PCR鉴定结果，其中，泳道C所用的模板为C.beijerinckii NCIMB8052基因组，泳道1-12的模板为的araR突变体基因组，泳道M为1kb DNA ladder。
具体实施方式
本申请中，“xylR蛋白”指拜氏梭菌中与NCIMB8052的xylR蛋白（SEQ IDNO:40）相对应的蛋白。“xylR基因”指拜氏梭菌基因组中与拜氏梭菌NCIMB8052的xylR基因（NCBI核酸数据库查询号为gi:149903712，也见SEQ ID NO:3）相对应的基因（包括基因组中所处位置以及相应的序列）；或与xylR基因具有90%以上、95%以上、97%以上、或98%以上同源性的分子。“xylT蛋白”指拜氏梭菌中与NCIMB8052的xylT蛋白（SEQ ID NO:41）相对应的蛋白。“xylT基因”指拜氏梭菌基因组中与拜氏梭菌NCIMB8052的xylT基因（NCBI核酸数据库查询号为gi:149901466，也见SEQ ID NO:4）相对应的基因（包括基因组中所处位置以及相应的序列），或与xylT基因具有90%以上、95%以上、97%以上、或98%以上同源性的分子。应理解，不同的拜氏梭菌菌株中的xylR基因和xylT基因可能会存在些许不同，但这些xylR基因和xylT基因应都在本申请的“xylR基因”和“xylT基因”的范围之内；同样，不同的拜氏梭菌中xylR蛋白和xylT蛋白可能也会存在些许不同，但这些xylR蛋白和xylR蛋白也够包括在本发明的“xylR蛋白”和“xylT蛋白”的范围之内。
本申请中，“抑制拜氏梭菌xylR基因表达”，既可以是降低拜氏梭菌xylR基因表达量，也可以是使拜氏梭菌xylR基因不表达或不能表达出正确的蛋白质。
根据本发明的一个实施方式，通过中断拜氏梭菌xylR基因表达的实现所述“抑制”。这种中断能提高拜氏梭菌混糖消耗率。在另一种实施方式中，采用反义核酸技术抑制xylR基因的表达，将xylR表达量下调。
“中断拜氏梭菌xylR基因表达”可通过在xylR基因中插入外源DNA序列或通过同源重组敲除部分或全部xylR基因来实现。可采用二类内含子插入技术在该基因内部的任何位点插入外源DNA而实现拜氏梭菌xylR基因的中断。“外源DNA”或“外源DNA片段”在本文中指并非是拜氏梭菌自身存在或产生的DNA片段，该外源DNA片段需要从拜氏梭菌外部导入。作为阐述性的例子，targetron技术是基于乳酸乳球菌的二类内含子（L1.ltrB）发展而来的。L1.ltrB RNA具有核酶的功能，可以通过反向剪切，直接插入到目标DNA位点，然后再由内含子编码蛋白(Intron-encoded protein,IEP)将这一段内含子RNA反转录成cDNA，产生的cDNA内含子可通过宿主的同源重组或修复酶机制使它完全整合到基因组DNA。可参见Lambowitz,A.M.,G.Mohr,and S.Zimmerly,eds.Group II intron homingendonucleases:Ribonucleoprotein complexes with programmable target specificity.Homing endonucleases and inteins.Nucleac acids and molecular biolgyed.M.Belfort.Vol.16.2005,Springer-Verlag:Heidelbeerg.121-145。
本申请不仅限于二类内含子。图9显示了二类内含子的结构，在该内含子的IV结构域中可插入任何DNA片段。优选地，该片段为100bp到1kb，例如，该片段长度可为100-300bp、300-1000bp、500-1000bp、300-500bp不等。在本发明的一个具体实施例中，所插入的片段如图8第173-1087位碱基所示。通过该二类内含子，可将所述DNA片段插入到xylR的任何位点中。
用于中断xylR基因的插入片段可在xylR基因中的任意位点插入，只需要能使xylR基因表达被中断或抑制即可。
XylR蛋白是通过与木糖代谢相关基因启动子区域结合来实现转录调控的功能的，因此如果破坏了该蛋白与DNA结合的区域，就会导致xylR不能正常行使调控功能。对于很多革兰氏阳性菌假定的xylR蛋白，N端有螺旋－转角－螺旋的结构，C端有亮氨酸拉链基序，这些基序都是与DNA结合有关的[7]。
对于拜氏梭菌的xylR蛋白结构预测显示，在第10到57个氨基酸（对应的碱基数是SEQ ID NO:3的30bp到171bp）处是螺旋－转角－螺旋的结构，第80位到第266位氨基酸（对应的碱基数是SEQ ID NO:3的240bp到798bp）处属于ROK（Repressor,Open reading fram,Kinase）家族保守结构域。因此，在本发明的优选实施例中，在SEQ ID NO:3的第1-798bp插入外源DNA片段。在本发明的另一优选实施例中，在第1位到第171位碱基之间插入外源DNA片段，或在第240和第798位之间插入外源DNA片段。在本发明的一个具体实施例中，在SEQ ID NO:3的第787/788位之间插入DNA片段。在其它实施方式中，在SEQ ID NO:3的第30-798bp之间插入外源DNA片段，更进一步地，在第37-171位碱基之间插入外源DNA片段。
在本发明的一个具体实施例中，使用重组质粒载体pWJ1-xylR实现DNA片段的插入，该质粒中使用的xylR-targetron片段是在IBS、EBS2、EBS1d位点碱基经修改后用于敲除xylR基因的片段，该片段属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，其中包含ltrA基因。但应理解，在重复本发明的试验时，可以选取其他插入位点进行试验，甚至还可以不使用重组质粒载体进行试验，只要能在xylR基因中插入核酸片段以中断xylR基因的表达即可。
也可通过同源重组来中断xylR基因。同源重组中断xylR基因包括通过同源重组敲除xylR部分或全部序列，使得xylR基因的表达被中断或被抑制或表达出不完整XylR蛋白。同源重组方法中使用到的“重组敲除质粒载体”包括用于敲除xylR基因的重组质粒载体，该载体具有与xylR基因的特定序列进行特异配对位点，以及用于对xylR基因进行特异性敲除的片段。
上述方法用于将xylR基因失活。除此之外还可以采用反义核酸技术抑制xylR基因的表达，将xylR表达量下调。实现上述目的的方法在本领域中为一般技术人员所熟知，例如，可参见Tummala,S.B.,N.E.Welker等，(2003).J Bacteriol185(6):1923-1934；Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989))。
根据本发明的一个优选实施例，过表达xylT，能提高拜氏梭菌木糖消耗率。过表达xylT基因的方法包括但不限于，用游离的过表达重组质粒载体携带xylT基因转入菌种进行表达。
根据本发明，“过表达重组质粒载体”包括用于过表达xylT基因的重组质粒载体。在具体的实施例中，本发明的过表达重组质粒载体可含有来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824ptb基因的启动子和拜氏梭菌NCIMB8052xylT基因。在一具体实施例中，本发明使用的过表达重组质粒载体是pIMP1-xylTptb。
因此，本申请提供一种提高拜氏梭菌木糖消耗率的方法，该方法包括采用上述方法抑制拜氏梭菌xylR基因表达和/或过表达xylT基因。
本申请也提供一种改造拜氏梭菌、以提高其木糖消耗率的方法，该方法包括采用上述方法抑制拜氏梭菌xylR基因表达和/或过表达xylT基因。
采用上述方法制备或改造后，可采用本领域常规的技术手段验证所得菌株的xylR基因表达是否已被抑制和/或xylT基因是否过表达。例如，可通过PCR和/或测序方法验证外源DNA片段是否已插入xylR基因中（示范性的例子可参见本申请实施例3的第3.2和3.3节），也可通过PCR验证过表达xylT的重组质粒是否已转入菌株中（示范性的例子可参见实施例8）。
本申请因而包括采用上述方法制备或改造得到的重组拜氏梭菌（即经基因工程化改造的拜氏梭菌）。在具体的实施方式中，本发明的重组拜氏梭菌因被改造而在其基因组xylR基因中插入了外源DNA片段、xylR基因部分或全部缺失、和/或xylT基因过表达。此外，所述重组拜氏梭菌也可通过反义核酸技术改造而具有降低的xylR基因表达的特征。
应理解，本申请中，拜氏梭菌xylR基因表达量降低、不表达或不能表达出正确的xylR蛋白以及xylT基因过表达是改造后的拜氏梭菌与改造之前的拜氏梭菌相比较而言的。改造之前其xylR基因和xylT基因均为野生型基因的任何拜氏梭菌都在本发明的改造对象之列，由此改造得到的拜氏梭菌也都包括在本发明的重组拜氏梭菌的范围之内。
又一方面，本发明提供了拜氏梭菌在混糖发酵中阿拉伯糖消耗率和有机溶剂生产的负调控基因：araR基因。araR基因在NCBI核酸数据库查询号为gi:150019267。优选地，所述AraR多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种通用方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
应理解，本发明的编码序列优选获自拜氏梭菌，获自其它菌或生物、与获自拜氏梭菌的编码序列高度同源(如具有50%以上，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更优选85%以上如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它编码序列也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有AraR和XylR多肽活性的蛋白片段及其类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然AraR和XylR多肽相同的生物学功能或活性的多肽。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
如本文所用，术语“基因转移”是指将外源的遗传物质由供体菌导入到受体菌内的过程，其可以通过转化、接合转移、转导、细胞融合等手段来实现。
如本文所用，术语“接合转移”是指细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质(主要是质粒DNA)从供体菌转移给受体菌。
如本文所用，术语“基因失活”是指降低目的基因的活性或表达、或降低目的基因编码多肽的产生和分泌，基因失活的方法包括(但不限于)：基因中断、基因敲除、RNA干扰、基于同源重组的基因缺失、基于二类内含子或转座子的基因插入失活，基于siRNA或shRNA的RNA干扰、miRNA等。
在本方面中，与野生型拜氏梭菌相比，所述基因的mRNA表达水平降低10%以上(更佳地降低20%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低80%以上，最佳地完全没有所述基因的表达)；或所述多肽的活性降低10%以上(更佳地降低20%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低80%以上，最佳地完全没有所述多肽的活性)。
如本文所用，术语“转化率”是指生成物的产量比投入原料量的百分比。在本文中，指乙醇、丁醇和/或丙酮的生成量比原料中投入总糖的量的百分比，其中总糖指原料中包含的所有的糖，包括但不限于原料中的葡萄糖、木糖、和阿拉伯糖。
如本文所用，术语“利用率”是指拜氏梭菌消耗的原料的量比投入原料的量的百分比。
如本文所用，术语“提高转化率”，或“提高利用率”是相对野生型菌株而言，具体是指比野生型菌株具有更高的产率或更高的利用率。
如本文所用，术语“抑制拜氏梭菌araR基因的表达”，既可以是降低拜氏梭菌araR基因的表达水平，也可以是使拜氏梭菌araR基因完全不表达，或不能表达出正确的有活性的功能蛋白。
本领域的一般技术人员可以使用常规方法实现上述目的，包括但不限于：基因中断、基因敲除、RNA干扰、基于同源重组的基因缺失、基于二类内含子或转座子的基因插入失活，基于siRNA或shRNA的RNA干扰、miRNA等。可以参考《分子克隆：实验室指南》等，在此不具体描述。
在本发明的另一个优选实施例中，所提供的拜氏梭菌重组菌株的基因组中araR基因表达被抑制，不能表达出具有完整结构的araR蛋白。
根据本发明，拜氏梭菌araR基因的中断，可采用二类内含子插入技术在该基因内部的任何位点插入DNA(例如内含子或大小不超过1kb的抗性基因，如pIMP1载体骨架上的红霉素抗性基因)实现；也可通过同源重组中断araR基因，用于中断araR基因的插入片段可在araR基因中的任意位点插入，只需要能使araR基因表达被中断或抑制即可；还可以通过同源重组敲除araR部分或全部序列实现，只要能使得araR基因的表达被中断或被抑制或表达出不完整araR蛋白即可。上述方法可用于将araR基因失活。
拜氏梭菌的AraR蛋白结构预测显示，在第5到73个氨基酸(对应的碱基数是15bp到219bp)处是螺旋-转角-螺旋的结构，第84位到第335位氨基酸(对应的碱基数是252bp到1005bp)处是LacI家族的糖结合区域，它们属于GntR家族保守结构域。因此，在本发明的一个优选实施例中，在araR的第1-1074bp插入外源DNA片段；较佳地，在第30位到第171位碱基之间插入外源DNA片段，或在第440和第873位之间插入外源DNA片段；也可以在araR的第540/541位之间插入DNA片段。在其它实施方式中，在araR第15-219bp之间插入外源DNA片段，更佳地，在第252-1005位碱基之间插入外源DNA片段。
除此之外，还可以采用反义核酸技术等本领域常规用于抑制特定基因表达的方法来抑制araR基因的表达，将araR表达量下调。实现上述目的的方法在本领域中为一般技术人员所熟知(例如但不限于Tummala,S.B.,N.E.Welker等(2003).JBacteriol185(6):1923-1934；Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989))，因此在此不具体描述。
“重组敲除质粒载体pWJ1-araR”指的是用于敲除araR基因的重组质粒载体，该载体应理解为具有与araR基因的特定序列进行特异配对位点的重组质粒载体，在上述重组质粒载体中包括用于对araR基因进行特异性敲除的片段。
本发明的优选实施例中，所使用的重组敲除质粒载体pWJ1-araR指的是：基于大肠杆菌和拜氏梭菌穿梭质粒pWJ1(其在拜氏梭菌中表达红霉素抗性基因，序列如SEQ ID NO.：1所示)构建的，用于敲除araR基因的重组质粒载体。在该载体中，使用的araR-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBS1d位点碱基经修改后，用于敲除araR基因的片段，该片段属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，其中包含ltrA基因。然而，本领域普通技术人员在实践本发明的方法时，可以选取其它插入位点进行试验，甚至还可以不使用重组质粒载体进行试验，只要能在araR基因中插入核酸片段以中断araR基因的表达即可。
应理解，除了可从基因水平对araR基因的表达进行抑制以外，为了实现本发明的目的，还可对araR蛋白的活性进行抑制。
再一方面，本发明还涉及同时抑制xylR基因和araR基因的表达或多肽活性。
在本发明中，优选在抑制araR基因的表达或蛋白活性的同时，抑制xylR基因的表达或蛋白活性。
可采用本领域中常规的方法，实现上述优选方案。例如，可同时或先后采用多种质粒对拜氏梭菌进行转化，例如先采用pWJ1-xylR转化、再采用pWJ1-araR进行转化。
在本发明的一个优选例中，拜氏梭菌xylRaraR是指用重组敲除质粒载体pWJ1-xylR中断了xylR基因以抑制该基因表达，并用重组敲除质粒载体pWJ1-araR中断了araR基因以抑制该基因表达而构建的重组拜氏梭菌菌株。根据本发明的一个优选实施例，在8052xylR中敲除araR基因，能进一步提高拜氏梭菌混合糖发酵中的阿拉伯糖的利用率。
根据本发明，使用的重组菌株，既可以是本发明提供的抑制拜氏梭菌xylR基因表达和抑制拜氏梭菌araR基因表达的菌株，也可以是根据本发明的教导和现有技术，制备的其它的抑制拜氏梭菌xylR基因表达和抑制拜氏梭菌araR基因的菌株，如采用反义核酸技术降低xylR表达量或的菌株。
本发明因此提供采用上述方法制备得到的重组菌株，该重组菌株提高了木糖的消耗率，能高效利用木糖和/或阿拉伯糖进行发酵。本发明方法和菌株对发酵原料中的木糖和/或阿拉伯糖的利用率显著提高，同时转化生成的ABE浓度相应提高，因此可用于丙酮、丁醇、乙醇的发酵生产。并且，本发明构建的工程菌株提高了混合糖中阿拉伯糖的消耗率，能高效利用葡萄糖-木糖-阿拉伯糖进行发酵，因此这些菌株能够提高木质纤维素水解液进行丙酮丁醇发酵的能力。
因此，本申请包括利用本申请的重组拜氏梭菌消耗木糖、制备丁醇以及进行丙酮丁醇发酵的方法，这些方法包括，使本申请的重组拜氏梭菌与含有木糖的物料接触，和在适合所述重组拜氏梭菌发酵的条件下进行发酵。
本申请中，术语“发酵”是指采用本申请的重组拜氏梭菌，由含木糖物料通过生物转化生产丙酮、丁醇、乙醇等产物的过程。该过程可采用本领域中常规使用的发酵设备和工艺进行，本领域普通技术人员可根据实际需要和条件对设备和工艺进行选择。本发明中，可采用常规的拜氏梭菌发酵条件来实现本发明重组拜氏梭菌的发酵。例如，本申请实实施例一中的施例1、4和5等给出了使用本发明重组拜氏梭菌发酵的示例性条件，本领域技术人员可根据实际的生产条件、生产规模对所述发酵条件做出适当的修改。
含有木糖的物料还可以含有其它成分，例如葡萄糖和/或阿拉伯糖等。含木糖的物料既可以是直接使用木糖等成分配制获得的物料，也可以是发酵或水解高分子化合物（如水解纤维素或半纤维素等）获得的物料。含木糖物料可获自传统的粮食，但更优选地获自非粮原料，例如廉价的木质纤维素资源或农林废弃物，如秸秆、稻草等。
用于本发明发酵生产的原料可为单一糖或混合糖，例如木糖-阿拉伯糖、葡萄糖-木糖-阿拉伯糖。使用的含糖原料既可以是直接使用葡萄糖、木糖和阿拉伯糖配制获得的单一糖或混合糖(如葡萄糖-木糖-阿拉伯糖)，也可以是发酵或水解高分子化合物(如水解纤维素或半纤维素等)，获得的混合糖。含糖原料可获自传统的粮食，但更优选地获自非粮原料，例如廉价的木质纤维素资源或农林废弃物，如秸秆、稻草等。混合糖中各种糖的浓度可为2-5%葡萄糖：0.3-2%木糖：0.05%-5%阿拉伯糖，优选可为2-5%葡萄糖：0.3-2%木糖：0.05%-0.5%阿拉伯糖，更优选3.9%葡萄糖:1.5%木糖:0.3%阿拉伯糖(所示百分比为w/v)(Aristidou,A.and M.Penttila(2000).CurrOpin Biotechnol11(2):187-198)。在本发明的一个实施例中，
含木糖的物料是含有木糖和葡萄糖的物料。在一个实施例中，物料中木糖的含量可以是0.1－70g/L。在还含有葡萄糖的情况下，葡萄糖的含量可以是0.1-70g/L。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。发酵液或糖溶液中糖的浓度为质量体积比w/v%（请核实是否准确）。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例一
本发明的下述实施例中，使用的菌株Clostridium beijerinckii NCIMB8052的xylR基因是通过本实验鉴定确定的，其在NCBI核酸数据库查询号为gi:149903712；使用的菌株Clostridium beijerinckii NCIMB8052的xylT基因是通过本实验鉴定确定的，其在NCBI核酸数据库查询号为gi:149901466。
本发明的下述实施例中，ABE为丙酮＋丁醇＋乙醇（Acetone-butanol-ethanol）的简称，ABE浓度指的是溶液中丙酮、丁醇、乙醇的总浓度。
本发明的下述实施例中，重组质粒载体pIMP1-Pptb指表达xylT基因的重组质粒载体，ptb启动子是来源于Clostridium acetobutylicum ATCC824ptb基因的启动子。
本发明的下述实施例中，重组质粒载体pIMP1-Pthl指表达xylT基因的重组质粒载体，thl启动子是来源于Clostridium acetobutylicum ATCC824thl基因的启动子。
重组敲除质粒载体pWJ1-xylR指的是用于在xylR基因中插入外源DNA片段的重组质粒载体，其中，使用的xylR-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBS1d位点碱基经修改后，用于插入xylR基因的片段，该片段属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，其中包含ltrA基因。
本发明使用的菌株和质粒分别为：
质粒pWJ1-xylR是敲除xylR基因所用质粒，为E.coli和Clostridium的穿梭质粒，在C.beijerinckii中表达红霉素抗性基因，该质粒的序列见SEQ ID NO.：1。
质粒pIMP1-xylTptb是过表达xylT基因所用质粒，为E.coli和Clostridium的穿梭质粒，在C.beijerinckii中表达红霉素抗性基因，该质粒的序列见SEQ ID NO.：2。
拜氏梭菌xylR基因的序列，见SEQ ID NO.：3。
拜氏梭菌xylT基因的序列，见SEQ ID NO.：4。
本发明中使用的PCR纯化和DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自华舜生物制品有限公司，TargetronTM Gene Knockout System（TA0100）Kit购自Sigma-Aldrich公司，基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。
在本发明的下述实施例中，使用的培养基和缓冲液如下：
CGM培养基配方如下（Joseph W.Roos et al，Biotechnology and Bioengineering,P681-694,Vol557,1985）：2g(NH4)2SO4，1g K2HPO4·3H2O，0.5g KH2PO4，0.1gMgSO4·7H2O，0.015g FeSO4·7H2O，0.01g CaCl2，0.01g MnSO4·H2O，0.002g CoCl2，0.002g ZnSO4，2g Tryptone，1g Yeast Extraction，50g Glucose，2%琼脂溶于1L水中。
XHP2培养基的配制方法如下：
溶液1：40g D-葡萄糖，20g D-木糖或50g D-木糖，加H2O定溶至850mL；
溶液2：KAC7.85g，NH4Cl2.14g，K2HPO4·3H2O0.5g，KH2PO40.5g，加H2O定溶至100mL；
溶液3：2.0g MgSO4·7H2O，0.1g MnSO4·H2O，0.1g NaCl，0.1g FeSO4·7H2O；
溶液4：100ml蒸馏水中加入100mg氨基苯酸（p-aminobenzoic acid），100mg维生素B1（thiamine），1mg生物素（biotin）；
溶液1和溶液2高温湿热灭菌，溶液3和溶液4过滤除菌，溶液1和溶液2冷却后混合均匀，再加入10mL溶液3和1mL溶液4，混匀后分装成95mL/瓶，用过滤除菌的N2排除瓶中的空气。
ETM缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4，10mMMgCl2。
ET缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4。
本发明使用的限制性内切酶，Taq DNA聚合酶，T4DNA连接酶和小牛碱性磷酸酶（CIAP）均购自TaKaRa公司，KOD plus DNA聚合酶购自Toyobo公司。
其他常规试剂均为国产或进口分装。
本发明通过PCR扩增用于表达xylT基因的片段和/或中断xylR基因的targetron片断，然后经双酶切并与经同样酶切的pIMP1-ptb和/或pWJ1载体连接，得到质粒pIMP1-ptb-xylT和/或pWJ1-xylR，电转Clostridium beijerinckii NCIMB8052，然后经菌落PCR鉴定出有外源基因片段的存在和/或内含子插入到基因组中的重组菌，经发酵验证确定重组菌木糖消耗率提高，具体如下述实施例所示。
序列表说明
表1：细菌菌株及质粒
Figure BDA00003104371200191
a xylR,木糖代谢的转录调节子;xylT,木糖转运蛋白;ltrA,LtrA蛋白,反向剪切所需;ColE1ORI,复制的ColE1起点;Ampr,氨卞青霉素抗性;pIM13ORI,复制的革兰氏阳性起点;MLSr,红霉素抗性;ptb,磷酸转丁酰基酶;thl,硫解酶。
表2：本申请所用的引物引物
Figure BDA00003104371200201
Figure BDA00003104371200221
a根据在线工具设计(www.clostron.com)
实施例1.8052菌株在3%w/v葡萄糖:3%w/v木糖以及3%w/v单木糖的合成培 养基中的发酵
从CGM平板上挑取单菌接入5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以5%接种量接入95mL6%w/v木糖的XHP2培养基中，培养12hr，使菌浓OD600达到0.5－1.0，以5%接入95ml XHP2培养基中培养发酵，取发酵液检测残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agela1200HPLC测定，结果如图1所示)，其中测定发酵液中的残糖含量前需进行如下预处理：发酵液经离心后，分别取上清液，以H2O经20倍稀释后用于残糖测定。
结果显示：8052能同时利用葡萄糖和木糖，其碳代谢阻遏效应不明显。无论是3%w/v葡萄糖:3%w/v木糖发酵还是3%w/v单木糖发酵，该菌72小时内都不能完全消耗培养基中的木糖，说明8052木糖代谢途径天然存在问题。因此，需要寻求一种可改善该代谢途径的新方法。
实施例2.构建pWJ1-xylR质粒载体
通过PCR扩增xylR targetron片断，然后使用XhoI和BsrG I进行双酶切，并与同样经XhoI和BsrG I酶切的pWJ1载体连接，得到中断质粒pWJ1-xylR，其中，PCR扩增xylR targetron的模板及引物设计方法来源于Sigma-Aldrich公司的TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒，具体步骤如下：
2.1PCR扩增引物
参考TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒提供的方法，分别设计引物xylR787|788s–IBS、xylR787|788s–EBS1d和xylR787|788s–EBS2，用于构建pWJ1-xylR质粒载体。
PCR扩增需要的EBS通用引物(EBS universal)由TargetronTM Gene KnockoutSystem(TA0100)试剂盒自带。
2.2PCR扩增
使用Sigma-Aldrich的TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃30s,94℃30s、55℃30s、72℃30s30个循环，72℃2min，4℃保存)，扩增需要的模板和试剂由试剂盒提供，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收350bp处的条带。
2.3构建pWJ1-xylR重组质粒载体
使用Xho I及BsrGI分别酶切载体pWJ1和xylR-targetron片段，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收酶切后产物。
将酶切后的xylR-targetron片段与酶切后的载体片段使用T4DNA连接酶连接，该连接反应在16℃水浴锅中进行10hr，将获得的连接产物以CaCl2热休克法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：42℃热击90sec，然后添加4℃LB液体培养基复苏1hr，然后将细胞以4500rpm离心5min，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上培养16-18hr。
对获得的菌落进行菌落PCR(反应试剂由Sigma-Aldrich的TargetronTM GeneKnockout System(TA0100)试剂盒提供、条件：95℃5min,94℃30s、55℃30s、72℃30s30个循环，72℃2min，4℃保存)，以检测350bp的targetron片段是否连接入pWJ1载体中，PCR扩增引物为IBS和EBS1d。
PCR检测结果显示，菌落PCR可以扩增出350bp特异性条带。随即挑取PCR呈阳性的菌落以LB液体培养基扩培，提取质粒。然后，以dpIMP1-fw作为引物，提取的质粒作为模板进行测序，结果如预期：targetron片段确已连接入pWJ1载体)。
实施例3.拜氏梭菌xylR突变株的构建、检测与敲除质粒的丢失
将pWJ1-xylR质粒电转拜氏梭菌NCIMB8052，复苏过夜后，取200μl细胞液涂布于加有10μg/mL红霉素的CGM平板上，在厌氧箱内37℃培养48-72小时后，挑取单菌进行菌落PCR验证，具体过程如下：
3.1pWJ1-xylR质粒电转入拜氏梭菌8052
将拜氏梭菌NCIMB8052于CGM培养基平板上划线培养48hr后，挑取单菌落接入5mL CGM液体培养基中培养16hr，再按1%接种量接入50mL CGM液体培养基中培养，当培养菌体的OD600达到0.6-0.7之间时取出培养菌，用于制备电转感受态细胞。取30mL菌液，于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入30mL4℃的ETM缓冲液悬浮，再于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入1mL4℃的ET缓冲液，获得悬浮菌液。
取上述悬浮菌液190μL，加入10μL(约1～3μg)pWJ1-xylR质粒(冰上操作)，混匀后转入电转杯中(2mm直径)，使用Bio-Rad MicroPulserTM电转仪电转，电压1.8kV，其余参考使用手册，电击后迅速加入常温的CGM培养基1mL，于37℃培养8hr后，取200μL细胞液涂布于加有10μg/mL红霉素的CGM平板上，于厌氧箱内37℃培养约2～3天。
3.2菌落的PCR验证
pWJ1-xylR质粒转化入拜氏梭菌NCIMB8052中后，可能会将二类内含子的部分序列插入到基因组的xylR基因中，是否有内含子插入可以使用插入位点上下游的引物，通过菌落PCR加以验证(未插入内含子的野生型菌将扩增出400bp的条带，插入有内含子的重组菌株将扩增出的条带为1.3Kb条带)，因此，随机挑取两个转化子进行验证，其中，以拜氏梭菌NCIMB8052基因组为阴性对照，具体过程如下：
PCR反应使用的引物为xylR_569-588和xylR_918-937；
PCR反应体系：体系100μl；10×Taq Buffer10μl；dNTP(2mM)10μl；MgCl2(25mM)10μl；Taq酶1μl；正向引物（100mM）2μl；反向引物(100mM)2μl；菌落（牙签占取微量）；水65μl。
PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃5min。
将PCR反应获得的产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。
根据图2的结果，得到的两个转化子均为插入了内含子的突变体。
3.3测序验证阳性转化子
随机挑取步骤3.2中对应于图2中标记为3的阳性转化子，以加有10μg/mL红霉素的CGM液体培养基培养后，抽提基因组。以抽提的基因组为模板，以xylR-_569-588和xylR_918-937为引物对进行PCR扩增，回收扩增获得的1.3kb DNA条带并测序，结果如图8所示。测序结果显示，该序列的位点的173-1087DNA为插入的内含子序列，即内含子序列精确地插入到预计的787|788位点之间。
3.48052/pWJ1-xylR敲除质粒的丢失
将3μl生长至对数生长期的转化子分别转接至5ml CGM无抗和含有红霉素(20μg/ml)的试管中，12～15小时转接一次，直至抗性试管不再生长为止，此过程需约2天，将此时对应的无抗试管菌液涂板，菌落PCR、测序验证(同3.2、3.3)保证内含子的插入，将丢失敲除质粒的突变株命名为8052xylR，用于后续的代谢工程改造。
实施例4.RT-PCR检测8052和8052xylR中木糖代谢相关基因的转录
从CGM平板上挑取8052xylR单菌接入5mL CGM液体培养基中，过夜培养至OD600＝0.8～1.0，以2%接种量接入50mL CGM培养基中，培养8～10hr，使菌浓OD600达到0.5－1.0，接入500ml SP2(30g/L甘油作为碳源,在XHP2的基础上加0.1g/L L-半胱氨酸和6g/l酵母提取物)培养基中发酵，并以8052作为对照，当OD600=0.5时，4℃，6000rpm，10min离心收集250ml菌体并用液氮速冻。细胞RNA的提取和cDNA的制备同文献[11]。
结果表明（图3）：和对照8052相比，xylT、xylAI、xylAII和xylB在8052xylR中转录都有明显上调,xylF和tal基因转录变化不明显，说明敲除xylR基因后，木糖代谢的大多数基因都转录上调。
实施例5.8052xylR突变株在合成培养基中的发酵
取实施例3步骤3.4中的中断了xylR基因的拜氏梭菌菌株8052xylR在XHP2培养基中发酵，并检测发酵液，具体过程如下：
从CGM平板上挑取单菌接入5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以5%接种量接入95mL6%w/v木糖的XHP2培养基中，培养12hr，使菌浓OD600达到0.5－1.0，以5%接入95ml6%w/v木糖XHP2培养基中培养发酵，取发酵液检测残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agela1200HPLC测定，结果如图4A所示)以及丙酮、丁醇和乙醇含量(使用Agela7890A气相色谱仪测定，结果如图4D所示)、OD600和pH，并以8052作为对照，其中，测定发酵液中的残糖含量和丙酮、丁醇和乙醇含量前需进行如下预处理：
发酵液经离心后分别取上清液测定残糖和丙酮、丁醇、乙醇：
上清液以H2O经20倍稀释后用于残糖测定；取400μL上清液与100μL内标混合均匀测定丙酮、丁醇和乙醇(内标配方为：25g异丁醇，5g异丁酸，50mL37%浓盐酸，加水定容至1L)。
结果显示：在发酵终点72小时，xylR基因经插入失活后，木糖的利用率为76%，在相同的时间野生型只能利用54%的木糖。相应的，8052xylR的生长、丁醇及ABE的生产量都优于野生型(图4)，xylR基因中断后，提高了菌体的木糖利用率。
实施例6.8052xylR突变株的互补
构建互补质粒pIMP1-xylRxylR，连同对照质粒pIMP1-Pptb一起电转8052xylR，经基因型鉴定获得阳性克隆后，发酵考察互补菌株木糖利用及溶剂生产的表型。其中，PCR、酶切、连接转化、菌落PCR方法同实施例2，具体工程实施如下：
6.1构建质粒pIMP1-xylRxylR
以拜氏梭菌NCIMB8052基因组为模板，以xylR-up和xylR-dn为引物扩增出xylR片段。使用PstI和Acc65I分别酶切载体pIMP1-Pptb和xylR片段，二者连接、转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
6.2质粒pIMP1-xylRxylR和pIMP1-Pptb电转8052xylR
同3.1
6.3菌落的PCR验证
PCR体系、方法、DNA琼脂糖电泳验证同3.2，阳性对照为各自构建正确的质粒，阴性对照为8052xylR菌落。
6.3.1拜氏梭菌8052xylR(pIMP1-Pptb)的鉴定
引物为dpIMP1-Pptb-up和dpIMP1-rev；获得的阳性菌落简称为8052xylR-P。
6.3.2拜氏梭菌8052xylR(pIMP1-xylRxylR)的鉴定
引物为dpIMP1-fw和dxylR-dn；获得的阳性菌落简称为8052xylR-X。
6.4互补菌株的发酵
同实施例5
结果如表3所示，互补菌株8052xylR-X在木糖消耗、丁醇和ABE溶剂生产等指标均回复到野生型水平，说明8052xylR木糖利用提高的表型是由于xylR基因的中断造成的。
表3：基因xylR（cbei2385）在菌株8052xylR中的互补
Figure BDA00003104371200281
a8052WT:C.beijerinckii NCIMB8052野生型菌株;8052xylR:xylR中断的菌株;8052xylR-P:xylR中断的菌株，携带有空白质粒对照pIMP1-Pptb;8052xylR-X:xylR中断的菌株，携带有pIMP1-xylRxylR。在含60克D-木糖/升的XHP2培养基中进行发酵。96小时后取样。发酵设三个平行。
实施例7.确定cbei0109为木糖转运蛋白的候选基因
将8052基因组中14个注释为糖转运蛋白的氨基酸序列与一个在824中被鉴定为木糖转运蛋白的氨基酸序列进行同源比对（BioEdit软件完成），结果如表4所示，cbei0109与已知蛋白的氨基酸序列相似性最高，为37%，故将之确定为木糖转运蛋白的候选基因。
Figure BDA00003104371200291
实施例8.在8052中敲除和过表达基因cbei0109
构建敲除质粒pWJ1-xylT和过表达质粒pIMP1-xylTthl，电转8052后获得阳性克隆并发酵考察木糖利用表型。具体实施过程如下：
8.1构建敲除质粒pWJ1-xylT
方法同实施例2，只是构建时使用的引物不同，分别是：xylT852|853s–IBS,xylT852|853s–EBS1d和xylT852|853s–EBS2。
8.2构建过表达质粒pIMP1-xylTthl
以拜氏梭菌NCIMB8052基因组为模板，以xylT-up和xylT-dn为引物扩增出基因cbei0109的片段。使用SalI和Acc65I分别酶切载体pIMP1-Pthl和cbei0109片段，二者连接、转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
8.3质粒pWJ1-xylT和pIMP1-xylTthl电转8052
同3.1
8.4菌落的PCR验证
PCR体系、方法、DNA琼脂糖电泳验证同3.2，阳性对照各自构建正确的质粒，阴性对照为8052菌落。
8.4.1拜氏梭菌8052(pWJ1-xylT)的鉴定
引物为xylT_579-596和xylT_1006-1023；获得的阳性菌落简称为8052xylT。
8.4.2拜氏梭菌8052(pIMP1-xylTthl)的鉴定
引物为dpIMP1-Pthl-up和dxylT-dn；获得的阳性菌落简称为8052-xylTthl。
8.5工程菌株在合成培养基中的发酵
同实施例5
和野生型相比，过表达基因cbei0109导致该基因的转录量提高。如图5所示，野生型里敲除基因cbei0109导致木糖利用率降低45%，过表达基因cbei0109导致木糖利用率提高33%。如表5所示，在野生型过表达基因cbei0109导致木糖消耗量提高32％，同时丁醇和总溶剂的产量也有相应的提高，分别比野生型高44％和53％，说明基因cbei0109是主要负责8052木糖转运的蛋白，下文中命名为xylT。
表5：菌株8052WT和8052xylTthl在6％XHP2发酵96小时的发酵参数
Figure BDA00003104371200311
实施例9.质粒pIMP1-xylT ptb 的构建
9.1质粒pIMP1-xylTptb的构建
以拜氏梭菌NCIMB8052基因组为模板，以xylT-up和xylT-dn为引物扩增出基因cbei0109的片段。使用SalI和Acc65I分别酶切cbei0109片段，分别与同样双酶切的pIMP1-Pptb连接，转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
实施例10.拜氏梭菌8052xylR(pIMP1-xylT ptb )、和8052xylR(pIMP1-xylT thl ) 突变株的构建与检测
将实施例8、9中构建正确的pIMP1-xylTptb和pIMP1-xylTthl电转进入8052xylR，具体过程如下：
10.1各质粒的电转
方法同3.1
10.2各个工程菌的菌落PCR验证
PCR体系、方法、DNA琼脂糖电泳验证同3.2，阳性对照为各自构建正确的质粒，阴性对照为8052xylR。
10.2.1拜氏梭菌8052xylR(pIMP1-xylTptb)的鉴定
引物为dpIMP1-Pptb-up和dxylT-dn；获得的阳性菌落简称为8052xylR-xylTptb。
10.2.2拜氏梭菌8052xylR(pIMP1-xylTthl)的鉴定
引物为dpIMP1-Pthl-up和dxylT-dn；获得的阳性菌落简称为8052xylR-xylTthl。
上述构建所得的8052xylR(pIMP1-xylT ptb )已于2012年2月15日保藏于中国 典型培养物保藏中心（武汉市武昌珞珈山，邮编：430072），保藏号为CCTCC NO：M2012014。
实施例11.拜氏梭菌8052、8052xylR、8052xylR(pIMP1-xylT ptb )和 8052xylR(pIMP1-xylT thl )在合成培养基中的发酵
方法同实施例5。
结果如图6所示，以不同启动子强度携带基因xylT过表达在8052xylR中，ptb启动子携带xylT过表达的工程菌和8052xylR相比木糖利用有明显提高，提高了23%，thl启动子携带xylT过表达和8052xylR相比，木糖利用提高1.7g/L。即菌株8052xylR-xylTptb是目前在合成培养基中木糖利用率最高的菌株。
实施例12.定量PCR检测8052xylR、8052xylR-xylT ptb 和8052xylR-xylT thl 中 xylT的转录
从CGM平板上挑取单菌接入含有10μg/ml红霉素的5mLCGM液体培养基中，过夜培养至OD600＝0.8～1.0，以5%接种量接入95mL6%w/v木糖的XHP2培养基中，培养12hr，使菌浓OD600达到0.5-1.0，接25ml入475mlXHP2(以6%w/v木糖为碳源)培养基中培养发酵，并以8052xylR作为对照，当OD600=0.6和2.5时，4℃，6000rpm，10min离心收集250ml菌体并用液氮速冻。细胞RNA的提取和cDNA的制备同文献[11]。
每20μl实时PCR反应体系包括：10μl iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)，200nM引物，1μl cDNA模板。实时PCR在实时PCR检测仪(Bio-Rad)中进行，PCR程序为：95℃3min；95℃20s，55℃20s，72℃20s，40个循环；65-95°C进行溶解曲线分析。所有样品都进行了三次平行实验，取平均值进行分析。为了计算相对表达水平，cDNA稀释了200倍进行分析，参见文献[12]。采用16S作为内参基因，引物为r16S–up和r16S–dn。实时PCR的xylT引物为rxylT-up和rxylT-dn。
结果如表6所示，和对照8052xylR相比，xylT在8052xylR-xylTptb中产酸期、产溶剂期转录都有上调，表达策略成功。
表6：菌株8052xylR-xylT thl 和8052xlyR-xylTptb中xylT转录倍数变化（以菌株8052xylR为对照）
Figure BDA00003104371200331
a产酸期和产溶剂期获取的OD600分别为0.6和2.5左右。使用16S rRNA（cbeir0001）作为内参基因。在含60g/L木糖的XHP2培养基中进行发酵。
实施例13.拜氏梭菌8052和8052xylR(pIMP1-xylT ptb )在的木糖母液发酵
从CGM平板上挑取单菌接入含有10μg/ml红霉素的5mLCGM液体培养基中，过夜培养至OD600＝0.8～1.0，以5%接种量接入95mL6%w/v木糖的XHP2培养基中，培养12hr，使菌浓OD600达到0.5-1.0，将5ml培养液接入95mlXHP2(以5.5%w/v木糖母液为碳源)培养基中培养发酵，并以8052作为对照，取样测定残糖含量；丙酮、丁醇和乙醇含量；OD600和pH。方法同实施例5。
如图7所示，8052xylR-xylTptb在61小时内能较为彻底地利用木糖母液中的各种糖分，体现出生长优势并最终在61小时内生产16.91g/L的ABE，溶剂得率为0.31g/g，均比野生型高35%。
实施例二
本实施例所用术语、材料和方法如下所述：
菌株拜氏梭菌：Clostridium beijerinckii NCIMB8052，购于NCIMB公司。
菌株拜氏梭菌中的xylR和araR基因是现有技术已知的，其在NCBI核酸数据库中基因组内的序号分别是：cbei2385和cbei4456。
“8052xylR”是指基于拜氏梭菌NCIMB8052构建的、xylR基因表达受抑制甚至不表达的菌株。
“8052xylRaraR”是指基于拜氏梭菌8052xylR构建的、xylR基因和araR基因的表达同时受抑制甚至不表达的菌株。
“重组敲除质粒载体pWJ1-xylR”是指用于敲除基因xylR的重组质粒载体，其中，使用的xylR-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBS1d位点碱基经修改后，用于敲除xylR基因的片段，该片段属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，其中包含ltrA基因。
“重组敲除质粒载体pWJ1-araR”是指用于敲除基因araR的重组质粒载体，其中，使用的araR-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBS1d位点碱基经修改后，用于敲除araR基因的片段，该片段属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，其中包含ltrA基因。
质粒pWJ1为大肠杆菌和拜氏梭菌的穿梭质粒(将来源于丁酸梭菌DSM10702的复制子pCB102替换掉pSY6的复制子pIM13)，在拜氏梭菌中表达红霉素抗性基因，该质粒的全部序列见SEQ ID NO.：1。本领域的普通技术人员可以使用常规方法构建所述质粒，并对所述质粒金子能够分子生物学操作。
本发明使用的PCR纯化和DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自华舜生物制品有限公司，TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)Kit购自Sigma-Aldrich公司，基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。
CGM培养基配方如下(Joseph W.Roos等，Biotechnology and Bioengineering,P681-694,Vol557,1985)：2g(NH4)2SO4，1g K2HPO4·3H2O，0.5g KH2PO4，0.1gMgSO4·7H2O，0.015g FeSO4·7H2O，0.01g CaCl2，0.01g MnSO4·H2O，0.002gCoCl2，0.002g ZnSO4，2g胰蛋白胨，1g酵母提取物(Yeast Extraction)，50g葡萄糖，2%琼脂溶于1L水中。
E-JL培养基(每升)的配制方法如下：
溶液1：11.13g D-葡萄糖：19.51g D-木糖：8.94g L-阿拉伯糖，加H2O定溶至850mL；
溶液2：(NH4)2SO42g，Na2SO45.24g，NaAC2.89g，加H2O定溶至100mL；
溶液3：2.0g MgSO4·7H2O，0.1g MnSO4·H2O，0.1g NaCl，0.1g FeSO4·7H2O；
试剂4：5g CaCO3。
溶液1、溶液2和试剂4高温湿热灭菌，溶液3过滤除菌，溶液1和溶液2冷却后混合均匀，再加入10mL溶液3，与试剂4混匀后放厌氧箱脱氧。
ETM缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4，10mM MgCl2。
ET缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4。
本发明使用的限制性内切酶，Taq DNA聚合酶和T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司，KOD plus DNA聚合酶购自Toyobo公司。
其它常规试剂均为国产或进口分装。
表1提供了本申请所需的菌株及质粒的信息。
表1
a xylR,木糖代谢的转录调节子;araR,阿拉伯糖代谢的转录调节子;ltrA,LtrA蛋白,反向剪切所需。
下表提供了本申请所用的引物。
Figure BDA00003104371200352
Figure BDA00003104371200361
Figure BDA00003104371200371
实施例概述
通过PCR方法，扩增用于中断xylR基因和araR基因的targetron片断，然后经双酶切、与经同样酶切的pWJ1载体连接，得到质粒pWJ1-xylR和pWJ1-araR，电转化拜氏梭菌NCIMB8052和拜氏梭菌8052xylR，然后经梭菌质粒PCR鉴定出有内含子插入到基因组中的重组菌，经发酵验证确定重组菌在混合糖中木糖、阿拉伯糖消耗率提高，具体如下述实施例所示。
实施例1
构建pWJ1-xylR质粒载体
通过PCR扩增xylR targetron片断，然后使用XhoI和BsrG I进行双酶切，并与同样经XhoI和BsrGI酶切的pWJ1载体连接，得到中断质粒pWJ1-xylR，其中，PCR扩增xylRtargetron的模板及引物设计方法来源于Sigma-Aldrich公司的TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒，具体步骤如下：
1.1PCR扩增引物
参考TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒提供的方法，分别设计引物xylR787|788s–IBS、xylR787|788s–EBS1d和xylR787|788s–EBS2，用于构建pWJ1-xylR质粒载体。PCR扩增需要的EBS通用引物(EBS universal)由TargetronTMGene Knockout System(TA0100)试剂盒自带。
1.2PCR扩增
使用Sigma-Aldrich的TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃30s,94℃30s、55℃30s、72℃30s30个循环，72℃2min，4℃保存)，扩增需要的模板和试剂由试剂盒提供，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收350bp处的条带。
1.3构建pWJ1-xylR重组质粒载体
使用Xho I及BsrGI分别酶切载体pWJ1和xylR-targetron片段，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收酶切后产物。
将酶切后的xylR-targetron片段与酶切后的载体片段使用T4DNA连接酶连接，该连接反应在16℃水浴锅中进行10hr，将获得的连接产物以CaCl2热休克法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：42℃热击90sec，然后添加4℃LB液体培养基复苏1hr，然后将细胞以4500rpm离心5min，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上培养16-18hr。
对获得的菌落进行菌落PCR(反应试剂由Sigma-Aldrich的TargetronTM GeneKnockout System(TA0100)试剂盒提供、条件：95℃5min,94℃30s、55℃30s、72℃30s30个循环，72℃2min，4℃保存)，以检测350bp的targetron片段是否连接入pWJ1载体中，PCR扩增引物为IBS和EBS1d。
PCR检测结果(图1)显示，菌落PCR可以扩增出350bp特异性条带。
随即挑取PCR阳性的菌落以LB液体培养基扩培，提取质粒。然后以dpIMP1-fw作为引物，提取的质粒作为模板进行测序，结果表明，targetron片段确已连接入pWJ1载体，得到构建成功的pWJ1-xylR重组质粒载体。
实施例2
拜氏梭菌xylR突变株的构建、检测与敲除质粒的丢失
将pWJ1-xylR质粒电转拜氏梭菌NCIMB8052，复苏过夜后，取200μl细胞液涂布于加有10μg/mL红霉素的CGM平板上，在厌氧箱内37℃培养48-72小时后，挑取单菌进行菌落PCR验证，具体过程如下：
2.1pWJ1-xylR质粒电转入拜氏梭菌8052
将拜氏梭菌NCIMB8052于CGM培养基平板上划线培养48hr后，挑取单菌落接入5mL CGM液体培养基中培养16hr，再按1%接种量接入50mL CGM液体培养基中培养，当培养菌体的OD600达到0.6-0.7之间时取出培养菌，用于制备电转感受态细胞。取30mL菌液，于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入30mL4℃的ETM缓冲液悬浮，再于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入1mL4℃的ET缓冲液，获得悬浮菌液。
取上述悬浮菌液190μL，加入10μL(约1～3μg)pWJ1-xylR质粒(冰上操作)，混匀后转入电转杯中(2mm直径)，使用Bio-Rad MicroPulserTM电转仪电转，电压1.8kV，其余参考使用手册，电击后迅速加入常温的CGM培养基1mL，于37℃培养8hr后，取200μL细胞液涂布于加有10μg/mL红霉素的CGM平板上，于厌氧箱内37℃培养约2～3天。
2.2菌落的PCR验证
pWJ1-xylR质粒转化入拜氏梭菌NCIMB8052中后，可能会将二类内含子的部分序列插入到基因组的xylR基因中，是否有内含子插入可以使用插入位点上下游的引物，通过菌落PCR加以验证(未插入内含子的野生型菌将扩增出400bp的条带，插入有内含子的重组菌株将扩增出的条带为1.3Kb条带)，因此，随机挑取两个转化子进行验证，其中，以拜氏梭菌NCIMB8052基因组为阴性对照，具体过程如下：
PCR反应使用的引物为xylR_569-588和xylR_918-937；
PCR反应体系：体系100μl；10×Taq Buffer10μl；dNTP(2mM)10μl；MgCl2(25mM)10μl；Taq酶1μl；正向引物(100mM)2μl；反向引物(100mM)2μl；菌落(牙签占取微量)；水65μl。
PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃5min。
将PCR反应获得的产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。
根据图1的结果，得到的两个转化子均为插入了内含子的突变体。
2.38052/pWJ1-xylR敲除质粒的丢失
将3μl生长至对数生长期的转化子分别转接至5ml CGM无抗和含有红霉素(20μg/ml)的试管中，12～15小时转接一次，直至抗性试管不再生长为止，此过程需约2天，将此时对应的无抗试管菌液涂板，菌落PCR、测序验证保证内含子的插入，将丢失敲除质粒的突变株命名为8052xylR，用于后续的代谢工程改造。
实施例3
构建pWJ1-araR质粒载体
构建方法同实施例1，只是构建时使用的引物不同，分别是：araR540|541s–IBS,araR540|541s–EBS1d和araR540|541s–EBS2。
实施例4
拜氏梭菌xylRaraR突变株的构建、检测与敲除质粒的丢失
方法同实施例2，只是电转化的宿主是8052xylR，质粒是pWJ1-araR，鉴定的引物是araR_N159和araR_C983，根据图2的结果，得到的四个转化子均为插入了内含子的突变体。
实施例5
拜氏梭菌xylR、拜氏梭菌xylRaraR在E-JL中的发酵
从CGM平板上挑取单菌接入5mlCGM液体培养基中，培养至对数期，转接1ml接入9ml E-JL培养基中培养发酵，取发酵液检测残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agela1200HPLC测定)和以及丙酮、丁醇和乙醇含量(使用Agela7890A气相色谱仪测定)，其中测定发酵液中的残糖含量前需进行如下预处理：发酵液经离心后，分别取上清液，以H2O经20倍稀释后用于残糖测定。测定溶剂时，取400μL上清液与100μL内标混合均匀测定丙酮、丁醇和乙醇(内标配方为：25g异丁醇，5g异丁酸，50mL37%浓盐酸，加水定容至1L)。
结果如下表所示。
Figure BDA00003104371200401
Figure BDA00003104371200411
根据表3的结果，8052xylR突变菌株的阿拉伯糖消耗率、生产效率、转化率均高于野生菌株，而8052xylRaraR在8052xylR的基础上阿拉伯糖消耗率、生产效率、转化率进一步提高。
因此，xylR基因经二类内含子插入失活后和araR基因经二类内含子插入失活后的菌株利用混合糖中阿拉伯糖的能力显著提高，同时转化生成的ABE浓度相应提高。
实施例6
重复实施例1和2，所不同的是将xylR基因替换为araR基因，按照实施例5的方法进行发酵检测。
结果表明，单独失活araR基因的突变菌株的阿拉伯糖消耗率、生产效率、转化率均高于野生菌株。
实施例三
本实施例所用术语、材料和方法如下所述：
菌株拜氏梭菌：Clostridium beijerinckii NCIMB8052，购于NCIMB公司。
菌株拜氏梭菌中的xylR和araR基因是现有技术已知的，其在NCBI核酸数据库中基因组内的序号分别是：cbei2385和cbei4456。
“8052xylR”是指基于拜氏梭菌NCIMB8052构建的、xylR基因表达受抑制甚至不表达的菌株。
“8052xylRaraR”是指基于拜氏梭菌8052xylR构建的、xylR基因和araR基因的表达同时受抑制甚至不表达的菌株。
“重组敲除质粒载体pWJ1-xylR”是指用于敲除基因xylR的重组质粒载体，其中，使用的xylR-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBS1d位点碱基经修改后，用于敲除xylR基因的片段，该片段属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，其中包含ltrA基因。
“重组敲除质粒载体pWJ1-araR”是指用于敲除基因araR的重组质粒载体，其中，使用的araR-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBS1d位点碱基经修改后，用于敲除araR基因的片段，该片段属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，其中包含ltrA基因。
质粒pWJ1为大肠杆菌和拜氏梭菌的穿梭质粒(将来源于丁酸梭菌DSM10702的复制子pCB102替换掉pSY6的复制子pIM13)，在拜氏梭菌中表达红霉素抗性基因，该质粒的全部序列见SEQ ID NO.：1。本领域的普通技术人员可以使用常规方法构建所述质粒，并对所述质粒金子能够分子生物学操作。
本发明使用的PCR纯化和DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自华舜生物制品有限公司，TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)Kit购自Sigma-Aldrich公司，基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。
CGM培养基配方如下(Joseph W.Roos等，Biotechnology and Bioengineering,P681-694,Vol557,1985)：2g(NH4)2SO4，1g K2HPO4·3H2O，0.5g KH2PO4，0.1gMgSO4·7H2O，0.015g FeSO4·7H2O，0.01g CaCl2，0.01g MnSO4·H2O，0.002gCoCl2，0.002g ZnSO4，2g胰蛋白胨，1g酵母提取物(Yeast Extraction)，50g葡萄糖，2%琼脂溶于1L水中。
E-JL培养基(每升)的配制方法如下：
溶液1：11.13g D-葡萄糖：19.51g D-木糖：8.94g L-阿拉伯糖，加H2O定溶至850mL；
溶液2：(NH4)2SO42g，Na2SO45.24g，NaAC2.89g，加H2O定溶至100mL；
溶液3：2.0g MgSO4·7H2O，0.1g MnSO4·H2O，0.1g NaCl，0.1g FeSO4·7H2O；
试剂4：5g CaCO3。
溶液1、溶液2和试剂4高温湿热灭菌，溶液3过滤除菌，溶液1和溶液2冷却后混合均匀，再加入10mL溶液3，与试剂4混匀后放厌氧箱脱氧。
ETM缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4，10mM MgCl2。
ET缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4。
A-JL发酵培养基配方如下：
培养基 A-JL-Glucose A-JL-GXA
总糖 60g/L(葡萄糖) 60g/L混糖(Glu:Xyl:Ara=23.06:15.08:1.85)
(NH4)2SO4 2g/L 2g/L
MgSO4.7H2O 0.2g/L 0.2g/L
MnSO4.H2O 0.01g/L 0.01g/L
NaCl 0.01g/L 0.01g/L
FeSO4.7H2O 0.01g/L 0.01g/L
CaCO3 5.0g/L 5.0g/L
乙酸钾 3.12g/L 3.12g/L
无水硫酸钠 3.85g/L 3.85g/L
本发明使用的限制性内切酶，Taq DNA聚合酶和T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司，KOD plus DNA聚合酶购自Toyobo公司。
其它常规试剂均为国产或进口分装。
表1提供了本申请所需的菌株及质粒的信息。
表1
Figure BDA00003104371200431
a xylR,木糖代谢的转录调节子;araR,阿拉伯糖代谢的转录调节子。
下表提供了本申请所用的引物。
Figure BDA00003104371200441
实施例概述
通过PCR方法，扩增araR基因的targetron片断，然后经双酶切、与经同样酶切的pWJ1载体连接，得到质粒pWJ1-araR，电转化拜氏梭菌8052::xylR/pIMP1-xylTptb，然后经梭菌质粒PCR鉴定出有内含子插入到基因组中的重组菌。进行NCIMB80528052/pIMP1-Pptb,8052xylR/pIMP1-xylTptb,8052xylRaraR/pIMP1-xylTptbR的4株转化子发酵比较试验。具体如下述实施例所示。
1．构建pWJ1-araR质粒载体
通过PCR扩增araR targetron片断，然后使用XhoI和BsrG I进行双酶切，并与同样经XhoI和BsrG I酶切的pWJ1载体连接，得到中断质粒pWJ1-araR，其中，PCR扩增araR targetron的模板及引物设计方法来源于Sigma-Aldrich公司的
TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒，具体步骤如下：
1.1PCR扩增引物
参考TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒提供的方法，分别设计引物araR-540|541s-IBS、araR-540|541s-EBS1d和araR-540|541s-EBS2，用于构建pWJ1-araR质粒载体。PCR扩增需要的EBS通用引物(EBS universal)由TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒自带。araR基因序列如SEQ IDNO:54所示：
araR Targetron引物:
araR-540|541s-IBS primer:
AAAACTCGAGATAATTATCCTTAAATTCCGCATATGTGCGCCCAGATAGGGTG（SEQ ID NO:55）
araR-540|541s-EBS1d primer:
CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCGCATATATTAACTTACCTTTCTTTGT（SEQ ID NO:56）
araR-540|541s-EBS2primer:
TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTGAATTCCGATAGAGGAAAGTGTCT（SEQID NO:57）
EBS universal primer:CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAAAC（SEQ IDNO:58）
1.2PCR扩增
使用Sigma-Aldrich的TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒进
行PCR扩增(PCR反应条件：9430s,9430s℃℃、5530s℃、7230s30℃个循环，722min℃，4℃保存)，扩增需要的模板和试剂由试剂盒提供，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用Axygen公司的胶回收试剂盒纯化回收350bp处的条带。结果见图11。
1.3构建pWJ1-araR重组质粒载体
使用Xho I及BsrGI分别酶切载体pWJ1和araR-targetron片段，然后使用Axygen公司的胶回收试剂盒纯化回收酶切后产物。将酶切后的araR-targetron片段与酶切后的载体片段使用T4DNA连接酶连接，该连接反应在16℃水浴锅中进行10hr，将获得的连接产物以CaCl2热休克法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：42℃热击90sec，然后添加4LB℃液体培养基复苏1hr，然后将细胞以4500rpm离心5min，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上培养16-18hr。
对获得的菌落进行菌落PCR(反应试剂由Sigma-Aldrich的TargetronTM GeneKnockout System(TA0100)试剂盒提供、条件：955min,94℃30s℃、5530s℃、7230s30℃个循环，722min℃，4℃保存)，以检测350bp的targetron片段是否连接入pWJ1载体中，PCR扩增引物为IBS和EBS1d。结果见图12。
PCR检测结果显示，菌落PCR可以扩增出350bp特异性条带。随即挑取PCR呈阳性的菌落以LB液体培养基扩培，提取质粒。然后，以dpIMP1-fw作为引物，提取的质粒作为模板进行测序，结果如预期：targetron片段确已连接入pWJ1载体)。
2．拜氏梭菌araR突变株的构建、检测与敲除质粒的丢失
将pWJ1-araR质粒电转拜氏梭菌8052xylR/pIMP1-xylTptb(即MM1643)，复苏过夜后，取200μl细胞液涂布于加有10μg/mL红霉素的CGM平板上，在厌氧箱内37℃培养48-72小时后，挑取单菌进行菌落PCR验证，具体过程如下：
2.1pWJ1-araR质粒电转入拜氏梭菌8052
将拜氏梭菌8052xylR/pIMP1-xylTptb于CGM培养基平板上划线培养48hr后，挑取单菌落接入5mL CGM液体培养基中培养16hr，再按1%接种量接入50mLCGM液体培养基中培养，当培养菌体的OD600达到0.6-0.7之间时取出培养菌，用于制备电转感受态细胞。取30mL菌液，于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入30mL4℃的ETM缓冲液悬浮，再于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入1mL4℃的ET缓冲液，获得悬浮菌液。取上述悬浮菌液190μL，加入10μL(约1～3μg)pWJ1-araR质粒(冰上操作)，混匀后转入电转杯中(2mm直径)，使用Bio-RadMicroPulserTM电转仪电转，电压201.8kV，其余参考使用手册，电击后迅速加入常温的CGM培养基1mL，于37℃培养8hr后，取200μL细胞液涂布于加有10μg/mL红霉素的CGM平板上，于厌氧箱内37℃培养约2～3天。
2.2菌落的PCR验证
pWJ1-araR质粒转化入拜氏梭菌8052xylR/pIMP1-xylTptb中后，可能会将二类内含子的部分序列插入到基因组的araR基因中，是否有内含子插入可以使用插入位点上下游的引物，通过菌落PCR加以验证(未插入内含子的野生型菌将扩增出825bp的条带，插入有内含子的重组菌株将扩增出的条带为1.8Kb条带)，因此，随机挑取两个转化子进行验证，其中，以拜氏梭菌NCIMB8052基因组为阴性对照，具体过程如下：
PCR反应使用的引物为araR-N159和araR-C983；
araR-N159:TTTAGTACAAGAAGGCTGGAT（SEQ ID NO:59）
araR-C983:CATTTGGCTGCTCTTATTCC（SEQ ID NO:60）
PCR反应体系：体系100μl；10×Taq Buffer10μl；dNTP(2mM)10μl；MgCl2(25mM)10μl；Taq酶1μl；正向引物（100mM）2μl；反向引物(100mM)2μl；菌落（牙签占取微量）；水65μl。
PCR反应条件：955min℃；9530s℃，5530s℃，721.5min℃，30个循环；725min℃。
将PCR反应获得的产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图13所示。根据图13的结果，得到的7个转化子均为插入了内含子的突变体。
2.3测序验证阳性转化子
随机挑取步骤2.2中对应于图2中的阳性转化子，以加有10μg/mL红霉素的CGM液体培养基培养后，抽提基因组。以抽提的基因组为模板，以araR-N159和araR-C983为引物对进行PCR扩增，回收扩增获得的1.8kb DNA条带并测序。测序结果显示，该序列的位点的381-1295DNA为插入的内含子序列，即内含子序列精确地插入到预计的540|541位点之间。
2.48052xylRaraR/pIMP1-xylTptb/pWJ1-araR敲除质粒pWJ1-araR的丢失
将3μl生长至对数生长期的转化子分别转接至5ml CGM无抗和含有红霉素(20μg/ml)的试管中，12～15小时转接一次，直至抗性试管不再生长为止，此过程需约2天，将此时对应的无抗试管菌液涂板，菌落PCR、测序验证(同2.2、2.3)保证内含子的插入，将丢失敲除质粒的突变株命名为8052xylRaraR/pIMP1-xylTptb（即CIBTS0795），用于后续的代谢工程改造。
3.NCIMB8052,8052/pIMP1-Pptb,8052xylR/pIMP1-xylTptb(MM1643),8052xylRaraR/pIMP1-xylTptb(CIBTS0795)的发酵比较试验
对菌株8052/pIMP1-Pptb，NCIMB8052，8052xylR/pIMP1-xylTptb(MM1643)，8052xylRaraR/pIMP1-xylTptb(CIBTS0795)分别划单菌，每株挑取3个单菌至0.8毫升CGM培养基试管培养过夜后，加2毫升CGM培养基，3-6小时后，OD0.6-1接种10%到发酵培养基A-JL中，进行48小时发酵。发酵结果经过液相色谱分析得到如下数据：
0小时培养基各组分含量（克/升）
培养基 g x a 总糖
A-JL-Clucose 61.3 0 0 61.3
A-JL-GXA 35.2 22.9 2.7 60.9
48小时分析结果
Figure BDA00003104371200481
Figure BDA00003104371200491
从上表可得出结论，8052xylRaraR/pIMP1-xylT较8052xylR/pIMP1-xylT能显著改善混糖培养基中阿拉伯糖的利用。
综上所述，本发明提供的方法，中断了拜氏梭菌中xylR基因的表达和/或增加木糖转运蛋白的活力，本发明提供的菌株中，xylR基因经二类内含子插入失活和/或xylT基因过量后的菌株利用木糖的能力显著提高，同时转化生成的ABE浓度相应提高，在木质纤维素水解液发酵中也有类似的表型，因此该菌株有利用木质纤维素水解液进行丙酮丁醇发酵的应用前景。
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Figure IDA00003104372100011
Figure IDA00003104372100021
Figure IDA00003104372100031
Figure IDA00003104372100041
Figure IDA00003104372100061
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Figure IDA00003104372100251
Figure IDA00003104372100261

Claims (24)

1.一种重组拜氏梭菌，其与野生型拜氏梭菌相比，xylR基因表达和/或xylR蛋白的活性被抑制，arar基因表达和/或arar蛋白的活性被抑制，和/或木糖转运蛋白的活力和/或其编码基因的表达提高。
2.如权利要求1所述的重组拜氏梭菌，其特征在于，所述重组拜氏羧菌通过选自下组一种或多种的基因工程化处理获得的：在拜氏梭菌基因组的xylR基因中插入外源DNA片段、通过同源重组敲除全部或部分所述xylR基因、和采用反义核酸技术抑制xylR基因的表达；在拜氏梭菌基因组的araR基因中插入外源DNA片段、通过同源重组敲除全部或部分所述araR基因、和采用反义核酸技术抑制araR基因的表达；在拜氏梭菌基因组中导入额外的木糖转运蛋白、引入提高木糖转运蛋白的表达或活力的突变、或提供表达木糖转运蛋白的表达载体。
3.如权利要求2所述的重组拜氏羧菌，其特征在于，所述拜氏梭菌基因组中xylR基因第1位到第798位碱基之间插入外源DNA片段。
4.如权利要求3所述的重组拜氏梭菌，其特征在于，所述xylR基因的第1位到第171位碱基之间插入了外源DNA片段，或在所述xylR基因的第240和第798位之间插入了外源DNA片段。
5.如权利要求3所述的重组拜氏梭菌，其特征在于，在所述xylR基因的第787和第788位之间插入了外源DNA片段。
6.如权利要求2所述的重组拜氏梭菌，其特征在于，在所述拜氏梭菌基因组中araR基因第1位到第1074位碱基之间插入外源DNA片段。
7.如权利要求6所述的重组拜氏梭菌，其特征在于，所述araR基因的第15位到第219位碱基之间插入了外源DNA片段，或在所述araR基因的第252和第1005位之间插入了外源DNA片段。
8.如权利要求2所述的重组拜氏羧菌，其特征在于，所述拜氏梭菌导入了过表达木糖转运蛋白的重组质粒载体。
9.如权利要求8所述的重组拜氏梭菌，其特征在于，所述过表达重组质粒载体含有来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824ptb基因的启动子和拜氏梭菌NCIMB8052xylT基因，或含有来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824thl基因的启动子和拜氏梭菌NCIMB8052xylT基因。
10.保藏号为CCTCC NO：M2012014的重组拜氏梭菌。
11.一种方法，所述方法选自下组的一种或多种：
(1)提高拜氏梭菌发酵中木糖和/或阿拉伯糖的消耗率和/或利用率；
(2)提高拜氏梭菌产生溶剂的能力；
(3)提高拜氏梭菌发酵生产溶剂的效率；
其特征在于，包括步骤：抑制拜氏梭菌xylR蛋白的活性和/或其编码基因的表达，抑制拜氏梭菌araR蛋白的活性和/或其编码基因的表达，和/或提高木糖转运蛋白的活力和/或其编码基因的表达。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，通过选自下组的方式抑制拜氏梭菌xylR基因表达：在所述拜氏梭菌基因组的xylR基因中插入外源DNA片段、通过同源重组敲除全部或部分所述xylR基因、和采用反义核酸技术抑制xylR基因的表达；通过选自下组的方式抑制拜氏梭菌araR基因表达：在所述拜氏梭菌基因组的araR基因中插入外源DNA片段、通过同源重组敲除全部或部分所述araR基因、和采用反义核酸技术抑制araR基因的表达；通过选自下组的方式提高拜氏羧菌木糖转运蛋白的表达：在拜氏梭菌基因组中导入额外的木糖转运蛋白、引入提高木糖转运蛋白的表达或活力的突变、和提供表达木糖转运蛋白的表达载体。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，通过以下方式抑制拜氏梭菌xylR基因表达：在所述拜氏梭菌基因组中xylR基因第1位到第798位碱基之间插入外源DNA片段。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在xylR基因第1位到第171位碱基之间插入外源DNA片段，或在第240和第798位之间插入外源DNA片段。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在xylR基因的第787和第788位之间插入外源DNA片段。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，通过以下方式抑制拜氏梭菌araR基因表达：在所述拜氏梭菌基因组中araR基因第1位到第1074位碱基之间插入外源DNA片段。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在所述araR基因的第15位到第219位碱基之间插入了外源DNA片段，或在所述araR基因的第252和第1005位之间插入了外源DNA片段。
18.如权利要求12所述的方法，其特征在于，使用过表达重组质粒载体携带木糖转运蛋白基因转入菌种进行表达，实现木糖转运蛋白基因的过表达。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述过表达重组质粒载体含有来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824ptb基因的启动子和拜氏梭菌NCIMB8052xylT基因，或含有来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824thl基因的启动子和拜氏梭菌NCIMB8052xylT基因。
20.采用权利要求11－19中任一项所述的方法制备得到的重组拜氏梭菌。
21.权利要求1-10和20中任一项所述拜氏梭菌的用途，其特征在于，它被用于生产有机溶剂；较佳地，所述的溶剂选自下组：乙醇，丙酮，丁醇，或其组合。
22.一种生产有机溶剂的方法，所述的有机溶剂为：乙醇，丙酮，丁醇，或其组合，其特征在于，包括步骤：
(A)在适合的条件下，培养权利要求1-10和20中任一项所述的拜氏梭菌，获得含有所述有机溶剂的培养物；和
(B)从所述的培养物中分离和/或纯化所述的有机溶剂。
23.如权利要求22所述方法，其特征在于，所述适合条件包括，使权利要求1－10和20中任一项所述的重组拜氏梭菌与含有木糖和/或阿拉伯糖的物料接触，和在适合所述重组拜氏梭菌发酵的条件下进行发酵。
24.如权利要求23所述的方法，所述包含木糖和/或阿拉伯糖的原料选自：纤维素或半纤维素的水解液、粮食和棉花。
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