CN104334716A - 具有重构转录单元的细菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组细菌及其用途，特别是用于生产乙醇。本发明还涉及用于生产这样的细菌的方法，以及适用于这样的生产的核酸构建体。本发明具体涉及具有重构生物质降解单元的细菌。

Description

具有重构转录单元的细菌及其用途
本发明涉及重组细菌、其制备及其用途。更具体地，本发明涉及具有重构转录单元的细菌及其用于生物质转化和/或生物燃料(特别是乙醇)的生产的用途。本发明还涉及细菌的核酸构建体、混合培养物和组合物，或其分离的提取物，以及生产生物乙醇的方法。 
引言
生物燃料可以通过大量工艺步骤从生物质材料生产，包括生物质降解和发酵，利用例如化学、物理和/或生物学处理和催化剂。通常，生物燃料生产需要预处理生物质以至少部分地水解半纤维素，除去木质素并且使纤维素非晶化，以使纤维素酶可以接近它们的底物。此外，为了有效地将糖类转化为乙醇，微生物应表现出特定性能如高乙醇收率和生产力，对酸、乙醇和抑制剂的高耐受性，并且在简单生长介质中和在野生工艺条件下具有活性。生物燃料如乙醇从木质纤维素生产将具有丰富、多样且低成本原料的进一步优势。然而，这也需要大量的加工以使可利用的糖类通过通常用来生产乙醇的微生物发酵。 
没有天然的微生物，包括细菌或酵母菌，满足全部这些要求。 
自从最近几十年，已经选择和操作微生物以改进其用于生产乙醇的性能。革兰氏阴性菌如大肠杆菌(Escherichia coli)、奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，革兰氏阳性菌如解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)或干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，并且若干酵母菌菌株已被改造用于从纤维素底物进行乙醇生产。特别地，生物合成基因(如PDC或ADH基因)已被克隆入细菌菌株中。而且，竞争性路径已被改变。 
这些微生物仍然显示缺陷。尤其是，潜在乙醇生产微生物如运动发酵单胞菌和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)通常不能水解复合糖如木质纤维 素。运动发酵单胞菌(Z.mobilis)不是很好适合于生物质转化，因为它仅发酵葡萄糖、果糖和蔗糖。而且，它显示对乙酸的极低耐受性。对于酿酒酵母，最佳温度通常为约37℃，这在其中温度可以显著增加的大型工业培养设施中可能不是最佳的。 
遗传改变的革兰氏阳性或土芽孢杆菌(Geobacillus)菌株已被提及(参见WO95/27064和WO2006/131734)。然而。从工业前景来看，对于这些菌株还没有满意的代谢物生产。此外，土芽孢杆菌菌株产生孢子，这对于工业用途来说是显著缺点。 
获得高乙醇收率意味着找到以很少副产物生产乙醇并且代谢所有主要的糖类如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖的菌株。而且，合适的工业过程将要求酶和培养条件相对于pH和温度是相容的。 
异常球菌是由Anderson和合作者在1956年分离的革兰氏阳性菌。这种极端微生物有机体耐受由UV和电离辐射或由交联剂(丝裂霉素C)导致的DNA损害并且耐受失水。WO01/023526显示异常球菌对辐射的不寻常耐受性并且进一步提出它们的改造和在生物修复中的用途。WO2009/063079显示异常球菌属细菌可以抵抗溶剂并且转化生物而生产乙醇。WO2010/130806进一步公开重组异常球菌菌株，其中已插入乙醇生物合成基因。这些重组菌株确实在乙醇生产中表现出改进的性能。 
本发明现在公开改进的细菌的进一步传代，具有更高且显著的生物质降解性质。更具体地，本发明公开了具有改进的生物质降解和生物燃料生产性能的改造的异常球菌或相关细菌。这些细菌已由发明人改造而含有重构的功能转录单元和/或修饰的代谢路径，导致显著改善的生物学性能。有利地，这些细菌已用由发明人分离和表征的特定基因改造，或者由发明人修饰以改善它们的表达，导致生产非GMO、改进的细菌。这些细菌与工业培养条件相容，利用生物质材料，并且已被改造而保持整合基因的适当表达用于最佳乙醇生产。这些细菌、其提取物或包含其的组合物，特别适用用于改性生物质并生产生物燃料。 
发明内容
本发明的目的涉及包含插入在其基因组中的重构生物质降解转录单元(reconstructed biomass degradation transcriptional unit)的异常球菌或相关细菌。更具体地，这些细菌包含重构生物质降解转录单元，其包含在单个启动子控制下的至少2个基因，所述至少2个基因编码独特(distinct)的生物质降解酶。 
在一个优选实施方式中，重构生物质降解转录单元不含有非异常球菌遗传物质，其改善它们的活性并且增加监管认可。 
在本发明的另一个优选实施方式中，所述细菌进一步包重组醇生产转录单元,优选重组乙醇生产转录单元。 
在另一个优选实施方式中，所述细菌含有改变的乙醇竞争性生物合成路径。更具体地，本发明的特定目的在于包含选自以下的失活内源性基因的异常球菌或相关细菌：磷酸乙酰转移酶基因，丙氨酸脱氢酶基因，葡萄糖脱氢酶基因,磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或苹果酸脱氢酶基因。 
本发明的另一个目的涉及包含如上所述的细菌和至少一种其他细菌的组合物。 
本发明的另一个目的涉及包含如上所述的细菌和培养基的组合物。 
本发明的另一个目的涉及如上所述的细菌的酶提取物。 
本发明还涉及包含如上所述的细菌或其提取物的生物催化剂。 
本发明还在于一种用于转化生物质的方法，包括将生物质暴露于如上所述的细菌、或提取物、或组合物。 
本发明的另一个目的是一种用于生产醇，特别是乙醇的方法，包括将糖或生物质暴露于如上所述的细菌、或提取物、或组合物，并且优选地，收集所产生的醇。 
本发明还涉及如上所述的细菌用于生产醇，特别是乙醇的用途。 
本发明还涉及一种用于生产异常球菌或相关细菌,或其原种(又称祖先，ancestor)的方法，所述方法包括： 
a)提供亲本异常球菌或相关细菌； 
b)同时或相继地在单个启动子控制性向所述亲本细菌的基因组中插入至 少2个基因，所述至少2个基因编码不同的生物质降解酶，和 
c)选择表达所述至少2个基因的b)的细菌。 
本发明还涉及一种核酸，其包含选择SEQ ID NO:11,13,16,18,23和24的序列。 
本发明还涉及一种分离的蛋白质，其包含选自SEQ ID NO:12和14的氨基酸序列，或其功能性变体或片段。 
附图说明
图1：用来构建具有重构生物质降解单元的异常球菌的插入步骤的图示。 
图2：重构细胞的淀粉分解活性。 
图3：重构细胞的淀粉酶活性。在含有2L介质的5L摇瓶中两个平行地进行培养。在左图：作为时间的函数的OD600测量结果。在右图：从无细胞上清液(蓝色和红色)和细胞团粒(紫色和绿色)测得的作为时间的函数的Cerα活性。在含有1mM CaCl2的100mM MOPS缓冲液(pH 7.0)中在45℃确定活性。 
图4：野生M23-3A菌株和重构细胞中的α-淀粉酶活性的本土化。通过SDS-PAGE和通过酶谱技术(pH 7.0)分析浓缩(20x)的培养上清(2＝M23-3A,3＝DG_4)、细胞团粒(4＝M23-3A,5＝DG_4)和细胞团粒的Triton X-100提取物(6＝M23-3A,7＝DG_4)。在没有沸腾样品下在非还原性条件下进行SDS-PAGE。 
图5：在全麦3％上培养期间的生物质和葡萄糖定量。 
图6:在全麦3％上培养期间的乙醇和有机酸定量。 
图7:在淀粉乳20％上培养期间的生物质和糖类定量。 
图8:在淀粉乳20％上培养期间的乙醇和有机酸定量。 
具体实施方式
本发明涉及异常球菌或相关细菌及其用于转化生物质和/或生产生物燃料或其他代谢物的用途。 
本发明将通过参考一下定义被最好理解： 
定义
在本发明的内容中，关于酶的术语“来源于细菌”表明该酶已分离自这样的细菌，或者该酶包含分离自或表征自这样的细菌的酶的氨基酸序列的所有或生物学活性部分。术语“来源于异常球菌细菌或相关细菌”进一步包括合成自在异常球菌或相关细菌中鉴别的核酸或氨基酸序列的任何重组、合成和/或任选修饰的酶(例如，化学、酶促、物理地修饰)。 
异常球菌属细菌是指异常球菌属的任何细菌，如但不限于，中度嗜热菌(D.geothermalis),解纤维素异常球菌(D.cellulolysiticus),耐辐射异常球菌(D.radiodurans),解蛋白异常球菌(D.proteolyticus),抗放射异常球菌(D.radiopugnans),嗜放射异常球菌(D.radiophilus),D.grandis,印度异常球菌(D.indicus),产气异常球菌(D.frigens),D.saxicola,马里科帕部落异常球菌(D.maricopensis),大理石异常球菌(D.marmoris),沙漠异常球菌(D.deserti),默氏异常球菌(D.murrayi),空气异常球菌(D.aerius),网文异常球菌(D.aerolatus),嗜气异常球菌(D.aerophilus),雅瑟留异常球菌(D.aetherius),D.alpinitundrae,高地异常球菌(D.altitudinis),D.apachensis,水生异常球菌(D.aquaticus),D.aquatilis,D.aquiradiocola,水活异常球菌(D.aquivivus),淤泥异常球菌(D.caeni),D.claudionis,无花果异常球菌(D.ficus),戈壁异常球菌(D.gobiensis),D.hohokamensis,D.hopiensis,D.misasensis,纳瓦河部落异常球菌(D.navajonensis),D.papagonensis,D.peraridilitoris,D.pimensis,D.piscis,D.radiomollis,玫瑰色异常球菌(D.roseus),D.sonorensis,乌鲁木齐异常球菌(D.wulumuqiensis),D.xibeiensis,新疆异常球菌(D.xinjiangensis),D.yavapaiensis或云微所异常球菌(D.yunweiensis)细菌。优选的异常球菌属细菌是中度嗜热菌(D.geothermalis),解纤维素异常球菌(D.cellulolysiticus),沙漠异常球菌(D.deserti),默氏异常球菌(D.murrayi)和耐辐射异常球菌(D.radiodurans)。 
与异常球菌“相关的”细菌是指这样的细菌，其(i)含有16S rDNA，在使用引物GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA(SEQ ID NO:26)和GGTATCTACGCATTCCACCGCTA(SEQ ID NO:25)扩增后，其产生约158个碱基对的片段和/或(ii)抵抗4mJ/cm2的UV处理。在特别的实施方式中，异常 球菌相关细菌是具有16S rDNA分子的细菌，其在序列上与异常球菌16S rDNA序列至少70％，优选至少80％相同。 
“基因”是指编码蛋白质的任何核酸。术语基因涵盖DNA，如cDNA或gDNA，以及RNA。基因可以首先通过例如重组、酶促和/或化学技术制备，并且随后在宿主细胞或体外系统中复制。基因通常包含编码所需蛋白质的开放读框。基因可以含有另外的序列，如转录终止子、信号肽、IRES、内含子等。优选地，基因不含有内含子。 
“转录单元”在本发明范围内是指一组在一个启动子控制下的至少一种基因。 
关于序列、核酸或细菌中的单元的术语“重构”或“重组”表明该序列、核酸或单元不是天然存在于细菌中并且已经组装和/或插入到所述细菌或其原种中。在重构或重组单元中，序列优选与它们在其中组装或插入的细菌具有相同起源。例如，异常球菌细菌中的重构单元优选基本上包含来源于异常球菌细菌的核酸。 
关于蛋白质或酶的术语“片段”是指它们的任何片段，其包含所述蛋白质的至少约10,15,20,25,40,50或甚至更多个，优选至少60好人连续氨基酸。最优选的片段是功能性的，通过它们本身或当融合至或与另一个多肽结合时。蛋白质的片段还指蛋白质的成熟形式(即，在蛋白质的N-末端不含有信号肽)。 
关于蛋白质或酶的术语“变体”是指任何这样的蛋白质，其与参照蛋白质表现出至少50％氨基酸序列同一性，甚至更优选至少60％,70％,80％或90％的氨基酸序列同一性，并且保留参照蛋白质的活性。序列同一性(同源性)的程度可以使用任何计算机程序和相关参数，包括BLAST 2.2.2或FASTA版本3.0t78，在缺省参数下确定。优选的变体与参照序列具有至少90％的同一性水平，最优选为至少92,95,或97％的同一性水平。在一个优选实施方式中，相比于参照蛋白质，变体至多包含1至50,1至40,1至30,1至25,1至20,1至15,1至10,或1至5个修饰的(例如，缺失的，取代的或插入的)氨基酸残基。如果蛋白质表现出至少20％，优选至少30％并且更优选至少50％的参照蛋白质的酶活性，则它们可以称为变体。 
根据本发明的术语“生物质”通常是指尤其包含纤维素和/或木聚糖的生物质。因此术语生物质包括生物起源的有机材料，包括植物或动物有机材料。生物质可以是未加工的或预处理的。生物质通常是含纤维素或木聚糖的有机植物或动物材料。生物质的实例包括但不限于林业产品，包括不适用于木材或纸张生产的成熟树木、有机废物、农业产品，如草、农作物和动物粪便，以及水产品，如藻类和海草。生物质的实例包括来源于各种类型的植物的木头和植物材料，包括芒(miscanthus),麻(hemp),甜菜(sugarbeet),小麦、玉米,杨木(poplar),柳树(willow),高粱(sorghum),甘蔗(sugarcane),以及各种各样的树物种，范围为桉树至油棕。生物质的来源包括但不限于植物残体、硬木或软木枝干、玉米棒子(cobs)、秸秆、草、树叶、种子、纸张等。(参见例如Sun et al.,Bioresource Technology 83(2002)1–11)。术语生物质还涵盖转化的生物质或二次生物质，其基本上含有水解的预处理生物质产品。 
在本发明的范围内，“改性”生物质包括其任何改性，包括转化、降解、水解、转换和加工。术语“改性”生物质通常涵盖导致可发酵糖产生的生物质的任何改性。改性通常还涵盖生物质的生物聚合物的水解。 
“生物质降解酶”是这样的酶，其参与生物质(或生物质的组分)降解成降解产物。生物质降解酶优选是有助于生物质降解或水解成可发酵糖的酶。这样的酶的实例包括淀粉酶,纤维素酶,阿拉伯呋喃糖酶(如例如，α-L-阿拉伯呋喃糖酶),木聚糖酶,漆酶,α-葡糖苷酸酶和酯酶,如阿魏酸酯酶或乙酰基木聚糖酯酶。 
术语“醇”或“生物醇”更具体地是指包含1至5个碳原子,优选选自1至4个碳原子的直链或支链醇、二醇或三醇。“醇”的具体和优选实例包括选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、丁醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、异丁醇或丙三醇的C1-4醇，更优选乙醇。 
根据本发明的术语“生物燃料”包括但不限于植物油、生物柴油、生物醇、生物气、合成气和固体生物燃料。 
生物质降解转录单元
已证实当被应激破坏时，异常球菌属细菌具有重新装配其全部或部分基因组的能力。异常球菌属细菌从生物质生产生物能产品的能力披露在WO2009/063079。本发明现在证实，这些细菌的性能可以通过改造代谢路径而改善。更具体地，本发明提供具有重构的生物质降解转录单元的新型细菌。本发明证实，这样的单元可以在没有改变细胞生长的情况下插入到异常球菌或相关细菌的基因组中。本发明证实，若干基因从单个启动子的表达是可行的并且允许更好地调控细胞中的酶水平。本发明进一步描述在单个插入位点包含具有5个基因的功能性重构生物质降解单元的细菌，其表现出改进的性能。本发明进一步描述这样的用异常球菌来源的核酸构建的重新改造的细菌，并且其不含有异源性遗传物质。 
这些细菌代表有价值的产品和生物催化剂并且特别适合于以改进的能力改性生物质。 
本发明的生物质降解转录单元是指优选地核酸分子，其包含在单个启动子控制下放置的至少两个不同基因，所述两个不同基因编码两种不同的生物质降解酶。本发明公开了在异常球菌细菌的基因组内的一个单个位置中在独特启动子控制下插入若干基因。这样的构造提供该基因的最佳表达并且不会影响细菌的生长。生物质降解酶可以选自淀粉酶,木聚糖酶,纤维素酶,漆酶,阿拉伯呋喃糖酶,α-葡糖苷酸酶和酯酶。酯酶的优选实例包括但不限于阿魏酸酯酶或乙酰基木聚糖酯酶。阿拉伯呋喃糖酶的具体实例包括，但不限于，α-L-阿拉伯呋喃糖酶。在一个优选实施方式中，生物质降解酶选自淀粉酶,纤维素酶和阿拉伯呋喃糖酶。 
在一个优选实施方式中，所述单元包含在单个启动子控制下的三个基因。本发明这样的单元的具体实例包含： 
-2个不同的淀粉酶基因，或 
-1个淀粉酶基因和1个阿拉伯呋喃糖酶基因，或 
-2个不同的淀粉酶基因和1个阿拉伯呋喃糖酶基因。 
淀粉酶参与多糖，特别是淀粉的水解。淀粉是由通过1-4和1-6糖苷键结合在一起的大量葡萄糖单元构成的碳水化合物。术语“淀粉酶”包括具有α- 淀粉酶,β-淀粉酶,葡糖淀粉酶,α-葡糖苷酶或支链淀粉酶(糖基水解酶)活性的多肽。α-淀粉酶具有水解淀粉中的内部α-1,4-糖苷键以产生更小分子量的麦芽糖糊精的能力。葡糖淀粉酶具有水解由a-1,4-和a-1,6-糖苷键连接的葡萄糖聚合物的能力。葡糖淀粉酶具有从葡聚糖释放β-D-葡萄糖的能力。 
用于本发明中的淀粉酶基因优选是编码α淀粉酶的基因。更优选地，淀粉酶基因编码来源于异常球菌细菌的淀粉酶。在这方面，申请人已从异常球菌属细菌鉴别了具有改进的性能的新型淀粉酶基因，其序列表示在SEQ ID NO:2和4(氨基酸序列)中。 
在一个优选实施方式中，本发明的转录单元包含编码包含SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列或其片段或变体的α淀粉酶的基因。 
由发明人进行的功能性分析已经证实，SEQ ID NO 2和4的α淀粉酶显示出不同的底物特异性，使得通过将这两种淀粉酶结合到本发明的细菌中，增加活性谱。 
纤维素酶是这样的酶，其催化纤维素或半纤维素(硬木和软木的主要组分)的水解。纤维素酶可以为不同类型，如内切葡聚糖酶,内切纤维素酶,纤维二糖水解酶(CBH)或纤维二糖苷酶，或β-葡糖苷酶(纤维二糖酶；BGL)。用于本发明的纤维素酶基因优选是编码内切纤维素酶或外切纤维素酶的基因。更优选地，纤维素酶基因编码来源于异常球菌细菌的纤维素酶。在这方面，申请人已从异常球菌属细菌鉴别了具有改进的性能的新型纤维素酶基因，其序列表示在SEQ ID NO:8和10(氨基酸序列)中。 
在一个优选实施方式中，本发明的转录单元包含编码包含SEQ ID NO:8或10的氨基酸序列、或其片段或变体的纤维素酶的基因。 
阿拉伯呋喃糖酶基因可以编码阿拉伯呋喃糖酶，更优选是来源于异常球菌细菌的阿拉伯呋喃糖酶的基因。在这方面，申请人已从异常球菌属细菌鉴别了具有改进的性能的新型阿拉伯呋喃糖酶基因，其序列表示在SEQ ID NO:5(核酸)和6(氨基酸)中。 
在一个优选实施方式中，本发明的转录单元包含编码包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、其片段或变体的阿拉伯呋喃糖酶的基因。 
本发明的生物质降解转录单元的实例包括在单个启动子控制下的选自以 下的至少两个基因： 
-编码包含SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列、或其片段或变体的α淀粉酶的基因； 
-编码包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其片段或变体的阿拉伯呋喃糖酶的基因；和 
-编码包含SEQ ID NO:8或10的氨基酸序列或其片段或变体的纤维素酶的基因。 
本发明的生物质降解转录单元的更具体的实例描述于实施例中，并且包含在单个启动子控制下并且以5’至3’的顺序的以下基因： 
-编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、或其片段或变体的α淀粉酶的基因，和编码包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、或其片段或变体的α淀粉酶的基因；或 
-编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、或其片段或变体的α淀粉酶的基因，和编码包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、或其片段或变体的阿拉伯呋喃糖苷酶的基因；或 
-编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、或其片段或变体的α淀粉酶的基因，编码包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、或其片段或变体的α淀粉酶的基因，和编码包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、或其片段或变体的阿拉伯呋喃糖苷酶的基因。 
本发明证实，上述基因构造允许整合基因的适当表达用于最佳乙醇生产。 
所述单元可以包含可替换或另外的基因，其编码例如漆酶,木聚糖酶或酯酶。这样的其他的基因的具体实例，由申请人分离自异常球菌或相关细菌，披露于PCT/EP2011/069669和PCT/EP2011/069670，通过引用结合。 
转录单元中的基因的表达由单个启动子调控。所述启动子与宿主的同源的(例如来自异常球菌基因的启动子)或异源的(例如，来自不同气源，如不同细菌、噬菌体、合成或杂交启动子等)。优选的启动子是同源的。在这方面，各种启动子已被研究和用于基因表达。合适的异常球菌启动子的实例包括来自翻译延伸因子Tu基因tufA(DR0309)和tufB(DR2050)的PtufA和PtufB 启动子，位于pI3中的resU基因的启动子，和groESL操纵子的启动子区域PgroESL(Lecointe et al,2004；Meima et al,2001)，或这样的启动子的衍生物。 
本发明证实，转录单元中的基因的合适水平的表达当在选自或来源于PtufA,PtufB或PgroESL的启动子控制下放置所述基因时获得。 
转录单元可以进一步包含额外的调控序列，如例如终止子和/或增强子。 
另外，转录单元可以包含在不同启动子控制下的另外的基因。在这方面，有可能在转录单元中插入编码生物质降解酶的额外基因，其由相同或不同启动子调控。 
在一个特别和优选的实施方式中，本发明的转录单元包含在第二启动子控制下的至少一个额外的生物质降解基因。在另一个优选实施方式中，转录单元包含在启动子控制下的2个额外的生物质降解基因。本发明证实，这样的重构生物质降解单元可以在异常球菌菌株的基因组中的一个位置中组装。本发明证实，操纵子中的构造为乙醇生产提供最佳基因表达水平。本发明证实，这样的细菌可存活且稳定。因此这些细菌代表用于生物燃料生产的非常有潜力的生物催化剂。 
在一个特别的实施方式中，本发明涉及包含重构生物质降解转录单元的异常球菌或相关细菌，其中所述单元包含： 
(i)在单个启动子控制下，2个淀粉酶基因,或1个淀粉酶基因和1个阿拉伯呋喃糖酶基因,或2个淀粉酶基因和1阿拉伯呋喃糖酶基因；和 
(ii)在第二启动子控制下，至少一个纤维素酶基因,优选1个内切纤维素酶基因和1个外切纤维素酶基因。 
基因的这些特别组合物和安排允许在细菌中的改进的表达和活性。 
转录单元可以在体外制备然后插入到细胞中，或者通过基因的相继插入在细胞中进行构建。常规重组DNA技术可以用于DNA操纵，克隆，和细胞转化。特别地，核酸可以插入到细菌的基因组中，或者作为(自发地)复制分子插入，例如，在质粒、游离基因(episome)、人工染色体等上。 
在一个优选实施方式中，转录单元被整合到细菌的基因组中。为此，将构建体克隆入适用于整合到异常球菌细菌的基因组中的一个或多个整合盒 中。这样的整合盒通常包含连接于(或侧悬)允许整合(优选位点特异性整合)的一个或多个序列的核酸。这样的序列可以例如与基因组的靶向区域同源的核酸序列，允许通过横跨该区域进行整合。 
插入可以靶向基因组的非必需(例如，非编码区域)中。然而，在一个优选实施方式中，插入靶向细菌基因组内的特定基因。在这方面，本发明的特别细菌包含整合到其基因组中的重构生物质降解转录单元，代替编码淀粉酶的全部或部分内源性基因。本发明证实内源性基因由本发明的转录单元替代进一步改进该细菌的性能。在这种情况下，术语“部分基因”是指基因的任何部分，其缺失足以引起细胞中的基因失活。 
各种技术可以用来将核酸插入到异常球菌或相关细菌中，如例如披露于WO2010/130806。特别地，它们可以通过自然转化(其可以在氯化钙存在下进一步被增强)或电穿孔插入。 
可替换的克隆位点包括，优选，代替地，选自磷酸乙酰转移酶基因、丙氨酸脱氢酶基因、葡萄糖脱氢酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因或苹果酸脱氢酶基因的基因。 
在可替换实施方式中，尽管较不是优选的，但是转录单元可以被克隆入合适载体中，其可以在异常球菌中复制。典型的载体含有，除了克隆的插入物外，选择基因(例如，抗生素耐受性，染料等)和有效在异常球菌中复制的起源。这样的载体的实例包括pMD66,pI3,pRAD1和pUE30。pMD66是用于含有pI3的12kb片段的耐辐射异常球菌(D.radiodurans)和大肠杆菌的大型载体(27kb)(Daly et al,1994)。pI3由Masters和Minton(1992)描述。pRAD1是含有用于耐辐射异常球菌的最小复制子的耐辐射异常球菌-大肠杆菌穿梭质粒(Meima and Lidstrom,2000)。pUE30是来源于抗放射异常球菌(D.radiopugnans)的菌株的内源性质粒，其能够在异常球菌中复制(参见US2003/0175977)。 
本发明还涉及一种用于生产异常球菌或相关细菌,或其原种的方法，所述方法包括： 
a)提供亲本异常球菌或相关细菌； 
b)在所述亲本细菌的基因组中同时或相继地插入在单个启动子控制下的 至少2个基因，所述至少2个基因编码不同的生物质降解酶，和 
c)选择表达所述至少2个基因的b)的细菌。 
具有插入的核酸的细菌可以根据本身已知的技术选择。基因的表达可以使用(例如，定量地)PCR验证并且这些酶的产生可以通过蛋白质印迹(Western blot)或通过本领域本身已知的酶测定验证并在实施例中举例说明。 
如在实验部分中公开的，已经生产了含有重构生物质降解转录单元的若干异常球菌属细菌。这些细菌可以培养，是存活的并且稳定地含有插入的单元。稳定性是优选的以使超过95％的细菌在2个生长周期后仍然含有所述单元。本发明的另外的优势在于，生物质降解转录单元可以完全有异常球菌来源的遗传物质形成。作为结果，细菌更稳定，更有效，不是GMO，并且更适于极端培养条件。而且，发明人鉴别和表征的特定酶表现出潜在和补充活性，这赋予细菌显著的活性。 
醇生产转录单元
在一个优选实施方式中，除了生物质降解转录单元之外，本发明的细菌包含重组醇生产转录单元。因此这样的细菌表达优化的基因组合以从生物质生产生物燃料或代谢物。 
重组醇生产转录单元优选包含编码醇脱氢酶(adh)和/或丙酮酸脱羧酶(pdc)的至少一个基因。 
丙酮酸脱羧酶(PDC,EC:4.1.1.1)催化丙酮酸至乙醛和二氧化碳的单氧化脱羧。醇脱氢酶(ADH,EC:1.1.1.1)催化乙醛至乙醇的转化。ADH和/或PDC基因插入到异常球菌中已在由申请人提交的在先申请中报道(WO2010/130806)。为了产生或改进这个代谢路径，编码PDC和/或ADH的基因现在已被克隆并且成功地引入到本发明的具有重构生物质降解单元的异常球菌或相关细菌中。 
更具体地，已制备编码功能性PDC的基因。这样的核酸分子可以包含天然或合成或突变的PDC基因的序列的全部或部分，只要改核酸分子编码催化丙酮酸至乙醛和二氧化碳的单氧化脱羧的蛋白质。PDC存在于植物、真菌和酵母菌中，但在细菌中很稀少。在耐辐射异常球菌基因组中没有发现完全测 序的明显的PDC。PDC基因已在各种菌株中鉴别，如在运动发酵单胞菌(Brau and Sahm,1986；Conway et al,1987a；Neale et al,1987)中，在巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)(Genbank:AF368435)(Chandra et al,2001)中，在胃八叠球菌(Sarcina ventriculi)(Genbank:AF354297)(Lowe and Zeikus,1992)中和在棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)(Genbank:AF474145)(Raj et al,2002)中。 
在一个优选实施方式中，PDC核酸包含细菌PDC基因的全部或部分的序列。在特定实施方式中，所述核酸包含来自运动发酵单胞菌的PDC基因的序列(ZmPDC,ZMO1360)。ZmPDC基因序列包含1707个碱基对并且表示在SEQ ID NO:15中。修饰的基因序列，优化了在异常球菌中的表达，已由发明人合成，其表示在SEQ ID NO:16。 
ADH基因已克隆子不同有机体，包括但不限于运动发酵单胞菌(Ingram et al,1987),短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(Liu et al,2007),或嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(Genbank:Z25544)(Talarico et al,2005)。来自异常球菌的ADH基因也已被分离并由发明人克隆。这些基因和编码的ADH酶的序列披露于SEQ ID NO:11-14。 
为了生产编码ADH活性的细菌，制备编码功能性ADH的基因，其可以包含天然或合成或突变的ADH基因的序列的全部或部分，只要核酸分子编码催化乙醛至乙醇的转化的蛋白质。 
在一个优选实施方式中，ADH核酸包含细菌ADH基因的全部或部分的序列。在一个特定实施方式中，所述核酸包含来自运动发酵单胞菌的adh基因的序列(ZmADH,ZMO1596)。ZmADH II包含1152个碱基对并且其序列描述于WO2010/130806(还参见SEQ ID NO:17)。修饰的基因序列，优化在异常球菌中的表达，已由发明人合成，其存在于SEQ ID NO:18。 
在另一个优选实施方式中，所述核酸编码包含SEQ ID NO:12或14的氨基酸序列的全部或部分的ADH。 
根据另一个特定实施方式中，醇生产转录单元包含编码NADP-依赖性ADH或PDC的至少一个基因。 
代谢通量比分析证实，一些异常球菌表现出令人惊讶的主要通过戊糖磷 酸途径消耗葡萄糖的性能，表明NADPH的重要部分作为氧化还原电势产生。为了利用此NADPH池，可以使用NADP-依赖性ADH基因。在这方面，乙醇单元可以包含来源于穆尔氏菌属(Moorella sp)的ADH基因HUC 22-1(例如，包含SEQ ID NO:19的全部或功能性部分)或来自发酵单胞菌属(Zymomonas)的Tzadh(包含SEQ ID NO:20的全部或功能性部分)。本发明证实，这样的基因在异常球菌属细菌中的表达是特别有用的，因为这些细菌具有高水平的NADPH通量。 
因此本发明的一个目的还在于异常球菌或相关细菌,其中所述细菌包含编码NADP-依赖性ADH或PDC的至少一个重组核酸序列。 
本发明的另一个目的是异常球菌或相关细菌,其中所述细菌包含编码NADP-依赖性ADH的至少一个重组核酸序列和编码NAD-依赖性ADH的至少一个重组核酸序列。 
核酸可以插入到细菌的基因组中，或作为(自发地)复制分子例如插入在质粒、游离基因、人工染色体等上，如上所述。在一个优选实施方式中，乙醇生产转录单元插入在所述细菌的基因组中，代替内源性基因，更优选代替磷酸乙酰转移酶基因。 
在这方面，本发明的目的在于异常球菌或相关细菌,其中所述细菌含有失活的磷酸乙酰转移酶基因(pta)。乙酰辅酶A(AcetylCoA)，其在糖酵解期间产生，可以用于乙醇生产以及用于作为第二竞争性路径的乙酸形成。通过缺失pta基因，乙酸生产应被减少(或消除)而有利于乙醇生产。本发明证实，这种基因可以在没有改变细菌生长的情况下缺失，同时改善细菌生产生物燃料的能力。 
适当的PDC或ADH的表达可以利用定量PCR验证并且这些酶的产生可以通过蛋白质印迹或通过本领域本身已知的酶测定验证。PDC活性可以通过分析NAD+的还原测量并且ADH活性可以通过分析由于这些酶的活性所致的NAD+的还原或NADH的氧化测量(Conway等,1987a和b)。 
竞争性路径的消除
本发明的细菌的性能可以同消除或改变细胞中的竞争性反应后路径而进 一步改进。 
本发明人现在已生产新型细菌，其中参与竞争性路径的基因已被失活。通过在所需路径中使用更多的其能量，这样的细菌在从生物质生产生物燃料方面表现出进一步改善的效力。更具体地，本发明的特定目的在于这样的异常球菌或相关细菌，其包含选自以下的失活内源性基因：磷酸乙酰转移酶基因,丙氨酸脱氢酶基因,葡萄糖脱氢酶基因,磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因,磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因,和/或苹果酸脱氢酶基因。 
在一个特别的实施方式中，靶基因全部或部分地被缺失，并且不编码功能性蛋白质。靶基因可以通过同源性重组、基因替代、靶向突变、或本领域本身已知的任何其他技术在所述细菌或其原种中失活。 
在一个优选实施方式中，基因通过缺失所述基因的至少一部分而失活，其可以通过异源性核酸(例如，选择标记物)替代。 
在一个优选实施方式中，本发明的细菌缺少所述基因的一部分，优选其至少100个连续的核苷酸，更优选至少200,300,400或500个。在实施例中，已经生产缺陷型异常球菌菌株，其缺少整个磷酸乙酰转移酶基因。这种菌株已使用包含乙醇生产转录单元(其由于所述基因的蛋白质同源的两个区域侧悬)的特定构建体通过双交换(double crossing-over)制备。典型的同源性区域应是足够长以允许杂交和交换，例如，多于200个核苷酸，优选多于300个核苷酸，典型地为300至7000个。这样的构建体代表本发明的特别目的。 
在这方面，本发明还涉及一种用于生产如上所述的异常球菌细菌或其原种的方法，所述方法包括： 
-提供(亲本)异常球菌细菌； 
-处理所述细菌以使选自以下的内源性基因失活：磷酸乙酰转移酶基因,丙氨酸脱氢酶基因,葡萄糖脱氢酶基因,磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因,磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因,和/或苹果酸脱氢酶基因，和 
-选择具有失活的所述基因的细菌。 
培养物、组合物和用途
本发明的细菌可以制备自异常球菌或相关细菌的任何物种。实例在本申请上文列出。它们是选自以下的物种的优选异常球菌属细菌：中度嗜热菌(D.geothermalis),解纤维素异常球菌(D.cellulolysiticus),沙漠异常球菌(D.deserti),默氏异常球菌(D.murrayi)和耐辐射异常球菌(D.radiodurans)。 
适用于本发明的亲本菌株的示例性实例包括但不限于例如中度嗜热菌(D.geothermalis)DSM 11300(DRH05),中度嗜热菌(D.geothermalis)DSM 11301(DRH06),中度嗜热菌(D.geothermalis)DSM 11302(DRH07),中度嗜热菌(D.geothermalis)HAMBI 2481(DRH37),中度嗜热菌(D.geothermalis)HAMBI 2480(DRH38),中度嗜热菌(D.geothermalis)HAMBI 2411(DRH39),中度嗜热菌(D.geothermalis)HAMBI 2791(DRH41),中度嗜热菌(D.geothermalis)M36-7D；耐辐射异常球菌(D.radiodurans)R1(ATCC 13939)；默氏异常球菌(D.murrayi)M11-9D(CNCM I-4155)(保藏日期：2009年5月7日，保藏单位：法国国家培养物和微生物保藏中心(CNCM)，保藏地址：巴斯德研究院,25，RUE DU DOCTEUR ROUX,75724巴黎CEDEX 15)；或默氏异常球菌(D.murrayi)M13-1A(CNCM I-4157)(保藏日期：2009年5月7日，保藏单位：法国国家培养物和微生物保藏中心(CNCM)，保藏地址：巴斯德研究院,25，RUE DU DOCTEUR ROUX,75724巴黎CEDEX 15)。 
异常球菌的其他菌株在公众保藏中心保藏，或者可以由本领域技术人员获得，其可以用来实现本发明。 
本发明的细菌可以在任何合适培养基和/或装置中培养和/或保持。这样的介质的实例包括复合葡萄糖介质或如在实施例中公开的确定介质，如例如，限定介质蔗糖、限定介质淀粉。 
本发明的另一个目的涉及一种组合物，其包含如上所述的细菌和至少一种其他细菌。 
本发明的另一个目的涉及一种组合物，其包含如上所述的细菌和培养基。 
本发明的另一个目的涉及如上所述的细菌的酶提取物。所述酶提取物至 少含有由所述重构单元编码的生物质降解酶。 
本发明还涉及生物催化剂，其包含如上所述的细菌或其提取物。 
本发明还在于一种用于转化生物质的方法，包括将生物质暴露于如上所述的细菌、或提取物或组合物。 
本发明的另一个目的是一种用于生产生物燃料的方法，包括将糖或生物质暴露于如上所述的细菌、或提取物或组合物。优选地，所述方法包括收集所生产的生物燃料的步骤。 
本发明还涉及如上所述的细菌用于生产生物燃料或代谢物的用途。 
底物可以是任何培养基或各种类型的生物质或来源于其的产物。特别地，生物燃料可以从可再生资源，尤其是植物或动物生物质，或者从市政和工业废物生产。 
更优选地，本发明的方法用于生产乙醇。 
本发明的方法可以在转换的反应器中进行。“反应器”是指特别设计用来实施本发明的用于生物质转化的常用发酵罐或任何设备或系统，并因此特别是由以下组成：生物反应器，生物过滤器，旋转生物接触器，和其他气相和/或液相生物反应器，尤其是适用于处理生物质或生物质衍生物的那些。根据本发明可以使用的设备可以连续或间歇地使用。 
在反应器中，为了实现本发明的方法，使用本发明的至少一种细菌，或其细菌提取物，同时所述反应器被排列和供应以使物理化学条件可以设置并在其中保持以使所述细菌在可操作用于所考虑的应用，并且使得任选地，细菌生长是可能的且优选在其中被促进。 
所述方法在需氧、厌氧下或在微需氧下进行，这取决于底物和细菌。本发明的一个优点涉及本发明的细菌抵抗紧张条件的能力，包括在培养基中存在乙醇。本发明的方法因此优选在约40℃以上的温度下，特别是在40-70℃的温度下、在酸性pH条件和/或在乙醇存在下进行。 
本方面的其他方面和优点将在以下实施例中披露，这些实施例应被视为举例说明性的并且不限制本申请的范围。 
实施例
A.材料和方法 
细菌菌株和生长条件:
使用大肠杆菌(E.coli)菌株SCS110,JM109或DH5α来繁殖质粒。将它们在Luria-Bertani(LB)肉汤(每升：胰蛋白胨10g,酵母膏5g,氯化钠10g)中在37℃和200RPM下培养。固体介质通过加入琼脂1.5％制备。 
异常球菌属细菌在PGY中在45℃和200RPM下培养。PGY介质的组成为如下，每升：蛋白胨(10g),酵母膏(5g)和葡萄糖(1g)。固体介质为，每升：蛋白胨(10g),酵母膏(5g),葡萄糖(1g)和琼脂(15g)。 
当需要时，LB或PGY介质补充适当抗生素： 
-氯霉素，用于中度嗜热菌(D.geothermalis)的终浓度为3μg/ml，并且用于大肠杆菌的终浓度为30μg/ml 
-博来霉素，用于中度嗜热菌(D.geothermalis)的终浓度为6μg/ml for中度嗜热菌(D.geothermalis)，并且用于大肠杆菌的终浓度为10μg/ml 
-氨苄西林，用于大肠杆菌的终浓度为100μg/ml 
转化:
大肠杆菌转化使用来自Stratagene的商业竞争性细胞SCS110或来自Promega的JM10进行。 
对于异常球菌细胞，在稳定期的新鲜培养物在50ml的PGY中稀释100倍。生长细胞直至指数期后期(OD600nm＝0.8)；团粒再悬浮在适当提及的冰冷2xPGY/10％v/v甘油/30mM CaCl2中。对于转化，向100μl细胞中加入所需量的质粒DNA。混合物在冰上温育30分钟，转到42℃持续90秒并返回到冰上持续5分钟。加入200μl的新鲜2XPGY介质并将转化株在2小时内在200RPM和37℃下振荡。将它们系列稀释并铺到适当选择性的PGY板上。 
DNA操纵:
从大肠杆菌细胞的质粒小量制备使用QIAGEN minipreps DNA纯化系统进行并且使用来自Macherey-Nagel的质粒DNA纯化Xtra Midi Plus EF试剂盒进行。这些制备从稳定期的3-100ml的大肠杆菌培养物 进行。 
从异常球菌的基因组DNA提取使用来自Qiagen的血液和组织商业试剂盒进行。这些制备从5ml稳定期培养物进行。 
寡核苷酸通过Eurogentec合成。用于PCR扩增的聚合酶是来自Finzyme的PHUSION Hi-Fidelity聚合酶，以及来自Novagen的KOD Xtreme-hot start DNA聚合酶用于重叠PCR。PCR片段使用来自Promega的Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System试剂盒清洁。 
遗传物质通过琼脂糖凝聚电泳分离。DNA用来自Eppendorf的Biophotometer定量。 
DNA插入物通过Genecust Europe合成并克隆入适当载体。 
遗传性插入到异常球菌染色体的方法:
DNA片段插入到异常球菌的染色体中使用同源性重组机制进行。插入的盒设计如下：必须被插入的区域的DNA序列由与染色体靶标上游或下游的序列同源的500bp区域侧悬(参见图1)。 
对于前2步(编码基因12_1103的内生性α-淀粉酶的缺失和pTufB-amy1的插入)，插入盒由pMD66热敏性穿梭载体携带，转化到异常球菌中并且使用高温暴露(52℃持续4天)以允许染色体插入和质粒失去。 
对于所有其他插入/缺失，将插入盒克隆入puc57自杀载体中并转化入异常球菌中。已将关注的区域结合到染色体张的转化株在含有适当抗生素的PGY介质上选择。 
正确的插入/缺失通过在基因组DNA上的PCR、标记物替代(当可能时，氯霉素至博来霉素或博来霉素至氯霉素)、以及关注区域上的修饰染色体的测序进行检查。 
图1是用来插入生物质降解基因和检查正确插入的第一次插入步骤和方法的示意图。 
醇脱氢酶活性测试:
将在无水乙醇中的2.5mg/ml的4ml副品红(pararosaniline)(Sigma)加入到含有50mg亚硫酸钠的200ml LB琼脂中(Conway et al,1987b)。将在 TGY琼脂板(如果需要，补充有适当抗生素)上生长的2天龄的耐辐射异常球菌(D.radiodurans)细胞在指示剂板上铺板并在37℃温育2至3小时。 
代谢物生产:
这种方法使得能够评价遗传修饰的微生物从生物质或生物质衍生物生产关注的代谢物的能力。 
该试验在30℃进行。 
从在复合介质葡萄糖中制备的预培养物(在稳定期)，接种6ml的富集介质(以1％v/v接种)。 
测试的富集培养基是复合介质葡萄糖(Complex Medium Glucose)、确定介质蔗糖(Defined Medium Sucrose)、确定介质淀粉(Defined Medium Starch)。 
复合介质葡萄糖含有：蛋白胨2g/L,酵母膏5g/L和葡萄糖10g/L在的渗透水中：溶液通过高压灭菌法灭菌(在120℃下15分钟)。向该溶液中加入以下溶液：MOPS缓冲液溶液(10X)pH7[酸MOPS 400mM,NH4Cl 200mM,NaOH 100mM,KOH 100mM,CaCl25μM,Na2SO42.76mM,MgCl25.28mM]；微量营养物(10000X)[(NH4)6(Mo7)24 300mM,H3BO34mM,CoCl20.3mM,CuSO40.1mM,MnCl22.5mM,ZnSO40.1mM]；FeCl3(100X)2mM，在C6H5Na3O720mM中；K2HPO41g/L:溶液通过过滤灭菌(0.2μm)。 
确定的介质含有：在渗透水中的碳源10g/L：溶液通过高压灭菌法灭菌(在120℃15分钟)。向该溶液中加入以下溶液：MOPS缓冲液溶液(10X)pH7[酸MOPS 400mM,NH4Cl 200mM,NaOH 100mM,KOH 100mM,CaCl25μM,Na2SO42.76mM,MgCl25.28mM]；微量营养物(10000X)[(NH4)6(Mo7)24 300mM,H3BO34mM,CoCl20.3mM,CuSO40.1mM,MnCl22.5mM,ZnSO40.1mM]；FeCl3(100X)2mM，在C6H5Na3O720mM中；K2HPO41g/L:溶液通过过滤灭菌(0.2μm)。 
向这些培养基中，除了野生型菌株，在接种前加入氯霉素：3μg/mL培养基。 
在需氧和厌氧下进行培养(Biomerieux,Genbag)。 
需氧条件下的培养物在搅拌下在30℃在温育器中留置7天。然后将培 养物以4000rpm离心10分钟。过滤上清(0.2μm)，倒入其他试管中，并放置在-80℃。 
厌氧条件下的培养物在30℃在温育器中留置4周。然后将培养物以4000rpm离心10分钟。过滤上清(0.2μm)，倒入其他试管中，并放置在-80℃。 
利用气相色谱FID分析(Varian CP-WAX 57CB 25m*0.32mm柱)来定量醇。有机酸通过液相色谱质谱(MicrOTOF-QII Bruker)或毛细管电泳(5mM 2,6-吡啶二甲酸0.5mM溴化十六烷基三甲铵；5.6pH调节缓冲液/61cm长、50μm直径毛细管Agilent)定量。残余葡萄糖通过偶联折射计的HPLC(Phenomenex LUNA 3μm NH2100A 150*4.6mm柱,乙腈/H2O 85:15流动相)。 
在需氧条件下，在含有3％-或6％-的全麦中生长7天后，对不同菌株监测酸和乙醇生产。 
B.具有2-基因重构生物质降解转录单元的异常球菌菌株的改造。 
中度嗜热菌(D.geothermalis)DSM 11300用作亲本菌株。在单独的实验组中，对以下列出的其他异常球菌或相关细菌应用相同方案： 
DRH05  中度嗜热菌(D.geothermalis)DSM 11300 
DRH06  中度嗜热菌(D.geothermalis)DSM 11301 
DRH07  中度嗜热菌(D.geothermalis)DSM 11302 
DRH37  中度嗜热菌(D.geothermalis)HAMBI 2481 
DRH38  中度嗜热菌(D.geothermalis)HAMBI 2480 
DRH39  中度嗜热菌(D.geothermalis)HAMBI 2411 
DRH41  中度嗜热菌(D.geothermalis)HAMBI 2791 
M36-7D 中度嗜热菌(D.geothermalis) 
DR1    耐辐射异常球菌(D.radiodurans)ATCC 13939 
M11-9D 默氏异常球菌(D.murrayi)CNCM I-4155(保藏日期：2009年5月7日，保藏单位：法国国家培养物和微生物保藏中心(CNCM)，保藏地址：巴斯德研究院,25，RUE DU DOCTEUR ROUX,75724巴黎CEDEX 15) 
M13-1A 默氏异常球菌(D.murrayi)CNCM I-4157(保藏日期：2009年5月7日，保藏单位：法国国家培养物和微生物保藏中心(CNCM)，保藏地址：巴斯德研究院,25，RUE DU DOCTEUR ROUX,75724巴黎CEDEX 15) 
B1.wtα-淀粉酶12_1103(amy)编码基因的缺失 
将在pTufA启动子控制下放置的含有博来霉素抗性基因(bleo)的DNA片段插入到亲本菌株的染色体中，通过同源性重组代替内生性α-淀粉酶编码基因12_1103，得到菌株DG_06。使用与该内生性α-淀粉酶编码基因的直接上游和下游的区域同源的500bp片段来进行插入。从ATG至终止密码子的整个α-淀粉酶开放读框的完全代替通过PCR和测序确认。 
B2.在amy座位处，来自菌株M23-3A的α-淀粉酶编码基因M23r-3A.18_109(amy1)的插入 
将具有氯霉素抗性基因且在pTufB启动子下，在操纵子中的带有α-淀粉酶编码基因M23r-3A.18_109(amy1–SEQ ID NO:1)的DNA片段插入到菌株DG_06的染色体(amy::ptufA-bleo)中，代替pTufA-bleo并得到菌株DG_02(amy::pTufB-amy1-cat)。使用pTufA-bleo盒直接上游和下游的区域同源的500bp片段进行插入，因此代替整个pTufA-bleo盒。通过标记物替代(bleo至cat)和PCR来检查插入。amy1编码序列融合至N-末端信号肽序列以允许蛋白质的分泌。 
B3.amy1基因的下游，来自菌株M23-3A的α-淀粉酶编码基因M23r-3A.305_673amy2)的插入 
将含有α-淀粉酶编码基因M23r-3A.305_673amy2,SEQ ID NO:3)和pTufA-bleo抗性盒的DNA片段插入到菌株DG_02的染色体(amy::pTufB-amy1-cat)中，在amy1基因的直接下游并代替cat抗性基因。使用与该cat基因直接上游和下游的区域同源的500bp片段进行插入，因此缺失整个cat基因。所得菌株DG_04(amy::pTufB-amy1-amy2-pTufA-bleo)带有在pTufB启动子 控制下放置的淀粉酶的操纵子。通过标记物替代(cat至bleo)和通过PCR确认的操纵子结构来检查插入。 
B4.重构细菌中的淀粉酶表达和淀粉分解活性 
a-板上的淀粉分解测定
细胞在富PGY介质中生长至指数期后期。然后将2至8μl的培养物(量根据OD600nm标准化)在含有0.5％淀粉的最小培养基板上成斑并在37℃温育。 
在3天后，使用革兰氏碘染色可视化淀粉分解晕。 
结果示于图2并显示在重构菌株中存在强淀粉酶活性。 
b-淀粉分解菌株DG_04的表征
含有α-淀粉酶M23r-2A.18_109和M23r-2A.305_673的菌株DG_04(amy::pTufB-M23r2A.18_109-M23r-2A.305_673-pTufA-bleo)在含有0.5％可溶淀粉的确定最小培养基(Sigma S976)上生长。培养基富集有5mM CaCl2和6μg/ml博来霉素(Calbiochem 203408)。在含有2L介质的5L摇瓶中进行培养。每天取样并测量OD600和α-淀粉酶活性。 
如图3所示，观察到α淀粉酶活性，并且大多数活性从细胞表面检测到。 
测试细胞团粒的Triton X-100提取以释放位于细胞表面的α-淀粉酶活性。将细胞悬浮在含有2mM CaCl2的100mM MOPS缓冲液中并加入Triton X-100至终浓度为0.1％。样品良好混合并在室温温育15分钟。在温育后，通过离心除去细胞并分析上清的α-淀粉酶活性。大约45％的α-淀粉酶活性可以通过Triton提取从细胞表面释放。 
浓缩的DG_04培养上清、细胞和Triton提取物通过SDS-PAGE和酶谱技术进一步分析(图4)。淀粉分解异常球菌菌株M23-3A用作参照菌株。DG_4在同工酶凝胶上显示5个活性带。在100kDa附近检测到两个主要带，而两个其他活性带位于65kDa附近。靶标α-淀粉酶(2ndα-淀粉酶)的理论分子量 为109kDa并且一个主要带最可能代表靶标酶。在50kDa附近观察到一个弱带，其与1stα-淀粉酶(MW＝53kDa)的分子量对应。亲本菌株含有若干淀粉分解基因。然而，仅从两个插入的α-淀粉酶基因鉴别了清楚的信号序列。因此，未鉴别的带可能起源于胞外酶的蛋白质分解降解或释放胞内活性的部分细胞溶解。凝胶伪像(Gel artifacts)和蛋白质聚集体也可能是由于分析中使用的非还原条件导致的同工酶结果的外延。亲本菌株的最高活性在细胞团粒样品(泳道5)中检测到并且随着活性可以利用Triton提取物部分地从细胞表面释放，这表明2ndα-淀粉酶的纯化将从Triton提取物进行。利用淀粉分解野生型菌株M23-3A，在培养上清中检测到具有50kDa分子量的极弱活性(泳道2)，而在细胞团粒样品中观察到100kDa附近的两个活性带(泳道4)。结果表明，在野生菌株M23-3A中，较小的M23r-2A.18_109α-淀粉酶(1stα-淀粉酶)位于上清中。相反，从细胞表明发现更大的M23-3A.305_673α-淀粉酶(2ndα-淀粉酶)。 
C.具有3-基因重构生物质降解单元的异常球菌菌株的改造 
含有来自菌株DRH46的α-L-阿拉伯呋喃糖酶61_237编码序列和pgroESL-cat氯霉素抗性盒的DNA片段插入到菌株DG_04的染色体(amy::pTufB-amy1-amy2-pTufA-bleo)中，amy2基因的直接下游，去除pTufA-bleo并将arabinofur基因放置在与该淀粉酶相同的操纵子中。使用与pTufA-bleo盒的直接上游和下游的区域同源的500bp片段进行插入，因此代替整个pTufA-bleo盒。所得菌株DG_16(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur-pgroESL-cat)检查标记物替代(bleo至cat)并且其操纵子结构通过PCR确认。 
D.具有4-基因重构生物质降解单元的异常球菌菌株的改造 
-在arabinofur基因下游，来自菌株DRH46的内切纤维素酶编码基因DRH46.66_2727(endocell)的插入 
带有以下构建体(pTufA-endocell-bleo)的DNA片段，其中来自菌株DRH046的内切纤维素酶编码基因66_2727在具有bleo抗性基因的操纵子中并且在启动子pTufA控制下放置，在arabinofur基因的下游插入到菌株 DG_16的染色体，得到菌株DG-16B(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur-pTufA-endocell-bleo)。 
E.具有5-基因重构生物质降解单元的异常球菌菌株的改造 
在编码转录单元pgroESL-sacBBs-cat的序列后，含有来自菌株M1-3H的外切纤维素酶编码基因284_1-4(exocell)的插入盒[sacB,来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)的果聚糖蔗糖酶基因，在具有cat抗性基因的操纵子中并且在pgroESL启动子的控制下]用于在具有endocell基因的操纵子中插入到DG_16B菌株的染色体中，产生菌株DG_16C(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur-pTufA-endocell-exocell-pgroESL-sacB-cat)。 
F.具有醇生产转录单元和生物质降解单元的异常球菌属细菌的改造 
除了生物质降解单元外，将包含PDC和ADH基因的乙醇生产单元插入到细胞中。 
F1.在第一组实验中，含有具有来自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶编码基因(pdcZm)和来自运动发酵单胞菌的醇脱氢酶编码基因(adhZm)的操纵子的盒(在pgroESL启动子控制下放置)和pTufA-bleo博来霉素抗性盒插入到菌株DG_16的染色体中，代替编码磷酸乙酰转移酶的内生性pta基因(26_1230)或代替含有磷酸乙酰转移酶基因(pta,26_1230)和乙酸激酶基因(ack,26_1224)的整个乙酸盐生产操纵子。所得菌株分别称为DG_17(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur；pta::pgroESL-pdcZm-adhZm-pTufA-bleo)和DG_19。 
对于pta基因缺失，将与pta基因直接上游和下游的区域同源的500bp片段用作同源性区域。为了避免对邻接ack基因(在具有pta基因的操纵子中)的极性影响，保留来自pta的第一ATG密码子。 
对于代替整个乙酸生产操纵子的插入，将与ack-pta操纵子直接上游和下游的区域同源的500bp片段用作同源性区域。 
这些细菌水解淀粉的能力和性能如实验部分中所公开的那样确定。结果概括在下表1中： 
菌株 淀粉水解(％)
DG 10
DG_04 80
DG_16 80
DG_17 80
这些结果证实，生物质降解单元的表达确实向细菌赋予改进的水解淀粉的能力。而且，所述细菌仍然存活且重构单元不影响生长性能。 
如下表2所示，虽然DG或DG_16在测试条件下都不产生乙醇，但是DG_17产生大量乙醇，不仅在试管中而且在1L反应器中。 
表2
F2.实验的另外步骤中，构建另一个乙醇生产单元并插入到细胞中。在这些实验中，在如F1中的类似策略后，使用pdc(SEQ ID NO:16)和adh基因(SEQ ID NO:18)的异常球菌DRH05密码子优化序列，从DG-16改造两个新菌株，得到菌株DG_18(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur；pta::pgroESL-pdcZm*-adhZm*-pTufA-bleo)和DG_20(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur；pta/ack::pgroESL-pdcZm*-adhZm*-pTufA-bleo)。 
F3.NADP-依赖性ADH编码基因的插入 
代谢通量比分析证实，在亲本DG菌株中，多达56％的葡萄糖通过戊糖 磷酸途径消耗，表明重要部分的NADPH作为氧化还原电势产生。为了将这种NADPH池用于EtOH生产，将来自穆尔氏菌属(Moorella sp)HUC 22-1的NADP-依赖性ADH编码基因在来自运动发酵单胞菌的NAD-依赖性ADH基因下游引入到菌株DG_17和DG_18中。 
这些新的菌株，称为DG_21(amy::TufB-amy1-amy2-arabinofur；pta::pgroESL-pdcZm-adhZm-adhMo-pTufA-kan)和DG_22(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur；pta/ack::pgroESL-pdcZm*-adhZm*-adhMo-pTufA-kan)，已通过在含卡那霉素板上选择菌株而获得。 
这些菌株表达两种不同类型的ADH，一种依赖于NAD而一种依赖于NADP。如下表3所示，共表达确实最大化乙醇生产。事实上，相比于DG-17，作为两种ADH基因表达的结果，菌株DG-21在1L生物反应器中产生更多5倍的乙醇。 
表3
F4.通过在arabinofur基因下游，插入来自菌株DRH46的内切纤维素酶编码基因DRH46.66_2727(endocell)的生物质降解的完成 
含有以下构建体(pTufA-endocell-bleo)的DNA片段，其中内切纤维素酶编码基因DRH46.66_2727在具有bleo抗性基因的操纵子中并且在pTufA启动子控制下放置，在arabinofur基因下游插入到菌株DG_21的染色体(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur；pta::pgroESL-pdcZm-adhZm-adhMo-pTufB-kan) 中，得到菌株DG_23(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur-pTufA-endocell-bleo；pta::pgroESL-pdcZm-adhZm-adhMo-pTufA-kan)。使用与cat基因直接上游和下游同源的500bp片段进行插入，由此替代整个cat基因。检查菌株的标记物替代(cat至bleo)并通过PCR确认。 
还将内切纤维素酶编码基因插入到菌株DG_22中，得到菌株DG_24(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur-pTufA-endocell-bleo；pta::pgorESL-pdcZm*-adhZm*-adhMo-pTufA-kan)。 
F5.在具有endocell基因的操纵子中，插入来自菌株M1-3H的外切纤维素酶编码基因M1-3H.284_1-4(exocell) 
在编码转录单元pgroESL-sacBBs-cat的序列后，含有的外切纤维素酶编码基因284_1-4(exocell)的插入盒A[sacB,来自枯草杆菌的果聚糖蔗糖酶基因，在具有cat抗性基因的操纵子中并在pgroESL启动子的控制下]用于插入到DG_23和DG_24的染色体中，产生菌株DG_25(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur-pTufA-endocell-exocell-pgroESL-sacB-cat,pta::pgroESL-pdcZm-adhZm-adhMo-pTufB-kan)和DG_26(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur-pTufA-endocell-exocell-pgroESL-sacB-cat,pta::pgroESL-pdcZm*-adhZm*-adhMo-pTufA-kan)。使用与bleo基因直接上游和下游的区域同源的500bp片段进行插入，因此代替整个bleo基因。所得菌株通过PCR检查器操纵子结构，以及标志物替代(bleo至cat)。 
G.DG_16中的非GMO乙醇生产路径的插入 
具有来自异常球菌misasensis(SEQ ID NO:11)的乙醛脱氢酶编码基因(DSM22328.88_978)和来自解纤维素异常球菌(Deinoccocus cellulosilyticus)DRH46(SEQ ID NO:13)的醇脱氢酶编码基因(DRH46.26_648)的乙醇生产操纵子，在pgroESL启动子的控制下放置，并将pTufA-bleo博来霉素抗性盒插入到菌株DG_16的染色体中代替编码磷酸乙酰转移酶的内生性pta基因(26_1230)。所得菌株称为DG_29(amy::pTufB-amy1-amy2-arabinofur；pta::pgroESL-acdhDSM22328-adhdrh46-pTufA-bleo)。 
H.从抗生素抗性基因清洁最终修饰的菌株 
为了缺失pgroESL-sacBBs-cat转录单元，将带有侧悬pgroESL-sacBBs-cat的区域的序列的DNA片段插入到菌株DG_25和DG_26的染色体中。使用相同策略来从“乙醇”操纵子去除卡那霉素抗性基因。来自枯草杆菌的sacB基因用作计数-选择标记物，因为它编码对蔗糖的毒性。最终操纵子结构通过PCR和测序确认。 
I.通过缺失竞争性代谢路径优化乙醇生产 
使用以下检测/清洁盒系列地进行编码竞争性活性的4个靶基因的缺失。盒骨架含有在pgroESL启动子控制下的sacBBs-cat转录单元(来自枯草杆菌的果聚糖蔗糖酶基因，在具有氯霉素cat抗性基因的操纵子中)。使用博来霉素选择，该盒插入到DG菌株的染色体中代替靶基因(一次一个)。对于每次插入，使用第二DNA片段，其中侧悬靶标座位的2个染色体区域被组装，以获得清洁缺失，从染色体去除pgroESL-sacB-cat单元，并在含蔗糖介质中计数选择。 
该方法用于以下遗传型缺失： 
-编码基因31_22的丙氨酸脱氢酶 
-编码基因52_885的葡萄糖脱氢酶1(GDH1) 
-编码基因22_1025的葡萄糖脱氢酶2(GDH2) 
-编码基因52_1088的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK) 
-编码基因12_1095的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC) 
-编码基因34_424的苹果酸脱氢酶 
J.发酵罐中的优化生产 
菌株DG_21在Infors HT multifors 2-倍1L发酵罐系统中培养。用于两个容器的培养条件为45℃温度、400rpm搅拌速度、气流65mL/min，在7的pH通过1M NaOH和1,5M H3PO4维持。 
接种物在具有10g/L葡萄糖电脑复合介质上在摇瓶中培养。添加博来霉 素抗生素，终浓度为6μg/mL。用于接种物培养的条件为45℃和150rpm。第一批细胞从甘油储液接种至各自含有20mL所述介质的250mL Erlenmeyer瓶。在16h后，将含有200mL新鲜介质的1L Erlenmeyer瓶以OD600nm 0.05接种并温育22h。对来自250mL Erlenmeyer瓶的足量细胞悬浮液离心并再悬浮在含有10mL复合介质(具有10g/L葡萄糖)的接种瓶中。将细胞从接种瓶转移到具有注射器的容器中。 
培养介质通过将各组分称重到小瓶中并用冷自来水天长该瓶至1L标线。然后将介质倒入容器中并将1mL的1:10稀二氧化硅消泡剂加入懂啊混合物中以防止灭菌期间起泡。然后将容器在121℃高压灭菌25分钟。每个容器中使用的培养介质描述如下： 
通过使用无菌玻璃瓶，通过取样管，每天手动地进行取样。从这些样品，进行多种分析： 
.生物质定量通过实施qPCR方法进行。 
.游离葡萄糖使用YSI分析仪定量。 
.气相色谱FID分析(Varian CP-WAX 57CB 25m*0.32mm柱)用来定量醇。 
.有机酸通过液相色谱质谱(MicrOTOF-QII Bruker)定量。 
结果在以下提供。它们证实，在发酵罐中，DG_21可以产生接近2g/L的乙醇滴度。而且，它们证实，生产的动力学非常主动，因为低葡萄糖消耗和高细胞密度可以达到，进一步记录了本发明的细菌的显著的性能。 
更具体地，图5示出了约7g/L的生物质细胞密度可以在小麦上培养后在稳定期达到，以及葡萄糖消耗甚至在稳定期还继续。 
图6示出了乙醇生产是线性的并且在96小时培养中达到大约2g/L。当葡萄糖从介质中耗尽时，乙醇生产不再进一步增加并且观察到平台。相关地，琥珀酸盐和乙酸盐在上清中检测到，分别达到约3.0g/L和1.2g/L。 
图7示出了，在淀粉乳上培养后，约15g/L的生物质细胞密度可以在稳 定期达到，以及葡萄糖消耗即使在稳定期中也继续。在144h后，剩余的总葡萄糖为约20g/L，这表明葡萄糖的低消耗速率。 
图8示出了乙醇生产逐渐增加，并且在淀粉乳中在144小时培养中达到大约2g/L。相关地，乙酸盐生产显著降低。 
因此，这些结果显示了细菌从生物质生产高水平乙醇的性能。 

Claims (26)

1.一种异常球菌属(Deinococcus)或相关细菌，其包含插入其基因组中的重构生物质降解转录单元，所述单元包括在单个启动子控制下的至少2个基因，所述至少2个基因编码在生物质降解或水解为可发酵糖中涉及的独特生物质降解酶。
2.根据权利要求1所述的细菌，其中所述生物质降解酶选自淀粉酶、阿拉伯呋喃糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、α-葡糖苷酸酶和酯酶，优选选自淀粉酶、阿拉伯呋喃糖酶和纤维素酶。
3.根据权利要求1或2所述的细菌，其中所述单元包含在单个启动子控制下的三个基因，所述三个基因的每一个编码优选选自淀粉酶、阿拉伯呋喃糖酶和纤维素酶的不同生物质降解酶。
4.根据权利要求1、2或3所述的细菌，其中所述单元包含，在所述单个启动子控制下，2个不同淀粉酶基因，或1淀粉酶基因和1个阿拉伯呋喃糖酶基因，或2个淀粉酶基因和1个阿拉伯呋喃糖酶基因。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细菌，其中所述淀粉酶α淀粉酶，优选选自包含SEQ ID NO:2或4(氨基酸序列)的淀粉酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细菌，其中所述纤维素酶是内切纤维素酶或外切纤维素酶，优选选自包含SEQ ID NO:8或10(氨基酸序列)的纤维素酶。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的细菌，其中所述阿拉伯呋喃糖酶包含SEQ ID NO:6(氨基酸序列)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细菌，其中所述单元进一步包含至少一个在第二启动子控制下的额外基因。
9.根据权利要求8所述的细菌，其中所述单元包含(i)在单个启动子控制下，2个淀粉酶基因，或1个淀粉酶基因和1个阿拉伯呋喃糖酶基因，或2个淀粉酶基因和1个阿拉伯呋喃糖酶基因；和(ii)在第二启动子控制下，至少一个纤维素酶基因，优选1个内切纤维素酶基因和1个外切纤维素酶基因。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细菌，其中所述细菌是异常球菌属细菌并且所述生物质降解酶起源于异常球菌属细菌。
11.根据前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述单个或第二启动子选自异常球菌pTufA启动子、pTufB启动子或pGroESL启动子。
12.根据前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述重构生物质降解转录单元不含有非异常球菌来源的核酸。
13.根据前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述重构生物质降解转录单元插入在所述细菌的基因组中代替内源性基因，优选代替内源性淀粉酶基因。
14.根据前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述细菌进一步包含重组醇生产转录单元，优选重组乙醇生产转录单元。
15.根据权利要求14所述的细菌，其中所述重组醇生产转录单元包含至少一个编码醇脱氢酶和/或丙酮酸脱羧酶的核酸序列。
16.根据权利要求14或15所述的细菌，其中所述醇生产转录单元包含至少一个编码NADP-依赖性ADH的核酸序列。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的细菌，其中所述醇生产转录单元插入在所述细菌的基因组中，优选代替内源性磷酸乙酰转移酶基因。
18.一种异常球菌或相关细菌，其中所述细菌含有失活的磷酸乙酰转移酶基因。
19.一种异常球菌或相关细菌，其中所述细菌包含至少一个编码NADP-依赖性ADH的重组核酸序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的细菌，其是中度嗜热菌(D.geothermalis),解纤维素异常球菌(D.cellulolysiticus),耐辐射异常球菌(D.radiodurans),解蛋白异常球菌(D.proteolyticus),抗放射异常球菌(D.radiopugnans),嗜放射异常球菌(D.radiophilus),D.grandis,印度异常球菌(D.indicus),产气异常球菌(D.frigens),D.saxicola,马里科帕部落异常球菌(D.maricopensis),大理石异常球菌(D.marmoris),沙漠异常球菌(D.deserti),默氏异常球菌(D.murrayi),空气异常球菌(D.aerius),网文异常球菌(D.aerolatus),嗜气异常球菌(D.aerophilus),雅瑟留异常球菌(D.aetherius),D.alpinitundrae,高地异常球菌(D.altitudinis),D.apachensis,水生异常球菌(D.aquaticus),D.aquatilis,D.aquiradiocola,水活异常球菌(D.aquivivus),淤泥异常球菌(D.caeni),D.claudionis,无花果异常球菌(D.ficus),戈壁异常球菌(D.gobiensis),D.hohokamensis,D.hopiensis,D.misasensis,纳瓦河部落异常球菌(D.navajonensis),D.papagonensis,D.peraridilitoris,D.pimensis,D.piscis,D.radiomollis,玫瑰色异常球菌(D.roseus),D.sonorensis,乌鲁木齐异常球菌(D.wulumuqiensis),D.xibeiensis,新疆异常球菌(D.xinjiangensis),D.yavapaiensis或云微所异常球菌(D.yunweiensis)。
21.一种组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的细菌和至少一种其他细菌。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的异常球菌或相关细菌的酶提取物。
23.一种生物催化剂，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的细菌，或根据权利要求22所述的提取物。
24.一种用于转化生物质的方法，包括将生物质暴露于根据权利要求1至20中任一项所述的异常球菌或相关细菌，或权利要求22所述的提取物，或权利要求21所述的组合物。
25.一种用于生产醇，优选乙醇的方法，包括将糖或生物质暴露于根据权利要求1至20中任一项所述的异常球菌或相关细菌，或权利要求22所述的提取物，或权利要求21所述的组合物。
26.根据权利要求1至20中任一项所述的异常球菌或相关细菌，或权利要求22的提取物，或权利要求21所述的组合物用于生产醇，优选乙醇的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438176A (zh) * 2019-06-27 2019-11-12 中国农业科学院生物技术研究所 具有酯酶功能的基因estDR4及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3105336A1 (en) * 2014-02-14 2016-12-21 Deinove Biomass transformation
US10392623B2 (en) 2015-02-16 2019-08-27 Deinove L-arabinose assimilation pathway and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009063079A1 (en) * 2007-11-14 2009-05-22 Deinove Use of bacteria for the production of bioenergy
WO2010094665A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Deinove Compositions and methods for degrading lignocellulosic biomass
WO2010130812A1 (en) * 2009-05-14 2010-11-18 Deinove High performance metabolic bacteria
WO2010130806A1 (en) * 2009-05-14 2010-11-18 Deinove Recombinant bacteria and the uses thereof for producing ethanol

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5482846A (en) 1988-08-31 1996-01-09 University Of Florida Ethanol production in Gram-positive microbes
WO2001023526A1 (en) 1999-09-27 2001-04-05 The Henry M. Jackson Foundation Engineered radiation resistant bioremediating bacteria
JP3845697B2 (ja) 2002-02-22 2006-11-15 独立行政法人 日本原子力研究開発機構 放射線抵抗性細菌／大腸菌シャトルベクター
WO2005042750A1 (en) * 2003-10-31 2005-05-12 Novozymes A/S Method for stable gene-amplification in a bacterial host cell
ES2369605T3 (es) * 2004-11-29 2011-12-02 Inbicon A/S Hidrólisis enzimática de biomasas que tienen un alto contenido de materia seca (ms).
GB0511602D0 (en) 2005-06-07 2005-07-13 Tmo Biotec Ltd Microorganisms
ES2431644T3 (es) * 2006-05-22 2013-11-27 Biogasol Ipr Aps Cepa BG1 de Thermoanaerobacter mathranii
JP2008086310A (ja) * 2006-09-04 2008-04-17 Gekkeikan Sake Co Ltd セルロース分解酵素を表層提示する酵母及びその利用
WO2010101158A1 (ja) * 2009-03-02 2010-09-10 住友商事株式会社 クロストリジウム セルロボランス由来新規遺伝子及びその利用
CA2816286A1 (en) * 2010-11-08 2012-05-18 Deinove Enzymes and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009063079A1 (en) * 2007-11-14 2009-05-22 Deinove Use of bacteria for the production of bioenergy
WO2010094665A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Deinove Compositions and methods for degrading lignocellulosic biomass
WO2010130812A1 (en) * 2009-05-14 2010-11-18 Deinove High performance metabolic bacteria
WO2010130806A1 (en) * 2009-05-14 2010-11-18 Deinove Recombinant bacteria and the uses thereof for producing ethanol

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438176A (zh) * 2019-06-27 2019-11-12 中国农业科学院生物技术研究所 具有酯酶功能的基因estDR4及其应用

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