CN102414314A - 用于生产丙酮的细胞和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产丙酮的细胞和方法。

Description

用于生产丙酮的细胞和方法
技术领域
本发明涉及用于生产丙酮的细胞和方法。
背景技术
梭菌属（ Clostridium ）中的 ABE 过程
经典的ABE发酵方法（即微生物生产丙酮、丁醇和乙醇）长期以来是世界上的第二大生物技术方法，仅次于酵母发酵生产乙醇。商业的ABE发酵于1916年在英格兰开始，那时Chaim Weizmann尤其发现了丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）形成溶剂丙酮、丁醇和乙醇的能力。该方法直到二十世纪五十年代末期还在西方国家得到采用，甚至直到1981年还在南非得到采用。
该方法被停止，存在2个主要原因：一方面，丙酮和丁醇的化学合成变得越来越有利，另一方面，发酵底物的价格急剧上涨。尤其是，由于作为牛的饲料添加剂的应用，糖蜜的价格大幅上涨。
日益增加的石化原料的成本，和在微生物的途径工程领域的新技术的可能性，现在打开了开发高性能菌株和生产溶剂诸如丙酮的商业发酵方法的新选项。
经典的ABE发酵是基于生物体丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）。二者都是革兰氏阳性的，并在严格的厌氧条件下繁殖。这些生物体可以转化单糖、二糖和多糖，其中在发酵中使用的主要底物是糖蜜和淀粉。
使用丙酮丁醇梭菌的发酵方法分为2个阶段。在第一个阶段，生物质形成随着乙酸盐、丁酸盐和痕量乙醇的形成(“产酸期”)而出现。在第二个阶段（所谓的“产溶剂期”），则将酸用于形成发酵产物丙酮、丁醇和乙醇(ABE)。产物丙酮、丁醇和乙醇在野生型丙酮丁醇梭菌中以3:6:1的近似比例形成。这些产物的比例可以广泛变化，取决于选择的培养条件(例如pH或营养物质供应)或使用的底物。
已经广泛地纯化并生化地表征了丙酮、丁醇和乙醇的溶剂生物合成酶(参见：图1; Duerre, P.,和Bahl, H. 1996. Microbial production of acetone/butanol/isopropanol. 在Biotechnology, 第6卷, 第2版. M. Roehr, (编), VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, Germany. 第229–268页。Duerre, P. 1998. New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 639–648)。也存在丙酮丁醇梭菌的基因组序列 (Noelling, J., Breton, G., Omelchenko, M. V.和16位其它作者(2001)。Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridium acetobutylicum. J Bacteriol 183, 4823–4838.)。
已经生成了丙酮丁醇梭菌菌株，其中丙酮的生产已经与丁醇和乙醇的生产不相关联(entkoppeln)，所以这些菌株仅生产丙酮(Mermelstein等人(1993). Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC824 for increased solvent production by enhancement of acetone formation enzyme activities using a synthetic operon. Biotech. Bioeng. 42:1053-1060.; Nair, R.V.,和Papoutsakis, E.T. 1994)。测量的丙酮的滴定度基本上低于它在野生型中的浓度。
图2显示了在梭菌属中特有的经典的丙酮合成代谢途径。该途径从乙酰辅酶A（在所有微生物中形成的一种中枢(zentral)代谢物）开始，无论代谢何种碳源或建立何种代谢途径。需要的酶是：β-酮硫解酶，乙酰辅酶A/丁酰辅酶A-转移酶的2个亚单元，和乙酰乙酸脱羧酶。
已经证实，这些来自丙酮丁醇梭菌的酶（它们催化从乙酰辅酶A开始形成丙酮）（乙酰乙酸脱羧酶、乙酰辅酶A/丁酰辅酶A-转移酶和硫解酶）在大肠杆菌中的异源表达，会导致在该生物体中形成约150 mM的丙酮，但是其中存在也生成大量乙酸盐(50 mM)的缺点(Bermejo L. L., N. E. Welker, E. T. Papoutsakis. 1998. Expression of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Genes in Escherichia coli for Acetone Production and Acetate Detoxification. Appl. Env. Microbiol. 64:1079-1085)。
在这里，另一个缺点是，仅在好氧条件下生成丙酮，因为在葡萄糖向乙酰辅酶A代谢过程中形成的氧化还原当量不能在厌氧条件下被大肠杆菌重新氧化。
描述的所有方法共有的缺点是，它们需要复杂的碳源，例如糖类。
产乙酸细胞
已知了产乙酸细胞，即能够借助于厌氧呼吸形成乙酸盐的细胞。
产乙酸细菌包括例如醋酸杆菌属的物种，诸如伍氏醋酸杆菌（A. woodii）和醋酸梭菌（Clostridium aceticum）。
WO0068407描述了使用产乙酸细菌生产乙醇。
最近已经存在扬氏梭菌（C. ljungdahlii ）的基因组序列。尚未公开醋酸梭菌和 C. carboxidivorans的基因组序列。但是已知，醋酸梭菌额外携带一个质粒(5.6 kBp, Lee 等人, 1987)。目前，尚未公开用于遗传地修饰这些生物体的技术。
产乙酸细菌群属于厌氧原核生物，它们能够利用CO2作为末端电子受体，并形成乙酸盐。目前，21个不同的属属于产乙酸菌(Drake等人, 2006)，其中一些梭菌也属于此(Drake & Küsel, 2005)。它们能够利用二氧化碳+氢或甚至一氧化碳作为碳源和能源(Wood, 1991)。另外，醇类、醛类、羧酸类和多种己糖也可以用作碳源(Drake 等人, 2004)。导致乙酸盐形成的还原代谢途径被称作乙酰辅酶A或Wood-Ljungdahl途径。
本发明的目的在于，提供能从随处可得到的碳源生产丙酮的方法。
发明内容
令人惊奇地发现，下文所述的细胞和方法达成了本发明的目的。
因此，本发明的主题在于如权利要求1中所述的细胞。
本发明另一主题在于使用根据本发明的细胞生产丙酮的方法。
本发明的一个优点是，细胞可以是厌氧的，因此可以在能量方面特别有利地培养。
本发明的另一个优点是，根据本发明的细胞为减少破坏气候的二氧化碳作出贡献。
根据本发明的细胞的另一个优点是，通过从二氧化碳和氢生产丙酮产量提高。
本发明的主题在于能够形成丙酮的产乙酸细胞。
在本发明的上下文中，术语“产乙酸细胞”是指能够借助于厌氧呼吸形成乙酸盐的细胞。
除非另有说明，给出的所有百分比是重量百分比。
优选地，产乙酸细胞是分离的、尤其是遗传修饰的细胞。根据本发明，能够从选自二氧化碳和一氧化碳的至少一种碳源形成丙酮的细胞是优选的。特别优选地，根据本发明的产乙酸细胞能够从作为唯一碳源的一氧化碳和二氧化碳形成丙酮。
本领域技术人员众所周知，借助于重组基因技术，可以提高在生物系统中的产物产量。因此，根据本发明更优选地，产乙酸细胞相对于它的野生型以如下方式被遗传地修饰：使得它能够形成比它的野生型更多的丙酮。
表述“使得它能够形成比它的野生型更多的丙酮”也涉及这样的情况：遗传修饰的细胞的野生型根本不能形成任何丙酮，或至少不会形成可检测量的该化合物，且只有在遗传修饰以后，才可以形成可检测量的该组分。
细胞的“野生型”优选地表示这样的细胞，其基因组处于诸如通过进化自然产生的状态。该术语既用于完整细胞也用于单个基因。术语“野生型”因此特别地不包括这样的细胞和/或这样的基因：其基因序列由人类借助于重组方法至少部分地改变。
优选地如此遗传修饰这些细胞：使得它们可以从碳源形成比它们的野生型更多的丙酮。
此外，根据本发明优选地，如此遗传修饰产乙酸细胞：使得在确定的时间间隔，优选地在2小时内，更优选地在8小时内，最优选地在24小时内，它形成为野生型细胞至少2倍多、特别优选至少10倍、更优选至少100倍、甚至更优选至少1000倍和最优选至少10 000倍的丙酮。可以如下测定产物形成的增加：例如，根据本发明的细胞和野生型细胞分别在相同的条件下(相同的细胞密度，相同的营养培养基，相同的培养条件)，在合适的营养培养基中培养一定的时间间隔，然后测定营养培养基中目标产物(丙酮)的量。
在这种情况下，优选地，所述细胞具有与它的野生型相比增加的至少一种下述酶的活性：
酶E1，其催化乙酰辅酶A向乙酰乙酰辅酶A的反应；
酶E2，其催化乙酰乙酰辅酶A向乙酰乙酸盐的反应；
酶E3，其催化乙酰乙酸盐向丙酮的反应。
在上文中和在下文中使用的表述“与它的野生型相比增加的酶Ex的活性”优选地总是表示增加到下述倍数的各种酶Ex的活性：至少2，特别优选地至少10，更优选地至少100，甚至更优选地至少1000，最优选地至少10 000。此外，具有“与它的野生型相比增加的酶Ex的活性”的根据本发明的细胞特别地也包括这样的细胞：其野生型不具有或具有至少不可检测的酶Ex的活性，且只有在增加酶活性以后（例如通过过表达）才表现出该酶Ex的可检测的活性。在这种情况下此术语“过表达”或在下文中使用的表述“表达的增加”也包括这样的情况：起始细胞（例如野生型细胞）不具有或具有至少不可检测的表达，且只有通过重组方法，才诱导酶Ex的可检测的表达。
在这种情况下，特别优选的细胞是这样的细胞，其中下述一种或多种酶的活性被增加：E1、E2、E3、E1 + E2、E1 + E3、E2 + E3、E1 + E2 + E3，其中E1 + E2 + E3是特别优选的。
此外，根据本发明优选地，酶E1是乙酰辅酶A-C-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.9)；
酶E2是丁酸乙酰乙酸辅酶A-转移酶(EC 2.8.3.9)或酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)；
酶E3是乙酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.4)。
特别优选地，用作酶E1的酶是得自丙酮丁醇梭菌的thlA 。
特别优选地，用作酶E2的丁酸乙酰乙酸辅酶A-转移酶为得自丙酮丁醇梭菌的ctfA和ctfB以及得自大肠杆菌的atoD和atoA。
特别优选地，用作酶E2的酰基辅酶A水解酶为得自枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的teII或得自流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的ybgC。
特别优选地，用作酶E3的酶是得自丙酮丁醇梭菌的adc 。
根据本发明的产乙酸细胞优选地是微生物，优选细菌，特别优选厌氧细菌，尤其是杆状革兰氏阳性细菌。
非常特别优选地，使用的产乙酸细胞选自：凯伍产醋菌（Thermoanaerobacter kivui）、伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）、潮湿厌氧醋菌（Acetoanaerobium notera ）、醋酸梭菌、食甲基丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum）、丙酮丁醇梭菌、热醋梭菌菌（Moorella thermoacetica）、粘液真杆菌（Eubacterium limosum）、产生消化链球菌（Peptostreptococcus productus）、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii ）和Clostridium carboxidivorans。一种特别适合的细菌是Clostridium carboxidivorans，尤其是菌株诸如“P7”和“P11”。所述细胞描述在例如US 2007/0275447和US 2008/0057554中。
另一种特别适合的细菌是扬氏梭菌，尤其是选自下述的菌株：扬氏梭菌PETC、扬氏梭菌ERI2、扬氏梭菌C0l和扬氏梭菌O-52的菌株，且描述在WO 98/00558和WO 00/68407中。
本发明的另一主题在于生产丙酮的方法，所述方法包括下述工艺步骤：A) 使根据本发明的细胞接触营养培养基，所述营养培养基包含至少一种选自二氧化碳和一氧化碳的碳源，B) 在能够使所述细胞形成丙酮的条件下，培养细胞，和C) 任选地，分离形成的丙酮。
优选地在厌氧条件下，根据本发明的产乙酸细胞能够由至少一种选自二氧化碳和一氧化碳的碳源形成丙酮。
关于这些底物的来源，显而易见，存在许多可能的来源以提供CO或CO2作为碳源。很明显，在实践中可以用能够给产乙酸细胞供应足够量碳的任意气体或气体混合物作为本发明的碳源，使得它能够进行它的厌氧呼吸，并形成丙酮。
在根据本发明的方法中，优选地，碳源由废气提供，所述废气例如合成气、烟道气、炼油厂废气、通过酵母发酵或梭菌发酵产生的气体、含有纤维素的物质的气化或煤气化产生的废气。
这些废气不一定需要作为其它过程的副作用而形成，可以为了用于根据本发明的方法中而特别地生产。
很明显，在实践中可以用能够给产乙酸细胞供应足够量碳的任意废气作为本发明的碳源，使得它能够进行它的厌氧呼吸。
在根据本发明的方法的一个优选的实施方案中，所述碳源是合成气。
合成气可以例如由煤气化的副产物提供。产乙酸细胞因此将作为废物的物质转化成有价值的原料。
或者，通过广泛可得到的、价格便宜的农业原料的气化，可以为根据本发明的方法提供合成气。
存在许多可以转化成合成气的原料的实例，因为几乎所有的植物形式都可以用于该目的。优选的原料选自：多年生的草诸如中国芦苇、谷类残渣、加工废物诸如锯屑。
通常，在气化器中从干燥的生物质得到合成气，主要通过热解、部分氧化和蒸气重整，其中主要产物是CO、H2和CO2。
一般而言，一部分产物气体经再加工，以便优化产物产率，并避免焦油形成。使用石灰和/或白云石，可以将不希望的焦油裂解成合成气和CO。这些方法详细描述在例如Reed, 1981 (Reed, T.B., 1981, Biomass gasification: principles and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ.)中。
不同来源的混合物也可以用作碳源。
在根据本发明的方法中使用的营养培养基必须以适当的方式满足各自菌株的要求。在美国细菌学学会（American Society for Bacteriology）的手册“Manual of Methods for General Bacteriology” (Washington D. C., USA, 1981)中，给出了不同微生物的营养培养基的描述。
除了碳源以外，营养培养基特别地含有氮源和磷源、盐和pH控制剂。
作为氮源可以使用含有有机的含氮化合物（诸如蛋白胨、酵母浸出物、肉膏、麦芽膏、玉米浆、大豆粉和尿素）或无机化合物（诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵）。可以单独地或作为混合物使用氮源。
营养培养基可以含有磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。培养基必须另外含有生长必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了前述物质以外，可以使用必需的生长素（诸如氨基酸和维生素）。
所述加入的物质可以以一次性批料的形式加入培养物中，或可以在培养过程中以合适的方式供给。
为了控制培养物的pH，可以适当地使用碱性化合物（诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水）或酸性化合物（诸如磷酸或硫酸）。为了控制泡沫的产生，可以使用消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以将适当的具有选择作用的物质（例如抗生素）加入培养基中。
在根据本发明的方法的工艺步骤B)中，在使细胞能够形成丙酮的条件下，培养产乙酸细胞。优选地，所述培养在厌氧条件下进行。
为了生产丙酮的目的，根据本发明的遗传修饰的细胞可以连续地或不连续地以分批工艺（分批培养），或补料-分批工艺（馈料式工艺）或反复补料-分批工艺（反复馈料式工艺），接触营养培养基，并由此进行培养。
半连续工艺也是可考虑的，如在GB-A-1009370中所述。已知的培养方法的概述描述在Chmiel的教科书(“Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik” (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))或Storhas的教科书(“Bioreaktoren und periphere Einrichtungen”, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)中。
其它非常适用于在工艺步骤B)中培养产乙酸细胞的方法描述在例如DOE报告“Bench-scale Demonstration of Biological Production of Ethanol from Coal Synthesis Gas”, Topical Report 5, 1995年11月(DOE合同号DE-AC22-92PC92118)和文件WO 98/00558、WO 00/68407和WO 02/08438中。
在根据本发明的方法的步骤C)中，可以任选地从细胞和/或营养培养基分离由细胞形成的丙酮，其中可以考虑本领域技术人员已知的所有从复杂组合物分离小分子物质的方法用于分离。
在这点上，例如可以列举：借助于适当溶剂的沉淀，借助于适当溶剂的萃取，络合（例如借助于环糊精或环糊精衍生物），结晶，通过色谱法纯化和/或分离，或将丙酮转化成可以容易地分离的衍生物。
通过蒸馏的分离方法特别适用于工艺步骤C)。
本发明的另一组成部分是根据本发明的方法可以得到的丙酮。
在下面呈现的实施例中，通过例证描述了本发明，但是本发明不限于在实施例中呈现的实施方案，本发明的应用范围由整个说明书和权利要求书确定。
下面的附图形成本公开内容的一部分：
图1: 经典的梭菌ABE方法的生物合成途径
图2: 丙酮丁醇梭菌中丙酮的生物合成途径
图3: 质粒图谱pUC_adc_ctfAB_thlA:
图4: 质粒图谱pIMP_adc_ctfAB_thlA:。
实施例 :
实施例1. 表达载体的克隆
为了在产乙酸细胞中生产丙酮，克隆进大肠杆菌XL2 blue中。为此，在质粒pIMP1上排列下述基因：
来自丙酮丁醇梭菌的ctfA 和 ctfB ，
或来自大肠杆菌的atoA和atoD ，
或来自枯草芽孢杆菌的teII ，
和/或来自流感嗜血杆菌的ybgC ，
连同来自丙酮丁醇梭菌的基因thlA 和 adc (Mermelstein等人, 1992)。
在表1中汇总了相应的表达质粒的一览表。
表1: 质粒
Figure 2010800177745100002DEST_PATH_IMAGE001
依次克隆所述基因。为此，为扩增所述基因首先通过导入相应酶切位点设计寡核苷酸(表2)，然后扩增所有片段。
表2: 寡核苷酸
名称 序列 (5’ → 3’) *) 酶切位点 Seq ID No
adc fw GGAAGGTACCTTTTATG Acc65I 1
adc rev GTAACTCTGAATTCTATTACTTAAG EcoRI 2
atoDA fw CACAACGGTGGATCCAAGAG BamHI 3
atoDA rev CGCGATATGGTACCAATCAT Acc65I 4
ctfAB fw GAATTTAAAAGGAGGGATCCAAATGAAC BamHI 5
ctfAB rev GTTTCATAGTATTGGTACCTAAACAGC Acc65I 6
thl fw CTCAGGTCGACTTCAAGAAG SalI 7
thl rev CAGAGTTATTTTTAAGGATCCTTTCTAGC BamHI 8
telI fw CAATTGGGATCCGATAACAATTTCACACAG BamHI 9
telI rev GAGATCTGGTACCCGGTTAAATGATCGGA Acc65I 10
ybgc fw CTCTAGAAGGATCCTGTTTAACTTTAAG BamHI 11
ybgc rev ATTGGGTACCTCATTGCATACTCCG Acc65I 12
使用常规的PCR方法，由基因组DNA，扩增相应的片段，电泳分离并纯化。
pUC_adc_ctfAB_thlA的生成:
在第一步中，通过酶切位点Acc65I和EcoRI，将adc克隆进载体pUC18，然后通过SalI和BamHI，添加thlA。在最后一步中，通过酶切位点BamHI和Acc65I，在一步中克隆ctfA和ctfB，因为它在丙酮丁醇梭菌中被构建成为操纵子。在由此得到的载体pUC_adc_ctfAB_thlA中现在存在构建于操纵子中丙酮生产所需的基因。
图3显示了得到的pUC质粒。
pIMP_adc_ctfAB_thlA的生成:
接着，通过限制性内切酶SalI和EcoRI，将基因盒再克隆进载体pIMP1中，生成表达质粒pIMP_adc_ctfAB_thlA，参见：图4。
pIMP_adc_atoDA_thlA、pIMP_adc_teII_thlA和pIMP_adc_ybgC_thlA的生成:
为了生成载体pIMP_adc_atoDA_thlA、pIMP_adc_teII_thlA和pIMP_adc_ybgC_thlA，通过酶切位点BamHI和Acc65I，将基因ctfA和ctfB切离载体pIMP_adc_ctfAB_thlA。扩增在大肠杆菌中构造在一个操纵子中的atoD和atoA以及来自枯草芽孢杆菌的基因teII和来自流感嗜血杆菌的ybgC，产生酶切位点BamHI和Acc65I。
通过这样做，首先将这些片段克隆进载体pDrive(atoDA)或pUC19(teII和ybgC)中。然后，从pDrive或pUC载体再克隆这些基因，以通过酶切位点BamHI和Acc65I，切出基因盒，纯化，并连接进已经如上所述限制处理(Acc65I和BamHI)并纯化的pIMP_adc_ctfAB_thlA载体主链。
实施例2: 大肠杆菌中的丙酮合成
为了检查功能性，得到的所有质粒变体(见表1)在大肠杆菌克隆菌株XL2-blue中研究丙酮形成。以100-ml的规模，在含有氨苄西林(100 µg/ml)的TY培养基中，进行分析。从相应的预培养物接种至0.1的光密度(600 nm)以后，在37℃和150转每分进行温育。光密度以光度计监测，并在约50 h的时间段内，在指定的时间点，取样，并通过气相色谱法，测定无细胞的培养基上清液中丙酮和乙酸盐的浓度。这里表明，使用梭菌基因(thlA和adc)与来自大肠杆菌的atoDA的组合，生成了至多80 mM丙酮。使用纯的梭菌基因(thlA , ctfAB, adc)，生成了5 mM丙酮，使用梭菌基因(thlA和adc)与来自枯草芽孢杆菌的teII或来自流感嗜血杆菌的ybgC的组合，生成了1 mM丙酮。
实施例3: 产乙酸的丙酮生产
根据采用的梭菌菌株，使用了不同的培养基：
为了制备C. carboxidivorans和扬氏梭菌的培养基，称量化学试剂，溶解于水中，然后调节pH值。另外，加入氧化还原指示剂Reszurin (1 mg/l)，以能够在以后测试氧化还原电位，并从而检验氧含量。然后，在加热套中加热培养基至沸腾，并在冰浴中冷却。在该过程中，用氮气进行除气，以去除溶解的氧。然后，将培养基引入厌氧室，用无氧水调节最终的体积，装灌，并气密性密封。如果要使用除了氮气以外的气相，然后进行气体交换，其中借助于长插管，用相应的气体对培养基通气，最后施加约0.8巴的轻微超压。
对于醋酸梭菌的培养基，称量所有组分，溶解，并装灌。另外，加入氧化还原指示剂Reszurin(1 mg/l)，以能够在以后测试氧化还原电位，并从而测试氧含量。然后，通过插管，使用80%N2和20% CO2的混合物进行通气，直到达到pH 7.4。这里也要施加轻微超压。高压灭菌后，以无氧的5% Na2CO3 溶液的形式，加入无菌的Na2CO3，以使pH达到8.2。另外，在无菌条件下，加入果糖至1%终浓度。生成80% H2和20% CO2的气体环境用于自养生长。
将所有培养基在121℃和1.2巴高压灭菌15 min。对有些培养基组分单独高压灭菌，以防止组分彼此之间的化学反应。不耐热的组分溶解，无菌过滤，并在使用之前加入冷却的、高压灭菌的培养基中。
为了生产固体培养基，在高压灭菌前加入1.5% (w/v)琼脂，高压灭菌后立即在厌氧室中将它们倒入培养皿中。倾倒后，将平板干燥几天，并在4℃储存直到使用。
Figure 2010800177745100002DEST_PATH_IMAGE003
在高压灭菌后，在无菌条件下加入25 ml/l的5重量% Na2CO3 溶液，以达到8.2的pH。另外，在无菌条件下，加入果糖至1重量%的终浓度（相对于总培养基）。对于自养生长，在高压灭菌之前，生成80体积% H2和20体积% CO2的气体环境。
C. carboxidivorans的培养基- Wilkins-Chalgren培养基
Wilkins-Chalgren无氧肉汤 (OXOID CM0643) 33 g 3.3 %
NaHCO3 1 g 12 mM
水 补至1000 ml。
将pH在煮沸和无氧处理前调节至5.6，并在高压灭菌后，加入10 ml还原剂 1(参见下面)，此后pH应当是6.0。
Figure 398190DEST_PATH_IMAGE004
在煮沸和无氧处理之前，调节pH至5.5。在高压灭菌以后，加入20 ml无菌的果糖溶液(250 g/l)和还原剂1和2 (参见下面)各5 ml，此后pH应当是5.9。
还原剂1
将1.8 g NaOH溶解于200 ml水中，煮沸，通氮气下冷却。在厌氧室中，首先将4 g L-半胱氨酸-HCl、然后将4 g Na2S•9 H2O溶解于100 ml无氧NaOH中，然后高压灭菌。
还原剂 2
将1.8 g NaOH溶解于200 ml水中，煮沸，通氮气下冷却。在厌氧室中，将4 gL-半胱氨酸-HCl溶解于100 ml无氧NaOH中，然后高压灭菌。
Figure 2010800177745100002DEST_PATH_IMAGE005
首先，将氨三乙酸完全溶解于水中，用氢氧化钾将pH调至6.0，然后溶解其它组分。
然后，通过接合(Purdy等人, 2002)或转化(Zhu等人,2004)，将在大肠杆菌XL2-blue中构建的质粒导入产乙酸的梭菌中，使得重组菌株获得生产丙酮的能力。
对于接合实验，在LB培养基中，有氧培养含有要转移的质粒的大肠杆菌供体菌株CA434过夜。1-ml 等分试样在10000 × g离心1 min，在厌氧室中，小心地将细胞沉淀物悬浮在1 ml无菌的无氧的PBS缓冲液(1.5 mM KH2PO4, 4.2 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)中，以防止接合菌毛被剪切掉。再次离心细胞，并放入200μl在适当培养基中培养过夜的梭菌属培养物中。在厌氧室中，将该混合物以10-μl滴分布在干燥好的琼脂板上，并在37℃厌氧温育6 h。然后，从琼脂板洗去细胞2-3次，每次使用0.5 ml无菌无氧的PBS缓冲液。将接合混合物涂布在选择性琼脂板(克拉霉素)上，并在37℃厌氧温育。
对于转化，在30℃，在50 ml含有40 mM DL-苏氨酸的醋酸梭菌培养基中培养梭菌细胞至0.3-0.4的光密度。在厌氧室中进行下一步。在这里，收获细胞(6000转每分，10 min，室温)，用SMP缓冲液(270 mM 蔗糖, 1 mM MgCl2, 7 mM NaH2PO4)洗涤2次，最后放入500-700 µl SMP缓冲液中，并用于转化。为此，将细胞转移至电穿孔槽(4 mm)，并加入0.5-1.5 μg 质粒-DNA。温育5分钟后，在具有4 mM槽(Biozym Scientific GmbH)的Gene-Pulser(Bio-Rad Laboratories GmbH; 慕尼黑)中，在25 µF、600 Ω和2.5 kV进行电穿孔。然后，立即将细胞加入5 ml预热的培养基中。随后在37℃为进行抗性表达而温育过夜至4天，然后接种5 ml含有克拉霉素(5 µg/ml)的培养基，并在37℃温育3-5天。
为了验证转化，随后使用“peqGOLD® 质粒小量制备试剂盒II”(Peqlab, Erlangen)，进行质粒分离。根据生产商的说明书，执行所有任选的步骤，进行制备。然后，使用大肠杆菌菌株XL2-blue，进行质粒回收，随后进行限制酶切消化。
研究了得到的所有质粒变体(参见表1)在自养梭菌中的丙酮形成。以50-ml规模，在含有克拉霉素(5 µg/ml)的相应培养基中，进行分析。从相应的预培养物接种以后，在37℃进行温育。在制备培养基时，进行必要的培养基通气。为此，使用合成气或比例为1:2的CO2/H2混合物。用光度计监测光密度，并在约100-200 h的时间段内，在指定的时间点，采样，并通过气相色谱法，测定无细胞的培养基上清液中丙酮和乙酸盐的浓度。已经发现，使用梭菌基因(thlA和adc)与来自大肠杆菌的atoDA的组合，使用梭菌基因(thlA和adc)与来自枯草芽孢杆菌的teII或来自流感嗜血杆菌的ybgC的组合，生成了最多1 mM丙酮。使用纯的梭菌基因(thlA , ctfAB, adc)，生成了最多0.24 mM丙酮。
序列表
<110> Evonik Degussa
<120> 用于生产丙酮的细胞和方法
<130> 200900033
<160> 16
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
ggaaggtacc ttttatg 17
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gtaactctga attctattac ttaag 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
cacaacggtg gatccaagag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
cgcgatatgg taccaatcat 20
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
gaatttaaaa ggagggatcc aaatgaac 28
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gtttcatagt attggtacct aaacagc 27
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
ctcaggtcga cttcaagaag 20
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
cagagttatt tttaaggatc ctttctagc 29
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
caattgggat ccgataacaa tttcacacag 30
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
gagatctggt acccggttaa atgatcgga 29
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
ctctagaagg atcctgttta actttaag 28
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
attgggtacc tcattgcata ctccg 25
<210> 13
<211> 8559
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒
<400> 13
agcttggctg caggtcgact tcaagaagag gcacctcatc ttggaaagcc tgtacttgtt 60
ttaagagatg ttactgaaag accagaagca gttgaggcag gaacggtaaa attagtagga 120
actgatatta aaaagatagt agacgaagcc tataaaataa tgaaagatga agaagaatat 180
gaaaaaatga gtaaggcaat aaatccatat ggtgatggaa aggcttcaga tagaatagtt 240
gatgctatat tgtatcattt tggagtatta aaggatagac cagatgaatt ttcacctaaa 300
aagtaataca tgagcattct aaaagaattt agaatgaagt ttcttatgca caagtatttt 360
ttattacatt aatatagtta aaatataaac ttatgtattt atgctaaaac atgattttaa 420
gggggttagc atatgcataa gtttaatttt tttgttaaaa aatattaaac tttgtgtttt 480
ttttaacaaa atatattgat aaaaataata atagtgggta taattaagtt gttagagaaa 540
acgtataaat tagggataaa ctatggaact tatgaaatag attgaaatgg tttatctgtt 600
accccgtatc aaaatttagg aggttagtta gaatgaaaga agttgtaata gctagtgcag 660
taagaacagc gattggatct tatggaaagt ctcttaagga tgtaccagca gtagatttag 720
gagctacagc tataaaggaa gcagttaaaa aagcaggaat aaaaccagag gatgttaatg 780
aagtcatttt aggaaatgtt cttcaagcag gtttaggaca gaatccagca agacaggcat 840
cttttaaagc aggattacca gttgaaattc cagctatgac tattaataag gtttgtggtt 900
caggacttag aacagttagc ttagcagcac aaattataaa agcaggagat gctgacgtaa 960
taatagcagg tggtatggaa aatatgtcta gagctcctta cttagcgaat aacgctagat 1020
ggggatatag aatgggaaac gctaaatttg ttgatgaaat gatcactgac ggattgtggg 1080
atgcatttaa tgattaccac atgggaataa cagcagaaaa catagctgag agatggaaca 1140
tttcaagaga agaacaagat gagtttgctc ttgcatcaca aaaaaaagct gaagaagcta 1200
taaaatcagg tcaatttaaa gatgaaatag ttcctgtagt aattaaaggc agaaagggag 1260
aaactgtagt tgatacagat gagcacccta gatttggatc aactatagaa ggacttgcaa 1320
aattaaaacc tgccttcaaa aaagatggaa cagttacagc tggtaatgca tcaggattaa 1380
atgactgtgc agcagtactt gtaatcatga gtgcagaaaa agctaaagag cttggagtaa 1440
aaccacttgc taagatagtt tcttatggtt cagcaggagt tgacccagca ataatgggat 1500
atggaccttt ctatgcaaca aaagcagcta ttgaaaaagc aggttggaca gttgatgaat 1560
tagatttaat agaatcaaat gaagcttttg cagctcaaag tttagcagta gcaaaagatt 1620
taaaatttga tatgaataaa gtaaatgtaa atggaggagc tattgccctt ggtcatccaa 1680
ttggagcatc aggtgcaaga atactcgtta ctcttgtaca cgcaatgcaa aaaagagatg 1740
caaaaaaagg cttagcaact ttatgtatag gtggcggaca aggaacagca atattgctag 1800
aaaagtgcta gaaaggatcc aaatgaactc taaaataatt agatttgaaa atttaaggtc 1860
attctttaaa gatgggatga caattatgat tggaggtttt ttaaactgtg gcactccaac 1920
caaattaatt gattttttag ttaatttaaa tataaagaat ttaacgatta taagtaatga 1980
tacatgttat cctaatacag gtattggtaa gttaatatca aataatcaag taaaaaagct 2040
tattgcttca tatataggca gcaacccaga tactggcaaa aaacttttta ataatgaact 2100
tgaagtagag ctctctcccc aaggaactct agtggaaaga atacgtgcag gcggatctgg 2160
cttaggtggt gtactaacta aaacaggttt aggaactttg attgaaaaag gaaagaaaaa 2220
aatatctata aatggaacgg aatatttgtt agagctacct cttacagccg atgtagcatt 2280
aattaaaggt agtattgtag atgaggccgg aaacaccttc tataaaggta ctactaaaaa 2340
ctttaatccc tatatggcaa tggcagctaa aaccgtaata gttgaagctg aaaatttagt 2400
tagctgtgaa aaactagaaa aggaaaaagc aatgaccccc ggagttctta taaattatat 2460
agtaaaggag cctgcataaa atgattaatg ataaaaacct agcgaaagaa ataatagcca 2520
aaagagttgc aagagaatta aaaaatggtc aacttgtaaa cttaggtgta ggtcttccta 2580
ccatggttgc agattatata ccaaaaaatt tcaaaattac tttccaatca gaaaacggaa 2640
tagttggaat gggcgctagt cctaaaataa atgaggcaga taaagatgta gtaaatgcag 2700
gaggagacta tacaacagta cttcctgacg gcacattttt cgatagctca gtttcgtttt 2760
cactaatccg tggtggtcac gtagatgtta ctgttttagg ggctctccag gtagatgaaa 2820
agggtaatat agccaattgg attgttcctg gaaaaatgct ctctggtatg ggtggagcta 2880
tggatttagt aaatggagct aagaaagtaa taattgcaat gagacataca aataaaggtc 2940
aacctaaaat tttaaaaaaa tgtacacttc ccctcacggc aaagtctcaa gcaaatctaa 3000
ttgtaacaga acttggagta attgaggtta ttaatgatgg tttacttctc actgaaatta 3060
ataaaaacac aaccattgat gaaataaggt ctttaactgc tgcagattta ctcatatcca 3120
atgaacttag acccatggct gtttaggtac cttttatgtt aaaggatgaa gtaattaaac 3180
aaattagcac gccattaact tcgcctgcat ttcctagagg accctataaa tttcataatc 3240
gtgagtattt taacattgta tatcgtacag atatggatgc acttcgtaaa gttgtgccag 3300
agcctttaga aattgatgag cccttagtca ggtttgaaat tatggcaatg catgatacga 3360
gtggacttgg ttgttataca gaaagcggac aggctattcc cgtaagcttt aatggagtta 3420
agggagatta tcttcatatg atgtatttag ataatgagcc tgcaattgca gtaggaaggg 3480
aattaagtgc atatcctaaa aagctcgggt atccaaagct ttttgtggat tcagatactt 3540
tagtaggaac tttagactat ggaaaactta gagttgcgac agctacaatg gggtacaaac 3600
ataaagcctt agatgctaat gaagcaaagg atcaaatttg tcgccctaat tatatgttga 3660
aaataatacc caattatgat ggaagcccta gaatatgtga gcttataaat gcgaaaatca 3720
cagatgttac cgtacatgaa gcttggacag gaccaactcg actgcagtta tttgatcacg 3780
ctatggcgcc acttaatgat ttgccagtaa aagagattgt ttctagctct cacattcttg 3840
cagatataat attgcctaga gctgaagtta tatatgatta tcttaagtaa tagaattcac 3900
tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc 3960
ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc 4020
cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta 4080
cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 4140
ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 4200
gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 4260
agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat 4320
ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg 4380
gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 4440
tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 4500
ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 4560
ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 4620
gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 4680
gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 4740
acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 4800
actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 4860
ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 4920
cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 4980
gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 5040
caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 5100
aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 5160
ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 5220
tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 5280
ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 5340
ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 5400
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 5460
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 5520
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 5580
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 5640
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 5700
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 5760
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 5820
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 5880
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 5940
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 6000
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 6060
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 6120
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 6180
ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 6240
ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 6300
caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca 6360
ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc 6420
attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga 6480
gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag ctttggctaa 6540
cacacacgcc attccaacca atagttttct cggcataaag ccatgctctg acgcttaaat 6600
gcactaatgc cttaaaaaaa cattaaagtc taacacacta gacttattta cttcgtaatt 6660
aagtcgttaa accgtgtgct ctacgaccaa aagtataaaa cctttaagaa ctttcttttt 6720
tcttgtaaaa aaagaaacta gataaatctc tcatatcttt tattcaataa tcgcatcaga 6780
ttgcagtata aatttaacga tcactcatca tgttcatatt tatcagagct cgtgctataa 6840
ttatactaat tttataagga ggaaaaaata aagagggtta taatgaacga gaaaaatata 6900
aaacacagtc aaaactttat tacttcaaaa cataatatag ataaaataat gacaaatata 6960
agattaaatg aacatgataa tatctttgaa atcggctcag gaaaagggca ttttaccctt 7020
gaattagtac agaggtgtaa tttcgtaact gccattgaaa tagaccataa attatgcaaa 7080
actacagaaa ataaacttgt tgatcacgat aatttccaag ttttaaacaa ggatatattg 7140
cagtttaaat ttcctaaaaa ccaatcctat aaaatatttg gtaatatacc ttataacata 7200
agtacggata taatacgcaa aattgttttt gatagtatag ctgatgagat ttatttaatc 7260
gtggaatacg ggtttgctaa aagattatta aatacaaaac gctcattggc attattttta 7320
atggcagaag ttgatatttc tatattaagt atggttccaa gagaatattt tcatcctaaa 7380
cctaaagtga atagctcact tatcagatta aatagaaaaa aatcaagaat atcacacaaa 7440
gataaacaga agtataatta tttcgttatg aaatgggtta acaaagaata caagaaaata 7500
tttacaaaaa atcaatttaa caattcctta aaacatgcag gaattgacga tttaaacaat 7560
attagctttg aacaattctt atctcttttc aatagctata aattatttaa taagtaagtt 7620
aagggatgca taaactgcat cccttaactt gtttttcgtg tacctatttt ttgtgaatcg 7680
attatgtctt ttgcgcattc acttcttttc tatataaata tgagcgaagc gaataagcgt 7740
cggaaaagca gcaaaaagtt tcctttttgc tgttggagca tgggggttca gggggtgcag 7800
tatctgacgt caatgccgag cgaaagcgag ccgaagggta gcatttacgt tagataaccc 7860
cctgatatgc tccgacgctt tatatagaaa agaagattca actaggtaaa atcttaatat 7920
aggttgagat gataaggttt ataaggaatt tgtttgttct aatttttcac tcattttgtt 7980
ctaatttctt ttaacaaatg ttcttttttt tttagaacag ttatgatata gttagaatag 8040
tttaaaataa ggagtgagaa aaagatgaaa gaaagatatg gaacagtcta taaaggctct 8100
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ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 5280
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 5340
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 5400
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5460
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5520
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5580
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5640
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5700
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5760
ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5820
aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 5880
ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5940
acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctttg gctaacacac acgccattcc 6000
aaccaatagt tttctcggca taaagccatg ctctgacgct taaatgcact aatgccttaa 6060
aaaaacatta aagtctaaca cactagactt atttacttcg taattaagtc gttaaaccgt 6120
gtgctctacg accaaaagta taaaaccttt aagaactttc ttttttcttg taaaaaaaga 6180
aactagataa atctctcata tcttttattc aataatcgca tcagattgca gtataaattt 6240
aacgatcact catcatgttc atatttatca gagctcgtgc tataattata ctaattttat 6300
aaggaggaaa aaataaagag ggttataatg aacgagaaaa atataaaaca cagtcaaaac 6360
tttattactt caaaacataa tatagataaa ataatgacaa atataagatt aaatgaacat 6420
gataatatct ttgaaatcgg ctcaggaaaa gggcatttta cccttgaatt agtacagagg 6480
tgtaatttcg taactgccat tgaaatagac cataaattat gcaaaactac agaaaataaa 6540
cttgttgatc acgataattt ccaagtttta aacaaggata tattgcagtt taaatttcct 6600
aaaaaccaat cctataaaat atttggtaat ataccttata acataagtac ggatataata 6660
cgcaaaattg tttttgatag tatagctgat gagatttatt taatcgtgga atacgggttt 6720
gctaaaagat tattaaatac aaaacgctca ttggcattat ttttaatggc agaagttgat 6780
atttctatat taagtatggt tccaagagaa tattttcatc ctaaacctaa agtgaatagc 6840
tcacttatca gattaaatag aaaaaaatca agaatatcac acaaagataa acagaagtat 6900
aattatttcg ttatgaaatg ggttaacaaa gaatacaaga aaatatttac aaaaaatcaa 6960
tttaacaatt ccttaaaaca tgcaggaatt gacgatttaa acaatattag ctttgaacaa 7020
ttcttatctc ttttcaatag ctataaatta tttaataagt aagttaaggg atgcataaac 7080
tgcatccctt aacttgtttt tcgtgtacct attttttgtg aatcgattat gtcttttgcg 7140
cattcacttc ttttctatat aaatatgagc gaagcgaata agcgtcggaa aagcagcaaa 7200
aagtttcctt tttgctgttg gagcatgggg gttcaggggg tgcagtatct gacgtcaatg 7260
ccgagcgaaa gcgagccgaa gggtagcatt tacgttagat aaccccctga tatgctccga 7320
cgctttatat agaaaagaag attcaactag gtaaaatctt aatataggtt gagatgataa 7380
ggtttataag gaatttgttt gttctaattt ttcactcatt ttgttctaat ttcttttaac 7440
aaatgttctt ttttttttag aacagttatg atatagttag aatagtttaa aataaggagt 7500
gagaaaaaga tgaaagaaag atatggaaca gtctataaag gctctcagag gctcatagac 7560
gaagaaagtg gagaagtcat agaggtagac aagttatacc gtaaacaaac gtctggtaac 7620
ttcgtaaagg catatatagt gcaattaata agtatgttag atatgattgg cggaaaaaaa 7680
cttaaaatcg ttaactatat cctagataat gtccacttaa gtaacaatac aatgatagct 7740
acaacaagag aaatagcaaa agctacagga acaagtctac aaacagtaat aacaacactt 7800
aaaatcttag aagaaggaaa tattataaaa agaaaaactg gagtattaat gttaaaccct 7860
gaactactaa tgagaggcga cgaccaaaaa caaaaatacc tcttactcga atttgggaac 7920
tttgagcaag aggcaaatga aatagattga cctcccaata acaccacgta gttattggga 7980
ggtcaatcta tgaaaatgcg atta 8004
<210> 16
<211> 7693
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒
<400> 16
agcttggctg caggtcgact tcaagaagag gcacctcatc ttggaaagcc tgtacttgtt 60
ttaagagatg ttactgaaag accagaagca gttgaggcag gaacggtaaa attagtagga 120
actgatatta aaaagatagt agacgaagcc tataaaataa tgaaagatga agaagaatat 180
gaaaaaatga gtaaggcaat aaatccatat ggtgatggaa aggcttcaga tagaatagtt 240
gatgctatat tgtatcattt tggagtatta aaggatagac cagatgaatt ttcacctaaa 300
aagtaataca tgagcattct aaaagaattt agaatgaagt ttcttatgca caagtatttt 360
ttattacatt aatatagtta aaatataaac ttatgtattt atgctaaaac atgattttaa 420
gggggttagc atatgcataa gtttaatttt tttgttaaaa aatattaaac tttgtgtttt 480
ttttaacaaa atatattgat aaaaataata atagtgggta taattaagtt gttagagaaa 540
acgtataaat tagggataaa ctatggaact tatgaaatag attgaaatgg tttatctgtt 600
accccgtatc aaaatttagg aggttagtta gaatgaaaga agttgtaata gctagtgcag 660
taagaacagc gattggatct tatggaaagt ctcttaagga tgtaccagca gtagatttag 720
gagctacagc tataaaggaa gcagttaaaa aagcaggaat aaaaccagag gatgttaatg 780
aagtcatttt aggaaatgtt cttcaagcag gtttaggaca gaatccagca agacaggcat 840
cttttaaagc aggattacca gttgaaattc cagctatgac tattaataag gtttgtggtt 900
caggacttag aacagttagc ttagcagcac aaattataaa agcaggagat gctgacgtaa 960
taatagcagg tggtatggaa aatatgtcta gagctcctta cttagcgaat aacgctagat 1020
ggggatatag aatgggaaac gctaaatttg ttgatgaaat gatcactgac ggattgtggg 1080
atgcatttaa tgattaccac atgggaataa cagcagaaaa catagctgag agatggaaca 1140
tttcaagaga agaacaagat gagtttgctc ttgcatcaca aaaaaaagct gaagaagcta 1200
taaaatcagg tcaatttaaa gatgaaatag ttcctgtagt aattaaaggc agaaagggag 1260
aaactgtagt tgatacagat gagcacccta gatttggatc aactatagaa ggacttgcaa 1320
aattaaaacc tgccttcaaa aaagatggaa cagttacagc tggtaatgca tcaggattaa 1380
atgactgtgc agcagtactt gtaatcatga gtgcagaaaa agctaaagag cttggagtaa 1440
aaccacttgc taagatagtt tcttatggtt cagcaggagt tgacccagca ataatgggat 1500
atggaccttt ctatgcaaca aaagcagcta ttgaaaaagc aggttggaca gttgatgaat 1560
tagatttaat agaatcaaat gaagcttttg cagctcaaag tttagcagta gcaaaagatt 1620
taaaatttga tatgaataaa gtaaatgtaa atggaggagc tattgccctt ggtcatccaa 1680
ttggagcatc aggtgcaaga atactcgtta ctcttgtaca cgcaatgcaa aaaagagatg 1740
caaaaaaagg cttagcaact ttatgtatag gtggcggaca aggaacagca atattgctag 1800
aaaagtgcta gaaaggatcc tgtttaactt taagaaggag atatacatat gttggataat 1860
ggcttttctt ttcctgttcg tgtgtattat gaagatactg atgcaggtgg cgtagtgtat 1920
cacgctcgct atttgcattt ttttgaacga gcaagaacag aatatttgcg tacattaaat 1980
tttacgcaac aaaccttact agaggaacaa caactcgcat ttgttgtcaa aacgctcgcc 2040
attgattatt gcgtggcagc aaaattggat gatttactta tggtggaaac agaggtttca 2100
gaagtaaaag gggctacaat cctttttgaa cagagactga tgcgcaacac cctgatgtta 2160
tcaaaggcta ctgttaaggt agcctgtgtt gatctaggca agatgaaacc agtggcgttt 2220
cccaaagaag ttaaagcggc gtttcatcac ttaaaataat ttttcggagt atgcaatgag 2280
gtacctttta tgttaaagga tgaagtaatt aaacaaatta gcacgccatt aacttcgcct 2340
gcatttccta gaggacccta taaatttcat aatcgtgagt attttaacat tgtatatcgt 2400
acagatatgg atgcacttcg taaagttgtg ccagagcctt tagaaattga tgagccctta 2460
gtcaggtttg aaattatggc aatgcatgat acgagtggac ttggttgtta tacagaaagc 2520
ggacaggcta ttcccgtaag ctttaatgga gttaagggag attatcttca tatgatgtat 2580
ttagataatg agcctgcaat tgcagtagga agggaattaa gtgcatatcc taaaaagctc 2640
gggtatccaa agctttttgt ggattcagat actttagtag gaactttaga ctatggaaaa 2700
cttagagttg cgacagctac aatggggtac aaacataaag ccttagatgc taatgaagca 2760
aaggatcaaa tttgtcgccc taattatatg ttgaaaataa tacccaatta tgatggaagc 2820
cctagaatat gtgagcttat aaatgcgaaa atcacagatg ttaccgtaca tgaagcttgg 2880
acaggaccaa ctcgactgca gttatttgat cacgctatgg cgccacttaa tgatttgcca 2940
gtaaaagaga ttgtttctag ctctcacatt cttgcagata taatattgcc tagagctgaa 3000
gttatatatg attatcttaa gtaatagaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 3060
tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 3120
tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 3180
ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 3240
atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac 3300
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 3360
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 3420
cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata 3480
atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 3540
ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 3600
cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt 3660
cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta 3720
aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc 3780
ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa 3840
gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc 3900
cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt 3960
acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact 4020
gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac 4080
aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata 4140
ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta 4200
ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg 4260
gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat 4320
aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt 4380
aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga 4440
aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa 4500
gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 4560
gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac 4620
tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc 4680
gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 4740
caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 4800
actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 4860
acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 4920
cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 4980
gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta 5040
cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 5100
gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 5160
tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc 5220
tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg 5280
gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat 5340
aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc 5400
agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg 5460
cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt 5520
gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt 5580
atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac 5640
agctatgacc atgattacgc caagctttgg ctaacacaca cgccattcca accaatagtt 5700
ttctcggcat aaagccatgc tctgacgctt aaatgcacta atgccttaaa aaaacattaa 5760
agtctaacac actagactta tttacttcgt aattaagtcg ttaaaccgtg tgctctacga 5820
ccaaaagtat aaaaccttta agaactttct tttttcttgt aaaaaaagaa actagataaa 5880
tctctcatat cttttattca ataatcgcat cagattgcag tataaattta acgatcactc 5940
atcatgttca tatttatcag agctcgtgct ataattatac taattttata aggaggaaaa 6000
aataaagagg gttataatga acgagaaaaa tataaaacac agtcaaaact ttattacttc 6060
aaaacataat atagataaaa taatgacaaa tataagatta aatgaacatg ataatatctt 6120
tgaaatcggc tcaggaaaag ggcattttac ccttgaatta gtacagaggt gtaatttcgt 6180
aactgccatt gaaatagacc ataaattatg caaaactaca gaaaataaac ttgttgatca 6240
cgataatttc caagttttaa acaaggatat attgcagttt aaatttccta aaaaccaatc 6300
ctataaaata tttggtaata taccttataa cataagtacg gatataatac gcaaaattgt 6360
ttttgatagt atagctgatg agatttattt aatcgtggaa tacgggtttg ctaaaagatt 6420
attaaataca aaacgctcat tggcattatt tttaatggca gaagttgata tttctatatt 6480
aagtatggtt ccaagagaat attttcatcc taaacctaaa gtgaatagct cacttatcag 6540
attaaataga aaaaaatcaa gaatatcaca caaagataaa cagaagtata attatttcgt 6600
tatgaaatgg gttaacaaag aatacaagaa aatatttaca aaaaatcaat ttaacaattc 6660
cttaaaacat gcaggaattg acgatttaaa caatattagc tttgaacaat tcttatctct 6720
tttcaatagc tataaattat ttaataagta agttaaggga tgcataaact gcatccctta 6780
acttgttttt cgtgtaccta ttttttgtga atcgattatg tcttttgcgc attcacttct 6840
tttctatata aatatgagcg aagcgaataa gcgtcggaaa agcagcaaaa agtttccttt 6900
ttgctgttgg agcatggggg ttcagggggt gcagtatctg acgtcaatgc cgagcgaaag 6960
cgagccgaag ggtagcattt acgttagata accccctgat atgctccgac gctttatata 7020
gaaaagaaga ttcaactagg taaaatctta atataggttg agatgataag gtttataagg 7080
aatttgtttg ttctaatttt tcactcattt tgttctaatt tcttttaaca aatgttcttt 7140
tttttttaga acagttatga tatagttaga atagtttaaa ataaggagtg agaaaaagat 7200
gaaagaaaga tatggaacag tctataaagg ctctcagagg ctcatagacg aagaaagtgg 7260
agaagtcata gaggtagaca agttataccg taaacaaacg tctggtaact tcgtaaaggc 7320
atatatagtg caattaataa gtatgttaga tatgattggc ggaaaaaaac ttaaaatcgt 7380
taactatatc ctagataatg tccacttaag taacaataca atgatagcta caacaagaga 7440
aatagcaaaa gctacaggaa caagtctaca aacagtaata acaacactta aaatcttaga 7500
agaaggaaat attataaaaa gaaaaactgg agtattaatg ttaaaccctg aactactaat 7560
gagaggcgac gaccaaaaac aaaaatacct cttactcgaa tttgggaact ttgagcaaga 7620
ggcaaatgaa atagattgac ctcccaataa caccacgtag ttattgggag gtcaatctat 7680
gaaaatgcga tta 7693

Claims (8)

1.产乙酸细胞，其能够形成丙酮。
2.权利要求1的产乙酸细胞，其特征在于，它能够从至少一种选自二氧化碳和一氧化碳的碳源形成丙酮。
3.权利要求1或2的产乙酸细胞，其特征在于，与它的野生型相比，以如下方式对其进行遗传地修饰：使得它能够形成比它的野生型更多的丙酮。
4.权利要求1-3中至少一项的产乙酸细胞，其特征在于，与它的野生型相比，其具有增加的至少一种下述酶的活性：
酶E1，其催化乙酰辅酶A向乙酰乙酰辅酶A的反应；
酶E2，其催化乙酰乙酰辅酶A向乙酰乙酸盐的反应；
酶E3，其催化乙酰乙酸盐向丙酮的反应。
5.权利要求4的产乙酸细胞，其特征在于，
所述酶E1是乙酰辅酶A-C-乙酰基转移酶(EC 2.3.1.9)；
所述酶E2是丁酸乙酰乙酸辅酶A-转移酶(EC 2.8.3.9)或酰基-CoA-水解酶(EC 3.1.2.20)；
所述酶E3是乙酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.4)。
6.权利要求1-5中至少一项的产乙酸细胞，其特征在于，它是选自下述的微生物：凯伍产醋菌、伍氏醋酸杆菌、潮湿厌氧醋菌、醋酸梭菌、食甲基丁酸杆菌、丙酮丁醇梭菌、热醋梭菌、粘液真杆菌、产生消化链球菌、扬氏梭菌和Clostridium carboxidivorans 。
7.一种生产丙酮的方法，所述方法包括下述工艺步骤：
A) 使权利要求1-6之一的细胞接触营养培养基，所述营养培养基包含至少一种选自二氧化碳和一氧化碳的碳源；
B) 在能够使所述细胞形成丙酮的条件下，培养所述细胞；
C) 任选地，分离所形成的丙酮。
8.能通过权利要求7的方法得到的丙酮。
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