CN108603186B - 共表达外源糖化酶的酵母菌株、获得所述酵母菌株的方法及其用于生产生物乙醇的用途 - Google Patents

共表达外源糖化酶的酵母菌株、获得所述酵母菌株的方法及其用于生产生物乙醇的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及改进的酿酒酵母菌株，其特征在于，它们共表达编码真菌来源的糖化酶的基因和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。本发明还涉及一种用于获得酵母菌株的方法，所述方法包括以下步骤：a)遗传改造酿酒酵母使其共表达编码真菌来源的糖化酶的基因和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因；b)在糊精培养基上培养并发酵步骤a)获得的菌株；c)选择发酵动力学至少等于或大于根据布达佩斯条约于2015年7月9日以保藏号I‑4999保藏于CNCM[法国国家微生物培养物中心]的菌株在相同条件下获得的发酵动力学的菌株。根据本发明的酵母菌株在生产生物乙醇中特别有用。

Description

共表达外源糖化酶的酵母菌株、获得所述酵母菌株的方法及 其用于生产生物乙醇的用途
技术领域
本发明涉及遗传改造从而共表达编码真菌来源和酿酒酵母糖化变种(Saccharomyces cerevisiae var.diastaticus)的糖化酶的基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。这种菌株在生产生物燃料，尤其是生物乙醇中特别有用。本发明还涉及获得这些酵母的方法以及这些酵母用于生产生物乙醇的用途。
背景技术
在过去几年，使用生物质生产生物乙醇已经吸引了大量注意。由农业残余物、工业废物和快速生长的植物生产的乙醇尤其被认为是有前途的替代燃料。
目前，“第一代”生物乙醇主要分别由巴西和美国的蔗糖和富含淀粉的种子使用酿酒酵母菌株生产，所述酿酒酵母菌株可以以高醇性滴度、生产率和产量将葡萄糖发酵成乙醇。
能够将淀粉转化为生物乙醇的方法需要将生物质淀粉预水解和液化、将液化淀粉转化为可发酵糖(通过水解淀粉)和将这些糖发酵为乙醇。后两个步骤通常同时进行。
淀粉水解需要称为淀粉分解酶的作用，但不幸地，大部分酿酒酵母不含这种类型的酶。目前，从由淀粉组成的生物质产生乙醇最终需要在两个步骤中添加外源的酶：第一步添加外源的淀粉分解酶以预水解并液化生物质中含有的淀粉；第二步使用其他外源酶以水解液化淀粉，并使用酿酒酵母发酵释放的可发酵糖。
外源酶的使用造成显著的成本增加和时间损失，因此获得能够水解液化淀粉且能够有效发酵水解液化淀粉产生的糖的酵母菌株是非常有利的。
发明简述
在本文中，本发明的发明人已经开发了遗传改造的酿酒酵母菌株，所述菌株共表达几个外源的糖化酶基因。具体地，根据本发明的酿酒酵母菌株共表达编码真菌来源的糖化酶的基因和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因两者。发明人证明，这些菌株能够水解从生物质提取的液化淀粉，同时成功地有效发酵所述水解产生的糖。实际上，使用根据本发明的酵母菌株能够替代液化淀粉转化为生物乙醇期间所需的外源酶的全部或一部分量。
因此，根据第一个方面，本发明涉及酿酒酵母菌株，其特征在于，它共表达：
-编码真菌来源的糖化酶的基因；和
-编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
发明人还开发了获得酿酒酵母菌株的方法，所述酿酒酵母菌株能够水解淀粉并发酵所述水解产生的糖。
因此，根据第二个方面，本发明涉及获得酵母菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
a)遗传改造酿酒酵母使其表达编码真菌来源的糖化酶的基因和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因；
b)在糊精培养基上培养并发酵步骤a)获得的菌株；
c)选择发酵动力学至少等于或大于根据布达佩斯条约于2015年7月9日以保藏号I-4999保藏于CNCM(法国国家微生物培养中心)的菌株在相同条件下获得的发酵动力学的菌株。
根据另一个方面，本发明涉及从生物质生产生物乙醇的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
a)预水解并液化生物质的淀粉；
b)将步骤a)获得的液化淀粉与根据本发明改造的酿酒酵母接触；
c)通过所述酵母水解并发酵液化淀粉；
d)提取步骤c)产生的乙醇。
此外，本发明涉及根据本发明改造的酿酒酵母菌株用于生产生物燃料的用途。
发明详述
为了获得能够水解淀粉并发酵淀粉水解产生的糖的酵母菌株，发明人遗传改造了酿酒酵母菌株，使其共表达两个编码外源糖化酶的基因。
因此，本发明的第一个方面是酿酒酵母菌株，其特征在于，它共表达：
-编码真菌来源的糖化酶的基因；和
-编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
具体地，本发明的一个主题是酿酒酵母菌株，其特征在于，它共表达：
-编码真菌来源的糖化酶的基因；和
-编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因，
其中所述酿酒酵母糖化变种的糖化酶的蛋白序列是SEQ ID NO：4。
出乎意料地，发明人发现，特定使用酿酒酵母糖化变种的糖化酶基因和真菌来源的糖化酶基因能够获得具有优异水解能力的菌株。
这些结果特别出乎意料，因为已知酿酒酵母糖化变种的糖化酶具有比真菌来源的糖化酶少得多的有效产量，这使得酶生产商很少使用这种酶。这个前提例如在以参考号WO2011/153516公开的国际专利申请中得到证明，该专利申请描述了酶的筛选，包括酿酒酵母糖化变种的糖化酶(GenBank ID：AAA35107.1)。在该文件中，没有将酿酒酵母糖化变种的糖化酶保留为对其酶活性感兴趣。
表述“酵母菌株”是指相对均匀的酵母细胞群。酵母菌株获得自克隆，克隆是从单个酵母细胞获得的酵母细胞群。
在本文中，术语“编码糖化酶的基因”意欲是指当表达时，提供功能性糖化酶蛋白的氨基酸序列。
在本文中，术语“糖化酶”意欲是指能够从直链淀粉和支链淀粉的非还原端开始水解粗淀粉或可溶淀粉的α-1，4糖苷键的酶。淀粉酶也称为淀粉葡萄糖苷酶或γ-淀粉酶(MEDLINE参考号：EC3.2.1.3)。除了作用于α-1，4键，糖化酶能够缓慢水解支链淀粉分子的α-1，6键，前提是序列中相邻的键是α-1，4键。
真菌来源的糖化酶选自已知具有良好酶活性的商业糖化酶，特别地，真菌来源的糖化酶选自以下：黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶、扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)的糖化酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)的糖化酶、米根霉(Rhizopus oryzae)的糖化酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)的糖化酶和疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosis)的糖化酶。
这些糖化酶是本领域技术人员已知的，它们的序列可以从以下GenBank参考号获得(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)：里氏木霉(ETS06561)、米根霉(BAA00033)、米曲霉(BAA00841)、疏棉状嗜热丝孢菌(ABQ23180)。
根据一个具体的实施方案，真菌来源的糖化酶是黑曲霉或扣囊复膜酵母的糖化酶。
扣囊复膜酵母的糖化酶由核酸序列为SEQ ID NO：17的GLU0111基因编码，其蛋白质序列为SEQ ID NO：18。黑曲霉的糖化酶由核酸序列为SEQ ID NO：1的GLAA基因编码，其蛋白质序列为SEQ ID NO：2。
酿酒酵母糖化变种的糖化酶由核酸序列为SEQ ID NO：3的STA1基因编码，其蛋白质序列为SEQ ID NO：4。
因此，在一个具体的实施方案中，本发明的主题是酿酒酵母菌株，其特征在于，它包含核酸序列SEQ ID NO：1和核酸序列SEQ ID NO：3。
在一个实施方案中，本发明的主题是酿酒酵母菌株，其特征在于，它共表达：
-编码黑曲霉的糖化酶的基因；和
-编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
在一个具体的实施方案中，本发明的主题是酿酒酵母菌株，其特征在于，它共表达：
-编码黑曲霉的糖化酶的基因；和
-编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因，
其中酿酒酵母糖化变种的糖化酶的蛋白序列是SEQ ID NO：4，黑曲霉的糖化酶的蛋白序列是SEQ ID NO：2。
表述“真菌来源的糖化酶”和“酿酒酵母糖化变种的糖化酶”不应当严格解释：它们涵盖由上述核酸序列编码的真菌来源和酿酒酵母糖化变种的糖化酶，也涵盖这些糖化酶的功能性变体。
通常，根据本发明的糖化酶的功能性变体的蛋白质序列与所述糖化酶的蛋白质序列具有至少80％、90％、95％，更具体的99％的百分比同一性。例如，黑曲霉和酿酒酵母糖化变种的糖化酶的功能性变体的蛋白质序列分别与SEQ ID NO：2或4具有至少80％、90％、95％，更具体的99％的百分比同一性。
“百分比同一性”是氨基酸序列之间的比较，并通过将在比较窗口上最佳比对的两个序列进行比较来确定。本领域技术人员知道如何计算两个序列之间的百分比同一性，并且他们有很多工具进行计算。两个序列中的一个与另一个序列相比可以具有氨基酸插入、取代和缺失。
本领域技术人员知道如何选择根据本发明的糖化酶的功能性变体。术语“功能性变体”意欲是指保留其糖化酶活性(即，具有相似的淀粉水解动力学特征)的变体。本申请的实验部分描述了测量和比较淀粉水解动力学的方法。可以通过各种常规方法，例如随机突变或定点突变来制备功能性变体。
本领域技术人员知晓很多将基因引入酵母菌株的方法，尤其是通过使用包含表达盒的载体。术语“载体”意欲是指其中可能插入外源核酸片段的任何DNA序列，载体能够将外源DNA引入宿主细胞。载体的实例有：质粒、黏粒和病毒衍生的载体。载体允许异源基因直接整合入酵母基因组，或在单独的质粒中表达。
将载体引入宿主细胞的方法是本领域技术人员广泛知晓的。一些方法特别描述于“Current Protocols in Molecular Biology”，13.7.1-13.7.10；或描述于Ellis T.等，Integrative Biology，2011，3(2)，109-118。
根据本发明，编码真菌来源的糖化酶的基因和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因可以插入一个相同的载体，或插入两个单独的载体。
因此，根据本发明一个具体的方面，将编码真菌来源的糖化酶的基因和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因各自单独整合入载体。根据一个具体的实施方案，载体是质粒。
在本发明一个具体的实施方案中，将编码真菌来源的糖化酶的基因和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因整合入所述酵母的基因组。
根据本发明的载体还可以携带可选择标记。术语“可选择标记”意欲是指其在包含它的酵母上的表达赋予能够选择它们的特征的基因。例如，它是抗生素抗性基因或允许酵母在特定培养基上生长的基因。
根据本发明的基因可以与启动子、终止子或其在酵母中的表达所需的任何其他序列功能性相连。
在本发明一个具体的模式中，编码真菌来源和酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因的表达由“强”启动子控制。本领域技术人员知晓“强启动子”的含义。强启动子例如是pADH1启动子、pTEF启动子或pTDH3启动子。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的酿酒酵母菌株，其中编码真菌来源的糖化酶的基因和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因由pADH1启动子控制。
编码真菌来源和酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因可以作为几个拷贝存在。
因此，在一个具体的实施方案中，本发明涉及如上所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，它包含m个拷贝的编码真菌来源的糖化酶的基因和n个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因，其中m是2-10的整数，n是2-10的整数。
因此，m和n独立地等于2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一个更具体的实施方案中，m是2-8的整数，n是2-8的整数。
本发明尤其涉及如上所述的酿酒酵母菌株，所述菌株是根据布达佩斯条约于2015年8月6日以保藏号I-5005保藏于CNCM的菌株，或根据布达佩斯条约于2015年7月9日以保藏号I-4997保藏于CNCM的菌株。
I-5005和I-4997酵母菌株包含至少4个拷贝的编码黑曲霉的糖化酶的基因，和至少3个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
本发明还涉及两个如上所述的酿酒酵母菌株，所述菌株是根据布达佩斯条约于2016年8月11日以保藏号I-5119保藏于CNCM的菌株，或根据布达佩斯条约于2016年8月11日以保藏号I-5120保藏于CNCM的菌株。
I-5119酵母菌株包含8个拷贝的编码黑曲霉的糖化酶的基因，和4个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
I-5120酵母菌株包含4个拷贝的编码黑曲霉的糖化酶的基因，和8个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
本发明还涉及两个如上所述的酿酒酵母菌株，所述菌株是根据布达佩斯条约于2016年8月11日以保藏号I-5121保藏于CNCM的菌株，或根据布达佩斯条约于2016年8月11日以保藏号I-5122保藏于CNCM的菌株。
I-5121酵母菌株包含4个拷贝的编码扣囊复膜酵母的糖化酶的基因，和4个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
I-5122酵母菌株包含4个拷贝的编码扣囊复膜酵母的糖化酶的基因，和8个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
同时，发明人开发了获得能够水解淀粉的酿酒酵母菌株的方法。
因此，根据另一个方面，本发明的主题是获得酵母菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
a)遗传改造酿酒酵母使其共表达编码真菌来源的糖化酶的基因和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因；
b)在糊精培养基上培养并发酵步骤a)获得的菌株；
c)选择发酵动力学至少等于或大于根据布达佩斯条约于2015年7月9日以保藏号I-4999保藏于CNCM的参考菌株在相同条件下获得的发酵动力学的菌株。
步骤a)的酿酒酵母是用于生产生物乙醇的酵母。
根据本发明一个具体的实施方案，步骤a)的酿酒酵母是于2008年9月4日以保藏号I-4071保藏于CNCM的Ethanol
Figure BDA0001610219650000081
酵母，以下称为ER。
术语“糊精培养基”意欲是指本领域技术人员已知的含有糊精的合成培养基。例如，它是含有淀粉糊精(220g/kg)、酵母提取物(5g/kg)、尿素(2g/kg)、磷酸二氢钾(1g/kg)和矿物质和维生素的合成培养基。
I-4999参考菌株是遗传改造的Ethanol
Figure BDA0001610219650000082
酵母菌株，其含有4个拷贝的编码扣囊复膜酵母的糖化酶的基因。
发酵动力学可以容易地通过本领域技术人员已知的各种技术来测量。例如，发酵动力学可以通过随时间称量的发酵监测来测量。
因此，选择的菌株对于从生物质生产生物燃料，尤其是生物乙醇特别有利。
术语“生物质”是指可以转化为能量的有机物的集合。各种类型的生物质，包括木材、农业残余物、草本作物，均可以用于生产生物燃料，尤其是生物乙醇。生物燃料被表征为“生物的”，因为它从可再生生物质产生。
因此，本发明涉及从生物质生产生物乙醇的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
a)预水解并液化生物质的淀粉；
b)将步骤a)获得的液化淀粉与根据本发明的酵母接触；
c)通过所述酵母水解并发酵液化淀粉；
d)提取步骤c)产生的乙醇。
根据一个具体的实施方案，如上所述的生产生物乙醇的方法还包括在步骤b)之后和/或步骤c)期间添加外源糖化酶的步骤b’)。
由此产生的乙醇可以具有多种用途，尤其是在汽车行业。
本发明还涉及如上所述的酵母菌株在生产生物燃料，尤其是生物乙醇中的用途。
附图说明
图1示出了两个糖化酶的过表达和克隆载体pANG和PSDG的实例。该载体是用于酵母中的基因表达的综合克隆载体。pADH1：酿酒酵母的ADH1启动子；tCYC1：酿酒酵母的CYC1终止子；Kan-MX：遗传霉素抗性标记；AmpR：氨苄青霉素抗性标记。BUD5-A和BUD5-B：在BUD5基因座整合的重组发生区。
图2描述了在HO基因座插入4个表达模块和1个选择模块的克隆策略。
图3描述了获得I-5005菌株(A)的策略和各个步骤。
图4示出了在YEG/淀粉培养基上筛选88个ER-GAND克隆的结果的实例。孵育48h后，淀粉的水解在分泌功能性糖化酶的酵母菌落周围呈现清晰的晕圈。在第12栏的酵母1-6是对照菌株，其允许比较晕圈的大小和强度。
图5示出了通过在糊精培养基上发酵进行的ER-GAND系列8000克隆的筛选。示出了三个发酵时间(20h、31h和54h)。箭头表示选择的15个ER-GAND-系列8000克隆。
图6示出了筛选的最佳的30个ER-GAND克隆和4个对照菌株(ER、I-4998、I-4899和I-4999)在糊精培养基上的发酵。发酵在32℃进行，且通过重量损失(g/kg)监测74h。
图7示出了筛选的最佳的5个ER-GAND系列7000克隆和3个对照菌株(I-4998、I-4899和I-4999)在工业玉米培养基上的发酵。发酵在32℃进行，且通过重量损失(g/kg)监测70h。
图8描述了获得I-5119(A)和I-5210(B)菌株的策略和各个步骤。
图9描述了获得ER-SDG-4c和ER SDG 8c对照菌株的策略和各个步骤。
图10描述了获得ER-ANG-8c菌株的策略和各个步骤。
图11示出了筛选的最佳的3个ER-GAND-12000克隆和6个对照菌株(I-4071、I-4899、I-4997、I-4998、ER-ANG-8c和ER-SDG-4c)在糊精培养基上的发酵。发酵在32℃进行，且监测重量损失(g/kg)70h。
图12示出了筛选的最佳的3个ER-GAND-48000克隆和4个对照菌株(I-4071、I-4899、I-4997和ER-SDG-8c)在糊精培养基上的发酵。发酵在32℃进行，且通过重量损失(g/kg)监测70h。
图13示出了糖化酶的过表达和克隆载体pSFG的实例。该载体是用于酵母中的基因表达的综合克隆载体。pADH1：酿酒酵母的ADH1启动子；tCYC1：酿酒酵母的CYC1终止子；Kan-MX：遗传霉素抗性标记；AmpR：氨苄青霉素抗性标记。BUD5-A和BUD5-B：在BUD5基因座整合的重组发生区。
图14描述了获得I-5121(A)和I-5122(B)菌株的策略和各个步骤。
图15示出了筛选的最佳的4个ER-GFD-8000克隆和3个对照菌株(I-4071、I-4999和ER-SDG-4c)在糊精培养基上的发酵。发酵在32℃进行，且通过重量损失(g/kg)监测70h。
图16示出了筛选的最佳的4个ER-GFD-48000克隆和5个对照菌株(I-4071、I-4999、ER-SDG-4c、ER-SDG-8c和ER-GFD-8044)在糊精培养基上的发酵。发酵在32℃进行，且通过重量损失(g/kg)监测70h。
图17示出了筛选的最佳ER-GAND克隆和4个对照菌株(I-4899、I-4997、ER-SDG-4c和ER-SDG-8c)在工业玉米培养基上的发酵。发酵在32℃进行，且通过重量损失(g/kg)监测70h。
图18示出了筛选的最佳ER-GFD系列8000克隆和3个对照菌株(I-4999、ER-SDG-4c和ER-SDG-8c)在工业玉米培养基上的发酵。发酵在32℃进行，且通过重量损失(g/kg)监测70h。
具体实施方式
实施例1：在酿酒酵母菌株中整合4个拷贝的编码黑曲霉的糖化酶的基因和至少3个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
用酿酒酵母的密码子使用偏好合成黑曲霉的糖化酶基因GLAA(SEQ ID NO：1)和酿酒酵母糖化变种的糖化酶基因STA1(SEQ ID NO：3)的拷贝。
将使用的DNA序列克隆至包含以下的标准载体：
-整合靶标；
-选择的启动子/终止子，例如pADH1/tCYC1；
-随后可以移除的抗性标记。
在本实施例中，使用pANG质粒(申请人的内部名称)表达黑曲霉的GLAA糖化酶(图1)。同样，制备质粒pSDG(申请人的内部名称)以表达酿酒酵母糖化变种的STA1糖化酶。
以下可以详细解释克隆4个拷贝的GLAA或至少3个拷贝的STA1的原理：
-用3对或4对不同的寡核苷酸扩增包含pADH1启动子、糖化酶的ORF和tCYC1终止子的表达模块。PCR扩增后获得的各个模块具有这3个共同的元件。
-包含强启动子/终止子和一个基因的选择模块，所述基因在包含它的酵母上的表达赋予能够选择它们的特征。它是例如抗生素抗性基因或允许酵母在特定培养基上生长的基因。由于抗生素标记抗性模块侧翼是LoxP位点，随后可以通过Cre重组酶的作用将其移除。
“ORF”是指“开放阅读框”。
用于在HO基因座整合4个拷贝的GLAA基因和选择模块的引物如下：
1f-Gibson AMG：
TCTGATGGCTAACGGTGAAATTAAAGACATCGCAAACGTCACGGCTAACTTGAAGCTTCGTACGCTGCAGG(SEQ ID No.：5)
A1-Gibson AMG：
TCACTGTACGGTGAGAACGTAGATGGTGTGCGCATAGGCCACTAGTGGATCT(SEQ ID No.：6)
A2-Gibson AMG：
CACACCATCTACGTTCTCACCGTACAGTGAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：7)
B1-Gibson AMG：
TTACGTAGACTGAGTAGCAACGGTTGAGGACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：8)
B2-Gibson AMG：
TCCTCAACCGTTGCTACTCAGTCTACGTAAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：9)
C1-Gibson AMG：
TCAGTAGCACAGAGAAGTGTAGGAGTGTAGCAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：10)
C2-Gibson AMG：
CTACACTCCTACACTTCTCTGTGCTACTGAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：11)
D1-Gibson AMG：
TTAGGATACATGCAGTAGACGAGGTAAGCACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：12)
D2-Gibson AMG：
TGCTTACCTCGTCTACTGCATGTATCCTAAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：13)
2r-Gibson AMG：
ACATACTTGCAATTTATACAGTGATGACCGCTGAATTTGTATCTTCCATACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：14)。
用于在GRE3基因座整合至少3个拷贝的STA1基因和选择模块的引物如下：
MCI-pADH1-GRE3-f：
TAAGGGATATAGAAGCAAATAGTTGTCAGTGCAATCCTTCAAGACGATTGGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：15)
A1-tCYC1-r：
TCACTGTACGGTGAGAACGTAGATGGTGTGCAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：21)
A2-Gibson AMG：
CACACCATCTACGTTCTCACCGTACAGTGAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：7)
B1-Gibson AMG：
TTACGTAGACTGAGTAGCAACGGTTGAGGACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：8)
B2-Gibson AMG：
TCCTCAACCGTTGCTACTCAGTCTACGTAAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：9)
C1-Gibson AMG：
TCAGTAGCACAGAGAAGTGTAGGAGTGTAGCAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：10)
C2-Gibson AMG：
CTACACTCCTACACTTCTCTGTGCTACTGAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：11)
D1-Gibson AMG：
TTAGGATACATGCAGTAGACGAGGTAAGCACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：12)
D2-Gibson AMG：
TGCTTACCTCGTCTACTGCATGTATCCTAAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：13)
MCI-tCYC1-GRE3-r：
CACATATACAGCATCGGAATGAGGGAAATTTGTTCATATCGTCGTTGAGTCAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：16)。
表1提及选择和表达模块中使用的寡核苷酸对。
Figure BDA0001610219650000141
表1：用于克隆4个拷贝的GLAA和例如3个或4个拷贝的STA1的引物对
“ANG基因”是指黑曲霉的糖化酶的GLAA基因。
“SDG基因”是指酿酒酵母糖化变种的糖化酶的STA1基因。
各扩增的模块在其启动子和其终止子的任一侧具有重组发生序列(A1、B1、C1和D1)。这些序列通过PCR引物的浮动尾部引入，并且使得模块可以通过这些重组基因序列之间的同源性进行比对和特异性重组(图2)。
采用的策略是，使用酵母在体内进行同源重组的天然能力作为基础，在单个步骤中将数个糖化酶基因表达模块同时整合至酿酒酵母菌株的给定基因座。
取决于制备的PCR产物的组合，至少三个糖化酶表达模块和一个选择模块可以转化入酿酒酵母菌株。
首先在整合盒(MCI)中选择模块存在的基础上选择正确整合了表达盒的克隆。
在给定基因座(例如HO基因座、多综合表达盒的5’和3’端)同源序列的存在允许通过同源重组在该给定基因座同时整合表达模块和选择模块。
使用各种可选择标记以及它们的再循环和在各个基因座的整合允许数个多综合盒的顺次且重复的整合。
例如，图3示出了获得I-5005菌株的各个步骤，解释如下。
1-在HO基因座整合黑曲霉的糖化酶(以下称为GLAA)的4个表达模块和G418选择模块(遗传霉素抗性基因/KanMX标记)，然后使其获得ER-ANG-G418菌株；
2-通过Cre重组酶的作用移除选择模块，使得能够选择于2014年10月15日以保藏号I-4899保藏于CNCM的菌株；
3-在GRE3基因座整合由酿酒酵母糖化变种的糖化酶(以下称为STA1)的数个表达模块组成的第二个盒。
共同表达黑曲霉的糖化酶(GLAA)和酿酒酵母糖化变种的糖化酶(STA1)菌株称为ER-GAND。因此，根据该构建模型，能够构建整合了至少4个拷贝的GLAA糖化酶基因和至少3个拷贝的STA1糖化酶基因的酵母。
对于ER-GAND酵母，产生两个系列的克隆。7000系列(ERGAND 7200至ER-GAND-7376)对应于整合了4个拷贝的(黑曲霉)的GLAA糖化酶基因和3个拷贝的(酿酒酵母糖化变种)的STA1糖化酶基因。至于8000系列(ER-GAND-8000至ER-GAND-8159)，克隆了至少4个拷贝的(黑曲霉)的GLAA糖化酶基因和4个拷贝的(酿酒酵母糖化变种)的STA1糖化酶基因。8159克隆对应于I-4997菌株。
下表2回顾了所用的酵母菌株及其特征。
Figure BDA0001610219650000161
表2：菌株名称/数量和整合的糖化酶基因的拷贝数的总结(nd：未保藏)。
实施例2：筛选菌株
进行了三个表型筛选，以选择用于预期应用最有效的最佳的15个克隆。
a)用碘进行的表型筛选
在YEG/淀粉琼脂培养基(1％葡萄糖、0.5％酵母提取物、1％可溶淀粉)上测试酵母转化体对可溶淀粉的水解。将酵母细胞沉积在YEG/淀粉琼脂上并于30℃孵育2天。然后用碘蒸气染色盘，以使酵母菌落周围存在的水解晕圈可视化。
使用碘蒸气的所述筛选能够选择分泌至少一种能够水解淀粉的酶的克隆。这些阳性克隆尤其可以通过水解晕圈可视化，其大小与酶活性成正比。图4示出了碘染色后，在YEG/淀粉培养基上筛选88个ER-GAND克隆的实例。表3示出了碘染色后获得的结果。
Figure BDA0001610219650000171
表3：2个ER-GAND系列的碘筛选的结果。
在各个系列筛选的176个克隆中，在实施例的培养条件下，少于3％的测试克隆不显示能够水解淀粉。应当注意，在该策略中使用的宿主菌株已经在其基因组中具有数个糖化酶基因，因此该菌株存在水解晕圈。因此，这些“阴性”克隆似乎丧失了它们的糖化酶基因。
b)通过在0.5g培养基上发酵的表型筛选
在发酵条件下，在糊精培养基上的表型筛选能够消除不能发酵或发酵比I-4899菌株更慢的ER-GAND克隆。为此，在发酵期间每天两次对生物质进行视觉监测，持续3天。通过比较生物质颗粒(pellet)相对于I-4999和I-4998对照菌株的出现速率，然后可以选择最有前景的菌株。
在图5的对照中提及的ER-SDG-1c菌株是Ethanol
Figure BDA0001610219650000172
菌株，其表达一个拷贝的酿酒酵母糖化变种的糖化酶基因(STA1)。
在图5的对照中提及的GO-ANG-4c菌株是于2013年7月25日以保藏号I-4791保藏于CNCM的
Figure BDA0001610219650000173
菌株，其表达4个拷贝的黑曲霉的糖化酶基因(GLAA)。
使用的发酵培养基是糊精培养基，其是含有淀粉糊精(220g/kg)、酵母提取物(5g/kg)、尿素(2g/kg)、KH2PO4(1g/kg)和矿物质和维生素的合成培养基。发酵最快的菌株是能够分泌大量糖化酶，从而能够通过水解糊精分子释放葡萄糖的菌株。释放的葡萄糖然后被酿酒酵母代谢以生产乙醇。
图5阐述了88个ER-GAND克隆板中发酵的实例。生物质颗粒对应于糊精培养基上发酵31h。箭头所示的克隆显示比I-4899菌株更大的生物质颗粒。这些是选择的待在100g糊精培养基上的发酵中测试的克隆。
对于各ER-GAND系列，选择15个克隆，并在100g糊精培养基上的发酵中测试。
c)通过在100g培养基上发酵的表型筛选
于32℃在100g选择性合成糊精培养基(玉米糊精220g/kg、酵母提取物5g/kg、尿素2g/kg、KH2PO41g/kg和矿物质和维生素)上进行发酵。糊精是淀粉水解物，其能够模拟真正的培养基。
将根据本发明改造的酿酒酵母菌株在YPG(酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖)培养基上于30℃预繁殖24h。将发酵培养基的初始pH调节至5.0，无调整。然后，以每千克培养基0.125g当量干物质的水平接种发酵培养基。没有向发酵培养基添加外源水解酶。通过重量损失监测72h，如图6所示。
在该类型的发酵培养基(糊精)中，t0时很少葡萄糖是游离的(约10g左右)。由于ER菌株不具有能够水解糊精的酶，它仅消耗可获得的葡萄糖，因而测量的重量损失低(约5g/kg)。
基于图6所示的重量损失监测结果，在测试的30个克隆中，根据它们在发酵中的动力学特征可以分成3组：
-A组：4个克隆，动力学谱与I-4899亲本酵母菌株相同。
-B组：2个克隆，动力学谱与I-4999参考菌株相似。
-C组：24个克隆的发酵动力学性能好于I-4999菌株(目标性能)。
在C组的菌株中，选择各系列(系列7000和8000)的最佳的5个克隆，以在工业培养基上在真正的生物燃料生产条件下测试。
实施例3：评估菌株酶活性的产量
在E140723-11工业培养基上，于32℃评估之前选择的具有4个拷贝的GLAA和3个拷贝的STA1的5个ER-GAND克隆(系列7000)，并与I-4998、I-4999和I-4899对照菌株比较。它们是以下克隆：7215、7250、7271、7296、7302。7302克隆对应于I-5005菌株。
表达来自酿酒酵母糖化变种的STA1活性的菌株(于2015年7月9日以保藏号I-4998保藏于CNCM)使其能够获得快速但不完全的糊精水解动力学，而表达来自黑曲霉的GLAA活性的菌株(I-4899)使其能够获得令人满意的糊精水解，但动力学不如I-4998好。
将菌株在培养基/水混合物(70％/30％)上于32℃预繁殖7.5h。然后将繁殖培养基转移至水平为2.5％/97.5％的发酵培养基。发酵在32℃进行。将繁殖和发酵培养基的初始pH值调节至5.0，无调整。在繁殖(1500ppm)和发酵(1000ppm)中加入尿素。在繁殖中加入剂量为0.06ml/kg的
Figure BDA0001610219650000191
Ultra(Novozyme)商购GA糖化酶固体，但发酵中不加入。
随时间测量从t＝0至t＝71h的发酵反应器的重量损失。
酒精发酵期间获得的重量损失结果如图7所示。
图7表明，新菌株能够获得与I-4998菌株一样快且与I-4899菌株一样完全的糊精水解，而且它们也比I-4999菌株快。基于此可以得出以下结论：酿酒酵母糖化变种产生的糖化酶对于黑曲霉的糖化酶的水解活性有刺激作用。这些菌株仅仅呈现出黑曲霉的真菌糖化酶和酿酒酵母糖化变种的糖化酶的特征的组合(即，具有的动力学谱在黑曲霉的糖化酶和酿酒酵母糖化变种的糖化酶之间)，但呈现出动力学加快的改进的动力学谱。因此，真菌来源的糖化酶和酿酒酵母糖化变种的糖化酶之间似乎有协同作用。
在
Figure BDA0001610219650000192
HPX 87H柱(Biorad)上，用5mM H2SO4溶液作为洗脱液，通过高效液相色谱(HPLC)测量发酵样品的组成。
发酵结束时进行的HPLC没有显示任何讨论菌株的任何主要缺陷(表4)。它们实际上回忆起STA1酶不能完全水解糊精，这与SFG和GLAA酶相反。
Figure BDA0001610219650000201
表4：发酵71H后的浓度(g/kg)
实施例4：在具有4个拷贝的编码黑曲霉的糖化酶的基因和至少4个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因的酿酒酵母菌株中整合4个额外拷贝的编码糖化酶的基因。
使用ER-GAND-8159克隆(CNCM I-4997)，将额外拷贝的糖化酶基因整合入BUD5基因座以增加两种糖化酶之一的基因的拷贝数。
在本实施例中，用于所述整合的序列是之前所述的黑曲霉的糖化酶基因GLAA(SEQID NO：1)和酿酒酵母糖化变种的糖化酶基因STA1(SEQ ID NO：3)。
克隆的总体原理与实施例1所述的相同，仅仅是整合基因座不同。
以下详细描述克隆4个额外拷贝的GLAA或4个额外拷贝的STA1的原理：
-用4对不同的寡核苷酸扩增包含pADH1启动子、糖化酶ORF和tCYC1终止子的表达模块。PCR扩增后获得的各个模块具有这3个共同的元件。
-包含强启动子/终止子和一个基因的选择模块，所述基因在包含它的酵母上的表达赋予能够选择它们的特征。它是例如抗生素抗性基因或允许酵母在特定培养基上生长的基因。由于抗生素标记抗性模块侧翼是LoxP位点，随后可以通过Cre重组酶的作用将其移除。
根据相同的克隆策略，还获得专门表达黑曲霉的糖化酶或酿酒酵母糖化变种的糖化酶的酿酒酵母菌株。这些酿酒酵母菌株然后可以在一个基因座或两个基因座包含4个或8个拷贝的相同糖化酶基因。
用于整合各个拷贝的GLAA基因或STA1基因和用于选择模块的引入如下：
MCI-pADH1-BUD5-f：
CGCTCCAGAATTAGCGGACCTCTTGAGCGGTGAGCCTCTGGCAAAGAAGAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：19)
MCI-pTEF-BUD5-f：
CGCTCCAGAATTAGCGGACCTCTTGAGCGGTGAGCCTCTGGCAAAGAAGATGAAGCTTCGTACGCTGCAGG(SEQ ID No.：20)
MCI-pADH1-GRE3-f：
TAAGGGATATAGAAGCAAATAGTTGTCAGTGCAATCCTTCAAGACGATTGGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：15)
A1-tCYC1-r：
TCACTGTACGGTGAGAACGTAGATGGTGTGCAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：21)
A2-Gibson AMG：
CACACCATCTACGTTCTCACCGTACAGTGAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：7)
B1-Gibson AMG：
TTACGTAGACTGAGTAGCAACGGTTGAGGACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：8)
B2-Gibson AMG：
TCCTCAACCGTTGCTACTCAGTCTACGTAAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：9)
C1-Gibson AMG：
TCAGTAGCACAGAGAAGTGTAGGAGTGTAGCAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：10)
C2-Gibson AMG：
CTACACTCCTACACTTCTCTGTGCTACTGAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：11)
D1-Gibson AMG：
TTAGGATACATGCAGTAGACGAGGTAAGCACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：12)
D2-Gibson AMG：
TGCTTACCTCGTCTACTGCATGTATCCTAAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：13)
MCI-tCYC1-BUD5-r：
CTCAAGAACGTAGGACGATAACTGGTTGGAAAGCGTAAACACGGAGTCAACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：22)
MCI-tCYC1-GRE3-r：
CACATATACAGCATCGGAATGAGGGAAATTTGTTCATATCGTCGTTGAGTCAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：16)。
表5提及了用于选择和表达模块的寡核苷酸对，以及用于各个构建体的宿主酵母菌株。
Figure BDA0001610219650000231
表5：用于在BUD5基因座克隆4个拷贝的GLAA和例如4个拷贝的STA1的引物对
策略与实施例1所采用的在单个步骤中在给定基因座将数个糖化酶基因表达模块同时整合入酿酒酵母菌株的策略严格相似，其使用酵母在体内进行同源重组的天然能力作为基础。
共同表达黑曲霉的糖化酶(GLAA)和酿酒酵母糖化变种的糖化酶(STA1)的菌株称为ER-GAND加上克隆号。制备了两个系列的克隆。12000系列(ER-GAND-12001至12023)整合了8个拷贝的(黑曲霉)的GLAA糖化酶基因和4个拷贝的(酿酒酵母糖化变种)的STA1糖化酶基因；48000系列(ER-GAND-480001至480088)对应于整合了4个拷贝的(黑曲霉)的GLAA糖化酶基因和8个拷贝的(酿酒酵母糖化变种)的STA1糖化酶基因。
专门表达黑曲霉的糖化酶(GLAA)的菌株称为ER-ANG-z-c，其中z对应于引入宿主菌株的GLAA基因的拷贝数。专门表达酿酒酵母糖化变种的糖化酶(STA1)的菌株称为ER-SDG-y-c，其中y对应于引入宿主菌株的STA1基因的拷贝数。
例如，图8-10示出了获得在本实施例中构建的ER-GAND-12000、ER-GAND-48000、ER-ANG-8c、ER-SDG-4c和ER-SDG-8c菌株的各个步骤。
下表6回顾了所用的酵母菌株及其特征。
Figure BDA0001610219650000241
表6：菌株名称/数量和整合的糖化酶基因的拷贝数的总结(nd：未保藏)。
实施例5：筛选菌株
进行表型筛选以选择用于预期应用最有效的最佳克隆。
a)用碘进行的表型筛选
用碘进行的表型筛选以与实施例2a)相同的方式进行。表7示出了碘染色之后获得的结果。
Figure BDA0001610219650000251
表7：对5个系列的克隆用碘进行的筛选结果。较弱的水解表型对应于克隆周围的晕圈比宿主酿酒酵母菌株的更小。
在进行筛选的所有5个系列中，仅ER-SDG-4c系列提供的克隆在实施例的培养条件下不具有淀粉水解活性。应当注意，这是其中克隆在不具有糖化酶基因的Ethanol
Figure BDA0001610219650000252
宿主菌种中进行的唯一系列。因此，这些“阴性”克隆似乎没有整合至少一个糖化酶基因。
b)通过在0.5g培养基上发酵的表型筛选
在发酵条件下，在糊精培养基上的表型筛选能够消除各个系列中不能发酵或发酵比相应的宿主菌株更慢的克隆。为此，在发酵期间每天两次对生物质进行视觉监测，持续2天。通过比较生物质颗粒相对于I-4997对照菌株的出现速率，然后可以选择最有前景的菌株。
使用的发酵培养基是糊精培养基，其是含有淀粉糊精(220g/kg)、酵母提取物(5g/kg)、尿素(2g/kg)、KH2PO4((1g/kg)和矿物质和维生素的合成培养基。发酵最快的菌株是能够分泌大量糖化酶，从而能够通过水解糊精分子释放葡萄糖的菌株。释放的葡萄糖然后被酿酒酵母代谢以生产乙醇。
对于各个克隆系列，选择2-4个克隆，并在100g糊精培养基上大规模发酵测试。
c)通过在100g培养基上发酵的表型筛选
如实施例2c)，于32℃在100g选择性合成糊精培养基(玉米糊精220g/kg、酵母提取物5g/kg、尿素2g/kg、KH2PO41g/kg和矿物质和维生素)上进行发酵。糊精是淀粉水解物，其能够模拟真正的培养基。
将根据本发明改造的酿酒酵母菌株在YPG(酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖)培养基上于30℃预繁殖24h。将发酵培养基的初始pH调节至5.0，无调整。然后，以每千克培养基0.125g当量干物质的水平接种发酵培养基。没有向发酵培养基添加外源水解酶。重量损失监测进行72h，如图11(ER-GAND-12000系列)和图12(ER-GAND-48000系列)所示。
在该类型的发酵培养基(糊精)中，t0时很少葡萄糖是游离的(约10g左右)。由于ER菌株没有能够水解糊精的任何酶，它仅消耗可获得的葡萄糖，因而从14h直至发酵结束测量到的重量损失低(约5g/kg)。
基于图11和图12所示的重量损失监测结果，各个系列测试的3个克隆显示基本上相同的重量损失动力学，因此在糊精培养基上的发酵性能这方面似乎相同。
酿酒酵母菌株中STA1或sGLAA基因的拷贝数增加(从4个至8个拷贝)还能够获得动力学性能增益，尤其是开始30个小时期间的发酵率(图11)。
此外，类似地，ER-GAND-8159菌株(I-4997)中4个拷贝的sGLAA基因(图11)或4个拷贝的STA1基因(图12)允许糊精培养基上发酵动力学的改进，因而能够结合酿酒酵母糖化变种的糖化酶和黑曲霉的糖化酶的性能水平。
实施例6：在含有4个拷贝的编码扣囊复膜酵母的糖化酶的基因的酿酒酵母菌株中整合4个或8个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
用酿酒酵母的密码子使用偏好合成酿酒酵母糖化变种的糖化酶基因STA1(SEQ IDNO：3)和扣囊复膜酵母的糖化酶基因GLU0111(SEQ ID NO：17)的拷贝。
将使用的DNA序列克隆至包含以下的标准载体：
-整合靶标；
-选择的启动子/终止子，例如pADH1/tCYC1；
-随后可以移除的抗性标记。
在本实施例中，使用pSFG质粒(申请人的内部名称)表达扣囊复膜酵母的GLU0111糖化酶(图13)。同样，制备质粒pSDG(申请人的内部名称)以表达酿酒酵母糖化变种的STA1糖化酶。
以下详细解释克隆4个拷贝的GLU0111或4个或8个拷贝的STA1的原理：
-用3对或4对不同的寡核苷酸扩增包含pADH1启动子、糖化酶的ORF和tCYC1终止子的表达模块。PCR扩增后获得的各个模块具有这3个共同的元件。
-包含强启动子/终止子和一个基因的选择模块，所述基因在包含它的酵母上的表达赋予能够选择它们的特征。它是例如抗生素抗性基因或允许酵母在特定培养基上生长的基因。由于抗生素标记抗性模块侧翼是LoxP位点，随后可以通过Cre重组酶的作用将其移除。
用于整合各个拷贝的GLAA基因或STA1基因和选择模块的引物如下：
1f-Gibson AMG：
TCTGATGGCTAACGGTGAAATTAAAGACATCGCAAACGTCACGGCTAACTTGAAGCTTCGTACGCTGCAGG(SEQ ID No.：5)
MCI-pTEF-BUD5-f：
CGCTCCAGAATTAGCGGACCTCTTGAGCGGTGAGCCTCTGGCAAAGAAGATGAAGCTTCGTACGCTGCAGG(SEQ ID No.：20)
MCI-pADH1-GRE3-f：
TAAGGGATATAGAAGCAAATAGTTGTCAGTGCAATCCTTCAAGACGATTGGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：15)
A1-Gibson AMG：
TCACTGTACGGTGAGAACGTAGATGGTGTGCGCATAGGCCACTAGTGGATCT(SEQ ID No.：6)
A1-tCYC1-r：
TCACTGTACGGTGAGAACGTAGATGGTGTGCAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：21)
A2-Gibson AMG：
CACACCATCTACGTTCTCACCGTACAGTGAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：7)
B1-Gibson AMG：
TTACGTAGACTGAGTAGCAACGGTTGAGGACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：8)
B2-Gibson AMG：
TCCTCAACCGTTGCTACTCAGTCTACGTAAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：9)
C1-Gibson AMG：
TCAGTAGCACAGAGAAGTGTAGGAGTGTAGCAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：10)
C2-Gibson AMG：
CTACACTCCTACACTTCTCTGTGCTACTGAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：11)
D1-Gibson AMG：
TTAGGATACATGCAGTAGACGAGGTAAGCACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：12)
D2-Gibson AMG：
TGCTTACCTCGTCTACTGCATGTATCCTAAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID No.：13)
MCI-tCYC1-BUD5-r：
CTCAAGAACGTAGGACGATAACTGGTTGGAAAGCGTAAACACGGAGTCAACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：22)
MCI-tCYC1-GRE3-r：
CACATATACAGCATCGGAATGAGGGAAATTTGTTCATATCGTCGTTGAGTCAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：16)
2r-Gibson AMG：
ACATACTTGCAATTTATACAGTGATGACCGCTGAATTTGTATCTTCCATACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID No.：14)。
Figure BDA0001610219650000291
表8：用于克隆4个拷贝的GLU0111和例如4个或8个拷贝的STA1的引物对
“SFG基因”是指扣囊复膜酵母的糖化酶基因GLU0111。
策略与实施例1所采用的在单个步骤中在给定基因座将数个糖化酶基因表达模块同时整合入酿酒酵母菌株的策略严格相似，其使用酵母在体内进行同源重组的天然能力作为基础。
例如，图14示出了获得I-5122菌株的各个步骤，解释如下：
1-在HO基因座整合4个扣囊复膜酵母糖化酶表达模块(以下称GLU0111)和G418选择模块(遗传霉素抗性基因/KanMX标记)，从而能够获得ER-SFG菌株；
2-在GRE3基因座整合由4个酿酒酵母糖化变种的糖化酶表达模块(以下称STA1)组成的第二个盒；
3-在BUD5基因座整合由4个酿酒酵母糖化变种的糖化酶表达模块(以下称STA1)组成的第三个盒。
共同表达扣囊复膜酵母的糖化酶(GLU0111)和酿酒酵母糖化变种的糖化酶(STA1)的菌株称为ER-GFD。因此，根据该构建模型，能够构建整合了4个拷贝的GLU0111糖化酶基因和至少4个拷贝的STA1糖化酶基因的酵母。
对于ER-GFD酵母，产生两个系列的克隆。8000系列(ER-GFD-8001至ER-GFD-8045)对应于整合了4个拷贝的(来自扣囊复膜酵母)的GLU0111糖化酶基因和4个拷贝的(来自酿酒酵母糖化变种)的STA1糖化酶基因。至于48000系列(ER-GFD-48001至ER-GFD-48015)，克隆了4个拷贝的(来自扣囊复膜酵母)的GLU0111糖化酶基因和8个拷贝的(来自酿酒酵母糖化变种)的STA1糖化酶基因。ER-GFD-8044和ER-GFD-48015克隆分别对应于I-5121和I-5122菌株。
下表9回顾了所用的酵母菌株及其特征。
Figure BDA0001610219650000301
表9：菌株名称/数量和整合的糖化酶基因的拷贝数的总结。
实施例7：筛选菌株
进行表型筛选以选择用于预期应用最有效的最佳克隆。
a)用碘进行的表型筛选
用碘进行的表型筛选以与实施例2a)相同的方式进行。表10示出了碘染色之后获得的结果。
Figure BDA0001610219650000311
表10：对2个系列的克隆用碘进行的筛选结果。较弱的水解表型对应于克隆周围的晕圈比宿主酿酒酵母菌株的更小。
在每个系列筛选的所有克隆中，少于2％的测试克隆似乎不能够在实施例的培养条件下水解淀粉。应当注意，在该策略中使用的宿主菌株已经在其基因组中具有了几个糖化酶基因，因此各个菌株存在水解晕圈。因此，这些“阴性”克隆似乎已经失去了它们的糖化酶基因。
b)通过在0.5g培养基上发酵的表型筛选
在发酵条件下，在糊精培养基上的表型筛选能够消除各个系列中获得的不能发酵或发酵比相应的宿主菌株更慢的克隆。为此，在发酵期间每天两次对生物质进行视觉监测，持续2天。通过比较生物质颗粒相对于I-4999对照菌株的出现速率，然后可以选择最有前景的菌株。
使用的发酵培养基是糊精培养基，其是含有淀粉糊精(220g/kg)、酵母提取物(5g/kg)、尿素(2g/kg)、KH2PO4((1g/kg)和矿物质和维生素的合成培养基。发酵最快的菌株是能够分泌大量糖化酶，从而能够通过水解糊精分子释放葡萄糖的菌株。释放的葡萄糖然后被酿酒酵母代谢以生产乙醇。
对于各个克隆系列，选择2-4个克隆，并在100g糊精培养基上大规模发酵测试。
c)通过在100g培养基上发酵的表型筛选
如实施例2c)和5c)，于32℃在100g选择性合成糊精培养基(玉米糊精220g/kg、酵母提取物5g/kg、尿素2g/kg、KH2PO41g/kg和矿物质和维生素)上进行发酵。糊精是淀粉水解物，其能够模拟真正的培养基。
将根据本发明改造的酿酒酵母菌株在YPG(酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖)培养基上于30℃预繁殖24h。将发酵培养基的初始pH调节至5.0，无调整。然后，以每千克培养基0.125g当量干物质的水平接种发酵培养基。没有向发酵培养基添加外源水解酶。重量损失监测进行72h，如图15(ER-GFD-8000系列)和图16(ER-GFD-48000系列)所示。
在该类型的发酵培养基(糊精)中，t0时很少葡萄糖是游离的(约10g左右)。由于ER菌株没有能够水解糊精的任何酶，它仅消耗可获得的葡萄糖，因而从14h直至发酵结束测量到的重量损失低(约5g/kg)。
基于图15和图16所示的重量损失监测结果，各个系列测试的克隆显示基本上相同的重量损失动力学，因此在糊精培养基上的发酵性能这方面似乎相同。
酿酒酵母糖化变种
实施例8：评估菌株酶活性的产量。
在E140723-11工业培养基上于32℃评估之前选择的克隆，并与I-4998、I-4999、I-4899、I-4997、ER-SDG-4c和ER-SDG-8c对照菌株比较。它们是以下克隆：ER-GAND-12020、ER-GAND-48084、ER-GFD-8044和ER-GFD-48015。
表达衍生自酿酒酵母糖化变种的STA1活性的菌株(以保藏号I-4998于2015年7月9日保藏于CNCM)能够获得快速但不完全的糊精水解动力学，而表达衍生自黑曲霉的GLAA活性的菌株(I-4899)能够获得令人满意的但动力学不如I-4998好的糊精水解。
将菌株在丰富培养基上于32℃预繁殖过夜。于32℃进行发酵。将发酵培养基的初始pH调节至5.0，无调整。在发酵中加入尿素(600ppm)。然后，以每千克培养基0.5g当量干物质的水平接种发酵培养基。
随时间测量从t＝0至t＝66h的发酵反应器的重量损失。
酒精发酵期间获得的重量损失结果如图17和18所示。
对于ER-GAND系列(I-5119和I-5120)，图17表明，新菌株能够获得与ER-SDG-4c和ER-SDG-8c菌株一样快且与I-4899菌株一样完全的糊精水解，而且它们也与I-4997菌株一样快。基于此可以得出以下结论：酿酒酵母糖化变种的糖化酶的产生对于黑曲霉的糖化酶的水解活性仍然有刺激作用。
对于ER-GFD系列(I-5121和I-5122)，图18表明，新菌株能够获得与I-ER-SDG4c菌株一样快且与I-4999菌株一样完全的糊精水解，而且它们也比I-4999菌株快得多。基于此可以得出以下结论：酿酒酵母糖化变种的糖化酶的产生对于扣囊复膜酵母的糖化酶的水解活性仍然有刺激作用。这些菌株不过是呈现出扣囊复膜酵母的真菌糖化酶和酿酒酵母糖化变种的糖化酶的特征的组合(即，具有的动力学谱在扣囊复膜酵母的糖化酶和酿酒酵母糖化变种的糖化酶之间)，但呈现出动力学加快的改进的动力学谱。因此，真菌来源的糖化酶和酿酒酵母糖化变种的糖化酶之间似乎有协同作用。
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Claims (15)

1.一种酿酒酵母菌株，其特征在于，它共表达：
-编码真菌来源的糖化酶的基因，所述真菌来源的糖化酶选自黑曲霉的糖化酶和扣囊复膜酵母的糖化酶；和
-编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因，
其中编码黑曲霉的糖化酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码扣囊复膜酵母的糖化酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO：17所示，和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，
并且其特征在于，它包含：
-2-10个拷贝的编码真菌来源的糖化酶的基因；和
-2-10个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
2.权利要求1所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝的编码真菌来源的糖化酶的基因和2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
3.权利要求1所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株包含4或8个拷贝的编码黑曲霉的糖化酶的基因和3或8个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因，或其特征在于，所述酵母菌株包含4个拷贝的编码扣囊复膜酵母的糖化酶的基因和4或8个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
4.权利要求1-3任一项所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母糖化变种的糖化酶的蛋白序列是SEQ ID NO：4。
5.权利要求1-4任一项所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述真菌来源的糖化酶是黑曲霉的糖化酶且蛋白序列是SEQ ID NO：2。
6.权利要求1-4任一项所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述真菌来源的糖化酶是扣囊复膜酵母的糖化酶且蛋白序列是SEQ ID NO：18。
7.权利要求1-6任一项所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述编码真菌来源的糖化酶的基因和所述编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因整合至所述酵母的基因组。
8.权利要求1所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述菌株选自：根据布达佩斯条约于2015年8月6日以保藏号I-5005保藏于CNCM[法国国家微生物培养物中心]的菌株、根据布达佩斯条约于2015年7月9日以保藏号I-4997保藏于CNCM的菌株、根据布达佩斯条约于2016年8月11日以保藏号I-5119保藏于CNCM的菌株、根据布达佩斯条约于2016年8月11日以保藏号I-5120保藏于CNCM的菌株、根据布达佩斯条约于2016年8月11日以保藏号I-5121保藏于CNCM的菌株和根据布达佩斯条约于2016年8月11日以保藏号I-5122保藏于CNCM的菌株。
9.一种酿酒酵母菌株，其特征在于，它包含核酸序列SEQ ID NO：1和核酸序列SEQ IDNO：3。
10.一种用于获得酵母菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
a)遗传改造酿酒酵母使其共表达编码选自黑曲霉的糖化酶和扣囊复膜酵母的糖化酶的真菌来源的糖化酶的基因和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因并且使其包含2-10个拷贝的编码真菌来源的糖化酶的基因和2-10个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因；
b)在糊精培养基上培养并发酵步骤a)获得的菌株；
c)选择发酵动力学至少等于或大于根据布达佩斯条约于2015年7月9日以保藏号I-4999保藏于CNCM的菌株在相同条件下获得的发酵动力学的菌株，
其中编码黑曲霉的糖化酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码扣囊复膜酵母的糖化酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO：17所示，和编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO：3所示。
11.权利要求10所述的用于获得酵母菌株的方法，其特征在于，所述酵母菌株包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝的编码真菌来源的糖化酶的基因和2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
12.权利要求10所述的用于获得酵母菌株的方法，其特征在于，所述酵母菌株包含4或8个拷贝的编码黑曲霉的糖化酶的基因和3或8个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因，或其特征在于，所述酵母菌株包含4个拷贝的编码扣囊复膜酵母的糖化酶的基因和4或8个拷贝的编码酿酒酵母糖化变种的糖化酶的基因。
13.一种用于从生物质生产生物乙醇的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
a)预水解并液化所述生物质的淀粉；
b)将步骤a)获得的液化淀粉与权利要求1-9任一项所述的酵母接触；
c)通过所述酵母水解并发酵所述液化淀粉；
d)提取步骤c)产生的乙醇。
14.权利要求13所述的方法，所述方法还包括在步骤b)之后和/或步骤c)期间添加外源糖化酶的步骤b’)。
15.权利要求1-9任一项所述的酵母菌株用于生产生物乙醇的用途。
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