WO2016088275A1 - 高効率エタノール発酵菌 - Google Patents

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育美 栗原
友裕 今井
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • ethanol is efficiently produced from pentose sugar (hereinafter sometimes referred to as C5 sugar) and hexose sugar (hereinafter sometimes referred to as C6 sugar). Relates to microorganisms that can.
  • C5 sugar pentose sugar
  • C6 sugar hexose sugar
  • Bioethanol is expected as a non-depleting renewable resource produced from biomass.
  • carbon dioxide generated by burning bioethanol is carbon neutral, it is considered that the increase in carbon dioxide, which is a major cause of global warming, is suppressed by the use of bioethanol.
  • xylose is a sugar that is contained in the biomass next to glucose, and the efficient use of pentose sugar is a major issue in bioethanol production.
  • Patent Document 1 discloses an invention in which xylose (C5 sugar) is converted to xylulose by introducing a gene having xylose transporter activity into a host cell, incorporated into a glycolytic pentose phosphate pathway, and used for fermentation. Has been.
  • Non-Patent Document 1 discloses that xylose utilization ability is imparted by incorporating a xylose utilization gene derived from Escherichia coli into Zymomonas.
  • Non-Patent Document 2 describes that Pichia yeasts produce ethanol using xylose.
  • Patent Document 1 introduces a protein having a xylose transporter activity derived from Candida guilliermondii into Saccharomyces cerevisiae as a host. That is, a foreign gene is introduced.
  • Patent Document 2 is also an invention in which different types of genes are introduced into the host, although the transporter genes are different.
  • Non-Patent Document 1 introduces a xylose-utilizing gene. Although the technical idea is different from that of Patent Documents 1 and 2, it is not different from introducing a foreign gene.
  • Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1 are both implemented in Japan to implement the “Cartagena Protocol on Biosafety of the Convention on Biological Diversity” adopted by the United Nations. It is necessary to take containment measures in accordance with the so-called Cartagena Act. Therefore, since a facility for assuring biosafety is required, it is disadvantageous in terms of cost to produce ethanol using the cells.
  • An object of the present invention is to obtain a high-efficiency ethanol-fermenting bacterium having high ethanol production efficiency without introducing a foreign gene.
  • the high-efficiency ethanol-fermenting bacterium of the present invention is a fermenting bacterium that efficiently produces ethanol from pentose and hexose, and has a deposit number of NITE BP-01963 at the Patent Microorganism Depository Center. It is characterized by being deposited as.
  • transaldolase gene The transaldolase gene, alcohol dehydrogenase gene, and pyruvate decarboxylase gene are all Meyerozyma guilliermondi genes.
  • the highly efficient ethanol-fermenting bacterium of the present invention can obtain higher ethanol production efficiency than the parent strain without introducing a foreign gene.
  • the wild strain of Meyerozyma guilliermondi an ascomycete yeast
  • ammonia-treated rice straw-derived enzyme saccharified solution for example, one obtained as follows can be used. First, rice straw produced in Kumagaya City, Saitama Prefecture is immersed in an equal amount of 25% by mass ammonia water at a temperature of 80 ° C. for 3 hours, and then pretreated by releasing ammonia. Next, after adjusting the pH of the pretreated rice straw, saccharification enzyme (Meiji Seika Pharma Co., Ltd., trade name: Acremonium Cellulase) is added and maintained at a temperature of 50 ° C. for 72 hours for enzymatic saccharification. And a slurry containing the enzyme saccharified solution is obtained.
  • saccharification enzyme Meiji Seika Pharma Co., Ltd., trade name: Acremonium Cellulase
  • the ammonia-treated rice straw-derived enzyme saccharified solution contains, for example, 3 to 15% by mass of glucose and 1 to 10% by mass of xylose.
  • mutagen examples include ethylating agents such as N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) and ethyl methanesulfonate (EMS), and base analogs such as 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU). Nitroso compounds such as nitroamine and nitrosoguanidine can be used.
  • ethylating agents such as N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) and ethyl methanesulfonate (EMS)
  • base analogs such as 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU).
  • Nitroso compounds such as nitroamine and nitrosoguanidine can be used.
  • the BP-01962 strain is a mutant strain obtained by acclimating and culturing the parent strain in a medium obtained by adding a mutagen to the ammonia-treated rice straw-derived enzyme saccharified solution, and repeatedly selecting bacteria that grow on the medium. . Therefore, the BP-01962 strain has improved xylose utilization and ethanol fermentation performance without introducing foreign genes compared to the wild strain or N strain of Meyerozyma guilliermondi.
  • the high-efficiency ethanol-fermenting bacteria of the present embodiment in which the self-cloned TAL gene, ADH gene, and PDC gene are further introduced into the BP-01962 strain, have been obtained by the Applicant from the National Institute of Technology and Evaluation of the National Institute of Technology and Evaluation, This is deposited in Japan at room 2-5-8, Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818, Japan.
  • the acceptance date is November 19, 2014, and the acceptance number is NITE BP-01963.
  • the BP-01963 strain has further improved xylose utilization and ethanol fermentation performance without introducing a foreign gene as compared to the BP-01962 strain or the N strain.
  • gene + terminator part PCR amplification of the gene to be introduced and its terminator part (hereinafter referred to as gene + terminator part). Amplify the promoter part to be used for introduction. All of these are PCR-amplified from the chromosome of Meyerozyma guilliermondi, the strain used in the present invention.
  • transaldolase + terminator may be used as the DNA fragment for homologous recombination. This is because it is considered that transaldolase acts efficiently by using a promoter of xylose reductase that functions during xylose utilization.
  • the promoter of xylose reductase was amplified using the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and the transaldolase gene and terminator part were amplified using the primers of SEQ ID NO: 3 and 4 below.
  • Sequence number 1 AAGGCTTGGGAACTTTCTTT Sequence number 2: AGCAATTGATGATTAATTTT Sequence number 3: ATGACCAATTCTCTTGAACA Sequence number 4: AAATTGTGCCGTGTCAAACT
  • a GAPDH promoter alcohol dehydrogenase + terminator may be used. Since GAPDH is a strong promoter present in the glycolytic system, it is considered that GAPDH acts efficiently by using it as a promoter for alcohol dehydrogenase, which is a glycolytic enzyme.
  • Alcohol dehydrogenase has an action of converting acetaldehyde into ethanol and produces NAD + when it is NADH-dependent, and therefore has an action of enhancing the action of NAD + -dependent xylitol dehydrogenase.
  • the GAPDH promoter was amplified using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 below, and the alcohol dehydrogenase gene and terminator part were amplified using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 8 below.
  • Sequence number 5 GTTGTAGCGGAGGCTCAATT Sequence number 6: TGTATAATTTAAATGTGGGT Sequence number 7: ATGTCAATTCCAGAATCCAT Sequence number 8: CACCTTGGCTGGAAGTGCTG
  • SEQ ID NO: 9 a DNA fragment obtained by introducing a GAPDH promoter amplified with the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 is used for homologous recombination. went.
  • the sequence of SEQ ID NO: 9 represents the end of the promoter of the PDC gene
  • the sequence of SEQ ID NO: 10 represents the start of the PDC gene.
  • the dilute sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solution used was obtained as follows. First, a corn stover produced in Iowa, USA is immersed in a double amount of 3.7% by mass sulfuric acid at a temperature of 170 ° C. for 10 minutes, and then pretreated by returning to normal temperature. Next, an aqueous NaOH solution is added to the pretreated corn stover to adjust the pH to 4, and then a saccharification enzyme (manufactured by Meiji Seika Pharma Co., Ltd., trade name: Acremonium Cellulase) is added and maintained at a temperature of 50 ° C. for 72 hours. Then, enzymatic saccharification is performed to obtain a slurry containing the enzymatic saccharified solution.
  • a saccharification enzyme manufactured by Meiji Seika Pharma Co., Ltd., trade name: Acremonium Cellulase
  • the slurry was subjected to solid-liquid separation by centrifugation, and the collected liquid was adjusted to pH 6 with an aqueous NaOH solution to obtain the diluted saccharified corn stover-derived enzyme saccharified solution.
  • the dilute sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solution contains, for example, 3 to 15% by mass of glucose and 1 to 10% by mass of xylose.
  • the dilute sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solution contained glucose 45 g / L and xylose 38 g / L, and had a pH of 6. Then, after the culture, the medium was collected, the ethanol concentration was measured by GC-FID (manufactured by GL Sciences, trade name: GC390B), and the fermentation yield was calculated by the following formula (1). The results are shown in FIG.
  • an enzyme saccharified solution derived from 26% by mass of dilute sulfuric acid-treated corn stover is used as a medium, and a culture solution of Meyerozyma guilliermondi N strain is added to the medium so that the OD 600 of the medium is 0.5, and the temperature is 30 ° C. Culture was performed for 100 hours.
  • the diluted sulfuric acid-treated corn stover-derived enzyme saccharified solution had a pH of 6 including glucose 64 g / L and xylose 48 g / L.
  • the culture medium was collected after the culture, and the ethanol concentration was measured by GC-FID (manufactured by GL Science Co., Ltd., trade name: GC390B), and the fermentation yield was calculated by formula (1).
  • the results are shown in FIG.
  • FIG. 2 shows that the total amount of glucose and xylose is digested 120 hours after the start of the culture, and the ethanol concentration increases as the culture time increases.
  • the glucose concentration was almost zero 48 hours after the start of the culture, but since then the xylose concentration decreased and the ethanol concentration continued to increase, the BP-01963 strain digested all the glucose. After that, it is clear that ethanol fermentation is performed using xylose as a substrate.

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Abstract

　外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を提供する。　高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６３として寄託されていることを特徴とする。

Description

高効率エタノール発酵菌
　リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、糖化溶液を発酵するための微生物に関する。
　特に、リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、五炭糖（以下、Ｃ５糖ということがある。）、及び六炭糖（以下、Ｃ６糖ということがある。）から効率的にエタノール生産することができる微生物に関する。
　バイオエタノールは、バイオマスから産生される枯渇することのない再生可能資源として期待されている。また、バイオエタノールを燃焼させて発生する二酸化炭素はカーボンニュートラルであることから、バイオエタノールの利用が進むことによって、地球温暖化の主な原因である二酸化炭素の上昇を抑制すると考えられている。
　バイオエタノールは、バイオマスを発酵させ、蒸留してエタノールを精製する。バイオエタノールの収率を高めるために糖化溶液から多くのアルコールを生成する必要がある。バイオエタノール生産の過程で一般的に用いられている酵母は、キシロース、アラビノースなどの五炭糖をアルコールに変換できないため、発酵原料としては六炭糖のみが用いられてきた。
　原料によって異なるものの典型的なバイオマスには、３５～４５％のセルロース、２５～４０％のヘミセルロース、１５～３０％のリグニンが含まれていると言われている。したがって、六炭糖が重合しているセルロースだけではなく、五炭糖であるキシロース等を主として含有するヘミセルロースを基質として利用することは効率的なエタノール産生につながることになる。
　キシロースはグルコースの次にバイオマス中に多く含まれている糖であると言われており、五炭糖を効率的に利用することはバイオエタノール生産において大きな課題となっている。
　これまでに、遺伝子組換えによるキシロース利用能の付与や、キシロースを利用してエタノールを産生する微生物の利用等により、キシロースを少しでも利用する技術が開示されている。
　特許文献１には、キシローストランスポーター活性を有する遺伝子を宿主細胞に導入することによって、キシロース（Ｃ５糖）をキシルロースに変換し、解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用する発明が開示されている。
　特許文献２には、アラビノーストランスポーターを付与した酵母によって、アルコールを生成する技術が開示されている。特許文献１と同様にアラビノース（Ｃ５糖）をアラビトール、キシルロースを経て解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用するものである。
　非特許文献１には、大腸菌由来のキシロース資化遺伝子をザイモモナスに組み込むことにより、キシロース資化能を付与することが開示されている。
　非特許文献２には、ピキア属酵母が、キシロースを利用してエタノールを生産することが記載されている。
特開2012-170422号公報 米国特許出願公開第2013/189788号明細書
Zhang, M., et al., Science, 1995. Vol. 267, pp. 240-243. Bicho, P.A., et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, Vol. 54, pp. 50-54.
　しかしながら、特許文献１の発明は、Candida guilliermondii由来のキシローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてSaccharomyces cerevisiaeに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。 
　また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。
　そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１に記載の発明は、いずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するために我が国において施行されているいわゆるカルタヘナ法に則した封じ込め策を講じる必要がある。従って、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。
　また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母はキシロース利用性が低く、エタノール産生効率はさほど高くならない。
　本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を得ることを課題とする。
　前記課題を解決するために、本発明の高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６３として寄託されていることを特徴とする。
　野生型Meyerozyma guilliermondiは、グルコース資化能に加えキシロース資化能を備えているとはいうものの、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。これに対して、本発明の高効率エタノール発酵菌（以下、ＢＰ－０１９６３株ということがある。）は、Meyerozyma guilliermondiの親株を菌株育種することによりキシロースの利用効率の高い菌を選抜して得た発酵菌（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６２、以下、ＢＰ－０１９６２株ということがある。）に、セルフクローニングしたトランスアルドラーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及び、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を導入したものである。
　前記トランスアルドラーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及び、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子はいずれも、Meyerozyma guilliermondiの遺伝子である。
　前記トランスアルドラーゼ遺伝子は、ペントースリン酸経路中の酵素であり、これを強化することによりキシロースを利用しやすくなると予測される。また、前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、アセトアルデヒドからエタノールを生産する。また、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子はピルビン酸を脱炭酸してアセトアルデヒドとＣＯ２とを生成する。
　この結果、本発明の高効率エタノール発酵菌は、外来遺伝子を導入することなく、親株より高いエタノール産生効率を得ることができる。
ＢＰ－０１９６３株と、ＢＰ－０１９６２株、Ｎ株との希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液における糖濃度と発酵収率との関係を示すグラフである。 アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液におけるＢＰ－０１９６３株によるグルコース及びキシロースの消化量と、エタノールの生成量との経時変化を示すグラフである。
　次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
　子嚢菌系酵母であるMeyerozyma guilliermondiの野生株は、グルコース資化能に加えてキシロース利用能を備えているが、そのキシロース利用能はバイオエタノール生産に十分とは言えない。そこで、本実施形態の高効率エタノール発酵菌は、子嚢菌系酵母であるMeyerozyma guilliermondi Ｎ株を親株として、アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することにより得られた発酵菌（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６２）に、セルフクローニングしたトランスアルドラーゼ遺伝子（以下、ＴＡＬ遺伝子と略記する。）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、ＡＤＨ遺伝子と略記する。）及び、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（以下、ＰＤＣ遺伝子と略記する。）を導入したものである。
　前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、例えば、次のようにして得たものを用いることができる。まず、埼玉県熊谷市産の稲わらを等量の２５質量％アンモニア水に８０℃の温度で３時間浸漬した後、アンモニアを放散させることにより前処理する。次に、前記前処理が施された稲わらに、ｐＨ調整後、糖化酵素（MeijiSeikaファルマ株式会社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を添加し５０℃の温度に７２時間保持して酵素糖化を行い、酵素糖化液を含むスラリーを得る。次に、前記スラリーをフィルタープレスにより固液分離し、回収された液体分を前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液とする。前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、例えば、３～１５質量％のグルコースと、１～１０質量％のキシロースとを含んでいる。
　前記変異剤としては、例えば、N－エチル－N－ニトロソウレア（ＥＮＵ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）等のエチル化剤、５－ブロモ－２´－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）等の塩基類似化合物、ニトロアミン、ニトロソグアニジン等のニトロソ化合物等を用いることができる。
　ＢＰ－０１９６２株は、前記親株を前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌の選抜を繰り返すことにより得られた変異株である。従って、ＢＰ－０１９６２株は、Meyerozyma guilliermondiの野生株又はＮ株に比較して、外来遺伝子を導入することなく、キシロース資化性及びエタノール発酵性能が向上している。
　ＢＰ－０１９６２株にさらに、セルフクローニングしたＴＡＬ遺伝子、ＡＤＨ遺伝子及び、ＰＤＣ遺伝子を導入した本実施形態の高効率エタノール発酵菌は、本出願人により独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（日本国　〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に寄託されている。受託日は２０１４年１１月１９日、受託番号は、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６３である。
　前記ＴＡＬ遺伝子、ＡＤＨ遺伝子及び、ＰＤＣ遺伝子は、いずれもMeyerozyma guilliermondiの遺伝子であるので、セルフクローニングしたこれらの遺伝子をＢＰ－０１９６２株に導入しても、外来遺伝子を導入することにはならない。
　この結果、ＢＰ－０１９６３株は、ＢＰ－０１９６２株又はＮ株に比較して、外来遺伝子を導入することなく、キシロース資化性及びエタノール発酵性能がさらに向上している。
　ＢＰ－０１９６３株に対する、セルフクローニングしたＴＡＬ遺伝子、ＡＤＨ遺伝子及び、ＰＤＣ遺伝子の導入は、例えば、次のようにして行うことができる。
　導入したい遺伝子及びそのターミネータ部（以下、遺伝子＋ターミネーター部という。）をＰＣＲ増幅する。導入に用いたいプロモータ部をＰＣＲ増幅する。これらは何れも本発明で用いた菌株であるMeyerozyma guilliermondiの染色体からＰＣＲ増幅する。
　ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をプロモータ、遺伝子＋ターミネーター部の順になるよう、インフュージョン法を用いて、大腸菌用の市販ベクターにクローニングする。クローニングされたベクターを大腸菌に形質転換し、ベクターを増幅する。増幅したベクターからプロモーター及び遺伝子＋ターミネーター部を制限酵素で切出す、あるいは増幅したベクターからＰＣＲ増幅することにより、相同組換用のＤＮＡ断片を得る。
　得られたＤＮＡ断片を菌株に相同組換えし、所望の菌株を得た。相同組換にはエレクトロポレーション法を用いた。この方法によって遺伝子を導入すると、染色体上に複数コピー導入することができるため、導入した酵素の活性を増強することができる。
　相同組換用ＤＮＡ断片としては、例えば、キシロースレダクターゼのプロモーター、トランスアルドラーゼ＋ターミネーターを用いると良い。キシロース資化の際に機能するキシロースレダクターゼのプロモーターを用いることによって、トランスアルドラーゼが効率良く作用すると考えられるからである。
　キシロースレダクターゼのプロモーターは具体的には下記配列番号１及び配列番号２のプライマー、トランスアルドラーゼ遺伝子及びターミネーター部分は下記配列番号３及び４のプライマーを用いて増幅した。
　配列番号１：AAGGCTTGGGAACTTTCTTT
　配列番号２：AGCAATTGATGATTAATTTT
　配列番号３：ATGACCAATTCTCTTGAACA
　配列番号４：AAATTGTGCCGTGTCAAACT
　また、ＧＡＰＤＨのプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ＋ターミネーターを用いると良い。ＧＡＰＤＨは解糖系に存在する強力なプロモータであることから、解糖系の酵素であるアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターとして使用することにより、効率よく作用するものと考えられる。アルコールデヒドロゲナーゼはアセトアルデヒドをエタノールに変換する作用を持つとともに、ＮＡＤＨ依存の場合にはＮＡＤ＋を生産するため、ＮＡＤ＋依存のキシリトールデヒドロゲナーゼの作用を強化する作用がある。
　ＧＡＰＤＨのプロモーターは具体的には下記配列番号５及び配列番号６のプライマー、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びターミネーター部分は下記配列番号７及び８のプライマーを用いて増幅した。
　配列番号５：GTTGTAGCGGAGGCTCAATT
　配列番号６：TGTATAATTTAAATGTGGGT
　配列番号７：ATGTCAATTCCAGAATCCAT
　配列番号８：CACCTTGGCTGGAAGTGCTG
　ＰＤＣ遺伝子は、ＰＤＣ遺伝子のプロモーターをＧＡＰＤＨのプロモーターに置換することにより強化した。配列番号９および配列番号１０で表される配列の間に、配列番号５および配列番号６のプライマーで増幅されるＧＡＰＤＨのプロモーターを導入することで得られるＤＮＡ断片を相同組換することで置換を行った。配列番号９の配列がＰＤＣ遺伝子のプロモーターの終端、配列番号１０の配列がＰＤＣ遺伝子の始端を表す。
　配列番号９：AGATTGCTGCAAAAATCATC
　配列番号１０：ATGACAGAAATTACTTTGGG
　また、この方法により得られた菌株は、遺伝子を導入しているが、セルフクローニングであるため、カルタヘナ法上、非組換菌扱いになる範疇に属するものとなっている。
　次に、希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を用いて、ＢＰ－０１９６３株と、ＢＰ－０１９６３株、Ｎ株との発酵収率を比較した。
　前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、次のようにして得たものを用いた。まず、米国アイオワ州産のコーンストーバを２倍量の３．７質量％硫酸に１７０℃の温度で１０分間浸漬した後、常温に戻すことにより前処理する。次に、前記前処理が施されたコーンストーバにＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨ４に調整後、糖化酵素（MeijiSeikaファルマ株式会社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を添加し５０℃の温度に７２時間保持して酵素糖化を行い、酵素糖化液を含むスラリーを得る。次に、前記スラリーを遠心分離により固液分離し、回収された液体分をＮａＯＨ水溶液でｐＨ６に調整し、前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液とした。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、例えば、３～１５質量％のグルコースと、１～１０質量％のキシロースとを含んでいる。
　次に、１５質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ－０１９６３株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース４５ｇ／Ｌ、キシロース３８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、次式（１）により発酵収率を算出した。結果を図１に示す。
　発酵収率＝生成エタノール濃度/（グルコース濃度＋キシロース濃度）/０．５１１４
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（１）
　（グルコース濃度及びキシロース濃度は培養開始前の初期濃度である）
　次に、２０質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ－０１９６２株の培養液を培地のＯＤ６００が０．５となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース６４ｇ／Ｌ、キシロース４８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、式（１）により発酵収率を算出した。結果を図１に示す。
　次に、２６質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にMeyerozyma guilliermondi Ｎ株の培養液を培地のＯＤ６００が０．５となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース６４ｇ／Ｌ、キシロース４８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、式（１）により発酵収率を算出した。結果を図１に示す。
　図１から、ＢＰ－０１９６３株は、Ｎ株よりも低濃度の前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液に対して、ＢＰ－０１９６２株及びＮ株よりもエタノール発酵性能に優れていることが明らかである。
　次に、２６質量％のアンモニア処理稲わら由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ－０１９６３株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１２０時間培養を行った。前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、グルコース７３．８ｇ／Ｌ、キシロース２８．３ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、所定時間毎に前記培地を採取し、キシロースの濃度をＨＰＬＣ（東ソー株式会社製、商品名：ＬＣ－８０２０）により、エタノールの濃度をＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）によりそれぞれ測定した。結果を図２に示す。
　図２から、培養開始から１２０時間後にはグルコース及びキシロースの全量が消化されており、エタノール濃度は培養時間が長くなるほど高くなることがわかる。また、培養開始から４８時間後にはグルコース濃度が殆どゼロになっているが、その後もキシロース濃度は低下し、エタノール濃度は増加を続けていることから、ＢＰ－０１９６３株はグルコースの全量が消化された後は、キシロースを基質としてエタノール発酵を行っていることが明らかである。
　符号なし。

Claims (2)

  1. 　五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、
    　特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６３として寄託されていることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
  2. 　請求項１に記載の高効率エタノール発酵菌において、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６２として寄託されている高効率エタノール発酵菌に、セルフクローニングしたトランスアルドラーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及び、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を導入したことを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
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