JP7078887B2 - エタノール発酵によるエタノール生産性の向上に関与する変異遺伝子及びこれを用いたエタノールの製造方法 - Google Patents
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Description
(2)上記30番目のアミノ酸残基はロイシン、バリン及びイソロイシンのいずれかであり、上記他のアミノ酸はシステインであることを特徴とする(1)記載の変異遺伝子。
(3)上記変異CDC123タンパク質は以下の(a)又は(b)であることを特徴とする(1)記載の変異遺伝子。
(a)配列番号3のアミノ酸配列からなる
(b)配列番号3のアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有し、配列番号3のアミノ酸配列のN末端側から324番目に相当するアミノ酸がシステインであるアミノ酸配列
(4)配列番号4に示すアミノ酸配列において、N末端側から52番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたコンセンサス配列を有する変異SUI3タンパク質をコードする変異遺伝子。
(5)上記52番目のアミノ酸残基はセリン又はアスパラギンであり、上記他のアミノ酸はトレオニンであることを特徴とする(4)記載の変異遺伝子。
(6)上記変異SUI3タンパク質は以下の(a)又は(b)であることを特徴とする(4)記載の変異遺伝子。
(a)配列番号6のアミノ酸配列からなる
(b)配列番号6のアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有し、配列番号6のアミノ酸配列のN末端側から112番目に相当するアミノ酸がトレオニンであるアミノ酸配列
(7)配列番号7に示すアミノ酸配列において、N末端側から31番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたコンセンサス配列を有する変異FPK1タンパク質をコードする変異遺伝子。
(8)上記31番目のアミノ酸残基はグリシンであり、上記他のアミノ酸はグルタミン酸であることを特徴とする(7)記載の変異遺伝子。
(9)上記変異FPK1タンパク質は以下の(a)又は(b)であることを特徴とする(7)記載の変異遺伝子。
(a)配列番号9のアミノ酸配列からなる
(b)配列番号9のアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有し、配列番号9のアミノ酸配列のN末端側から704番目に相当するアミノ酸がグルタミン酸であるアミノ酸配列
(10)上記(1)~(9)のいずれかに記載の変異遺伝子を有する、キシロース代謝能を有する変異酵母。
(11)上記(10)記載の変異酵母を、キシロースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
(12)上記培地はセルロースを含有しており、上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする(11)記載のエタノールの製造方法。
変異遺伝子1は、CDC(Cell Division Cycle)123タンパク質における特定のアミノ酸が他のアミノ酸に置換した変異CDC123タンパク質をコードする。CDC123は、eIF2翻訳開始因子複合体の会合因子(集合因子や構築因子、アセンブリ因子とも称される)であり、翻訳開始を調節する機能を有している。なお、CDC123をコードする遺伝子のsystematic nameはYLR215Cである。
変異遺伝子2は、翻訳開始因子eIF2のβサブユニットにおける特定のアミノ酸が他のアミノ酸に置換した変異SUI3タンパク質をコードする。SUI3タンパク質は、翻訳開始因子eIF2のβサブユニットとして、eIF2が開始コドンを見つけることに関与している。なお、SUI3タンパク質をコードする遺伝子のsystematic nameはYPL237Wである。
変異遺伝子3は、セリン/トレオニン・プロテインキナーゼにおける特定のアミノ酸が他のアミノ酸に置換した変異FPK1タンパク質をコードする。FPK1タンパク質は、アミノリン脂質トランスロカーゼファミリーメンバーをリン酸化し、リン脂質の転位置及び膜の非対称性を調節する機能を有する。また、FPK1タンパク質は、上流の阻害性キナーゼYpk1pをリン酸化し及び阻害する機能を有する。なお、FPK1タンパク質をコードする遺伝子のsystematic nameはYNR047Wである。
本発明に係る変異酵母は、上述した変異遺伝子を有しており、キシロース代謝能を有している。上述した変異遺伝子を有する変異酵母は、例えば、ゲノム中に内在する野生型遺伝子を上記変異が導入されるように改変する方法によって作製できる。すなわち、本発明に係る変異遺伝子を有する変異酵母は、上述したような部位特異的突然変異誘発法によって作出することができる。
以上で説明した変異酵母を使用してエタノールを製造する際には、少なくともキシロースを含有する培地にてエタノール発酵培養を行う。すなわち、エタノール発酵を行う培地とは、炭素源として少なくとも代謝可能なキシロースを含有することとなる。なお、培地には、予めグルコース等の他の炭素源が含まれていても良い。
特開2014-193152号公報に記載された方法に従って、キシロース代謝能を有する酵母Uz736株を作製した。詳細は以下の通りである。
次に、Uz736株を長期培養することでエタノール発酵能が向上した酵母を育種した。先ず、バイオマスを糖化した液体培地中でUz736株を30日~60日間長期培養した。培養した酵母をYPD寒天培地(10g/L乾燥酵母エキス、20g/Lバクトペプトン、20g/Lグルコース、20g/L寒天)に撒くことで、シングルコロニーを獲得した。これら、シングルコロニーのエタノール発酵能を評価することで、エタノール発酵能の向上した育種酵母を獲得した。
・温度:37℃
・流速:0.8 mL/分
[HPLC]
・カラム:AminexHPX-87H
・移動相:0.01N H2SO4
・流量:0.6ml/min
・温度:30℃
・検出器:示差屈折率検出器(RID-10A)
本実施例で使用したOC700及びUz736、本実施例で作出したUz1015、Uz1229、Uz1230及びUz1235を各々タカラバイオ社の次世代シークエンス(Hiseq)解析を行った。得られたシークエンスデータは、SoftGenetics社の解析ソフトNextGENeで変異箇所を解析した。なお、リファレンスはSaccharomyces cerevisiae S288Cの遺伝子配列データを使用し、解析パラメーターはデフォルトで設定した。得られた変異データを比較し、エタノール発酵性能が特に優れているUz1230及びUz1235で共通で有していて、かつ、その他4株では有していない6遺伝子の変異を同定した。
上述したUz736株と同様にして、実験室酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742株のリボゾーマルRNA遺伝子座、GRE3遺伝子座を各々破壊しながら、シロアリ腸内共生原生生物由来のキシロースイソメラーゼ(XI)遺伝子、酵母由来XKS1遺伝子をマーカー遺伝子(ハイグロマイシン耐性遺伝子、URA3d遺伝子)を用いて導入することで、キシロース代謝能を有するUz2443株を作製した。Uz2443株のCDC123遺伝子、FPK1遺伝子、SUI3遺伝子、YPR1遺伝子、EPO1遺伝子、YPL150w遺伝子に変異を導入するために必要なプラスミドを6種類作製した。
6種類の変異遺伝子を個別に導入したキシロース代謝能を有する6種類の変異酵母及び変異を導入していないキシロース代謝能を有する酵母を寒天培地より白金耳で1ループ取り、三角フラスコにて8mlのYPD(10g/L乾燥酵母エキス、20g/Lバクトペプトン、20g/Lグルコース)培地で32℃、150rpmで24時間振とう培養した。その後、それら酵母を初期PCV=0.12にそろえて8mlの培地(グルコース80g/L、キシロース100g/L、バニリン0.3g/L、シリンガアルデヒド0.2g/L、酢酸10g/L、フルフラール0.8g/L、乾燥酵母エキス10g/L)で35℃、80rpmで90時間振とう培養した。
Claims (4)
- 以下の(a)又は(b)のアミノ酸配列を含む変異CDC123タンパク質をコードする変異遺伝子。
(a)配列番号3のアミノ酸配列
(b)配列番号3のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、配列番号3のアミノ酸配列のN末端側から324番目に相当するアミノ酸がシステインであるアミノ酸配列 - 請求項1記載の変異遺伝子を有する、キシロース代謝能を有する変異酵母。
- 請求項2記載の変異酵母を、キシロースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
- 上記培地はセルロースを含有しており、上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする請求項3記載のエタノールの製造方法。
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