JPWO2010101158A1 - クロストリジウムセルロボランス由来新規遺伝子及びその利用 - Google Patents

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Abstract

セルロース及びヘミセルロースをほぼ完全に糖化できるタンパク質をコードする新規ＤＮＡ、ベクター、遺伝子組換え体、セルロース又はヘミセルロースから単糖又は低級アルコールを製造する方法を提供する。配列番号１〜１７０のいずれか１つに記載の、クロストリジウム セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）由来新規塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、及びこのＤＮＡを発現可能に保持する遺伝子組換え体を培養する工程を含む、セルロース又はヘミセルロースから単糖又は低級アルコールを製造する方法。

Description

本発明はクロストリジウム セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）由来新規遺伝子及びその利用に関する。より詳細には、クロストリジウム セルロボランス由来新規塩基配列からなるＤＮＡ、このＤＮＡを含むベクター、このベクターで形質転換された遺伝子組換え体、このＤＮＡにコードされるタンパク質、セルロース又はヘミセルロースから単糖を製造する方法、セルロース又はヘミセルロースから低級アルコールを製造する方法に関する。
近年、再生可能な植物系バイオマスからエタノール等の燃料を製造する方法が注目されている。植物系バイオマスは、糖質系バイオマス、デンプン系バイオマスとセルロース系バイオマスとに大別される。サトウキビやビート等を原料とした糖質系バイオマスや、トウモロコシ、コムギ、キャッサバ等を原料としたデンプン系バイオマスを用いたエタノールの生産は、食糧と競合し、穀物価格の高騰を招いて深刻な問題となっている。このため、非食糧バイオマスであるセルロース系バイオマスへの原料転換が急務となっている。
セルロース系バイオマスは、主にセルロース、ヘミセルロース及びリグニンから構成される有機化合物からなる。セルロースは６炭糖であるグルコースのβ−１、４−結合ポリマーであり、ヘミセルロースは、６炭糖であるグルコースやマンノース等と５炭糖であるキシロースやアラビノース等を含んだポリマーである。リグニンは、フェノール性芳香族が複雑に重合した高分子化合物で、セルロースやヘミセルロースと複雑に絡みあって存在する。
セルロース系バイオマスから低級アルコールを製造するためには、セルロースをとりまく強固な組織を破壊する前処理、発酵の原料となる単糖に分解する糖化、糖をアルコールに変換するアルコール発酵の各工程が必要である。前処理は、高温高圧条件での物理的方法、アルカリや酸、アンモニア等の化学的方法、微生物を用いた生物的方法等により行なわれる。糖化は、酸を用いる化学的方法や、酵素を用いた方法等により行なわれる。また、セルロース系バイオマスを糖化すると、６炭糖であるグルコースやマンノース等と５炭糖であるキシロースやアラビノース等の多種の糖が生成されるが、天然の生物で、これらの６炭糖及び５炭糖の全てを効率的に代謝してアルコールに変換できるものは知られていない。
特許文献１には、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチド、及びセルロース供給材料の転換を改良するポリペプチドをコードする単離された核酸配列が開示されている。特許文献２には、複合糖質を脱重合させるのに適した多糖分解酵素の発現及び分泌を増加させるよう操作した組換えホスト細胞が開示されている。
特表２００９−５０９５４６号公報
特表２００３−５０００５８号公報
しかしながら、工業規模でセルロース及びヘミセルロースを完全に単糖にまで分解できる系はこれまで存在していなかった。従来のセルラーゼを用いた酵素によるセルロースの糖化では、ヘミセルロースを分解することができなかった。このことはバイオマスの全量を利用できていないことを意味する。そこで本発明は、セルロース及びヘミセルロースをほぼ完全に単糖にまで分解することができる新規タンパク質及びこれらのタンパク質をコードする新規ＤＮＡを提供することを目的とする。本発明はまた、これらのＤＮＡを含むベクター、このベクターで形質転換された遺伝子組換え体、このＤＮＡにコードされるタンパク質、セルロース又はヘミセルロースから単糖を製造する方法、セルロース又はヘミセルロースから低級アルコールを製造する方法を提供することを目的とする。
発明者らは、クロストリジウム セルロボランスの全ゲノムの塩基配列を解読した。その結果、クロストリジウム セルロボランスのゲノム上には、セルロース又はヘミセルロースを分解するほぼ全ての酵素をコードする遺伝子が存在していることを初めて明らかにした。
本発明は、配列番号１〜１７０のいずれか１つに記載の、クロストリジウム セルロボランス由来新規塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離されたＤＮＡを提供する。これらのＤＮＡは、配列番号１７１〜３４０のいずれか１つに記載の、クロストリジウム セルロボランス由来新規アミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡは、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有するタンパク質をコードしている。後述するように、これらの新規ＤＮＡを発現させた微生物は、セルロースやヘミセルロースを、グルコース、マンノース、キシロース、キシルロース、アラビノース、ガラクトース等の単糖にまでほぼ完全に分解する能力を示した。したがって、これらの新規ＤＮＡは、従来困難であった、セルロース又はヘミセルロースを完全に分解できる系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１〜３１のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルロソーム形成活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号１７１〜２０１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルロソーム形成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡはドックリンドメインと呼ばれる特徴的な構造を有するタンパク質をコードしている。これらのタンパク質はドックリンドメインを介してコヘシンと呼ばれる骨格タンパク質のコヘシンドメインに特異的に結合し、セルロソームという酵素複合体を形成することができる。したがって、ドックリンドメインを有するタンパク質はセルロソーム形成活性を有している。本明細書において、セルロソーム形成活性を有することをセルロソーマルであるという場合がある。セルロソームは非常に効率よくセルロースを分解することができるため、これらの新規ＤＮＡはセルロソーム又はセルロソームに類似する酵素複合体を人工的に再構成し、効率よくセルロースを分解する系の確立に利用することができる。
発明者らは、クロストリジウム セルロボランスの全ゲノムの塩基配列を解読したことにより、セルロースだけでなく、ヘミセルロースを分解する活性を持つセルロソーマルな新規タンパク質も多数見出した。これらの新規ＤＮＡはセルロソーム又はセルロソームに類似する酵素複合体を人工的に再構成し、ヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３２〜１７０のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルロソーム形成活性を有さないタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２０２〜３４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルロソーム形成活性を有さないタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
本明細書において、セルロソーム形成活性を有さないことを、ノンセルロソーマルであるという場合がある。後述するように、発明者らは、セルロソーマルなタンパク質同士またはノンセルロソーマルなタンパク質同士を組み合わせるとセルロース又はヘミセルロースを効率よく分解することを見出した。また、セルロソーマルなタンパク質とノンセルロソーマルなタンパク質の組み合わせると相乗的に作用して、さらにセルロース又はヘミセルロースを効率よく分解することを見出した。したがって、これらのＤＮＡはセルロース又はヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号５、１２、１３、６３、６４、６５のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、マンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号１７５、１８２、１８３、２３３、２３４、２３５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、マンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いマンナナーゼ活性を示した。したがって、これらのＤＮＡはヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１、２、３、４、６、７、９、１０、１１、３２、３３、３４、３５、３６、４２、４３、１１１、１６４のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号１７１、１７２、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９、１８０、１８１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２１２、２１３、２８１、３３４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いエンドグルカナーゼ活性を示した。したがって、これらのＤＮＡはセルロース又はヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号８又は７０に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号１７８又は２４０に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いキシラナーゼ活性を示した。したがって、これらのＤＮＡはヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１５、５９、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８、９９のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号１８５、２２９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いガラクトシダーゼ活性を示した。したがって、これらのＤＮＡはヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１６、４７、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４４のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号１８６、２１７、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３１４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いペクチン酸リアーゼ活性を示した。したがって、これらのＤＮＡはヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号５８、７７、７９、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８８、１０１、１２２のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、キシロシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２２８、２４７、２４９、２５０、２５１、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２７１、２９２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キシロシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いキシロシダーゼ活性を示した。したがって、これらのＤＮＡはヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号８２又は８５に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２５２又は２５５に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いキシロースイソメラーゼ活性を示した。したがって、これらのＤＮＡはヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。また、クロストリジウム セルロボランスがそのゲノム上にノンセルロソーマルなキシロースイソメラーゼを持っていることは、発明者らが今回初めて明らかにしたことである。
本発明は、配列番号４５、４８、５０、５２、５３、５４、５６、５７、６０のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２１５、２１８、２２０、２２２、２２３、２２４、２２６、２２７、２３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いβ−グルコシダーゼ活性を示した。したがって、これらのＤＮＡはセルロース又はヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号７８、１０３、１２２、１２７のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２４８、２７３、２９２、２９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いアラビノフラノシダーゼ活性を示した。したがって、これらのＤＮＡはヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号９４に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、β−マンノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２６４に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−マンノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いβ−マンノシダーゼ活性を示した。したがって、これらのＤＮＡはヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１３９、１４０、１４１のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ポリガラクツロン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号３０９、３１０、３１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ポリガラクツロン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いポリガラクツロン酸リアーゼ活性を示した。したがって、これらのＤＮＡはペクチンを含むヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１７に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、アセチルエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号１８７に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アセチルエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いアセチルエステラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはヘミセルロースからのアセチル基の切断に必要であり、ヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１９又は２０に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号１８９又は１９０に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いペプチダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはタンパク質の特異的な分解を促進し、セルロソームあるいはノンセルロソーム、細胞外の微生物の表層タンパク質を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３５又は３６に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、β−グルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２０５又は２０６に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いβ−グルカナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはセルロース等のβ−グルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３７、３８、５５、１１５のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セロビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２０７、２０８、２２５、２８５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セロビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いセロビオースホスホリラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはセルロース等生成されたセロビオースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３９に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、キシログルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キシログルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いキシログルカナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはキシログルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号４０、４１、８９のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２１０、２１１、２５９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いグリコシダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはセルロースを含むβ−グルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号４４に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２１４に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いセルラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはセルロースを含むβ−グルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号４６、４９、１００のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２１６、２１９、２７０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いα−グルコシダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはデンプン等のα−グルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号５１、１１２、１１８のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、α−アミラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２２１、２８２、２８８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、α−アミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いα−アミラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはデンプン等のα−グルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号６１又は６２に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、プルラナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２３１又は２３２に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、プルラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いプルラナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはプルランを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号６６、６７、６８、６９、７１、７２、７３、７４、７５、７６のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、デアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２３６、２３７、２３８、２３９、２４１、２４２、２４３、２４５、２４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、デアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いデアセチラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはＤ−グルコサミン等の糖を生成する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１０４に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２７４に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いグルカノトランスフェラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡは転移糖を合成する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１０５に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、グリコーゲンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２７５に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グリコーゲンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いグリコーゲンホスホリラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはグルコースからグルコース−１−リン酸を効率よく合成する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１０６に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、グルクロニダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２７６に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルクロニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いグルクロニダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはＤ−グルクロン酸β配糖体を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１０７、１０８、１１０、１２０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２７７、２７８、２８０、２９０、３１２、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いグリコシルトランスフェラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはＤ−グルクロン酸β配糖体を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１０９に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、グルクロノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２７９に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルクロノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いグルクロノシルトランスフェラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはビリルビンからビリルリングルクロニドを合成する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１１３又は１１４に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、アセチルキシランエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２８３又は２８４に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アセチルキシランエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いアセチルキシランエステラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡは転移糖を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１１９、１２３、１２６のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２８９、２９３、２９６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いマンノシルトランスフェラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはＯ−マンノース型糖鎖を効率よく修飾する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１２１、１５９、１６０のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ムラミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２９１、３２９、３３０に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ムラミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いムラミダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはペプチドグリカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１２５又は１２８に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２９５又は２９８に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、イソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いイソメラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡは糖の光学異性体を効率よく相互変換する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１２９に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、Ｌ−フクロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号２９９に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｌ−フクロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いＬ−フクロキナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはＬ−フクロースを効率よくリン酸化する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１３０に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、シアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号３００に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いシアリダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはシアル酸側鎖を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１３１に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号３０１に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いキチナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはキチンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２１又は１３２に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、リパーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号１９１又は３０２に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いリパーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡは脂質を構成するエステル結合を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１４２に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号３１２に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いポリガラクツロナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはペクチンを含むポリガラクツロン酸を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１４３、１６９、１７０のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ペクチンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号３１３、３３９、３４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ペクチンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いペクチンエステラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはペクチンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１６１又は１６６に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号３３１又は３３６に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いヒドロラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはヘテロ多糖キサンタンやアミノ酸残基を効率よく加水分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１６２又は１６３に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ラクタマーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号３３２又は３３３に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ラクタマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いラクタマーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはβ−ラクタム環を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１６５に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、グルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号３３５に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いグルコサミニダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのＤＮＡはジアセチルキトビオースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
さらに、本発明は、配列番号２３、２４、２５のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ペプチダーゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。このＤＮＡは、配列番号１９３、１９４、１９５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ペプチダーゼ阻害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。これらのＤＮＡは、ペプチダーゼ阻害活性のうち特にシャーガシン（Ｃｈａｇａｓｉｎ）ペプチダーゼ阻害活性を有することが好ましい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いペプチダーゼ阻害活性を示した。したがって、これらのＤＮＡは植物や微生物が生産するある種のペプチダーゼに対して阻害活性を示すことで、クロストリジウム セルロボランス、あるいは、それが生産するセルロソームの分解の阻止に利用することができる。
本発明は、配列番号１８、２２、２６、２７、２８、２９、３０、３１のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有する、機能未知のタンパク質、機能未知ドメイン、細胞表面タンパク質又はセルロソームタンパク質 ドックリン タイプＩ又はＣＢＭ３−ＳＬＨ−Ｃｏｈ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢあるいはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。
このＤＮＡは、配列番号１８８、１９２、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、機能未知のタンパク質、機能未知ドメイン、細胞表面タンパク質、セルロソームタンパク質 ドックリン タイプＩ又はＣＢＭ３−ＳＬＨ−Ｃｏｈタンパク質（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢあるいはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質はコヘシンドメインあるいはドックリンドメインを含んでおり、セルロソームを構成する成分であった。したがって、これらのＤＮＡはセルロソームの形成に利用することができる。
本発明は、配列番号１０２、１１６、１１７のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有する、エンドアラビナーゼ様タンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。
このＤＮＡは、配列番号２７２、２８６、２８７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、エンドアラビナーゼ様タンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質はエンドアラビノースに相同性が高かった。したがって、これらのＤＮＡはＬ−アラビノース含有多糖を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１２４に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有する、アラビノオリゴサッカライド結合タンパク質をコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。
このＤＮＡは、配列番号２９４に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アラビノオリゴサッカライド結合タンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質はアラビノース含有オリゴ糖に対して結合能を有するタンパク質と高い相同性があった。したがって、これらのＤＮＡはアラビノース含有オリゴ糖と結合してアラビノオリゴサッカライド結合タンパク質を回収するための系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１６７又は１６８に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有する、パタチンをコードする塩基配列からなる単離された新規ＤＮＡを提供する。
このＤＮＡは、配列番号３３７又は３３８に記載のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、パタチンをコードするＤＮＡであってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は生体防御タンパク質であるパタチンに相同性が高かった。したがって、これらのＤＮＡは植物病虫に対して殺虫作用を有するタンパク質の合成に利用することができる。
本発明は、配列番号１７１〜３４０のいずれか１つに記載の、クロストリジウム セルロボランス由来新規アミノ酸配列、又は配列番号１〜１７０のいずれか１つに記載の新規塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１７１〜３４０のいずれか１つに記載の、クロストリジウム セルロボランス由来新規アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いセルロース又はヘミセルロース分解活性を示すため、例えば、精製酵素として添加することにより、従来困難であった、セルロース又はヘミセルロースを完全に分解できる系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１７１〜２０１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１〜３１のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、セルロソーム形成活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１７１〜２０１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルロソーム形成活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質はセルロソームを形成することができ、高いセルロース又はヘミセルロース分解活性を示すため、例えば、精製酵素として添加することにより、セルロース又はヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２０２〜３４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号３２〜１７０のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、セルロソーム形成活性を有さない単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２０２〜３４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルロソーム形成活性を有さないタンパク質であってもよい。
後述するように、発明者らは、セルロソーマルなタンパク質同士またはノンセルロソーマルなタンパク質同士を組み合わせるとセルロース又はヘミセルロースを効率よく分解することを見出した。また、セルロソーマルなタンパク質とノンセルロソーマルなタンパク質の組み合わせると相乗的に作用して、さらにセルロース又はヘミセルロースを効率よく分解することを見出した。これらの新規タンパク質はノンセルロソーマルであるため、例えば、精製酵素として、セルロソーマルな新規タンパク質と組み合わせて添加することにより、セルロース又はヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１７５、１８２、１８３、２３３、２３４、２３５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号５、１２、１３、６３、６４、６５のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、マンナナーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１７５、１８２、１８３、２３３、２３４、２３５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、マンナナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規タンパク質は高いマンナナーゼ活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、ヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１７１、１７２、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９、１８０、１８１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２１２、２１３、２８１、３３４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１、２、３、４、６、７、９、１０、１１、３２、３３、３４、３５、３６、４２、４３、１１１、１６４のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、エンドグルカナーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１７１、１７２、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９、１８０、１８１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２１２、２１３、２８１、３３４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規タンパク質は高いエンドグルカナーゼ活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、セルロース又はヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１７８又は２４０に記載のアミノ酸配列、又は配列番号８又は７０に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、キシラナーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１７８又は２４０に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キシラナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規タンパク質は高いキシラナーゼ活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、ヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１８５、２２９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１５、５９、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８、９９のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ガラクトシダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１８５、２２９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規タンパク質は高いガラクトシダーゼ活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、ヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１８６、２１７、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３１４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１６、４７、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４４のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ペクチン酸リアーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１８６、２１７、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３１４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規タンパク質は高いペクチン酸リアーゼ活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、ヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２２８、２４７、２４９、２５０、２５１、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２７１、２９２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号５８、７７、７９、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８８、１０１、１２２のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、キシロシダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２２８、２４７、２４９、２５０、２５１、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２７１、２９２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キシロシダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規タンパク質は高いキシロシダーゼ活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、ヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２５２又は２５５に記載のアミノ酸配列、又は配列番号８２又は８５に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、キシロースイソメラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２５２又は２５５に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規タンパク質は高いキシロースイソメラーゼ活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、ヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２１５、２１８、２２０、２２２、２２３、２２４、２２６、２２７、２３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号４５、４８、５０、５２、５３、５４、５６、５７、６０のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２１５、２１８、２２０、２２２、２２３、２２４、２２６、２２７、２３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規タンパク質は高いβ−グルコシダーゼ活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、セルロース又はヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２４８、２７３、２９２、２９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号７８、１０３、１２２、１２７のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、アラビノフラノシダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２４８、２７３、２９２、２９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規タンパク質は高いアラビノフラノシダーゼ活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、ヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２６４に記載のアミノ酸配列、又は配列番号９４に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、β−マンノシダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２６４に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−マンノシダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規タンパク質は高いβ−マンノシダーゼ活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、ヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３０９、３１０、３１１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１３９、１４０、１４１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ポリガラクツロン酸リアーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号３０９に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ポリガラクツロン酸リアーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規タンパク質は高いポリガラクツロン酸リアーゼ活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、ペクチンを含むヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１８７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１７に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、アセチルエステラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１８７に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アセチルエステラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いアセチルエステラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、ヘミセルロースからのアセチル基の切断に必要であり、ヘミセルロースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１８９又は１９０に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１９又は２０に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ペプチダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１８９又は１９０に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ペプチダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いペプチダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、タンパク質の特異的な分解を促進し、セルロソームあるいはノンセルロソーム、細胞外の微生物の表層タンパク質を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２０５又は２０６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号３５又は３６に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、β−グルカナーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２０５又は２０６に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−グルカナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いβ−グルカナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、セルロース等のβ−グルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２０７、２０８、２２５、２８５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号３７、３８、５５、１１５のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、セロビオースホスホリラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２０７、２０８、２２５、２８５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セロビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いセロビオースホスホリラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、セルロース等生成されたセロビオースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列、又は配列番号３９に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、キシログルカナーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２０９に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キシログルカナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いキシログルカナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、キシログルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２１０、２１１、２５９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号４０、４１、８９のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、グリコシダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２１０、２１１、２５９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グリコシダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いグリコシダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、セルロースを含むβ−グルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２１４に記載のアミノ酸配列、又は配列番号４４に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２１４に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いセルラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、セルロースを含むβ−グルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２１６、２１９、２７０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号４６、４９、１００のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、α−グルコシダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２１６、２１９、２７０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、α−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いα−グルコシダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、デンプン等のα−グルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２２１、２８２、２８８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号５１、１１２、１１８のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、α−アミラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２２１、２８２、２８８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、α−アミラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いα−アミラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、デンプン等のα−グルカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２３１又は２３２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６１又は６２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、プルラナーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２３１又は２３２に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、プルラナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いプルラナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、プルランを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２３６、２３７、２３８、２３９、２４１、２４２、２４３、２４５、２４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号６６、６７、６８、６９、７１、７２、７３、７４、７５、７６のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、デアセチラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２３６、２３７、２３８、２３９、２４１、２４２、２４３、２４５、２４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、デアセチラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いデアセチラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、Ｄ−グルコサミン等の糖を生成する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２７４に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１０４に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、グルカノトランスフェラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２７４に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルカノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いグルカノトランスフェラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、転移糖を合成する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２７５に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１０５に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、グリコーゲンホスホリラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２７５に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グリコーゲンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いグリコーゲンホスホリラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、グルコースからグルコース−１−リン酸を効率よく合成する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２７６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１０６に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、グルクロニダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２７６に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルクロニダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いグルクロニダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、Ｄ−グルクロン酸β配糖体を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２７７、２７８、２８０、２９０、３１２、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１０７、１０８、１１０、１２０、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２７７、２７８、２８０、２９０、３１２、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いグリコシルトランスフェラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、Ｄ−グルクロン酸β配糖体を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２７９に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１０９に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、グルクロノシルトランスフェラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２７９に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルクロノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いグルクロノシルトランスフェラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、ビリルビンからビリルリングルクロニドを合成する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２８３又は２８４に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１１３又は１１４に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、アセチルキシランエステラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２８３又は２８４に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アセチルキシランエステラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いアセチルキシランエステラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、転移糖を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２８９、２９３、２９６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１１９、１２３、１２６のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２８９、２９３、２９６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いマンノシルトランスフェラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、Ｏ−マンノース型糖鎖を効率よく修飾する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２９１、３２９、３３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１２１、１５９、１６０のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ムラミダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２９１、３２９、３３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ムラミダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いムラミダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、ペプチドグリカンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２９５又は２９８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１２５又は１２８に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、イソメラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２９５又は２９８に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、イソメラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いイソメラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、糖の光学異性体を効率よく相互変換する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２９９に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１２９に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、Ｌ−フクロキナーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２９９に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｌ−フクロキナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いＬ−フクロキナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、Ｌ−フクロースを効率よくリン酸化する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３００に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１３０に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、シアリダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号３００に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、シアリダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いシアリダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、シアル酸側鎖を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３０１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１３１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、キチナーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号３００に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キチナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いキチナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、キチンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号１９１又は３０２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２１又は１３２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１９１又は３０２に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いリパーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、脂質を構成するエステル結合を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３１２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１４２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ポリガラクツロナーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号３１２に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いポリガラクツロナーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、ペクチンを含むポリガラクツロン酸を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３１３、３３９、３４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１４３、１６９、１７０のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ペクチンエステラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号３１３、３３９、３４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ペクチンエステラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いペクチンエステラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、ペクチンを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３３１又は３３６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１６１又は１６６に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ヒドロラーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号３３１又は３３６に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヒドロラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いヒドロラーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、ヘテロ多糖キサンタンやアミノ酸残基を効率よく加水分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３３２又は３３３記載のアミノ酸配列、又は配列番号１６２又は１６３に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ラクタマーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号３３１又は３３６に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ラクタマーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いラクタマーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、β−ラクタム環を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３３５に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１６５に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、グルコサミニダーゼ活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号３３５に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
これらの新規タンパク質は高いグルコサミニダーゼ活性を示すと考えられた。したがって、これらのタンパク質は、ジアセチルキトビオースを効率よく分解する系の確立に利用することができる。
さらに、本発明は、配列番号１９３、１９４、１９５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号２３、２４、２５のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ペプチダーゼ阻害活性を有する単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１９３、１９４、１９５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ペプチダーゼ阻害活性を有するタンパク質であってもよい。
後述するように、これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は高いペプチダーゼ阻害活性を示した。したがって、これらのタンパク質は、植物や微生物が生産するある種のペプチダーゼに対して阻害活性を示すことで、クロストリジウム セルロボランス、あるいは、それが生産するセルロソームの分解の阻止に利用することができる。
本発明は、配列番号１８８、１９２、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１８、２２、２６、２７、２８、２９、３０、３１のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、機能未知のタンパク質、機能未知ドメイン、細胞表面タンパク質、セルロソームタンパク質 ドックリン タイプＩ又はＣＢＭ３−ＳＬＨ−Ｃｏｈ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢあるいはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）をコードする塩基配列からなる単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号１８８、１９２、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、機能未知のタンパク質、機能未知ドメイン、細胞表面タンパク質、セルロソームタンパク質 ドックリン タイプＩ、ＣＢＭ３−ＳＬＨ−Ｃｏｈ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢあるいはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）をコードする塩基配列からなるタンパク質であってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質はコヘシンドメインあるいはドックリンドメインを含んでおり、セルロソームを構成する成分であった。したがって、これらのタンパク質は、セルロソームの形成に利用することができる。
本発明は、配列番号２７２、２８６、２８７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１０２、１１６、１１７のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、エンドアラビナーゼ様タンパク質として単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２７２、２８６、２８７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、エンドアラビナーゼ様タンパク質をコードする塩基配列からなるタンパク質であってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質はエンドアラビノースに相同性が高かった。したがって、これらのタンパク質は、Ｌ−アラビノース含有多糖を効率よく分解する系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号２９４に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１２４に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、アラビノオリゴサッカライド結合タンパク質として単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号２９４に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アラビノオリゴサッカライド結合タンパク質をコードする塩基配列からなるタンパク質であってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質はアラビノース含有オリゴ糖に対して結合能を有するタンパク質と高い相同性があった。したがって、これらのタンパク質は、アラビノース含有オリゴ糖と結合してアラビノオリゴサッカライド結合タンパク質を回収するための系の確立に利用することができる。
本発明は、配列番号３３７又は３３８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１６７又は１６８に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、パタチンとして単離された新規タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号３３７又は３３８に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、パタチンをコードする塩基配列からなるタンパク質であってもよい。
これらの新規ＤＮＡがコードするタンパク質は生体防御タンパク質であるパタチンに相同性が高かった。したがって、これらのタンパク質は、植物病虫に対して殺虫作用を有するタンパク質として利用することができる。
本発明は、上記のクロストリジウム セルロボランス由来の新規ＤＮＡを含むベクターを提供する。また、このベクターで形質転換された遺伝子組換え体を提供する。ここで、遺伝子組換え体は、酵母、大腸菌、枯草菌、クロストリジウム属、乳酸菌、コリネ菌、麹菌、糸状菌等の微生物、又は、動物細胞、植物細胞等を含む高等真核生物であってよい。これらの遺伝子組換え体は、セルロースやヘミセルロースを効率よく分解して、単糖や低級アルコールを製造する系の確立に利用することができる。
本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号１〜３１のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルロソーム形成活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡ；及び（ｂ）配列番号３２〜１７０のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルロソーム形成活性を有さないタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡの組み合わせを発現可能に保持する、遺伝子組換え体を提供する。本発明はまた、セルロース又はヘミセルロースの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、セルロース又はヘミセルロースから単糖を製造する方法を提供する。本発明はさらに、セルロース又はヘミセルロースの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、セルロース又はヘミセルロースから低級アルコールを製造する方法を提供する。
この遺伝子組換え体は、単一微生物（クロストリジウム セルロボランス）に由来する酵素をコードするＤＮＡの組み合わせを保持する。したがって、由来の異なる酵素の組み合わせを発現する微生物と比較して、効率的にセルロース又はヘミセルロースを分解する酵素の組み合わせを発現することができる。さらに、この組み合わせはセルロソーマルな酵素とノンセルロソーマルな酵素の組み合わせであるため、後述するように相乗的に作用して、セルロース又はヘミセルロースを効率よく分解することができる。この方法により製造された単糖は、低級アルコールのみならず、例えば芳香族化合物等の汎用化学物質の生産に利用することも可能である。また、エタノールやブタノール等の低級アルコールを連続糖化発酵工程により効率的に製造することが可能である。連続糖化発酵工程とは、糖化及び発酵を連続して効率的に行なう工程である。
本発明は、配列番号５、１２、１３、６３、６４、６５のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、マンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡを発現可能に保持する、遺伝子組換え体を提供する。本発明はまた、マンナンの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、マンナンからマンノースを製造する方法を提供する。本発明はさらに、マンナンの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、マンナンから低級アルコールを製造する方法を提供する。
後述するように、この遺伝子組換え体を用いて、マンナンからマンノースを効率よく製造することができる。また、マンナンから連続糖化発酵工程により効率よく低級アルコールを製造することができる。
本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号５、１２、１３、６３、６４、６５のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、マンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡ；及び（ｂ）配列番号９４に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、β−マンノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡの組み合わせを発現可能に保持する、遺伝子組換え体を提供する。本発明はまた、マンナンの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、マンナンからマンノースを製造する方法を提供する。本発明はさらに、マンナンの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、マンナンから低級アルコールを製造する方法を提供する。
後述するように、この遺伝子組換え体を用いて、マンナンからマンノースを効率よく製造することができる。また、マンナンから連続糖化発酵工程により効率よく低級アルコールを製造することができる。
本発明は、配列番号１６、４７、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４４のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡを発現可能に保持する、遺伝子組換え体を提供する。本発明はまた、ペクチンの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、ペクチンからガラクツロン酸を製造する方法を提供する。本発明はさらに、ペクチンの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、ペクチンから低級アルコールを製造する方法を提供する。本明細書において、ペクチンはヘミセルロースに含まれるものとする。ペクチンは水溶性のポリマーであり、ラムノガラクツロナン、ホモガラクツロナン等を含む。
後述するように、この遺伝子組換え体を用いて、ペクチンからガラクツロン酸を効率よく製造することができる。また、ペクチンから連続糖化発酵工程により効率よく低級アルコールを製造することができる。
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号８又は７０に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡ；（ｂ）配列番号５８、７７、７９、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８８、１０１、１２２のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、キシロシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡ；及び（ｃ）配列番号８２又は８５に記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡの組み合わせを発現可能に保持する、遺伝子組換え体を提供する。本発明はまた、キシランの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、キシランからキシルロースを製造する方法を提供する。本発明はさらに、キシランの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、キシランから低級アルコールを製造する方法を提供する。
後述するように、この遺伝子組換え体を用いて、キシランからキシルロースを効率よく製造することができる。また、キシランから連続糖化発酵工程により効率よく低級アルコールを製造することができる。
本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号１、２、３、４、６、７、９、１０、１１、３２、３３、３４、３５、３６、４２、４３、１１１、１６４のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡ；及び（ｂ）配列番号４５、４８、５０、５２、５３、５４、５６、５７、６０のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡの組み合わせを発現可能に保持する、遺伝子組換え体を提供する。本発明はまた、セルロースの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、セルロースからグルコースを製造する方法を提供する。本発明はさらに、セルロースの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、セルロースから低級アルコールを製造する方法を提供する。
後述するように、この遺伝子組換え体を用いて、セルロースからグルコースを効率よく製造することができる。また、セルロースから連続糖化発酵工程により効率よく低級アルコールを製造することができる。
本発明は、配列番号７８、１０３、１２２、１２７のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡを発現可能に保持する、遺伝子組換え体を提供する。本発明はまた、アラビノースを含むヘミセルロースの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、アラビノースを含むヘミセルロースからアラビノースを製造する方法を提供する。本発明はさらに、アラビノースを含むヘミセルロースの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、アラビノースを含むヘミセルロースから低級アルコールを製造する方法を提供する。
後述するように、この遺伝子組換え体を用いて、アラビノースを含むヘミセルロースからアラビノースを効率よく製造することができる。また、アラビノースを含むヘミセルロースから連続糖化発酵工程により効率よく低級アルコールを製造することができる。
本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号５、１２、１３、６３、６４、６５のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、マンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡ；及び（ｂ）配列番号１５、５９、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８、９９のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡの組み合わせを発現可能に保持する、遺伝子組換え体を提供する。本発明はまた、ガラクトマンナンの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、ガラクトマンナンからガラクトース及びマンノースを製造する方法を提供する。本発明はさらに、ガラクトマンナンの存在下で、この遺伝子組換え体を培養する工程を含む、ガラクトマンナンから低級アルコールを製造する方法を提供する。
後述するように、この遺伝子組換え体を用いて、ガラクトマンナンからガラクトース及びマンノースを効率よく製造することができる。また、ガラクトマンナンから連続糖化発酵工程により効率よく低級アルコールを製造することができる。
上記の遺伝子組換え体は、上記ＤＮＡ又はＤＮＡの組み合わせを、細胞表層への発現及び細胞外への分泌の組み合わせで発現するものであってよい。上記のセルロース又はヘミセルロースを分解する活性を有するタンパク質を遺伝子組換え体の細胞表面に発現することにより、セルロソームに類似する酵素複合体を人工的に再構成することができる。また、セルロース又はヘミセルロースを分解する活性を有するタンパク質を細胞外に分泌させて発現することにより、ノンセルロソーマルな酵素を人工的に再構成することができる。
これにより、クロストリジウム セルロボランスのセルロソーマルな酵素とノンセルロソーマルな酵素の組み合わせに類似した酵素活性を得ることができ、セルロース又はヘミセルロースを更に効率よく完全に分解することが可能となる。
本発明のセルロース又はヘミセルロースから単糖を製造する方法においては、セルロース又はヘミセルロースの存在下で、上記の遺伝子組換え体を２種類以上混合して培養する工程を含んでよい。また、本発明のセルロース又はヘミセルロースから低級アルコールを製造する方法においては、セルロース又はヘミセルロースの存在下で、上記の遺伝子組換え体を２種類以上混合して培養する工程を含んでよい。
後述するように、遺伝子組換え体を２種類以上混合することにより、必要な酵素を発現する遺伝子組換え体の組み合わせを簡便に用意し、セルロース又はヘミセルロースに作用させることが可能となる。
本発明により、非食糧バイオマスであるセルロース及びヘミセルロースを、ほぼ完全に分解することができる新規タンパク質及びこれらのタンパク質をコードする新規ＤＮＡが提供される。また、これらのＤＮＡを含むベクター、このベクターで形質転換された遺伝子組換え体、このＤＮＡにコードされるタンパク質、セルロース又はヘミセルロースから単糖を製造する方法、セルロース又はヘミセルロースから連続糖化発酵工程により低級アルコールを製造する方法が提供される。これらの方法により、セルロース又はヘミセルロースを完全に分解し、植物系バイオマスの全量を利用することが可能となる。また、再生可能な植物系バイオマスを原料として、エタノールやブタノール等の燃料や、芳香族化合物等の汎用化学物質の生産を効率的に行なうことが可能となる。
実施例１のバガスの結果を示す写真である。 実施例１の稲わらの結果を示す写真である。 （Ａ）及び（Ｂ）は、プラスミドｐＵＬＤ１の構造を示す図である。 （Ａ）及び（Ｂ）は、プラスミドｐＵＬＳＧ１の構造を示す図である。 ２Ｄ−ＬＣシステムの概要を示す図である。 実施例１２の代表的な結果を示す図である。
本明細書において、「９０％以上の相同性を有する塩基配列」とは、２つの塩基配列を、可能な限り多数の塩基が相互に一致するように並列させて比較した場合に、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の塩基が同一である塩基配列を意味する。ここで、塩基配列を並列させる際には、最大の相同性を与えるようにギャップを含んでもよい。
本明細書における「相同性」には、「類似性」、「同一性」のいずれもが含まれ、「９０％以上の相同性を有する塩基配列」は、９０％以上の類似性を有する塩基配列であっても、９０％以上の同一性を有する塩基配列であってもよい。さらに、８０％以上の類似性又は同一性を有する塩基配列、８５％以上の類似性又は同一性を有する塩基配列も、本発明の「相同性を有する塩基配列」に含むことができ、特に、「９０％以上の相同性を有する塩基配列」が好ましい塩基配列とされる。
本明細書において、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、基準となるアミノ酸配列と比較して、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。
セルロースは６炭糖であるグルコースのβ−１、４−結合ポリマーであり、ヘミセルロースは、６炭糖であるグルコースや５炭糖であるキシロースやアラビノース等を含んだポリマーである。ヘミセルロースには、マンナン、キシラン、ガラクトマンナン、ラムノガラクツロナン、アラビナン、アラビノキシラン等が含まれる。アラビノースを含むヘミセルロースとしては、アラビナンやアラビノキシラン等が例示される。本明細書において、ヘミセルロースはペクチンを含むものとする。ペクチンは水溶性のポリマーであり、ラムノガラクツロナン、ホモガラクツロナン等を含む。
セルラーゼとは、セルロースのグリコシド結合を加水分解する酵素の総称であり、エンドグルカナーゼやエキソグルカナーゼを含む。エキソグルカナーゼはセロビオヒドロラーゼとも呼ばれる。本明細書においては、エンドグルカナーゼはセロビオヒドラーゼを含むものとする。また、本明細書においては、セルラーゼ活性とエンドグルカナーゼ活性を同義に用いる場合がある。ヘミセルラーゼとは、へミセルロースを分解する酵素の総称であり、マンナナーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、キシロースイソメラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ等を含む。
１つの態様において、本発明は、配列番号１〜１７０のいずれか１つに記載の、クロストリジウム セルロボランス由来新規塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを提供する。これらのＤＮＡは、本明細書で開示した塩基配列をもとにプライマーを合成し、クロストリジウム セルロボランスから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行なうこと等により、取得することができる。
これらのＤＮＡを適切なベクターに連結し、適切な宿主に導入することにより発現させることができる。大腸菌を宿主に用いる場合のベクターとしては、ｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドを用いることができるが、これらに限定されるものではない。大腸菌用のプロモーターとしては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター等が使用可能である。
酵母を宿主として細胞表層に目的タンパク質を発現させる場合には、例えばプラスミドｐＵＬＤ１をベクターに用いることができるが、これに限定されるものではない。ｐＵＬＤ１の構造を図３（Ａ）及び（Ｂ）に示す。このベクターには、細胞壁アンカリングドメインとして機能する、α−アグルチニンのＣ末端領域をコードする遺伝子が組み込まれているため、目的遺伝子をα−アグルチニンとの融合蛋白として酵母細胞表層に発現させることができる。
酵母を宿主として細胞外に目的タンパク質を分泌させる場合には、例えばプラスミドｐＵＬＳＧ１をベクターに用いることができるが、これに限定されるものではない。ｐＵＬＳＧ１の構造を図４（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
酵母用のプロモーターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーターや酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター等が使用可能である。酵母に適した分泌シグナル配列としては、酵母分泌蛋白質由来のものが好ましく、例えば酵母インベルターゼ（ＳＵＣ２）、酵母酸性フォスファターゼ（ＰＨＯ５）、酵母プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ１）、酵母シクロスポリン関連遺伝子（ＣＲＧ１）等が例示できる。
１つの態様において、本発明は、配列番号１７１〜３４０のいずれか１つに記載の、クロストリジウム セルロボランス由来新規アミノ酸配列、又は配列番号１〜１７０のいずれか１つに記載の新規塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有する新規タンパク質を提供する。これらのタンパク質は、例えば次のような方法により取得することができる。まず、クロストリジウム セルロボランスから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行なうこと等により、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを得る。続いて、このＤＮＡを発現ベクターに連結し、大腸菌や酵母等の宿主細胞に導入して発現させる。ここで、目的タンパク質の発現ベクターは、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ等のタグ配列との融合タンパクを発現するように構築されてもよい。これらのタグは、例えば、アフィニティーカラムでタンパク質を精製するために利用することができる。続いて、これらの宿主細胞の菌体又は培養上清から目的タンパク質を精製する。本明細書において、プラスミドとベクターは同義に用いる場合がある。これらのタンパク質は、例えば次のようにして利用することができる。例えば、これらのタンパク質を精製酵素としてセルロース又はヘミセルロースに添加することにより、これらのバイオマスを分解することができる。また、微生物を用いてセルロース又はヘミセルロースを分解する工程においても、これらのタンパク質を添加することにより、その工程を増強することができる。
１つの態様において、本発明は、上記のクロストリジウム セルロボランス由来の新規ＤＮＡを含むベクターを提供する。また、このベクターで形質転換された遺伝子組換え体を提供する。ここで、遺伝子組換え体は、酵母、大腸菌、枯草菌、クロストリジウム属、乳酸菌、コリネ菌、麹菌、糸状菌等の微生物、又は、動物細胞、植物細胞等を含む高等真核生物であってよい。本明細書において、形質転換された微生物とは、形質転換された微生物及びその子孫、並びに異なるベクターで形質転換された微生物同士を掛け合わせて得られたハイブリッドも含む場合がある。
１つの態様において、本発明は、配列番号１〜１７０のいずれか１つに記載の塩基配列、又はこの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる新規ＤＮＡを発現可能に保持する、遺伝子組換え体を提供する。これらの遺伝子組換え体は、例えば次のようにして取得することができる。まず、クロストリジウム セルロボランスから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行なうこと等により、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを得る。続いて、このＤＮＡを発現ベクターに連結し、大腸菌や酵母等の宿主細胞に導入し、遺伝子組換え体を得る。
１つの態様において、本発明は、セルロース又はヘミセルロースの存在下で、上記遺伝子組換え体を培養する工程を含む、セルロース又はヘミセルロースから単糖を製造する方法を提供する。これは、例えば、バガスや稲わら等の、セルロース及びヘミセルロースを含むバイオマスの存在下で、上記の遺伝子組換え体を培養することで実現できる。この培地から、セルロース又はヘミセルロースの糖化により得られた単糖を分離することができる。
１つの態様において、本発明は、セルロース又はヘミセルロースの存在下で、上記の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、セルロース又はヘミセルロースから低級アルコールを製造する方法を提供する。これは、例えば、バガスや稲わら等の、セルロース及びヘミセルロースを含むバイオマスの存在下で、上記の遺伝子組換え体を培養することで実現できる。遺伝子組換え体として、アルコール発酵能を有するものを培養することにより、セルロース又はヘミセルロースの糖化で得られた単糖を発酵して低級アルコールを製造することができる。遺伝子組換え体として、５炭糖を発酵する能力を持つものを使用すれば、ヘミセルロースの糖化で得られた５炭糖を発酵して低級アルコールを製造することができる。また、遺伝子組換え体が酵母である場合には、アルコールに対する耐性が高いことから、より効率よく低級アルコールを製造することができる。遺伝子組換え体がブタノール発酵能を持つものである場合には、低級アルコールとしてブタノールを製造することができる。また、適切な遺伝子組換え体を利用することにより、低級アルコールだけでなく、例えば芳香族化合物等の汎用化学物質の生産を行うことも可能である。
低級アルコールとしては、エタノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、グリセリン等が例示できる。
以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
（実施例１）
（クロストリジウム セルロボランスの培養）
培地に対して４（ｗ／ｖ）％のバガスを含む培地を用意し、クロストリジウム セルロボランスを接種して、３７℃で嫌気的条件下で静置培養を行った。バガスは、サトウキビから砂糖をつくるときに得られる搾りかすである。クロストリジウム セルロボランスを接種していない培地も調製し、コントロールとした。図１に培養５日後の写真を示す。クロストリジウム セルロボランスを接種した培地においては、培養５日後においてバカスの体積の減少とともに、水素等の醗酵産物が観察された。この結果は、クロストリジウム セルロボランスが、バガスを構成するセルロースやヘミセルロースを分解したことを示す。
培地に対して０．５（ｗ／ｖ）％の稲わら（もみ殻）及び０．３（ｗ／ｖ）％のセロビオースを含む培地を用意し、クロストリジウム セルロボランスを接種して、３７℃で嫌気的条件下で静置培養を行った。クロストリジウム セルロボランスを接種していない培地も調製し、コントロールとした。図２に培養７日後の写真を示す。クロストリジウム セルロボランスを接種した培地においては、培養７日後において稲わらの体積の減少とともに、水素等の醗酵産物が観察された。この結果は、クロストリジウム セルロボランスが、稲わらを構成するセルロースやヘミセルロースを分解したことを示す。
（実施例２）
（クロストリジウム セルロボランスゲノムの塩基配列決定）
シークエンサーＧＳ ＦＬＸ（ロシュ社製）及びＧＡＩＩ（イルミナ社製）を用いて、クロストリジウム セルロボランスの全ゲノム塩基配列を決定した。まず、シークエンサーＧＳ ＦＬＸ（ロシュ社製）を用いて、精度が低いドラフト配列の決定を行なった。続いて、シークエンサーＧＡＩＩ（イルミナ社製）を用いて、より詳細な、一連の塩基配列であるコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）配列の決定を行なった。コンティグ配列をドラフト配列と比較し、塩基配列の精度の改善を行なった。これらのシークエンサーで決定できなかった繰り返し領域の塩基配列を、ＰＣＲ及びサンガー法に基づいた塩基配列決定法により決定した。
（実施例３）
（クロストリジウム セルロボランスゲノムの塩基配列の解析）
コンティグ配列の向きを揃えて順番どおりに並べることにより、３０個のスキャホールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）配列が得られた。これらのスキャホールド配列は、約５．１Ｍｂｐのほぼ完全なクロストリジウム セルロボランスの全ゲノムの塩基配列を構成し、４、２２０個の予想される遺伝子を含んでいた。興味深いことに、クロストリジウム セルロボランスのゲノムは、過去に塩基配列決定がなされたいずれのクロストリジウム属のゲノムよりも１．１〜１．３Ｍｂｐ大きかった。このため、全ゲノムの塩基配列の決定は非常に困難であった。この塩基配列情報は、微生物を改良し、バイオマスからバイオプロセスにより化学品やエネルギー等を生産する、バイオリファイナリーを実現するために非常に有用である。
クロストリジウム セルロボランスの全ゲノムの塩基配列を、ｉｎ ｓｉｌｌｉｃｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（商標） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０．２６ ソフトウエアを用いて解析した。その結果、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有する１７０個の新規タンパク質をコードする遺伝子を同定した。このうち、セルロソーマルなタンパク質をコードする新規遺伝子が３１個であり、ノンセルロソーマルなタンパク質をコードする新規遺伝子が１３９個であった。これらの遺伝子の配列番号、配列の種類、ローカスタグ及び遺伝子名を表１〜表１０に示す。ローカスタグとは、各遺伝子座を示す記号である。
（実施例４）
（酵母のセルロース及びヘミセルロース分解活性の検出）
酵母のセルロース及びヘミセルロース分解活性は、色素結合多糖を用いる方法により検出した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００１）３５５、１６７−１７７を参照）。色素結合多糖として、アゾ−ラムノガラクツロナン、アゾ−セルロース、アゾ−マンナン及びアゾ−キシラン（全てＭｅｇａｚｙｍｅ社製）を使用した。これらは、それぞれ、ラムノガラクツロラン、セルロース、マンナン、キシランに青色色素であるレマゾールブリリアントブルーＲを結合させたものであり、酵母が発現した酵素によって分解されると、色素が培地中に遊離拡散するため、酵素活性を検出することができる。
０．５〜１％のアゾ−ラムノガラクツロナン、アゾ−セルロース、アゾ−マンナン及びアゾ−キシランを添加したＳＤ寒天培地に試料液を塗沫し、２〜５日間酵母の培養を行った。コロニー周囲の基質が分解拡散し、ハローを形成したものを釣菌した。ここでハローとは、コロニー周囲に形成された透明な部分を意味する。
（実施例５）
（新規マンナナーゼの活性の評価）
（酵母発現プラスミドの構築）
ベクターとしてｐＵＬＤ１を使用した（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００９）８２、７１３−７１９を参照）。ｐＵＬＤ１の構造を図３（Ａ）及び（Ｂ）に示す。このベクターには、細胞壁アンカリングドメインとして機能する、α−アグルチニンのＣ末端領域をコードする遺伝子が組み込まれているため、目的遺伝子をα−アグルチニンとの融合蛋白として酵母細胞表層に発現させることができる。
プラスミドｐＵＬＤ１に、クロストリジウム セルロボランスのファミリー２６に属するマンナナーゼである、マンナナーゼＧＨ２６−ＤＳ（配列番号１２、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ６９＿ＣＤ００００２４＿３８８３９＿３５９９９）をコードするＤＮＡ断片をサブクローニングした。
プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣ−３’（配列番号３４１）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号３４２）を用いて、クロストリジウム セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲでは、９４℃／１分−６０℃／１分−７２℃／３０秒のサイクルを３０回繰り返した。これらのプライマーには、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで切断した。また、プラスミドｐＵＬＤ１を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで切断した。制限酵素で切断したＰＣＲ産物をプラスミドｐＵＬＤ１のＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ切断部位に挿入して、プラスミドｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ａ−ＤＳ（マンナナーゼＧＨ２６−ＤＳ、配列番号１２由来）を得た。
（細胞表層にマンナナーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ａ−ＤＳを単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法により酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ａ−ＤＳが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。この酵母を、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ）と名付けた。
得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのマンナナーゼ活性をアゾ−マンナン培地のハローの有無により観察した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にマンナナーゼ活性は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ）の培地中にはほとんどマンナナーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ）菌体はマンナナーゼ活性を有していた。この結果は、酵母細胞表層にマンナナーゼが発現されたことを意味する。
酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、０．５％マンナンを含むＳＤ液体培地で培養し、エタノール醗酵を行った。その結果、マンナンからエタノールが生産された。この結果はマンナンからマンノースが生産されたことを示す。また、連続糖化発酵工程によりマンナンからエタノールが生産されたことを示す。
（実施例６）
（新規セルラーゼ及びヘミセルラーゼの活性の評価）
（酵母発現プラスミドの構築）
プラスミドｐＵＬＤ１に、次の６種類のセルロソーマルな新規セルラーゼ及び新規ヘミセルラーゼ、すなわち、エンドグルカナーゼＧＨ９−ＤＳ（配列番号１、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ４８＿ＣＤ００００４３＿６４０５５＿６２２０２）、エンドグルカナーゼＧＨ５−ＤＳ（配列番号２、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５７＿ＧＬ０００００２＿９４３＿２５４７）、マンナナーゼＧＨ５−ＧＨ５−ＣＢＭ１１−ＤＳ（配列番号５、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３２９＿ＣＤ００００２４＿３５９７１＿３１７７５）、キシラナーゼＧＨ８−ＤＳ（配列番号８、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５１＿ＣＤ０００００７＿１１７９０＿１０３３６）、エンド−β−ガラクトシダーゼＧＨ９８−ＤＳ（配列番号１５、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３４２＿ＣＲ００００１０＿１４１０３＿１１０６２）、ペクチン酸リアーゼ−ＤＳ（配列番号１６、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５６＿ＣＤ００００１１＿１３３４８＿１５０７５）をコードするＤＮＡ断片をサブクローニングした。
配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＴＡＣＡＧＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＣＧ−３’（配列番号３４３）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＴＣＧＡＴＴＡＴＣＣＣ−３’（配列番号３４４）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＡＧＣ−３’（配列番号３４５）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＡＣＡＧＣ−３’（配列番号３４６）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＴＧＴＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＧＧ−３’（配列番号３４７）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＡＣＴＴＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＴＧＣ−３’（配列番号３４８）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡＴＧＧ−３’（配列番号３４９）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＣ−３’（配列番号３５０）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号１５の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号３５１）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＡＴＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＴＴＡＧＣ−３’（配列番号３５２）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号１６の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＡＣＴＧＴＡＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧ−３’（配列番号３５３）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＡＧＴＧＣＣ−３’（配列番号３５４）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
これらのプライマーを用い、クロストリジウム セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃／１分−６０℃／１分−７２℃／３０秒のサイクルを３０回繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、あるいは制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。また、プラスミドｐＵＬＤ１を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、あるいは制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。制限酵素で切断した各ＰＣＲ産物をプラスミドｐＵＬＤ１のＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ切断部位、あるいはＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ切断部位に挿入して、それぞれ、プラスミドｐＵＬＤ１−ＥＧ９−ＤＳ（エンドグルカナーゼＧＨ９−ＤＳ、配列番号１由来）、ｐＵＬＤ１−ＥＧ５−ＤＳ（エンドグルカナーゼＧＨ５−ＤＳ、配列番号２由来）、ｐＵＬＤ１−ｍａｎ５Ｂ−ＤＳ（マンナナーゼＧＨ５−ＧＨ５−ＣＢＭ１１−ＤＳ、配列番号５由来）、ｐＵＬＤ１−Ｘｙｎ８−ＤＳ（キシラナーゼＧＨ８−ＤＳ、配列番号８由来）、ｐＵＬＤ１−Ｂｇａｌ９８−ＤＳ（エンド−β−ガラクトシダーゼＧＨ９８−ＤＳ、配列番号１５由来）、及びｐＵＬＤ１−ＰＬ１−ＤＳ（ペクチン酸リアーゼ−ＤＳ、配列番号１６由来）を得た。
（細胞表層にエンドグルカナーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−ＥＧ９−ＤＳ及びｐＵＬＤ１−ＥＧ５−ＤＳをそれぞれ単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−ＥＧ９−ＤＳあるいはｐＵＬＤ１−ＥＧ５−ＤＳが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。これらの酵母を、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ９）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ５）と名付けた。
得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ９）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ５）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地でそれぞれ培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのセルラーゼ活性をアゾ−セルロース培地のハローの有無により観察した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にセルラーゼ活性（エンドグルカナーゼ活性）は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ９）及び酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ５）の培地中にはいずれもセルラーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ９）菌体及び酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ５）菌体はセルラーゼ活性を有していた。この結果は、酵母細胞表層にエンドグルカナーゼが発現されたことを意味する。
（細胞表層にマンナナーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−ｍａｎ５Ｂ−ＤＳを単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−ｍａｎ５Ｂ−ＤＳが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。この酵母を、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ）と名付けた。得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのマンナナーゼ活性をアゾ−マンナン培地のハローの有無により観察した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にマンナナーゼ活性は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ）の培地中にはほとんどマンナナーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ）菌体はマンナナーゼ活性を有していた。この結果は、酵母細胞表層にマンナナーゼが発現されたことを意味する。また、マンナンからマンノースが生産されたことを示す。
（細胞表層にキシラナーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−Ｘｙｎ８−ＤＳを単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−Ｘｙｎ８−ＤＳが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。この酵母を、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８）と名付けた。得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのキシラナーゼ活性をアゾ−キシラン培地のハローの有無により観察した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にマンナナーゼ活性は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８）の培地中にはほとんどキシラナーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８）菌体はキシラナーゼ活性を有していた。この結果は、酵母細胞表層にキシラナーゼが発現されたことを意味する。また、キシランからキシロースが生産されたことを示す。
（細胞表層にβ−ガラクトシダーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−Ｂｇａｌ９８−ＤＳを単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−Ｂｇａｌ９８−ＤＳが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。この酵母を、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｇａｌ９８）と名付けた。得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｇａｌ９８）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのβ−ガラクトシダーゼ活性をＸ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を塗布した寒天培地におけるコロニーの色（ブルー／ホワイト）について観察した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にβ−ガラクトシダーゼ活性は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｇａｌ９８）の培地中にはほとんどβ−ガラクトシダーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｇａｌ９８）菌体はβ−ガラクトシダーゼ活性を有していた。この結果は、酵母細胞表層にβ−ガラクトシダーゼが発現されたことを意味する。また、セルロースからグルコースが生産されたことを示す。
（細胞表層にペクチン酸リアーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−ＰＬ１−ＤＳを単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−ＰＬ１−ＤＳが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。
この酵母を、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＤＳ）と名付けた。得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＤＳ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのペクチン酸リアーゼ活性をアゾ−ラムノガラクツロナン培地のハローの有無により観察した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（２００１）９８、４１２５−４１２９を参照）。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にペクチン酸リアーゼ活性は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＤＳ）の培地中にはほとんどペクチン酸リアーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＤＳ）菌体はペクチン酸リアーゼ活性を有していた。この結果は、酵母細胞表層にペクチン酸リアーゼが発現されたことを意味する。また、ラムノガラクツロナンからガラクツロン酸が生産されたことを示す。
酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＤＳ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、０．５％ホモガラクツロナンを含むＳＤ液体培地で培養し、エタノール醗酵を行った。その結果、ホモガラクツロナンからエタノールが生産された。この結果はホモガラクツロナンからガラクツロン酸が生産されたことを示す。また、連続糖化発酵工程によりホモガラクツロナンからエタノールが生産されたことを示す。
（実施例７）
（新規キシラナーゼ、キシロシダーゼ及びキシロースイソメラーゼを用いたエタノール生産）
（酵母発現プラスミドの構築）
プラスミドｐＵＬＤ１に、セルロソーマルな新規キシラナーゼ、ノンセルロソーマルな新規キシラナーゼ、ノンセルロソーマルな新規キシロシダーゼ及びノンセルロソーマルな新規キシロースイソメラーゼ、すなわち、キシラナーゼＧＨ８−ＤＳ（配列番号８、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５１＿ＣＤ０００００７＿１１７９０＿１０３３６、セルロソーマル）、エンド−１、４−β−キシラナーゼＧＨ４３（配列番号７０、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５６＿ＣＤ００００１６＿２２１３２＿２１２０６、ノンセルロソーマル）、β−キシロシダーゼＧＨ３９（配列番号８４、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３３６＿ＣＤ００００４３＿５２１４２＿４９６４７、ノンセルロソーマル）、キシロースイソメラーゼ（配列番号８２、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ２５７＿ＣＲ０００００６＿６７８３＿５４６４、ノンセルロソーマル）をコードするＤＮＡ断片をサブクローニングした。
配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡＴＧＧ−３’（配列番号３４９）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＣ−３’（配列番号３５０）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号７０の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＴＡＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号３５５）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＴＣＧＡＴＴＡＴＣＣＣ−３’（配列番号３５６）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号８４の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＴＡＴＧＧ−３’（配列番号３５７）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＴＣ−３’（配列番号３５８）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号８２の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＴＧＣＧ−３’（配列番号３５９）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴＴＧ−３’（配列番号３６０）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
これらのプライマーを用い、クロストリジウム セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃／１分−６０℃／１分−７２℃／３０秒のサイクルを３０回繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、あるいは制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。また、プラスミドｐＵＬＤ１を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、あるいは制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。制限酵素で切断した各ＰＣＲ産物をプラスミドｐＵＬＤ１のＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ切断部位、あるいはＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ切断部位に挿入して、それぞれ、プラスミドｐＵＬＤ１−Ｘｙｎ８−ＤＳ（キシラナーゼＧＨ８−ＤＳ、配列番号８由来）、ｐＵＬＤ１−Ｘｙｎ４３（エンド−１、４−β−キシラナーゼＧＨ４３、配列番号７０由来）、ｐＵＬＤ１−Ｘｙｌ３９（β−キシロシダーゼＧＨ３９、配列番号８４由来）、及びｐＵＬＤ１−ＸＩ（キシロースイソメラーゼ、配列番号８２由来）を得た。
（細胞表層にキシラナーゼ及びキシロシダーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−Ｘｙｎ８−ＤＳ、ｐＵＬＤ１−Ｘｙｎ４３、ｐＵＬＤ１−Ｘｙｌ３９、及びｐＵＬＤ１−ＸＩをそれぞれ単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−Ｘｙｎ８−ＤＳ、ｐＵＬＤ１−Ｘｙｎ４３、ｐＵＬＤ１−Ｘｙｌ３９あるいはｐＵＬＤ１−ＸＩが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。これらの酵母を、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ４３）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｌ３９）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＸＩ）と名付けた。
得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ４３）、及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｌ３９）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地でそれぞれ培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのキシラナーゼ活性をアゾ−キシラン培地のハローの有無により観察した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にキシラナーゼ活性は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８）ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ４３）、及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｌ３９）の培地中にはいずれもキシラナーゼあるいはキシロシダーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ４３）、及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｌ３９）それぞれの菌体はキシラナーゼあるいはキシロシダーゼ活性を有していた。この結果は、酵母細胞表層にキシラナーゼあるいはキシロシダーゼが発現されたことを意味する。
酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｌ３９）、あるいは、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ４３）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｌ３９）を用いて、それぞれの組み合わせでハイブリットを作製し、さらに酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＸＩ）を掛け合わせた。最終的に、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８−Ｘｙｌ３９−ＸＩ）及び酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ４３−Ｘｙｌ３９−ＸＩ）を得た。得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８−Ｘｙｌ３９−ＸＩ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ４３−Ｘｙｌ３９−ＸＩ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、０．５％キシランを含むＳＤ液体培地でそれぞれ培養し、エタノール醗酵を行った。その結果、両菌株ともに６２時間の発酵でキシランから約８ｇ／Ｌ以上のエタノールを生産した。この結果はキシランからキシロースを経てキシルロースが生産されたことを示す。また、連続糖化発酵工程によりキシランからエタノールが生産されたことを示す。また、セルロソーマルな酵素とノンセルロソーマルな酵素との組み合わせが相乗的に作用することを示す。
（実施例８）
（新規エンドグルカナーゼ及びβ−グルコシダーゼを用いたエタノール生産）
（酵母発現プラスミドの構築）
プラスミドｐＵＬＤ１に、セルロソーマルな新規エンドグルカナーゼ及びノンセルロソーマルなβ−グルコシダーゼ、すなわち、エンドグルカナーゼＧＨ９−ＤＳ（配列番号１、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ４８＿ＣＤ００００４３＿６４０５５＿６２２０２、セルロソーマル）、エンドグルカナーゼＧＨ５−ＤＳ（配列番号２、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５７＿ＧＬ０００００２＿９４３＿２５４７、セルロソーマル）、β−グルコシダーゼＧＨ１（配列番号４５、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３１９＿ＣＲ００００１２＿１４６０６＿１３１７０、ノンセルロソーマル）をコードするＤＮＡ断片をサブクローニングした。
配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＴＡＣＡＧＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＣＧ−３’（配列番号３４３）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＴＣＧＡＴＴＡＴＣＣＣ−３’（配列番号３４４）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＡＧＣ−３’（配列番号３４５）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＡＣＡＧＣ−３’（配列番号３４６）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号８４の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＧＧＴＧＣＣ−３’（配列番号３６１）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号３６２）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
これらのプライマーを用い、クロストリジウム セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃／１分−６０℃／１分−７２℃／３０秒のサイクルを３０回繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、あるいは制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。また、プラスミドｐＵＬＤ１を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、あるいは制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。制限酵素で切断した各ＰＣＲ産物をプラスミドｐＵＬＤ１のＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ切断部位あるいはＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ切断部位に挿入して、それぞれ、プラスミドｐＵＬＤ１−ＥＧ９−ＤＳ（エンドグルカナーゼＧＨ９−ＤＳ、配列番号１由来）、ｐＵＬＤ１−ＥＧ５−ＤＳ（エンドグルカナーゼＧＨ５−ＤＳ、配列番号２由来）、及びｐＵＬＤ１−ＢｇｌＢ（β−グルコシダーゼＧＨ１、配列番号４５由来）を得た。
（細胞表層にエンドグルカナーゼ及びβ−グルコシダーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−ＥＧ９−ＤＳ、ｐＵＬＤ１−ＥＧ５−ＤＳ及びｐＵＬＤ１−ＢｇｌＢをそれぞれ単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−ＥＧ９−ＤＳ、ｐＵＬＤ１−ＥＧ５−ＤＳあるいはｐＵＬＤ１−ＢｇｌＢが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。これらの酵母を、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ９）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ５）、及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＢｇｌＢ）と名付けた。
得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ９）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ５）、及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＢｇｌＢ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地でそれぞれ培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのセルラーゼ活性（エンドグルカナーゼ活性）をアゾ−セルロース培地のハローの有無により観察した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にセルラーゼ活性は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ９）、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ５）、及び酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＢｇｌＢ）の培地中にはいずれもセルラーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ９）菌体及び酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ５）菌体はセルラーゼ活性を有していた。また、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＢｇｌＢ）についてはパラニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシド（ＰＮＰ−β−Ｇｌｕ）を基質として分解を観察したところ黄色の発色が認められ、β−グルコシダーゼ活性が検出された。この結果は、酵母細胞表層にエンドグルカナーゼ及びβ−グルコシダーゼが発現されたことを意味する。また、セルロースからグルコースが生産されたことを示す。
酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ９）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ５）、及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＢｇｌＢ）を掛け合わせ、最終的に、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ９−ＥＧ５−ＢｇｌＢ）を得た。得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＥＧ９−ＥＧ５−ＢｇｌＢ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、０．５％セルロース（β−グルカン）を含むＳＤ液体培地でそれぞれ培養し、エタノール醗酵を行った。その結果、５０時間の発酵でセルロース（β−グルカン）から約２０ｇ／Ｌのエタノールが生産された。この結果は、連続糖化発酵工程によりセルロースからエタノールが生産されたことを示す。また、セルロソーマルな酵素とノンセルロソーマルな酵素との組み合わせが相乗的に作用することを示す。
（実施例９）
（新規アラビノフラノシダーゼを用いたエタノール生産）
（酵母発現プラスミドの構築）
プラスミドｐＵＬＤ１にノンセルロソーマルな新規アラビノフラノシダーゼ、すなわち、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＧＨ４３（配列番号１０３、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３０５＿ＣＤ００００１１＿２１１６３＿１４１３８、ノンセルロソーマル）をコードするＤＮＡ断片をサブクローニングした。
配列番号１０３の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧ−３’（配列番号３６３）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＣＣＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号３６４）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
これらのプライマーを用い、クロストリジウム セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃／１分−６０℃／１分−７２℃／３０秒のサイクルを３０回繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。また、プラスミドｐＵＬＤ１を制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。制限酵素で切断したＰＣＲ産物をプラスミドｐＵＬＤ１のＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ切断部位に挿入して、プラスミドｐＵＬＤ１−ＡｒｆＢ（α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＧＨ４３、配列番号１０３由来）を得た。
（細胞表層にアラビノフラノシダーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−ＡｒｆＢを単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−ＡｒｆＢが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。これらの酵母を、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｒｆＢ）と名付けた。
得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｒｆＢ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地でそれぞれ培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのアラビノフラノシダーゼ活性をｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド（ＰＮＰ−α−Ａｒａ）を基質として作用させた場合、遊離するｐ−ニトロフェノールの有無により観察した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にアラビノフラノシダーゼ活性は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｒｆＢ）の培地中にはアラビノフラノシダーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｒｆＢ）菌体はアラビノフラノシダーゼ活性を有していた。この結果は、酵母細胞表層にアラビノフラノシダーゼが発現されたことを意味する。また、アラビノキシランやアラビナン等のアラビノースを含むヘミセルロースからアラビノースを生産できることを示す。
酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｒｆＢ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、０．５％アラビノキシランを含むＳＤ液体培地で培養し、エタノール醗酵を行った。その結果、アラビノキシランからエタノールが生産された。この結果はアラビノキシランからアラビノースが生産されたことを示す。また、連続糖化発酵工程によりアラビノキシランからエタノールが生産されたことを示す。
酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｒｆＢ）と、上記実施例７で得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ８−Ｘｙｌ３９−ＸＩ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｘｙｎ４３−Ｘｙｌ３９−ＸＩ）とを混合して、０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、０．５％アラビノキシランを含むＳＤ液体培地でそれぞれ培養し、エタノール醗酵を行った。その結果、５０時間の発酵でアラビノキシランからエタノールが生産された。
この結果は、アラビノキシランからアラビノース、キシロース、キシルロースが生産されたことを示す。また、アラビノキシランから連続糖化発酵工程によりエタノールが生産されたことを示す。また、セルロソーマルな酵素とノンセルロソーマルな酵素との組み合わせが相乗的に作用することを示す。また、複数の遺伝子組換え酵母を混合して糖化や連続糖化発酵工程を行なうことが有効であることを示す。
（実施例１０）
（新規マンナナーゼ及びα−ガラクトシダーゼによるガラクトマンナンの分解）
（酵母発現プラスミドの構築）
プラスミドｐＵＬＤ１に、ノンセルロソーマルな新規β−マンナナーゼ及びノンセルロソーマルな新規α−ガラクトシダーゼ、すなわち、β−マンナナーゼＧＨ２６（配列番号６５、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５２＿ＣＲ００００２８＿４１６５３＿３７７７５、ノンセルロソーマル）、α−ガラクトシダーゼＧＨ４（配列番号９０、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３７５＿ＣＲ００００１２＿１４０８３＿１５５８５、ノンセルロソーマル）、α−ガラクトシダーゼＧＨ３１（配列番号９１、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３７５＿ＧＬ００００２５＿３１５７５＿２９３５９、ノンセルロソーマル）をコードする配列をサブクローニングした。
配列番号６５の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号３６５）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＡＡＴＣＣ−３’（配列番号３６６）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号９０の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＡＣＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号３６７）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＴＣＣＡＴＣＧＣ−３’（配列番号３６８）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号９１の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＣ−３’（配列番号３６９）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＡＡＴＣＴＣＣ−３’（配列番号３７０）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
これらのプライマーを用い、クロストリジウム セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃／１分−６０℃／１分−７２℃／３０秒のサイクルを３０回繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、あるいは制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。また、プラスミドｐＵＬＤ１を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、あるいは制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。制限酵素で切断した各ＰＣＲ産物をプラスミドｐＵＬＤ１のＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ切断部位、あるいはＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ切断部位に挿入して、それぞれ、プラスミドｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ｂ（β−マンナナーゼＧＨ２６、配列番号６５由来）、ｐＵＬＤ１−ＡｇａｌＡ（α−ガラクトシダーゼＧＨ４、配列番号９０由来）、及びｐＵＬＤ１−ＡｇａｌＢ（α−ガラクトシダーゼＧＨ３１、配列番号９１由来）を得た。
（細胞表層にマンナナーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ｂを単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ｂが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。この酵母を、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）と名付けた。
得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのマンナナーゼ活性をアゾ−マンナン培地のハローの有無により観察した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にマンナナーゼ活性は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）の培地中にはほとんどマンナナーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）菌体はマンナナーゼ活性を有していた。この結果は、酵母細胞表層にマンナナーゼが発現されたことを意味する。
（細胞表層にα−ガラクトシダーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−ＡｇａｌＡ及びｐＵＬＤ１−ＡｇａｌＢをそれぞれ単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−ＡｇａｌＡ及びｐＵＬＤ１−ＡｇａｌＢが染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。この酵母を、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｇａｌＡ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｇａｌＢ）と名付けた。
得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｇａｌＡ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｇａｌＢ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのα−ガラクトシダーゼ活性をｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトシド（ＰＮＰ−α−Ｇａｌ）を基質として作用させた場合、遊離するｐ−ニトロフェノールの有無により観察した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にα−ガラクトシダーゼ活性は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｇａｌＡ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｇａｌＢ）の培地中にはほとんどα−ガラクトシダーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｇａｌＡ）菌体及び酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｇａｌＢ）菌体はともにα−ガラクトシダーゼ活性を有していた。
酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｇａｌＡ）と、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ＡｇａｌＢ）をそれぞれ掛け合わせた。最終的に、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ−ＡｇａｌＡ）及び酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ−ＡｇａｌＢ）をそれぞれ得た。得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ−ＡｇａｌＡ）及び酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ−ＡｇａｌＢ）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、０．５％ローカストビーンガムを含むＳＤ液体培地でそれぞれ培養し、エタノール醗酵を行った。ローカストビーンガムは、常緑樹であるカロブ樹の種子の胚乳部分から製造される多糖類であり、主成分はガラクトマンナンである。その結果、５０時間の発酵でローカストビーンガムからエタノールが生産された。この結果は、ガラクトマンナンからマンノース及びガラクトースが生産されたことを示す。また、連続糖化発酵工程によりガラクトマンナンからエタノールが生産されたことを示す。
（実施例１１）
（新規マンナナーゼ及びβ−マンノシダーゼを用いたエタノール生産）
（酵母発現プラスミドの構築）
プラスミドｐＵＬＤ１に、セルロソーマル及びノンセルロソーマルな新規マンナナーゼ並びにノンセルロソーマルな新規β−マンノシダーゼ、すなわち、マンナナーゼＧＨ５−ＧＨ５−ＣＢＭ１１−ＤＳ（配列番号５、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３２９＿ＣＤ００００２４＿３５９７１＿３１７７５、セルロソーマル）、マンナナーゼＧＨ２６−ＤＳ（配列番号１２、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ６９＿ＣＤ００００２４＿３８８３９＿３５９９９、セルロソーマル）、β−マンナナーゼＧＨ２６（配列番号６５、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５２＿ＣＲ００００２８＿４１６５３＿３７７７５、ノンセルロソーマル）、β−マンノシダーゼＧＨ２（配列番号９４、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３３＿ＣＲ００００２７＿３３３２３＿３０８３７、ノンセルロソーマル）をコードする配列をサブクローニングした。
配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＴＧＴＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＧＧ−３’（配列番号３４７）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＡＣＴＴＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＴＧＣ−３’（配列番号３４８）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号１２の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣ−３’（配列番号３４１）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号３４２）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号６５の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号３６５）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＡＡＴＣＣ−３’（配列番号３６６）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号９４の塩基配列からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＡＡＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＴＧＧ−３’（配列番号３７１）及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号３７２）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
これらのプライマーを用い、クロストリジウム セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃／１分−６０℃／１分−７２℃／３０秒のサイクルを３０回繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、あるいは制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。また、プラスミドｐＵＬＤ１を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、あるいは制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。制限酵素で切断した各ＰＣＲ産物をプラスミドｐＵＬＤ１のＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ切断部位、あるいはＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ切断部位に挿入して、それぞれ、プラスミドｐＵＬＤ１−ｍａｎ５Ｂ−ＤＳ（マンナナーゼＧＨ５−ＧＨ５−ＣＢＭ１１−ＤＳ、配列番号５由来）、ｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ａ−ＤＳ（マンナナーゼＧＨ２６−ＤＳ、配列番号１２由来）、ｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ｂ（β−マンナナーゼＧＨ２６、配列番号６５由来）、ｐＵＬＤ１−Ｂｍａｎ２（β−マンノシダーゼＧＨ２、配列番号９４由来）を得た。
（細胞表層にマンナナーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
得られたプラスミドｐＵＬＤ１−ｍａｎ５Ｂ−ＤＳ、ｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ａ−ＤＳ、ｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ｂ及びｐＵＬＤ１−Ｂｍａｎ２を単離し、制限酵素ＳｔｕＩで一カ所を切断して線状としたＤＮＡを、酢酸リチウム法で酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕに導入した。０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ寒天培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。本培地ではプラスミドｐＵＬＤ１−ｍａｎ５Ｂ−ＤＳ、ｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ａ−ＤＳ、ｐＵＬＤ１−ｍａｎ２６Ｂ及びｐＵＬＤ１−Ｂｍａｎ２がそれぞれ染色体に導入され、ウラシル要求性が相補された株のみが生育できる。これらの酵母を、それぞれＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｍａｎ２）と名付けた。
得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｍａｎ２）をそれぞれ０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、２％グルコースを含むＳＤ液体培地で培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離し、それぞれのマンナナーゼ活性をアゾ−マンナン培地のハローの有無により観察した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にマンナナーゼ活性は認められなかった。形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｍａｎ２）の培地中にはほとんどマンナナーゼ活性はみられなかったが、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ）菌体、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ）菌体、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）菌体はマンナナーゼ活性を有していた。この結果は、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）の細胞表層にマンナナーゼが発現されたことを意味する。また、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｍａｎ２）におけるβ−マンノシダーゼ活性を、ｐ‐ニトロフェニル‐β‐Ｄ‐マンノシド（ＰＮＰ−β−Ｍａｎ）を基質として作用させ、遊離するｐ‐ニトロフェノールの有無について観察することで検出した。コントロールとして、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕを用いた。その結果、コントロールでは、培地及び菌体にβ−マンノシダーゼ活性は認められなかった。また、形質転換された酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｍａｎ２）の培地中にはほとんどβ−マンノシダーゼ活性はみられなかったが、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｍａｎ２）菌体はβ−マンノシダーゼ活性を有していた。この結果は、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｍａｎ２）の細胞表層にβ−マンノシダーゼが発現されたことを意味する。
酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｍａｎ２）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｍａｎ２）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（Ｂｍａｎ２）をそれぞれ掛け合わせた。最終的に、酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ−Ｂｍａｎ２）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ−Ｂｍａｎ２）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ−Ｂｍａｎ２）をそれぞれ得た。
得られた酵母ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ５Ｂ−Ｂｍａｎ２）、ＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ａ−Ｂｍａｎ２）及びＧＲＩ−１１７−Ｕ（ｍａｎ２６Ｂ−Ｂｍａｎ２）を０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．０７７％ＣＳＭ−ＵＲＡ（ＢＩＯ１０１社製）、０．５％マンナンを含むＳＤ液体培地でそれぞれ培養し、エタノール醗酵を行った。その結果、マンナンからエタノールが生産された。この結果は、マンナンからマンノースが生産されたことを示す。また、連続糖化発酵工程によりマンナンからエタノールが生産されたことを示す。また、セルロソーマルな酵素とノンセルロソーマルな酵素との組み合わせが相乗的に作用することを示す。
（実施例１２）
（各種セルロース又はヘミセルロースの存在下でのクロストリジウム セルロボランスの培養上清におけるセルロソーマル及びノンセルロソーマルな酵素群のプロテオーム解析）
セルロース又はキシラン、マンナン、ペクチン等の様々なヘミセルロースの存在下でクロストリジウム セルロボランスを培養したときに分泌されるセルロソームにおけるセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、糖質結合タンパク質等の構成成分の網羅的な定量的プロテオーム解析を行った。これらのセルロース及びヘミセルロースを約０．５（ｗ／ｖ）％含む培地でクロストリジウム セルロボランスを培養し、集菌後にタンパク質の抽出を行った。プロテオーム解析には、２Ｄ−ＬＣシステムを用いた分離を行った。図５に２Ｄ−ＬＣシステムの概要を示す。１次元目でイオン交換クロマトグラフィーを用いてタンパク質を等電点の差により分離し、２次元目で逆相クロマトグラフィーを用いて疎水性の差により分離した後、ＭＳで同定することにより、タンパク質の同定及び定量を高速に行なった。図６に代表的な解析結果を示す。その結果、セルロース及びキシランの存在下では、セルロソームが主要な構成成分であり、それに加えてノンセルロソーマルな酵素も検出されることが明らかとなった。また、ペクチンの存在下では、セルロソームに加えて、ノンセルロソーマルな酵素の高い発現が検出された。
代表的なセルロース系バイオマスである、稲わら及びバガスについても同様の実験を行った。その結果、いずれの存在下においても、セルロソームが主要な構成成分であり、それに加えてノンセルロソーマルな酵素の高い発現が検出された。これらのプロテオーム解析により、発現することが明らかとなった酵素をコードする遺伝子を、クロストリジウム セルロボランスから抽出したゲノムＤＮＡからクローニングし、酵母の細胞表層に提示するための発現ベクターを構築した。発現ベクターは、マルチコピープラスミドであり、プロモーター、分泌シグナル、酵素遺伝子、タグ及び細胞壁アンカリングドメインとして機能するα−アグルチニンのＣ末端領域を、この順で含んでいた。構築した発現ベクターを酵母に導入して、酵母の細胞表層に酵素を発現させた。得られた酵母を、セルロース、キシロース、ペクチン、稲わら、バガスの存在下でそれぞれ培養した。その結果、いずれのセルロース又はヘミセルロースにおいてもエタノール発酵が確認された。この結果はセルロース又はヘミセルロースから単糖が生産されたことを示す。また、連続糖化発酵工程によりセルロース又はヘミセルロースからエタノールが生産されたことを示す。また、クロストリジウム セルロボランスに由来するセルロソーマルな酵素及びノンセルロソーマルな酵素の組み合わせが、非常に高い効率でセルロース又はヘミセルロースを糖化し、さらに、アルコール発酵を行なうために有効であることを示す。
（実施例１３）
（新規セルラーゼ及びヘミセルラーゼの活性の評価）
（酵母発現プラスミドの構築）
プラスミドｐＵＬＤ１に、次の１９種類のセルロソーマルな新規セルラーゼ及び新規ヘミセルラーゼ、すなわち、マンナナーゼＧＨ５−ＧＨ５−ＣＢＭ１１−ＤＳ（配列番号５、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３２９＿ＣＤ００００２４＿３５９７１＿３１７７５）、マンナナーゼＧＨ２６−ＤＳ（配列番号１２、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ６９＿ＣＤ００００２４＿３８８３９＿３５９９９）、β−マンナナーゼＧＨ２６（配列番号６５、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５２＿ＣＲ００００２８＿４１６５３＿３７７７５）、エンドグルカナーゼＧＨ９−ＤＳ（配列番号１、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ４８＿ＣＤ００００４３＿６４０５５＿６２２０２）、エンドグルカナーゼＧＨ５−ＤＳ（配列番号２、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５７＿ＧＬ０００００２＿９４３＿２５４７）、キシラナーゼＧＨ８−ＤＳ（配列番号８、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５１＿ＣＤ０００００７＿１１７９０＿１０３３６）、エンド−１、４−β−キシラナーゼＧＨ４３（配列番号７０、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５６＿ＣＤ００００１６＿２２１３２＿２１２０６）、β−キシロシダーゼＧＨ３９（配列番号８４、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３３６＿ＣＤ００００４３＿５２１４２＿４９６４７）、キシロースイソメラーゼ（配列番号８２、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ２５７＿ＣＤ０００００６＿６７８３＿５４６４）、ペクチン酸リアーゼ−ＤＳ（配列番号１６、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５６＿ＣＤ００００１１＿１３３４８＿１５０７５）、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＧＨ４３（配列番号１０３、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３４４＿ＣＲ０００００１＿６０５＿３）、α−ガラクトシダーゼＧＨ４（配列番号９０、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３７５＿ＣＲ００００１２＿１４０８３＿１５５８５）、α−ガラクトシダーゼＧＨ３１（配列番号９１、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３７５＿ＧＬ００００２５＿３１５７５＿２９３５９）、β−グルコシダーゼＧＨ１（配列番号４５、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３１９＿ＣＲ００００１２＿１４６０６＿１３１７０）、β−マンノシダーゼＧＨ２（配列番号９４、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３３＿ＣＲ００００２７＿３３３２３＿３０８３７）、ペクチン酸リアーゼＰＬ１（配列番号１３５、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５１＿ＣＤ０００００９＿１４８６１＿１３６２３）、ペクチン酸リアーゼＰＬ９（配列番号１３３、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ２４８＿ＣＤ０００００４＿４２３０＿３２２６）、ペクチン酸リアーゼＰＬ１０（配列番号１３４、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ６１＿ＣＤ００００４４＿４６５１５＿４５５５０）又はエキソポリガラクツロン酸リアーゼＰＬ９（配列番号１３９、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ３５６＿ＣＤ００００１１＿１３３４８＿１５０７５）をコードするＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をそれぞれサブクローニングした。
配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＣＴＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧ‐３’（配列番号３７３）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＡＡＡＡＴＣＡＣＴＴＴＴＴＴＣ‐３’（配列番号３７４）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号１２の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＧ‐３’（配列番号３７５）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＡＧＣ‐３’（配列番号３７６）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号６５の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＧＴＡＴＴＧＧＡＧＧＴＴＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧ‐３’（配列番号３７７）及び５’‐ＣＡＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＡＡＴＣＣＡＡＣＡＡＣ‐３’（配列番号３７８）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＴＡＣＡＧＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＣＧ‐３’（配列番号３７９）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＴＴＧＧＴＧＴＡＣＴＣＧＧＴＡＡ‐３’（配列番号３８０）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＡＧＣ‐３’（配列番号３８１）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＡＣＡＧＣＴＡＡＡＴＣ‐３’（配列番号３８２）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡＴＧＧＴＧＣ‐３’（配列番号３８３）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＣＣＴＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＣＴＡＡＡＴＣＡＡＴＴＧＣ‐３’（配列番号３８４）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号７０の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＧＣＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＣＡＴＴＴＴＡＡＧＧ‐３’（配列番号３８５）及び５’‐ＣＡＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＡＴＴＣＴＡＣＴＡＴＡＴＴＣＣＴＣＣ‐３’（配列番号３８６）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号８４の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＡＧＴＡＧＡＴＣＴＡＡＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＧ‐３’（配列番号３８７）及び５’‐ＣＡＧＴＣＴＣＧＡＧＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＣＧＣ‐３’（配列番号３８８）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号８２の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＡＧＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＡＣＣＧ‐３’（配列番号３８９）及び５’‐ＣＡＧＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＴＴＧＧＴＴＡＡＣ‐３’（配列番号３９０）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号１６の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＴＡＴＡＡＴＡＧＴＡＧＴＡＣＴＧＴＡＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＣ‐３’（配列番号３９１）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＡＧ‐３’（配列番号３９２）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号１０３の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＡＴＡＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＡＣ‐３’（配列番号３９３）及び５’‐ＣＡＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＣＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＡＴＴＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣ‐３’（配列番号３９４）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号９０の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＡＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＴＴＡＡＧＧＴＴＡＣＡＴＴＴＡＴＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧ‐３’（配列番号３９５）及び５’‐ＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣＴＴＴＴＴＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴＴＣＣＡＴＣＧＣ‐３’（配列番号３９６）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＳｐｈＩの認識配列が導入されている。
配列番号９１の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＡＧＴＡＧＡＴＣＴＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＡＴＡＴＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧ‐３’（配列番号３９７）及び５’‐ＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＡＴＡＴＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＧ‐３’（配列番号３９８）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＳｐｈＩの認識配列が導入されている。
配列番号４５の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＣＣＣＧ‐３’（配列番号３９９）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＡＧＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＣＴＣ‐３’（配列番号４００）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号９４の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＡＡＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＴＧＧ‐３’（配列番号４０１）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＡＡＴＣＣ‐３’（配列番号４０２）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号１３５の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＣＡＡＡＡＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＧＣ‐３’（配列番号４０３）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＴＧＣＧＣ‐３’（配列番号４０４）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号１３３の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＴＧＴＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣ‐３’（配列番号４０５）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＧＡＣＴＴＧＴＡＴＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣ‐３’（配列番号４０６）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号１３４の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＣＡＧＣ‐３’（配列番号４０７）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＧＴＴＡＧＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＴＧＴＴＡＣＡＣＣ‐３’（配列番号４０８）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
配列番号１３９の塩基配列からなるＤＮＡ断片のうち、分泌シグナルを除いた部位をＰＣＲ増幅するためには、プライマー５’‐ＣＣＡＧＡＴＣＴＴＡＴＡＡＴＡＧＴＡＧＴＡＣＴＧＴＡＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧ‐３’（配列番号４０９）及び５’‐ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＡＧＴＧＣＣＡＧＧＴＣＣ‐３’（配列番号４１０）を用いた。これらのプライマーには、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩの認識配列が導入されている。
これらのプライマーを用い、クロストリジウム セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、配列番号５の塩基配列においては９４℃／１５秒−５１℃／３０秒−６８℃／４分１２秒のサイクルを３０回繰り返した。また、配列番号１２の塩基配列においては９４℃／１５秒−５２℃／３０秒−６８℃／２分４８秒、配列番号６５の塩基配列においては９４℃／１５秒−５４℃／３０秒−６８℃／３分５０秒、配列番号１の塩基配列においては９４℃／１５秒−５０℃／３０秒−６８℃／１分５０秒、配列番号２の塩基配列においては９４℃／１５秒−５２℃／３０秒−６８℃／１分３６秒、配列番号８の塩基配列においては９４℃／１５秒−５３℃／３０秒−６８℃／１分２７秒、配列番号７０の塩基配列においては９４℃／１５秒−５０℃／３０秒−６８℃／５６秒、配列番号８４の塩基配列においては９４℃／１５秒−５０℃／３０秒−６８℃／２分３０秒、配列番号８２の塩基配列においては９４℃／１５秒−５０℃／３０秒−６８℃／１分２０秒、配列番号１６の塩基配列においては９４℃／１５秒−５３℃／３０秒−６８℃／１分４４秒、配列番号１０３の塩基配列においては９４℃／１５秒−５４℃／４０秒−６８℃／７分、配列番号９０の塩基配列においては９４℃／１５秒−５４℃／３０秒−６８℃／１分３０秒、配列番号９１の塩基配列においては９４℃／１５秒−５５℃／３０秒−６８℃／２分１２秒、配列番号４５の塩基配列においては９４℃／１５秒−５５℃／４０秒−６８℃／１分２４秒、配列番号９４の塩基配列においては９４℃／１５秒−５５℃／３０秒−６８℃／２分３０秒、配列番号１３５の塩基配列においては９４℃／１５秒−５０℃／３０秒−６８℃／１分２０秒、配列番号１３３の塩基配列においては９４℃／１５秒−５０℃／３０秒−６８℃／１分１０秒、配列番号１３４の塩基配列においては９４℃／１５秒−５０℃／３０秒−６８℃／１分１０秒、配列番号１３９の塩基配列においては９４℃／１５秒−５０℃／３０秒−６８℃／１分１０秒のサイクルを、それぞれ３０回繰り返した。
得られたＰＣＲ産物をそれぞれスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製後、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ及びＳｐｈＩ又は制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。また、プラスミドｐＵＬＤ１を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ及びＳｐｈＩ、又は制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断した。
制限酵素で切断した各ＰＣＲ産物をプラスミドｐＵＬＤ１のＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ切断部位、ＢｇｌＩＩ及びＳｐｈＩ部位又はＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ切断部位に挿入して、それぞれ、プラスミドｐＵＬＤ１−ＭａｎＧＨ５−ＤＳ（マンナナーゼＧＨ５−ＧＨ５−ＣＢＭ１１−ＤＳ、配列番号５由来）、ｐＵＬＤ１−ＭａｎＧＨ２６Ａ−ＤＳ（マンナナーゼＧＨ２６−ＤＳ、配列番号１２由来）、ｐＵＬＤ１−ＭａｎＧＨ２６Ｂ（β―マンナナーゼＧＨ２６、配列番号６５由来）、ｐＵＬＤ１−ＥｎｇＧＨ９−ＤＳ（エンドグルカナーゼＧＨ９−ＤＳ、配列番号１由来）、ｐＵＬＤ１−ＥｎｇＧＨ５−ＤＳ（エンドグルカナーゼＧＨ５−ＤＳ、配列番号２由来）、ｐＵＬＤ１−ＸｙｎＧＨ８−ＤＳ（キシラナーゼＧＨ８−ＤＳ、配列番号８由来）、ｐＵＬＤ１−ＸｙｎＧＨ４３（エンド−１、４−β−キシラナーゼＧＨ４３、配列番号７０由来）、ｐＵＬＤ１−ＸｙｌＧＨ３９（β−キシロシダーゼＧＨ３９、配列番号８４由来）、ｐＵＬＤ１−Ｘｙｉ（キシロースイソメラーゼ、配列番号８２由来）、ｐＵＬＤ１−Ｐｅｌ１Ａ−ＤＳ（ペクチン酸リアーゼ、配列番号１６由来）、ｐＵＬＤ１−ＡｒｆＧＨ４３（α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＧＨ４３、配列番号１０３由来）、ｐＵＬＤ１−ＡｇａｌＧＨ４（α−ガラクトシダーゼＧＨ４、配列番号９０由来）、ｐＵＬＤ１−ＡｇａｌＧＨ３１（α−ガラクトシダーゼＧＨ３１、配列番号９１由来）、ｐＵＬＤ１−ＢｇｌＧＨ１（β−グルコシダーゼＧＨ１、配列番号４５由来）、ｐＵＬＤ１−ＢｍａｎＧＨ２（β−マンノシダーゼＧＨ２、配列番号９４由来）、ｐＵＬＤ１−Ｐｅｌ１Ｂ（ペクチン酸リアーゼＰＬ１、配列番号１３５由来）、ｐＵＬＤ１−Ｐｅｌ９Ｂ（ペクチン酸リアーゼＰＬ９、配列番号１３３由来）、ｐＵＬＤ１−Ｐｅｌ１０Ａ（ペクチン酸リアーゼＰＬ１０、配列番号１３４由来）及びｐＵＬＤ１−ＥｐｌＡ（エキソポリガラクツロン酸リアーゼＰＬ９、配列番号１３９由来）を得た。
（細胞表層にエンドグルカナーゼを有する酵母の作製と酵素活性の確認）
上記により構築されたプラスミドを大腸菌内にて増幅、精製後、酢酸リチウム法でそれぞれ酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１（Δｓｅｄ１）株に導入した。本酵母株はＥｕｒｏｓｃａｒｆから入手したものであり、導入した遺伝子の細胞表層への提示効率向上のため、ＳＥＤ１遺伝子が破壊されたものである（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、 ８２、 ７１３−７１９、 ２００９）。
各プラスミドを導入した酵母をそれぞれ０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．００２％Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、０．００３％Ｌｅｕｃｉｎｅ、０．００３％Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、２％ グルコースからなるＳＤ寒天培地で３０℃で培養し、生育してきた酵母を形質転換体として選択した。
得られたそれぞれの酵母を上記と同じＳＤ液体培地、３０℃にて２４時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌した。１次抗体としてＦＬＡＧタグを認識する抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ社製）を、２次抗体として蛍光標識した抗ＩｇＧ抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ；インビトロジェン社製）を加えて蛍光抗体染色を行い、染色後の細胞を蛍光顕微鏡によって観察することで、酵母細胞表層におけるエンドグルカナーゼの発現を確認した。
その結果、いずれの酵母においても、細胞表層上に２次抗体由来の緑色蛍光が検出されたことから、マンナナーゼＧＨ５−ＧＨ５−ＣＢＭ１１−ＤＳ、マンナナーゼＧＨ２６−ＤＳ、β−マンナナーゼＧＨ２６、エンドグルカナーゼＧＨ９−ＤＳ、エンドグルカナーゼＧＨ５−ＤＳ、キシラナーゼＧＨ８−ＤＳ、エンド−１、４−β−キシラナーゼＧＨ４３、β−キシロシダーゼＧＨ３９、キシロースイソメラーゼ、ペクチン酸リアーゼ−ＤＳ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＧＨ４３、α−ガラクトシダーゼＧＨ４、α−ガラクトシダーゼＧＨ３１、β−グルコシダーゼＧＨ１、β−マンノシダーゼＧＨ２、ペクチン酸リアーゼＰＬ１、ペクチン酸リアーゼＰＬ９、ペクチン酸リアーゼＰＬ１０又はエキソポリガラクツロン酸リアーゼＰＬ９が各酵母の細胞表層に提示されていることが確認できた。
（細胞表層にマンナナーゼを有する酵母の酵素活性の確認）
細胞表層提示した酵素の活性を３、５−Ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ （ＤＮＳ）法によって測定した。本活性測定法では、０．５％ＤＮＳ（和光純薬社製）、１．６％水酸化ナトリウム（ナカライテスク社製）、３０％酒石酸カリウムナトリウム（和光純薬社製）からなるＤＮＳ試薬を用いて、酵素反応により生成する還元糖量を定量する。
マンナナーゼＧＨ５−ＧＨ５−ＣＢＭ１１−ＤＳ提示酵母、マンナナーゼＧＨ２６−ＤＳ提示酵母又はマンナナーゼＧＨ２６提示酵母をそれぞれＳＤ液体培地で、３０℃にて３６時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌した。これをイオン交換水で洗浄した後、ＯＤ６００＝４０になるよう０．５％のローカストビーンガム（シグマ社製）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１ｍｌに懸濁した。３０℃、２４時間で振とうさせながら反応を行った後、遠心分離し、上清５００μｌをサンプリングした。ここにＤＮＳ試薬１ｍｌを加え、５分間煮沸した後、氷冷し、５２５ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、コントロール株と比べてマンナナーゼＧＨ５−ＧＨ５−ＣＢＭ１１−ＤＳ提示酵母、マンナナーゼＧＨ２６−ＤＳ提示酵母及びマンナナーゼＧＨ２６提示酵母はいずれも高い吸光度の値を示したことから、細胞表層に提示したマンナナーゼＧＨ５−ＧＨ５−ＣＢＭ１１−ＤＳ、マンナナーゼＧＨ２６−ＤＳ及びマンナナーゼＧＨ２６がいずれもマンナナーゼ活性をもつことが確認された。
（細胞表層にエンドグルカナーゼを有する酵母の酵素活性の確認）
細胞表層提示した酵素の活性を、マンナナーゼと同様に３、５−Ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＳ）法によって測定した。
その結果、コントロール株と比べてエンドグルカナーゼＧＨ９−ＤＳ提示酵母及びエンドグルカナーゼＧＨ５−ＤＳ提示酵母はいずれも高い吸光度の値を示したことから、細胞表層に提示したエンドグルカナーゼＧＨ９−ＤＳ及びエンドグルカナーゼＧＨ５−ＤＳがいずれもエンドグルカナーゼ活性をもつことが確認された。
（細胞表層にキシラナーゼを有する酵母の酵素活性の確認）
細胞表層提示した酵素の活性を、マンナナーゼと同様に３、５−Ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＳ）法によって測定した。
その結果、コントロール株と比べてキシラナーゼＧＨ８−ＤＳ提示酵母及びエンド−１、４−β−キシラナーゼＧＨ４３提示酵母はいずれも高い吸光度の値を示したことから、細胞表層に提示したキシラナーゼＧＨ８−ＤＳ及びエンド−１、４−β−キシラナーゼＧＨ４３がいずれもキシラナーゼ活性をもつことが確認された。
（細胞表層にキシロシダーゼを有する酵母の酵素活性の確認）
β−キシロシダーゼＧＨ３９提示酵母をＳＤ液体培地で、３０℃にて３６時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌した。これをイオン交換水で洗浄した後、ＯＤ６００＝４０になるよう２ｍＭの２−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１ｍｌに懸濁した。３０℃、２４時間で振とうさせながら反応を行った後、遠心分離し、上清５００μｌをサンプリングした。ここに２Ｍ炭酸ナトリウム１ｍｌを加えて反応停止後、遊離した２−ニトロフェノールに由来する４００ｎｍの吸光度を測定することによりキシロシダーゼ活性を評価した。
その結果、コントロール株と比べてβ−キシロシダーゼＧＨ３９提示酵母は高い吸光度の値を示したことから、細胞表層に提示したβ−キシロシダーゼＧＨ３９がキシロシーゼ活性をもつことが確認された。
（細胞表層にキシロースイソメラーゼを有する酵母の酵素活性の確認）
キシロースイソメラーゼ提示酵母をＳＤ液体培地で、３０℃にて２４時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌した。これをイオン交換水で洗浄した後、ＯＤ６００＝４０になるよう反応溶液Ｉ（１０ｍＭトリエタノールアミン、２５０ｍＭキシロース、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、ｐＨ８．０）５００μｌに懸濁した。３０℃、２４時間で振とうさせながら反応を行った後、遠心分離し、上清２００μｌをサンプリングした。ここに反応溶液ＩＩ（１０ｍＭ１トリエタノールアミン、０．１５ｍＭＮＡＤＨ、０．５Ｕソルビトールデヒドロゲナーゼ、ｐＨ７．０）７００μｌ、イオン交換水３００μｌを加え、３５℃で５分間インキュベートし、３４０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＮＡＤＨの減少を調べた。
その結果、コントロール株と比べてキシロースイソメラーゼ提示酵母はより大きく吸光度が減少したことから、キシロースからキシルロースヘの変換が示され、キシロースイソメラーゼ活性をもつことが確認された。
（細胞表層にペクチン酸リアーゼを有する酵母の酵素活性の確認）
ペクチン酸リアーゼ−ＤＳ提示酵母、ペクチン酸リアーゼＰＬ１提示酵母、ペクチン酸リアーゼＰＬ９提示酵母又はペクチン酸リアーゼＰＬ１０提示酵母をそれぞれＳＤ液体培地で、３０℃にて３６時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌した。これをイオン交換水で洗浄した後、ＯＤ６００＝４０になるよう０．３ｍＭ塩化カルシウム、０．２％ポリガラクツロン酸を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１ｍｌに懸濁した。３０℃、２４時間で振とうさせながら反応を行った後、遠心分離し、上清５００μｌをサンプリングした。ここに２０ｍＭＥＤＴＡ ２５μｌを加えて反応停止後、２３５ｎｍの吸光度を測定することにより活性を評価した。
その結果、コントロール株と比べてペクチン酸リアーゼ−ＤＳ提示酵母、ペクチン酸リアーゼＰＬ１提示酵母、ペクチン酸リアーゼＰＬ９提示酵母及びペクチン酸リアーゼＰＬ１０提示酵母はいずれも高い吸光度の値を示したため、細胞表層に提示したペクチン酸リアーゼ−ＤＳ、ペクチン酸リアーゼＰＬ１、ペクチン酸リアーゼＰＬ９及びペクチン酸リアーゼＰＬ１０がいずれもペクチン酸リアーゼ活性をもつことが明らかとなった。
（細胞表層にα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを有する酵母の酵素活性の確認）
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＧＨ４３提示酵母をＳＤ液体培地、３０℃にて３６時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌した。これをイオン交換水で洗浄した後、ＯＤ６００＝４０になるよう２ｍＭ ４−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド（シグマ社製）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１ｍｌに懸濁した。３０℃、２４時間で振とうさせながら反応を行った後、遠心分離し、上清５００μｌをサンプリングした。ここに２Ｍ炭酸ナトリウム１ｍｌを加えて反応停止後、遊離した４−ニトロフェノールに由来する４００ｎｍの吸光度を測定することにより活性を評価した。
その結果、コントロール株と比べてα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＧＨ４３提示酵母は高い吸光度の値を示したため、細胞表層に提示したα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＧＨ４３がアラビノフラノシダーゼ活性をもつことが明らかとなった。
（細胞表層にα−ガラクトシダーゼを有する酵母の酵素活性の確認）
α−ガラクトシダーゼＧＨ４提示酵母又はα−ガラクトシダーゼＧＨ３１提示酵母をＳＤ液体培地、３０℃にて３６時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌した。これをイオン交換水で洗浄した後、ＯＤ６００＝４０になるよう２ｍＭ ４−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（シグマ社製）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１ｍｌに懸濁した。３０℃、２４時間で振とうさせながら反応を行った後、遠心分離し、上清５００μｌをサンプリングした。ここに２Ｍ 炭酸ナトリウム１ｍｌを加えて反応停止後、遊離した４−ニトロフェノールに由来する４００ｎｍの吸光度を測定することにより活性を評価した。 その結果、コントロール株と比べてα−ガラクトシダーゼＧＨ４提示酵母及びα−ガラクトシダーゼＧＨ３１提示酵母はいずれも高い吸光度の値を示したため、細胞表層に提示したα−ガラクトシダーゼＧＨ４及びα−ガラクトシダーゼＧＨ３１がいずれもガラクトシダーゼ活性をもつことが明らかとなった。
（細胞表層にβ−グルコシダーゼを有する酵母の酵素活性の確認）
β−グルコシダーゼＧＨ１提示酵母をＳＤ液体培地、３０℃にて３６時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌した。これをイオン交換水で洗浄した後、ＯＤ６００＝４０になるよう２ｍＭ ４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ社製）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１ｍｌに懸濁した。３０℃、２４時間で振とうさせながら反応を行った後、遠心分離し、上清５００μｌをサンプリングした。ここに２Ｍ 炭酸ナトリウム１ｍｌを加えて反応停止後、遊離した４−ニトロフェノールに由来する４００ｎｍの吸光度を測定することにより活性を評価した。
その結果、コントロール株と比べてβ−グルコシダーゼＧＨ１提示酵母は高い吸光度の値を示したため、細胞表層に提示したβ−グルコシダーゼＧＨ１がグルコシダーゼ活性をもつことが明らかとなった。
（細胞表層にβ−マンノシダーゼを有する酵母の酵素活性の確認）
β−マンノシダーゼＧＨ２提示酵母をＳＤ液体培地で、３０℃にて３６時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌した。これをイオン交換水で洗浄した後、ＯＤ６００＝４０になるよう２ｍＭ ４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノシド（シグマ社製）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１ｍｌに懸濁した。３０℃、２４時間で振とうさせながら反応を行った後、遠心分離し、上清５００μｌをサンプリングした。ここに２Ｍ 炭酸ナトリウム１ｍｌを加えて反応停止後、遊離した４−ニトロフェノールに由来する４００ｎｍの吸光度を測定することにより活性を評価した。
その結果、コントロール株と比べてβ−マンノシダーゼＧＨ２提示酵母は高い吸光度の値を示したため、細胞表層に提示したβ−マンノシダーゼＧＨ２がマンノシダーゼ活性をもつことが明らかとなった。
（細胞表層にエキソポリガラクツロン酸リアーゼを有する酵母の酵素活性の確認）
エキソポリガラクツロン酸リアーゼＰＬ９提示酵母をＳＤ液体培地で、３０℃にて３６時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌した。これをイオン交換水で洗浄した後、ＯＤ６００＝４０になるよう０．３ｍＭ 塩化カルシウム、０．２％ポリガラクツロン酸を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１ｍｌに懸濁した。３０℃、２４時間で振とうさせながら反応を行った後、遠心分離し、上清５００μｌをサンプリングした。ここに２０ｍＭ ＥＤＴＡ２５μｌを加えて反応停止後、２３５ｎｍの吸光度を測定することにより活性を評価した。
その結果、コントロール株と比べてエキソポリガラクツロン酸リアーゼＰＬ９提示酵母は高い吸光度の値を示したため、細胞表層に提示したエキソポリガラクツロン酸リアーゼＰＬ９がペクチン酸リアーゼ活性をもつことが明らかとなった。
（実施例１４）
（新規ペプチダーゼ阻害因子の活性評価）
（酵母発現プラスミドの構築）
新規ペプチダーゼ阻害因子の活性を評価するため、新規ペプチダーゼ阻害因子の酵母細胞表層への発現提示を行った。細胞表層提示のためのカセットベクターとしてプラスミドｐＵＬＤ１を使用した。
プラスミドｐＵＬＤ１にクロストリジウム セルロボランスのシャーガシン（Ｃｈａｇａｓｉｎ）ペプチダーゼ阻害因子Ｉ４２−ＤＳ（配列番号２５、ローカスタグ：ＴＡＯ０１．Ｃ２７３＿ＣＲ００００１３＿２０４７５＿１９５２２）をコードするＤＮＡ断片をクローニングした。プライマー５’‐ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧ‐３’（配列番号４１１）及び５’‐ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＧＣＡＡＣ‐３’（配列番号４１２）を用い、クロストリジウム セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲでは、９４℃／１５秒−５０℃／３０秒−６８℃／４０秒のサイクルを３０回繰り返した。これらのプライマーにはｐＵＬＤ１への組み込みを行うために、制限酵素認識配列（ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ）が導入されている。
得られたＰＣＲ産物をスピンカラム（キアゲン社製、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）により精製した後、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで切断した。また、プラスミドｐＵＬＤ１も同じ制限酵素によって切断した。制限酵素で切断したＰＣＲ産物をプラスミドのＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ切断部位に挿入して、プラスミドｐＵＬＤ１−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１９５２２を得た。
（細胞表層にシャーガシン（Ｃｈａｇａｓｉｎ）ペプチダーゼ阻害因子を有する酵母の作製とプロテアーゼ阻害活性の確認）
上記により構築されたプラスミドｐＵＬＤ１−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１９５２２を大腸菌内にて増幅、精製後、酢酸リチウム法によって酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１（Δｓｅｄ１）株に導入した。０．６７％ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ （Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．００２％ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、０．００３％ Ｌｅｕｃｉｎｅ、０．００３％ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、２％ グルコースからなるＳＤ寒天培地上にて３０℃で培養し、生育してきたクローンを形質転換体として選抜した。
得られた酵母を上記と同じＳＤ液体培地、３０℃にて２４時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌し、１次抗体としてＦＬＡＧタグを認識する抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ社製）を、２次抗体として蛍光標識した抗ＩｇＧ抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ； インビトロジェン社製）を加えて蛍光抗体染色を行った。染色後の細胞を蛍光顕微鏡によって観察した結果、細胞表層上に２次抗体由来の緑色蛍光が検出されたため、シャーガシン（Ｃｈａｇａｓｉｎ）ペプチダーゼ阻害因子の細胞表提示が確かめられた。
細胞表提示を確認することのできた酵母をシャーガシン（Ｃｈａｇａｓｉｎ）ペプチダーゼ阻害因子Ｉ４２−ＤＳ提示酵母として、ＳＤ液体培地で、３０℃にて２４時間培養した後、遠心分離により酵母細胞を集菌した。これをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、同じ緩衝液に再懸濁した。
シャーガシン（Ｃｈａｇａｓｉｎ）ペプチダーゼ阻害因子Ｉ４２−ＤＳ提示酵母において、細胞表層提示されたシャーガシン（Ｃｈａｇａｓｉｎ）ペプチダーゼ阻害因子の阻害活性を評価するため、細胞懸濁液にＰａｐａｉｎ（和光純薬社製）、及びＣａｔｈｅｐｓｉｎＬ（和光純薬社製）をそれぞれ終濃度が５μｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬとなるよう添加し、３０℃で１０分間インキュベートした。その後、基質Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所製）を終濃度５μＭとなるよう添加し、Ｐａｐａｉｎ及びＣａｔｈｅｐｓｉｎＬによる切断で生じる蛍光を、励起光３５５ｎｍ、放射光４６０ｎｍにて経時的に測定した。
その結果、コントロール株と比べてシャーガシン（Ｃｈａｇａｓｉｎ）ペプチダーゼ阻害因子Ｉ４２−ＤＳ提示酵母では蛍光強度の傾きが小さくなったことから、細胞表層に提示したシャーガシン（Ｃｈａｇａｓｉｎ）ペプチダーゼ阻害因子がプロテアーゼ阻害活性を有することが確認された。
本発明により、非食糧バイオマスであるセルロース及びヘミセルロースを、ほぼ完全に分解することができる新規タンパク質及びこれらのタンパク質をコードする新規ＤＮＡが提供される。また、これらのＤＮＡを含むベクター、このベクターで形質転換された遺伝子組換え体、このＤＮＡにコードされるタンパク質、セルロース又はヘミセルロースから単糖を製造する方法、セルロース又はヘミセルロースから連続糖化発酵工程により低級アルコールを製造する方法が提供される。これらの方法により、セルロース又はヘミセルロースを完全に分解し、植物系バイオマスの全量を利用することが可能となる。また、再生可能な植物系バイオマスを原料として、エタノールやブタノール等の燃料や、芳香族化合物等の汎用化学物質の生産を効率的に行なうことが可能となる。

Claims (57)

  1. 配列番号１〜１７０のいずれか１つに記載の、クロストリジウム セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）由来新規塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
  2. 配列番号１〜３１のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルロソーム形成活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１に記載のＤＮＡ。
  3. 配列番号３２〜１７０のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、セルロソーム形成活性を有さないタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１に記載のＤＮＡ。
  4. 配列番号５、１２、１３、６３、６４、６５のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、マンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
  5. 配列番号１、２、３、４、６、７、９、１０、１１、３２、３３、３４、３５、３６、４２、４３、１１１、１６４のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
  6. 配列番号８又は７０に記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
  7. 配列番号１５、５９、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８、９９のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
  8. 配列番号１６、４７、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４４のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ペクチン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
  9. 配列番号５８、７７、７９、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８８、１０１、１２２のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、キシロシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１又は３に記載のＤＮＡ。
  10. 配列番号８２又は８５に記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１又は３に記載のＤＮＡ。
  11. 配列番号４５、４８、５０、５２、５３、５４、５６、５７、６０のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１又は３に記載のＤＮＡ。
  12. 配列番号７８、１０３、１２２、１２７のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１又は３に記載のＤＮＡ。
  13. 配列番号９４に記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、β−マンノシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１又は３に記載のＤＮＡ。
  14. 配列番号１３９、１４０、１４１のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ポリガラクツロン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１又は３に記載のＤＮＡ。
  15. 配列番号２３、２４、２５のいずれか１つに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の相同性を有し、ペプチダーゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる、請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
  16. 配列番号１７１〜３４０のいずれか１つに記載の、クロストリジウム セルロボランス由来新規アミノ酸配列、又は配列番号１〜１７０のいずれか１つに記載の新規塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、セルロース又はヘミセルロース分解活性を有するタンパク質。
  17. 配列番号１７１〜２０１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１〜３１のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、セルロソーム形成活性を有する、請求項１６に記載のタンパク質。
  18. 配列番号２０２〜３４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号３２〜１７０のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、セルロソーム形成活性を有さない、請求項１６に記載のタンパク質。
  19. 配列番号１７５、１８２、１８３、２３３、２３４、２３５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号５、１２、１３、６３、６４、６５のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、マンナナーゼ活性を有する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
  20. 配列番号１７１、１７２、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９、１８０、１８１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２１２、２１３、２８１、３３４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１、２、３、４、６、７、９、１０、１１、３２、３３、３４、３５、３６、４２、４３、１１１、１６４のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、エンドグルカナーゼ活性を有する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
  21. 配列番号１７８又は２４０に記載のアミノ酸配列、又は配列番号８又は７０に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、キシラナーゼ活性を有する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
  22. 配列番号１８５、２２９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１５、５９、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８、９９のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ガラクトシダーゼ活性を有する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
  23. 配列番号１８６、２１７、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３１４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１６、４７、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４４のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ペクチン酸リアーゼ活性を有する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
  24. 配列番号２２８、２４７、２４９、２５０、２５１、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２７１、２９２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号５８、７７、７９、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８８、１０１、１２２のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、キシロシダーゼ活性を有する、請求項１６又は１８に記載のタンパク質。
  25. 配列番号２５２又は２５５に記載のアミノ酸配列、又は配列番号８２又は８５に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、キシロースイソメラーゼ活性を有する、請求項１６又は１８に記載のタンパク質。
  26. 配列番号２１５、２１８、２２０、２２２、２２３、２２４、２２６、２２７、２３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号４５、４８、５０、５２、５３、５４、５６、５７、６０のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、β−グルコシダーゼ活性を有する、請求項１６又は１８に記載のタンパク質。
  27. 配列番号２４８、２７３、２９２、２９７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又は配列番号７８、１０３、１２２、１２７のいずれか１つに記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、アラビノフラノシダーゼ活性を有する、請求項１６又は１８に記載のタンパク質。
  28. 配列番号２６４に記載のアミノ酸配列、又は配列番号９４に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、β−マンノシダーゼ活性を有する、請求項１６又は１８に記載のタンパク質。
  29. 配列番号３０９、３１０、３１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ポリガラクツロン酸リアーゼ活性を有する、請求項１６又は１８に記載のタンパク質。
  30. 請求項１９３、１９４、１９５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなり、ペプチダーゼ阻害活性を有する、請求項１６又は１７に記載のタンパク質。
  31. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＤＮＡを含むベクター。
  32. 請求項３１に記載のベクターで形質転換された、遺伝子組換え体。
  33. 以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ：
    （ａ）請求項２に記載のＤＮＡ；及び
    （ｂ）請求項３に記載のＤＮＡ
    の組み合わせを発現可能に保持する、遺伝子組換え体。
  34. セルロース又はヘミセルロースの存在下で、請求項３３に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、セルロース又はヘミセルロースから単糖を製造する方法。
  35. セルロース又はヘミセルロースの存在下で、請求項３３に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、セルロース又はヘミセルロースから低級アルコールを製造する方法。
  36. 請求項４に記載のＤＮＡを発現可能に保持する、遺伝子組換え体。
  37. 以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ：
    （ａ）請求項４に記載のＤＮＡ；及び
    （ｂ）請求項１３に記載のＤＮＡ
    の組み合わせを発現可能に保持する、遺伝子組換え体。
  38. マンナンの存在下で、請求項３６又は３７に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、マンナンからマンノースを製造する方法。
  39. マンナンの存在下で、請求項３６又は３７に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、マンナンから低級アルコールを製造する方法。
  40. 請求項８に記載のＤＮＡを発現可能に保持する、遺伝子組換え体。
  41. ペクチンの存在下で、請求項４０に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、ペクチンからガラクツロン酸を製造する方法。
  42. ペクチンの存在下で、請求項４０に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、ペクチンから低級アルコールを製造する方法。
  43. 以下の（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ：
    （ａ）請求項６に記載のＤＮＡ；
    （ｂ）請求項９に記載のＤＮＡ；及び
    （ｃ）請求項１０に記載のＤＮＡ
    の組み合わせを発現可能に保持する、遺伝子組換え体。
  44. キシランの存在下で、請求項４３に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、キシランからキシルロースを製造する方法。
  45. キシランの存在下で、請求項４３に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、キシランから低級アルコールを製造する方法。
  46. 以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ：
    （ａ）請求項５に記載のＤＮＡ；及び
    （ｂ）請求項１１に記載のＤＮＡ
    の組み合わせを発現可能に保持する、遺伝子組換え体。
  47. セルロースの存在下で、請求項４６に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、セルロースからグルコースを製造する方法。
  48. セルロースの存在下で、請求項４６に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、セルロースから低級アルコールを製造する方法。
  49. 請求項１２に記載のＤＮＡを発現可能に保持する、遺伝子組換え体。
  50. アラビノースを含むヘミセルロースの存在下で、請求項４９に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、アラビノースを含むヘミセルロースからアラビノースを製造する方法。
  51. アラビノースを含むヘミセルロースの存在下で、請求項４９に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、アラビノースを含むヘミセルロースから低級アルコールを製造する方法。
  52. 以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ：
    （ａ）請求項４に記載のＤＮＡ；及び
    （ｂ）請求項７に記載のＤＮＡ
    の組み合わせを発現可能に保持する、遺伝子組換え体。
  53. ガラクトマンナンの存在下で、請求項５２に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、ガラクトマンナンからガラクトース及びマンノースを製造する方法。
  54. ガラクトマンナンの存在下で、請求項５２に記載の遺伝子組換え体を培養する工程を含む、ガラクトマンナンから低級アルコールを製造する方法。
  55. 前記ＤＮＡ又はＤＮＡの組み合わせを、細胞表層への発現及び細胞外への分泌の組み合わせで発現する、請求項３２、３３、３６、３７、４０、４３、４６、４９及び５２のいずれか一項に記載の遺伝子組換え体。
  56. セルロース又はヘミセルロースの存在下で、以下の（ａ）〜（ｊ）の遺伝子組換え体：
    （ａ）請求項３２に記載の遺伝子組換え体；
    （ｂ）請求項３３に記載の遺伝子組換え体；
    （ｃ）請求項３６に記載の遺伝子組換え体；
    （ｄ）請求項３７に記載の遺伝子組換え体；
    （ｅ）請求項４０に記載の遺伝子組換え体；
    （ｆ）請求項４３に記載の遺伝子組換え体；
    （ｇ）請求項４６に記載の遺伝子組換え体；
    （ｈ）請求項４９に記載の遺伝子組換え体；
    （ｉ）請求項５２に記載の遺伝子組換え体；及び
    （ｊ）請求項５５に記載の遺伝子組換え体
    からなる群から選択される、２種類以上の遺伝子組換え体を混合して培養する工程を含む、セルロース又はヘミセルロースから単糖を製造する方法。
  57. セルロース又はヘミセルロースの存在下で、以下の（ａ）〜（ｊ）の遺伝子組換え体：
    （ａ）請求項３２に記載の遺伝子組換え体；
    （ｂ）請求項３３に記載の遺伝子組換え体；
    （ｃ）請求項３６に記載の遺伝子組換え体；
    （ｄ）請求項３７に記載の遺伝子組換え体；
    （ｅ）請求項４０に記載の遺伝子組換え体；
    （ｆ）請求項４３に記載の遺伝子組換え体；
    （ｇ）請求項４６に記載の遺伝子組換え体；
    （ｈ）請求項４９に記載の遺伝子組換え体；
    （ｉ）請求項５２に記載の遺伝子組換え体；及び
    （ｊ）請求項５５に記載の遺伝子組換え体
    からなる群から選択される、２種類以上の遺伝子組換え体を混合して培養する工程を含む、セルロース又はヘミセルロースから低級アルコールを製造する方法。
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