CN102041267B - 一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法，以及一种基因组中丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达被抑制的重组菌株。本发明提供的解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法通过抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达来实现。使用本发明提供的方法，中断了丙酮丁醇梭菌ccpA基因的表达。本发明提供的菌株中，ccpA基因经二类内含子插入失活后菌株同步利用木糖和葡萄糖的能力显著提高，同时转化生成的ABE浓度相应提高。本发明构建的工程菌株解除了葡萄糖抑制效应，能同步利用葡萄糖和木糖进行发酵，因此该菌株有利用木质纤维素水解液进行丙酮丁醇发酵的潜力。

Description

一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法。

背景技术

由于石油资源的有限性以及国际原油价格的波动性，利用可再生资源制造生物能源已受到世界各国的普遍重视。丁醇由于其优良的燃烧特性及较乙醇更优的储存运输特性，有望在将来成为新一代生物燃料。自二战以来随着石油工业的发展，生物丁醇发酵由于其较高的原料成本，其大规模发酵一直处于停滞状态，而且随着近年来粮食价格的不断上涨及国家相关粮食安全战略的制定，采用粮食发酵生产燃料丁醇已受到严格限制。

丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum是能够发酵产生丁醇的四种梭菌之一(Keis et al.，Int J Syst Evol Microbiol，Issue 6，Vol 51，2001)，在发酵过程中产生丁醇、丙酮、乙醇、乙酸和丁酸。利用丙酮丁醇梭菌发酵生产丙酮、丁醇的历史已经有上百年。Clostridium acetobutylicum除了能够利用葡萄糖、蔗糖、淀粉外，还能利用木糖、乳糖、阿拉伯糖等多种碳源。纤维素和半纤维素水解后的主要成分就是葡萄糖、木糖及阿拉伯糖，因而可以利用纤维素和半纤维素为原料进行生物丁醇发酵。纤维素和半纤维素在自然界中占到植物界碳素的50％以上，利用纤维素和半纤维素水解液进行生物丁醇发酵，有望大大降低原料成本。但丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum像很多其他细菌一样存在着糖代谢物阻遏效应(carboncatabolite repression，CCR)，即在葡萄糖存在条件下，其代谢产物阻遏了其他糖类的利用。目前的丙酮丁醇梭菌只能将木质纤维素水解液中的葡萄糖利用完全，而木糖、阿拉伯糖等五碳糖的利用受到抑制，因此解除CCR效应成为木质纤维素原料应用于丙酮丁醇发酵的关键技术之一。

C.acetobutylicum属于革兰氏阳性菌，GC含量30％，2001年完成全基因组测序(Nolling et al.，J Bacteriol，Issue 16，Vol 183，2001)，其中含有ccpA基因，该基因在NCBI核酸数据库查询号为gi：1119220。CCR效应在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtitles)中得到了较多的研究，而在丙酮丁醇梭菌中的研究很少。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法，从而能同步利用葡萄糖和木糖发酵生产丙酮、丁醇、乙醇。

本发明提供的方法，通过抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现。

根据本发明的一个优选实施例，通过在丙酮丁醇梭菌ccpA基因中插入DNA片段可实现本发明。

本发明还有一个目的在于，提供一种丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达被抑制的Clostridium acetobutylicum重组菌株。

根据本发明的一个优选实施例，本发明提供的重组菌株的基因组中丙酮丁醇梭菌ccpA基因中已插入DNA片段。

本发明还有一个目的在于，提供该重组菌株用于同步利用葡萄糖-木糖混合糖发酵生产丙酮、丁醇、乙醇的应用。

本发明还有一个目的在于，提供一种提高丙酮丁醇梭菌利用葡萄糖-木糖混合糖发酵生产丙酮、丁醇、乙醇能力的方法。

本发明提供的方法通过抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现。

本发明中所指的“抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达”，既可以是降低丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达量，也可以是使丙酮丁醇梭菌ccpA基因不表达或不能表达出正确的蛋白质。

根据本发明的一个优选实施例，中断丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达，能解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应。

根据本发明，丙酮丁醇梭菌ccpA基因的中断，可采用二类内含子插入技术在该基因内部的任何位点插入DNA实现；也可通过同源重组中断ccpA基因，用于中断ccpA基因的插入片段可在ccpA基因中的任意位点插入，只需要能使ccpA基因表达被中断或抑制即可；还可以通过同源重组敲除ccpA部分或全部序列实现，只要能使得ccpA基因的表达被中断或表达出不完整的ccpA蛋白即可。上述三种方法用于将ccpA基因失活，除此之外还可以采用反义核酸技术抑制ccpA基因的表达，将ccpA表达量下调。实现上述目的的方法在本领域中为一般技术人员所熟知，因此在此不具体描述。

根据本发明，“重组质粒载体”指的是用于敲除ccpA基因的重组质粒载体，该载体应理解为具有与ccpA基因的特定序列进行特异位点配对序列的重组质粒载体，在上述重组质粒载体中包括用于对ccpA基因进行特异性敲除的片段。

本发明提供的Clostridium acetobutylicum重组菌株的基因组中的ccpA基因表达被抑制，不能表达出具有完整结构的CcpA蛋白。

本发明提供的重组菌株，解除了葡萄糖抑制效应，能同步利用葡萄糖-木糖进行发酵，但不限于仅能利用葡萄糖-木糖进行发酵，也可利用受葡萄糖代谢物抑制的其他糖类进行发酵，其中，使用的葡萄糖-木糖既可以是直接使用葡萄糖和木糖配制获得的葡萄糖-木糖，也可以是发酵或水解高分子化合物，如水解纤维素或半纤维素等，获得的葡萄糖-木糖。

根据本发明，使用的重组菌株，既可以是本发明提供的抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达的菌株，也可以是根据本发明的教导和现有技术，制备的其他的抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达的菌株，如采用反义核酸技术降低ccpA表达量的菌株。

本发明的实施例中，使用的重组质粒载体pSY6-ccpA指的是用于敲除ccpA基因的重组质粒载体，其中，使用的ccpA-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBS1d位点碱基经修改后，用于敲除ccpA基因的片段，该片段属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，其中包含ltrA基因，但在重复本发明的试验时，可以选取其他插入位点进行试验，甚至还可以不使用重组质粒载体进行试验，只要能在ccpA基因中插入核酸片段以中断ccpA基因的表达即可。

本发明提供的重组菌株能同步利用葡萄糖-木糖混合糖进行发酵，以用于生产丙酮、丁醇、乙醇。

本发明提供的提高丙酮丁醇梭菌利用葡萄糖-木糖混合糖发酵生产丙酮、丁醇、乙醇能力的方法，通过抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现。

本发明提供的方法，中断了丙酮丁醇梭菌ccpA的表达，本发明提供的菌株中，ccpA经二类内含子插入失活后的菌株同步利用葡萄糖和木糖的能力显著提高，同时转化生成的ABE浓度相应提高。本发明构建的工程菌株解除了葡萄糖抑制效应，能同步利用葡萄糖-木糖进行发酵，因此该菌株有利用木质纤维素水解液进行丙酮丁醇发酵的潜力。

附图说明

图1为ccpA中断菌株的菌落PCR鉴定的凝胶电泳检测结果，其中，NC表示未加模板的阴性对照，WT所用的模板为C.acetobutylicum ATCC 824的基因组，ccpAmutant的模板分别为转化子824ΔccpA 1-3，marker为1kb DNA ladder。

图2为发酵0-72hr的Clostridium acetobutylicum ccpA-突变株和Clostridiumacetobutylicum ATCC 824的OD600的检测结果。

图3为发酵0-72hr的Clostridium acetobutylicum ccpA-突变株和Clostridiumacetobutylicum ATCC 824的残糖含量的检测结果。

图4为发酵0-72hr的Clostridium acetobutylicum ccpA-突变株和Clostridiumacetobutylicum ATCC 824的ABE含量的检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明的下述实施例中，使用的菌株Clostridium acetobutylicum ATCC 824含有的ccpA基因是现有技术已知的，其在NCBI核酸数据库查询号为gi：1119220。

本发明的下述实施例中，ABE为丙酮、丁醇、乙醇(Acetone-butanol-ethanol)的简称，ABE浓度指的是溶液中丙酮、丁醇、乙醇的总浓度。

本发明的下述实施例中，重组质粒载体pSY6-ccpA指的是用于敲除ccpA基因的重组质粒载体，其中，使用的ccpA-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBS1d位点碱基经修改后，用于敲除ccpA基因的片段，该片段属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，其中包含ltrA基因。

本发明使用的菌株和质粒分别为：

质粒pSY6(Shao L.，Hu S.，Yang Y.，Chen J.，Yang Y，Jiang W，Yang S，Cellresearch，2007，doi：10.1038/cr.2007.91)，为E.coli和C.acetobutylicum的穿梭质粒，在C.acetobutylicum中表达红霉素抗性基因，该质粒的序列见SEQ ID NO.：6。

质粒pANS1，序列见SEQ ID NO.：7，含壮观霉素抗性基因；

菌株E.coli ER2275购自New England Biolabs公司。

本发明中使用的PCR纯化和DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自华舜生物制品有限公司，Targetron^TM Gene Knockout System(TA0100)Kit购自Sigma-Aldrich公司，基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

在本发明的下述实施例中，使用的培养基和缓冲液如下：

CGM培养基配方如下(Joseph W.Roos et al，Biotechnology and Bioengineering，P681-694，Vol 557，1985)：2g(NH₄)₂SO₄，1g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g KH₂PO₄，0.1gMgSO₄·7H₂O，0.015g FeSO₄·7H₂O，0.01g CaCl₂，0.01g MnSO₄·H₂O，0.002g CoCl₂，0.002g ZnSO₄，2g Tryptone，1g Yeast Extraction，50g Glucose，2％琼脂溶于1L水中。

P2培养基的配制方法如下(F.Monot et al，Appl Environ Microbiol，Issue 6，Vol44，1982)：

溶液1：40g D-葡萄糖，20g D-木糖，加H₂O定溶至850mL；

溶液2：NH₄Ac 2.2g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，加H₂O定溶至100mL；

溶液3：2.0g MgSO₄·7H₂O，0.1g MnSO₄·H₂O，0.1g NaCl，0.1g FeSO₄·7H₂O；

溶液4：100ml蒸馏水中加入100mg氨基苯酸(p-aminobenzoic acid)，100mg维生素B1(thiamine)，1mg生物素(biotin)；

溶液1和溶液2高温湿热灭菌，溶液3和溶液4过滤除菌，溶液1和溶液2冷却后混合均匀，再加入10mL溶液3和1mL溶液4，混匀后分装成95mL/瓶，配制培养基时在培养体系中添加1％CaCO₃，以过滤除菌N₂排除瓶中的空气。

ETM缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM NaH₂PO₄，10mMMgCl₂。

ET缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM NaH₂PO₄。

本发明使用的限制性内切酶，Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶和小牛碱性磷酸酶(CIAP)均购自TaKaRa公司，KOD plus DNA聚合酶购自Toyobo公司。

其他常规试剂均为国产或进口分装。

本发明通过PCR扩增用于中断ccpA基因的targetron片断，然后经Xho I及BsrGI双酶切并与经同样酶切的pSY6载体连接，得到中断质粒pSY6-ccpA，电转Clostridium acetobutylicum ATCC 824，然后经菌落PCR鉴定出有内含子插入到基因组中的重组菌，并经测序验证在ccpA基因的816-817bp间插入了L1.LtrB内含子片段，经发酵验证确定ccpA基因经插入失活后解除了葡萄糖抑制效应，能够同步利用葡萄糖-木糖混合碳源进行ABE发酵，具体如下述实施例所示。

实施例1、构建pSY6-ccpA质粒载体

通过PCR扩增ccpA targetron片断，然后使用XhoI和BsrG I进行双酶切，并与同样经XhoI和BsrG I酶切的pSY6载体连接，得到中断质粒pSY6-ccpA，其中，PCR扩增ccpA targetron的模板及引物设计方法来源于Sigma-Aldrich公司的Targetron^TM Gene Knockout System(TA0100)Kit，具体步骤如下：

1.1、引物设计

参考Targetron^TM Gene Knockout System(TA0100)Kit提供的方法，分别设计引物ccpA-IBS(如序列SEQ ID NO.：1所示)、ccpA-EBS1d(如序列SEQ ID NO.：2所示)和ccpA-EBS2(如序列SEQ ID NO.：3所示)，用于构建pSY6-ccpA质粒载体。

PCR扩增需要的EBS universal由Targetron^TM Gene Knockout System(TA0100)Kit自带。

1.2、PCR扩增

使用Sigma-Aldrich的Targetron^TM Gene Knockout System(TA0100)Kit进行PCR扩增，扩增需要的模板和试剂由试剂盒提供，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收350bp处的条带。

1.3、构建pSY6-ccpA重组质粒载体

使用Xho I及BsrGI分别酶切载体pSY6和ccpA-targetron片段，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收酶切后产物。

将酶切后的ccpA-targetron片段与酶切后的载体片段使用T4 DNA连接酶连接，该连接反应在16℃水浴锅中进行10hr，将获得的连接产物以CaCl₂热休克法转化E.coli DH5α感受态细胞：42℃热击90sec，然后添加4℃LB液体培养基复苏1hr，然后将细胞以4500rpm离心5min，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上培养16-18hr。

对获得的菌落进行菌落PCR，以检测350bp的targetron片段是否连接入pSY6载体中，PCR扩增引物为IBS和EBS1d。

PCR检测结果显示，菌落PCR可以扩增出350bp特异性条带。随即挑取PCR呈阳性的菌落以LB液体培养基扩陪，提取质粒。

然后，以pIMP1-seq-for(如SEQ ID NO：9所示)作为引物，提取的质粒pSY6-ccpA作为模板进行测序，测序结果如SEQ ID NO：10所示，其中196-244bp为IBS序列，485-544bp为EBS1d序列，424-472bp为IBS2序列。

根据SEQ ID NO：10的结果，扩增得到的350bp序列含有目的突变位点，因此，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后获得的阳性转化子含有重组质粒pSY6-ccpA。

实施例2、Clostridium acetobutylicum ccpA-突变株的构建与检测

将pSY6-ccpA质粒经E.coli ER2275/pANS1在Cac8 I位点甲基化后，电转Clostridium acetobutylicum ATCC 824，复苏过夜后，取200μl细胞液涂布于加有40μg/mL红霉素的CGM平板上，在厌氧箱内37℃培养48-96小时后，挑取单菌进行菌落PCR验证，具体过程如下：

2.1、pSY6-ccpA质粒的甲基化

为防止外源DNA进入c.acetobutylicum后被其限制系统切割降解，pSY6-ccpA质粒需甲基化(Mermelstein，L.D and Papoutsakis，E.T.Appl Environ Microbiol.vol59.issue 4.page 1077-81)。

将pANS1质粒以CaCl₂热休克法转化入E.coli ER2275，获得菌株E.coliER2275/pANS1。

将抽提获得的pSY6-ccpA质粒转化入E.coli ER2275/pANS1感受态细胞，由于pANS1质粒具有壮观霉素抗性，因此涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的LB培养基平板上培养过夜后，挑取单菌落接至4mL添加有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的LB液体培养基中过夜培养，获得含pANS1及pSY6-ccpA的E.coli ER2275，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，将抽提获得的质粒使用SatI酶切验证(以未转化入E.coli ER2275/pANS1的pSY6-ccpA为对照；satI为Cac824I的同裂酶，与Cac824I具有相同的识别位点)，酶切结果显示，经上述处理的质粒pSY6-ccpA不能被SatI酶切，而对照可被SatI酶切，根据酶切结果，经上述处理的质粒pSY6-ccpA的Cac824I酶切位点被甲基化而不被clostridiumacetobutylicum的限制系统所识别。

2.2、pSY6-ccpA质粒电转入Clostridium acetobutylicum ATCC 824

将C.acetobutylicum ATCC 824于CGM培养基平板上划线培养48hr后，挑取单菌落接入5mL CGM液体培养基中培养16hr，再按1％接种量接入50mL CGM液体培养基中培养，当培养菌体的OD600达到0.6-0.7之间时取出培养菌，用于制备电转感受态细胞。取30mL菌液，于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入30mL4℃的ETM缓冲液悬浮，再于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入3mL 4℃的ET缓冲液，获得悬浮菌液。

取上述悬浮菌液180μL，加入20μL(约1～3μg)pSY6-ccpA甲基化质粒(冰上操作)，混匀后转入电转杯中(2mm直径)，使用Bio-Rad MicroPulser^TM电转仪电转，电压2.0kV，其余参考使用手册，电击后迅速加入常温的CGM培养基1mL，于37℃培养8hr后，取200μL细胞液涂布于加有40μg/mL红霉素的CGM平板上，于厌氧箱内37℃培养约2-4天。

2.3、菌落PCR验证

pSY6-ccpA质粒转化入C.acetobutylicum ATCC 824中后，可能会将二类内含子的部分序列插入到基因组的ccpA基因中，是否有内含子插入可以使用插入位点上下游的引物，通过菌落PCR加以验证(未插入内含子的野生型菌将扩增出219bp的条带，插入有内含子的重组菌株将扩增出的条带为1133bp条带)，因此，随机挑取三个转化子(分别命名为824ΔccpA 1-3)进行验证，其中，以C.acetobutylicumATCC 824基因组为负对照，具体过程如下：

PCR反应使用的引物为CCPA(ID)-FW和CCPA(ID)-REV，其序列分别如SEQID No.：4和SEQ ID No.：5所示；

PCR反应体系：与实施例1相同；

PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 5min。

将PCR反应获得的产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。

根据图1的结果，得到的三个转化子均为插入了内含子的突变体。

2.4、测序验证阳性转化子

随机挑取步骤2.3中对应于图1中标记为4的阳性转化子，以加有40μg/mL红霉素的CGM液体培养基培养后，抽提基因组。以抽提的基因组为模板，以CCPA(ID)-FW和CCPA(ID)-REV为引物对进行PCR扩增，回收扩增获得的1.1kbDNA条带并测序，结果如SEQ ID NO.：8所示，测序结果显示，该序列的817-1731位点的DNA为插入的内含子序列，即内含子序列精确地插入到预计的816|817位点之间。

实施例3、Clostridium acetobutylicum ccpA-突变株的发酵

取步骤2.2中获得的中断了ccpA基因的Clostridium acetobutylicum菌株Clostridium acetobutylicum ccpA^-在P2培养基中发酵，并检测发酵液，具体过程如下：

从CGM平板上挑取单菌接入5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1％接种量接入50mL CGM培养基中，培养8～10hr菌浓OD600达到0.4，以5％接入P2培养基中培养发酵，并于0，12，25，34，48，60，72时取发酵液，检测OD600(结果如图2所示)，残糖含量(使用WATERS公司的sugar-pak柱经Agela 1200 HPLC测定，结果如图3所示)以及丙酮、丁醇和乙醇含量(使用Agela 7890A气相色谱仪测定，结果如图4所示)，并以Clostridium acetobutylicum ATCC 824作为对照，其中，测定发酵液中的残糖含量和丙酮、丁醇和乙醇含量前需进行如下预处理：

发酵液经离心后分别取上清液测定残糖和丙酮、丁醇、乙醇：上清液以H₂O经20倍稀释后用于残糖测定；400μL上清液与100μL内标混合均匀测定丙酮、丁醇和乙醇(内标配方为：25g异丁醇，5g异丁酸，50mL 37％浓盐酸，加水定容至1L)。

根据图3的结果，ccpA基因经插入失活后，实现了葡萄糖和木糖的同步利用，发酵60hr可以使20g/L的木糖利用81％，产率为0.28g/L/hr，而野生型经60hr发酵仅能利用12％，产率为0.04g/L/hr，ccpA突变后木糖利用能力提高6倍。可见ccpA经插入失活后解除了葡萄糖抑制效应。

根据图4的结果，ccpA突变菌株发酵液中的丙酮、丁醇和乙醇的终浓度均高于野生菌株。

综上所述，本发明提供的方法，中断了丙酮丁醇梭菌中ccpA基因的表达，本发明提供的菌株中，ccpA基因经二类内含子插入失活后的菌株同步利用葡萄糖和木糖的能力显著提高，同时转化生成的ABE浓度相应提高。本发明构建的工程菌株解除了葡萄糖抑制效应，能同步利用葡萄糖-木糖进行发酵，因此该菌株有利用木质纤维素水解液进行丙酮丁醇发酵的潜力。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法

<130>P5091068

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>53

<212>DNA

<213>引物

<400>1

aaaactcgag ataattatcc ttaaaggacg tagatgtgcg cccagatagg gtg           53

<210>2

<211>60

<212>DNA

<213>引物

<400>2

cagattgtac aaatgtggtg ataacagata agtcgtagat gttaacttac ctttctttgt    60

<210>3

<211>49

<212>DNA

<213>引物

<400>3

tgaacgcaag tttctaattt cggtttcctt ccgatagagg aaagtgtct                49

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>4

gatggaacag acggaataaa                                                20

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>5

atcccatatc gtaagtaggt tg                                             22

<210>6

<211>8032

<212>DNA

<213>质粒pSY6

<400>6

tcgagataat tatccttacc agcccatagg gtgcgcccag atagggtgtt aagtcaagta    60

gtttaaggta ctactctgta agataacaca gaaaacagcc aacctaaccg aaaagcgaaa    120

gctgatacgg gaacagagca cggttggaaa gcgatgagtt acctaaagac aatcgggtac    180

gactgagtcg caatgttaat cagatataag gtataagttg tgtttactga acgcaagttt    240

ctaatttcgg ttgctggtcg atagaggaaa gtgtctgaaa cctctagtac aaagaaaggt    300

aagttaagcc tatggactta tctgttatca ccacatttgt acaatctgta ggagaaccta    360

tgggaacgaa acgaaagcga tgccgagaat ctgaatttac caagacttaa cactaactgg    420

ggatacccta aacaagaatg cctaatagaa aggaggaaaa aggctatagc actagagctt    480

gaaaatcttg caagggtacg gagtactcgt agtagtctga gaagggtaac gccctttaca    540

tggcaaaggg gtacagttat tgtgtactaa aattaaaaat tgattaggga ggaaaacctc    600

aaaatgaaac caacaatggc aattttagaa agaatcagta aaaattcaca agaaaatata    660

gacgaagttt ttacaagact ttatcgttat cttttacgtc cagatattta ttacgtggcg    720

acgcgttggg aaatggcaat gatagcgaaa caacgtaaaa ctcttgttgt atgctttcat    780

tgtcatcgtc acgtgattca taaacacaag tgaatgtcga cagtgaattt ttacgaacga    840

acaataacag agccgtatac tccgagaggg gtacgtacgg ttcccgaaga gggtggtgca    900

aaccagtcac agtaatgtga acaaggcggt acctccctac ttcaccatat cattttctgc    960

agccccctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatata tggctagatc    1020

gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata tgcgttgatg    1080

caatttctat gcactcgtag tagtctgaga agggtaacgc cctttacatg gcaaaggggt    1140

acagttattg tgtactaaaa ttaaaaattg attagggagg aaaacctcaa aatgaaacca    1200

acaatggcaa ttttagaaag aatcagtaaa aattcacaag aaaatataga cgaagttttt    1260

acaagacttt atcgttatct tttacgtcca gatatttatt acgtggcgta tcaaaattta    1320

tattccaata aaggagcttc cacaaaagga atattagatg atacagcgga tggctttagt    1380

gaagaaaaaa taaaaaagat tattcaatct ttaaaagacg gaacttacta tcctcaacct    1440

gtacgaagaa tgtatattgc aaaaaagaat tctaaaaaga tgagaccttt aggaattcca    1500

actttcacag ataaattgat ccaagaagct gtgagaataa ttcttgaatc tatctatgaa    1560

ccggtattcg aagatgtgtc tcacggtttt agacctcaac gaagctgtca cacagctttg    1620

aaaacaatca aaagagagtt tggcggcgca agatggtttg tggagggaga tataaaaggc    1680

tgcttcgata atatagacca cgttacactc attggactca tcaatcttaa aatcaaagat    1740

atgaaaatga gccaattgat ttataaattt ctaaaagcag gttatctgga aaactggcag    1800

tatcacaaaa cttacagcgg aacacctcaa ggtggaattc tatctcctct tttggccaac    1860

atctatcttc atgaattgga taagtttgtt ttacaactca aaatgaagtt tgaccgagaa    1920

agtccagaaa gaataacacc tgaatatcgg gagctccaca atgagataaa aagaatttct    1980

caccgtctca agaagttgga gggtgaagaa aaagctaaag ttcttttaga atatcaagaa    2040

aaacgtaaaa gattacccac actcccctgt acctcacaga caaataaagt attgaaatac    2100

gtccggtatg cggacgactt cattatctct gttaaaggaa gcaaagagga ctgtcaatgg    2160

ataaaagaac aattaaaact ttttattcat aacaagctaa aaatggaatt gagtgaagaa    2220

aaaacactca tcacacatag cagtcaaccc gctcgttttc tgggatatga tatacgagta    2280

aggagatctg gaacgataaa acgatctggt aaagtcaaaa agagaacact caatgggagt    2340

gtagaactcc ttattcctct tcaagacaaa attcgtcaat ttatttttga caagaaaata    2400

gctatccaaa agaaagatag ctcatggttt ccagttcaca ggaaatatct tattcgttca    2460

acagacttag aaatcatcac aatttataat tctgaactcc gcgggatttg taattactac    2520

ggtctagcaa gtaattttaa ccagctcaat tattttgctt atcttatgga atacagctgt    2580

ctaaaaacga tagcctccaa acataaggga acactttcaa aaaccatttc catgtttaaa    2640

gatggaagtg gttcgtgggg gatcccgtat gagataaagc aaggtaagca gcgccgttat    2700

tttgcaaatt ttagtgaatg taaatcccct tatcaattta cggatgagat aagtcaagct    2760

cctgtattgt atggctatgc ccggaatact cttgaaaaca ggttaaaagc taaatgttgt    2820

gaattatgtg ggacgtctga tgaaaatact tcctatgaaa ttcaccatgt caataaggtc    2880

aaaaatctta aaggcaaaga aaaatgggaa atggcaatga tagcgaaaca acgtaaaact    2940

cttgttgtat gctttcattg tcatcgtcac gtgattcata aacacaagtg aatgtcgagc    3000

acccgttctc ggagcactgt ccgaccgctt tggccgccgc ccagtcctgc tcgcttcgct    3060

acttggagcc actatcgact acgcgatcat ggcgaccaca cccgtcctgt ggatcgccaa    3120

gccgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat    3180

aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa    3240

cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc    3300

cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc    3360

catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt cctgtcgtca tatctacaag    3420

catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca    3480

cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag    3540

acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa    3600

acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat    3660

aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg    3720

tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat    3780

gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat    3840

tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt    3900

aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag    3960

cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa    4020

agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg    4080

ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct    4140

tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac    4200

tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca    4260

caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat    4320

accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact    4380

attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc    4440

ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga    4500

taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg    4560

taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg    4620

aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca    4680

agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta    4740

ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca    4800

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg    4860

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga    4920

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa    4980

tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc    5040

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg    5100

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac    5160

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct    5220

acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc    5280

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg    5340

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg    5400

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct    5460

ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga    5520

taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg    5580

cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc    5640

gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag    5700

tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt    5760

tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa    5820

cagctatgac catgattacg ccaagctttg gctaacacac acgccattcc aaccaatagt    5880

tttctcggca taaagccatg ctctgacgct taaatgcact aatgccttaa aaaaacatta    5940

aagtctaaca cactagactt atttacttcg taattaagtc gttaaaccgt gtgctctacg    6000

accaaaagta taaaaccttt aagaactttc ttttttcttg taaaaaaaga aactagataa    6060

atctctcata tcttttattc aataatcgca tcagattgca gtataaattt aacgatcact    6120

catcatgttc atatttatca gagctcgtgc tataattata ctaattttat aaggaggaaa    6180

aaataaagag ggttataatg aacgagaaaa atataaaaca cagtcaaaac tttattactt    6240

caaaacataa tatagataaa ataatgacaa atataagatt aaatgaacat gataatatct    6300

ttgaaatcgg ctcaggaaaa gggcatttta cccttgaatt agtacagagg tgtaatttcg    6360

taactgccat tgaaatagac cataaattat gcaaaactac agaaaataaa cttgttgatc    6420

acgataattt ccaagtttta aacaaggata tattgcagtt taaatttcct aaaaaccaat    6480

cctataaaat atttggtaat ataccttata acataagtac ggatataata cgcaaaattg    6540

tttttgatag tatagctgat gagatttatt taatcgtgga atacgggttt gctaaaagat    6600

tattaaatac aaaacgctca ttggcattat ttttaatggc agaagttgat atttctatat    6660

taagtatggt tccaagagaa tattttcatc ctaaacctaa agtgaatagc tcacttatca    6720

gattaaatag aaaaaaatca agaatatcac acaaagataa acagaagtat aattatttcg    6780

ttatgaaatg ggttaacaaa gaatacaaga aaatatttac aaaaaatcaa tttaacaatt    6840

ccttaaaaca tgcaggaatt gacgatttaa acaatattag ctttgaacaa ttcttatctc    6900

ttttcaatag ctataaatta tttaataagt aagttaaggg atgcataaac tgcatccctt    6960

aacttgtttt tcgtgtacct attttttgtg aatcgattat gtcttttgcg cattcacttc    7020

ttttctatat aaatatgagc gaagcgaata agcgtcggaa aagcagcaaa aagtttcctt    7080

tttgctgttg gagcatgggg gttcaggggg tgcagtatct gacgtcaatg ccgagcgaaa    7140

gcgagccgaa gggtagcatt tacgttagat aaccccctga tatgctccga cgctttatat    7200

agaaaagaag attcaactag gtaaaatctt aatataggtt gagatgataa ggtttataag    7260

gaatttgttt gttctaattt ttcactcatt ttgttctaat ttcttttaac aaatgttctt    7320

ttttttttag aacagttatg atatagttag aatagtttaa aataaggagt gagaaaaaga    7380

tgaaagaaag atatggaaca gtctataaag gctctcagag gctcatagac gaagaaagtg    7440

gagaagtcat agaggtagac aagttatacc gtaaacaaac gtctggtaac ttcgtaaagg    7500

catatatagt gcaattaata agtatgttag atatgattgg cggaaaaaaa cttaaaatcg    7560

ttaactatat cctagataat gtccacttaa gtaacaatac aatgatagct acaacaagag    7620

aaatagcaaa agctacagga acaagtctac aaacagtaat aacaacactt aaaatcttag    7680

aagaaggaaa tattataaaa agaaaaactg gagtattaat gttaaaccct gaactactaa    7740

tgagaggcga cgaccaaaaa caaaaatacc tcttactcga atttgggaac tttgagcaag    7800

aggcaaatga aatagattga cctcccaata acaccacgta gttattggga ggtcaatcta    7860

tgaaaatgcg attaagcttg gctgcaggtc gacggatccc cgggaattct ataaaatata    7920

aataattttc taaaaaactt aacttcatgt gaaaagtttg ttaaaatata aatgagcacg    7980

ttaatcattt aacatagata attaaatagt aaaagggagt gtcgacatat gc            8032

<210>7

<211>6196

<212>DNA

<213>质粒pANS1

<400>7

gtcgactcta gaggatcccc catatgcaag ggtttattgt tttctaaaat ctgattacca    60

attagaatga atatttccca aatattaaat aataaaacaa aaaaattgaa aaaagtgttt    120

ccaccatttt ttcaattttt ttataatttt tttaatctgt tatttaaata gtttatagtt    180

aaatttacat tttcattagt ccattcaata ttctctccaa gataactacg aactgctaac    240

aaaattctct ccctatgttc taatggagaa gattcagcca ctgcatttcc cgcaatatct    300

tttggtatga ttttacccgt gtccatagtt aaaatcatac ggcataaagt taatatagag    360

ttggtttcat catcctgata attatctatt aattcctctg acgaatccat aatggctctt    420

ctcacatcag aaaatggaat atcaggtagt aattcctcta agtcataatt tccgtatatt    480

cttttatttt ttcgttttgc ttggtaaagc attatggtta aatctgaatt taattccttc    540

tgaggaatgt atccttgttc ataaagctct tgtaaccatt ctccataaat aaattcttgt    600

ttgggaggat gattccacgg taccatttct tgctgaataa taattgttaa ttcaatatat    660

cgtaagttgc ttttatctcc tatttttttt gaaataggtc taattttttg tataagtatt    720

tctttacttt gatctgtcaa tggttcagat acgacgacta aaaagtcaag atcactattt    780

ggttttagtc cactctcaac tcctgatcca aacatgtaag taccaataag gttatttttt    840

aaatgtttcc gaagtatttt tttcacttta ttaatttgtt cgtatgtatt caaatatatc    900

ctcctcacta ttttgattag tacctatttt atatccatag ttgttaatta aataaactta    960

atttagttta tttatagatt tcattggctt ctaaattttt tatctagata ataattattt    1020

tagttaattt tattctagat tatatatgat atgatctttc atttccataa aactaaagta    1080

agtgtaaacc tattcattgt tttaaaaata tctcttgcca gtcacgttac gttattagtt    1140

atagttatta taacatgtat tcacgaacga aaatcgatgg gctgcaggaa ttcgatctga    1200

acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga    1260

tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc    1320

ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta    1380

tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca aaagttggcc    1440

cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa gtgatcttcc    1500

gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt actgatttag    1560

tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct gtccctcctg    1620

ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc agcgctagcg    1680

gagtgtatac tggcttacta tgttggcact gatgagggtg tcagtgaagt gcttcatgtg    1740

gcaggagaaa aaaggctgca ccggtgcgtc agcagaatat gtgatacagg atatattccg    1800

cttcctcgct cactgactcg ctacgctcgg tcgttcgact gcggcgagcg gaaatggctt    1860

acgaacgggg cggagatttc ctggaagatg ccaggaagat acttaacagg gaagtgagag    1920

ggccgcggca aagccgtttt tccataggct ccgcccccct gacaagcatc acgaaatctg    1980

acgctcaaat cagtggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc    2040

tggcggctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc tgcctttcgg tttaccggtg tcattccgct    2100

gttatggccg cgtttgtctc attccacgcc tgacactcag ttccgggtag gcagttcgct    2160

ccaagctgga ctgtatgcac gaaccccccg ttcagtccga ccgctgcgcc ttatccggta    2220

actatcgtct tgagtccaac ccggaaagac atgcaaaagc accactggca gcagccactg    2280

gtaattgatt tagaggagtt agtcttgaag tcatgcgccg gttaaggcta aactgaaagg    2340

acaagttttg gtgactgcgc tcctccaagc cagttacctc ggttcaaaga gttggtagct    2400

cagagaacct tcgaaaaacc gccctgcaag gcggtttttt cgttttcaga gcaagagatt    2460

acgcgcagac caaaacgatc tcaagaagat catcttatta atcagataaa atatttctag    2520

atttcagtgc aatttatctc ttcaaatgta gcacctgaag tcagccccat acgatataag    2580

ttgtaattct catgtttgac agcttatcat cgataagctt tcgtatttga aaacgtaaaa    2640

gggttgataa cgaagcgtca ccgtcctaca ttcgacgcac ttatcgagaa gtttaatgaa    2700

ataggttacg agattagttg ggaagtagta aacgcgtggg attacggagt agcgcagaaa    2760

cgtgagcgag tgtttatagt tggtgtgcgg aatgacctcg gttttaagtt cgattttccg    2820

aatccgttag aaggcgatta tcagacgcga gtattgcggg atgtgatcgg agatctgcca    2880

gaggtcggag aatacttcta cgttaatcgg gggggttggg gtaagtgttt ggtgaaaagt    2940

gttttcggac tcgaagatgt atcgccgact ataaaaagtc aaaacgcaaa tcttcctcct    3000

ggttatcccg gacaccctaa agacgccgat caaatctgca accgaccgat tagccaacaa    3060

aagcgccccg ccgtttcacc gttcgcgaat gtctccgaat ccaatctgcg ccagacactt    3120

acgtcctgcc agacgatatt tccttaacgg cgcagtatcg gattagtcgg taacggaatt    3180

gcttcgcgtg ttgcgtggta tatcgggcgg gcgttgcgga tcaactttca tctaactgta    3240

agtaattatg atagataaga tggttgaaat attacataaa agatcaattt tatttagagt    3300

aaaaataaaa tatatggagg ttgtttgttg agtaaactac gtgtaatgag cctttttagt    3360

ggaattggtg catttgaagc tgcattaaga aacataggcg ttgattatga actgattggc    3420

tttagtgaaa tagataaata tgcaatcaaa tcttattgtg caattcataa tgtaagtgaa    3480

acattgaatg ttggagacat aagtaaagct aagaaagata atattccata ttttgatttg    3540

ttaacaagtg gatttccttg tcccactttt tcagtagccg gcggccgtga tggtatggaa    3600

tataagtgta gcaattgttc gcacgagcat ttaattactt atgaggatta taagaaggga    3660

gtcaaatgcc cgaagtgtga agctgtttct aaggctaaag atgaacgggg aacgctcttt    3720

tttgaaacag ctttgttagc agaagagaag aagccgaaat ttgtgatatt agaaaatgta    3780

aaagggctaa ttaatagtgg caatggacaa gtgttaagaa taattagtga gactatgaac    3840

aatataggct ataggattga cctagagcta cttaattcaa agtttttcaa tgttccacag    3900

aatcgtgaac gggtatacat aattggcatt agagaagatt tggttgaaaa tgaacaatgg    3960

gttgtaggtc agaagcgaaa cgatgttctg agtaaaggta aaaagagatt gcaagaaata    4020

aatataaaga gttttaattt taaatggcct ttacaagaca ctgtcacaaa gaggttgaga    4080

gaaattcttg aggattttgt tgatgagaag tattacttaa atgaagaaaa gacgaagaaa    4140

cttgttgagc aactaggaac cgcaccgcta caaaaacaag aagtaaggga gccgttaatg    4200

gtgggacacg tggatttaaa aggtcacgat gccatcaaaa gagtttactc gcctgaagga    4260

ctttcaccga cattaactac aatgggcggc ggtcacagag aacctaaaat cgcagaaaag    4320

cagaaagaag taagggcagt gttaacgcca gaaagagaag agaaaagaca gaatggaaga    4380

cgttttaaag aaaacggaga accggctttc acggttaata caattgatcg acatggtgta    4440

gcaatcggag aatacccaaa atataaaatt agaaagctct ctccattaga atgttggaga    4500

ctccaagcat ttgatgacga agattttgaa aaagcttttg cagcaggaat aagtaactca    4560

caattataca agcaagccgg taattcaatt acagttagtg tgcttgagtc tatatttcaa    4620

gaattaatac atacatatgt taataaagaa tctgaataaa atttgtcttt taaacaaatg    4680

caaaataaga gggattgaga ggtgaggaag atggatagtt acccagagtc tttaaaaaga    4740

gagacagagg agattaaaga gcgtgttagg aatggaaata tcaaagaaga caggattaaa    4800

gaaattgcag aaacgacagt tgagtttttg aaatcagagg agaaaagaca taaatacttt    4860

tctgaagttg ctgcagctat ggcgtataac ttaagtgagt ttttcaaatc ttatttaaaa    4920

ggagagtgaa tatgctaact gatcagaaaa aattgacttg gtaaacgctc ttagaaaaaa    4980

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    5040

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    5100

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    5160

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    5220

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    5280

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    5340

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    5400

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    5460

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    5520

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagctt    5580

taatgcggta gtttatcaca gttaaattgc taacgcagtc aggcaccgtg tatgaaatct    5640

aacaatgcgc tcatcgtcat cctcggcacc gtcaccctgg atgctgtagg cataggcttg    5700

gttatgccgg tactgccggg cctcttgcgg gatatcgtcc attccgacag catcgccagt    5760

cactatggcg tgctgctagc gctatatgcg ttgatgcaat ttctatgcgc acccgttctc    5820

ggagcactgt ccgaccgctt tggccgccgc ccagtcctgc tcgcttcgct acttggagcc    5880

actatcgact acgcgatcat ggcgaccaca cccgtcctgt ggatcctcta cgccggacgc    5940

atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc    6000

accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt    6060

atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc    6120

cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag    6180

tcgcataagg gagagc                                                    6196

<210>8

<211>1920

<212>DNA

<213>clostridium acetobutylicum ccpA-转化子突变序列

<400>8

atggctgcct ctattaaaga tgtcgctaga gaagcgagag tatctattgc aacagtttca    60

agagttctaa acaatgtaga cgttgtaaat gaagagacta agaaaaaagt aatggaagca    120

attaaaaagt tagattatag acctaatatc gtagcaagaa gtttaaaaac gcaaagaaca    180

agaacaattg gaatcgttat acctgatata tcaagccagt tttacccaga gatagtaagg    240

ggagcggaag atgtgtctaa tatatataat tataatgtaa ttttatgtaa tacagattta    300

gatatatcga aagaaaaaga ttacattaga gttcttaagg agaagatggt tgatggagtt    360

atttacatga gtaattcctt agcacctgaa atacttcaat tattaagaga tcttaagatt    420

cctacagtgc ttgttgagac aagggaaagt gaagacgaga atgcctttcc aagtgtaaca    480

atagataatg ctaaagctgc ctatgatgca gtaaattatt taattaaaaa gggtaacaat    540

aaaattgctt atgtaggtgt aaaccctaaa ttaaaaaata atgctagagc tataatctat    600

gaaggataca agaaggctct tttagataac aatattccgc ttaatgaaaa tttaatacaa    660

tttggtggtt tgaaggctat agatggaaca gacggaataa atgttataat taaaaaggaa    720

aagattgatg ctgttttttg tgcatgtgat gagatagcta tgggagctat aaatgcactt    780

agagaaaatg gtatagatgt tccaaaggat gtagatgtgc gcccagatag ggtgttaagt    840

caagtagttt aaggtactac tctgtaagat aacacagaaa acagccaacc taaccgaaaa    900

gcgaaagctg atacgggaac agagcacggt tggaaagcga tgagttacct aaagacaatc    960

gggtacgact gagtcgcaat gttaatcaga tataaggtat aagttgtgtt tactgaacgc    1020

aagtttctaa tttcggtttc cttccgatag aggaaagtgt ctgaaacctc tagtacaaag    1080

aaaggtaagt taacatctac gacttatctg ttatcaccac atttgtacaa tctgtaggag    1140

aacctatggg aacgaaacga aagcgatgcc gagaatctga atttaccaag acttaacact    1200

aactggggat accctaaaca agaatgccta atagaaagga ggaaaaaggc tatagcacta    1260

gagcttgaaa atcttgcaag ggtacggagt actcgtagta gtctgagaag ggtaacgccc    1320

tttacatggc aaaggggtac agttattgtg tactaaaatt aaaaattgat tagggaggaa    1380

aacctcaaaa tgaaaccaac aatggcaatt ttagaaagaa tcagtaaaaa ttcacaagaa    1440

aatatagacg aagtttttac aagactttat cgttatcttt tacgtccaga tatttattac    1500

gtggcgacgc gttgggaaat ggcaatgata gcgaaacaac gtaaaactct tgttgtatgc    1560

tttcattgtc atcgtcacgt gattcataaa cacaagtgaa tgtcgacagt gaatttttac    1620

gaacgaacaa taacagagcc gtatactccg agaggggtac gtacggttcc cgaagagggt    1680

ggtgcaaacc agtcacagta atgtgaacaa ggcggtacct ccctacttca cgttgtaggc    1740

tttgacaata tttatacatc atcaatattt tatccaaagc ttactacaat agagcaacct    1800

acttacgata tgggatctgt tggaatgaga atgcttataa aaataataaa taaagcagaa    1860

ccagaatgtc ttcattatgt acttgattac aatataattg agagagattc atgtaaataa    1920

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>测序引物

<400>9

gcaagaggca aatgaaatag                                                20

<210>10

<211>1132

<212>DNA

<213>质粒pSY6-ccpA测序验证序列

<400>10

acgtagttat tgggaggtca atctatgaaa tgcgattaag cttggctgca ggtcgacgga    60

tccccgggaa ttctataaaa tataaataat tttctaaaaa acttaacttc atgtgaaaag    120

tttgttaaaa tataaatgag cacgttaatc atttaacata gataattaaa tagtaaaagg    180

gagtgtcgac atatgctcga gataattatc cttaaaggac gtagatgtgc gcccagatag    240

ggtgttaagt caagtagttt aaggtactac tctgtaagat aacacagaaa acagccaacc    300

taaccgaaaa gcgaaagctg atacgggaac agagcacggt tggaaagcga tgagttacct    360

aaagacaatc gggtacgact gagtcgcaat gttaatcaga tataaggtat aagttgtgtt    420

tactgaacgc aagtttctaa tttcggtttc cttccgatag aggaaagtgt ctgaaacctc    480

tagtacaaag aaaggtaagt taacatctac gacttatctg ttatcaccac atttgtacaa    540

tctgtaggag aacctatggg aacgaaacga aagcgatgcc gagaatctga atttaccaag    600

acttaacact aactggggat accctaaaca agaatgccta atagaaagga ggaaaaaggc    660

tatagcacta gagcttgaaa atcttgcaag ggtacggagt actcgtagta gtctgagaag    720

ggtaacgccc tttacatggc aaaggggtac agttattgtg tactaaaatt aaaaattgat    780

tagggaggaa aacctcaaaa tgaaaccaac aatggcaatt ttagaaagaa tcagtaaaaa    840

ttcacaagaa aatatagacg aagtttttac aagactttat cgttatcttt tacgtccaga    900

tatttattac gtggcgacgc gttgggaaat ggcaatgata gcgaaacaac gtaaaactct    960

tgttgtatgc tttcattgtc atcgtcacgt gattcataaa cacaagtgaa tgtcgacagt    1020

gaattttacg acgacattac agagccgtat acttcgagag gggtacgtac ggttccgaga    1080

gggtggtgca aaccagtcac agtaatgtga acaaggcggt acctccctac tt            1132

Claims (4)

1.一种解除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的方法，其特征在于，所述方法通过二类内含子插入技术抑制丙酮丁醇梭菌的ccpA基因表达实现，所述通过二类内含子插入技术抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达通过在丙酮丁醇梭菌ccpA基因中插入二类内含子DNA片段中断丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现，包括以下步骤：

首先，使用PCR扩增ccpA targetron片段，与经过同样酶切的pSY6载体连接，获得中断质粒pSY6-ccpA，其中，PCR扩增ccpA targetron的模板及引物设计方法来源于Sigma-Aldrich公司的Targetron^TM Gene Knockout System(TA0100)kit；

然后，将pANS1质粒转化入E.coli ER2275，获得菌株E.coli ER2275／pANS1，将抽提获得的pSY6-ccpA质粒转化入E.coli ER2275／pANS1，获得Cac824I酶切位点被甲基化的pSY6-ccpA质粒；

最后，将Cac824I酶切位点被甲基化的pSY6-ccpA质粒转化入C.acetobutylicumATCC824菌株获得ccpA基因中断的丙酮丁醇梭菌突变株。

2.一种Clostridium acetobutylicum重组菌株，其特征在于，所述菌株的基因组中丙酮丁醇梭菌的ccpA基因表达被抑制，所述丙酮丁醇梭菌的ccpA基因表达被抑制通过在丙酮丁醇梭菌ccpA基因中插入二类内含子DNA片段中断丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现，包括以下步骤：

首先，使用PCR扩增ccpAtargetron片段，与经过同样酶切的pSY6载体连接，获得中断质粒pSY6-ccpA，其中，PCR扩增ccpA targetron的模板及引物设计方法来源于Sigma-Aldrich公司的Targetron^TM Gene Knockout System(TA0100)kit；

然后，将pANS1质粒转化入E.coliER2275，获得菌株E.coliER2275/pANS1，将抽提获得的pSY6-ccpA质粒转化入E.coli ER2275／pANS1，获得Cac824I酶切位点被甲基化的pSY6-ccpA质粒；

最后，将Cac824I酶切位点被甲基化的pSY6-ccpA质粒转化入C.acetobutylicumATCC824菌株获得ccpA基因中断的丙酮丁醇梭菌突变株。

3.如权利要求2所述的重组菌株用于生产丙酮、丁醇、乙醇的应用，其特征在于，所述菌株同步利用葡萄糖-木糖混合糖进行发酵。

4.一种提高丙酮丁醇梭菌利用葡萄糖-木糖混合糖发酵生产丙酮、丁醇、乙醇能力的方法，其特征在于，所述方法通过二类内含子插入技术抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现，所述通过二类内含子插入技术抑制丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达通过在丙酮丁醇梭菌ccpA基因中插入二类内含子DNA片段中断丙酮丁醇梭菌ccpA基因表达实现，包括以下步骤：

首先，使用PCR扩增ccpAtargetron片段，与经过同样酶切的pSY6载体连接，获得中断质粒pSY6-ccpA，其中，PCR扩增ccpA targetron的模板及引物设计方法来源于Sigma-Aldrich公司的Targetron^TM Gene Knockout System(TA0100)kit；

然后，将pANS1质粒转化入E.coli ER2275，获得菌株E.coli ER2275／pANS1，将抽提获得的pSY6-ccpA质粒转化入E.coli ER2275／pANS1，获得Cac824I酶切位点被甲基化的pSY6-ccpA质粒；

最后，将Cac824I酶切位点被甲基化的pSY6-ccpA质粒转化入C.acetobutylicumATCC824菌株获得ccpA基因中断的丙酮丁醇梭菌突变株。

Images