CN113980991B - 大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大肠杆菌‑芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用，该穿梭质粒载体包括pTC、pBE、pTN和pTK中的任意一种，序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示。本发明从PUC19出发获得大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性的基因片段，从pMarA出发获得芽孢杆菌温敏复制起点和卡那霉素抗性和红霉素抗性的基因片段，从pBEST502和pSG1164中分别获得新霉素抗性基因和氯霉素抗性基因，经过酶切和酶链接构建了大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体。本发明中的四个质粒载体可在不同芽孢杆菌中穿梭、共存以及消除，避免质粒发生漂移对环境产生污染，可潜在应用于外源蛋白的表达，实现对芽孢杆菌基因组DNA的编辑。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性菌是一种极具潜力的外源蛋白表达宿主菌，利用表面或噬菌体外壳蛋白的膜锚定结构域序列构建基因融合，将重组蛋白靶向到噬菌体或细胞表面。不论是用来高效表达外源蛋白还是作为口服疫苗或全细胞酶的载体，都展现出其他细菌无可比拟的优势，是研究较多、应用广泛的生物安全菌。随着对枯草芽孢杆菌研究的深入，外源蛋白在穿梭质粒载体构建系统中的表达已经引起越来越多学者的兴趣。枯草芽孢杆菌作为表达系统，优点在于可以高效表达具有生物学活性的异源蛋白，并将其分泌到培养基中，从而有利于产物的纯化回收。
质粒是外源蛋白异源表达的必须工具，目前，可用于外源蛋白在B.subtilis 中表达的质粒虽然不少，但含有不同的抗性标记基因的穿梭质粒载体，很少有人报道。
穿梭质粒载体具有两类不同生物来源的复制起点和遗传标记基因，它可以克服两类生物在遗传上的障碍，并在这两类生物中自主复制和表达相应的遗传标记基因，穿梭质粒载体具备的特殊性能，一直是基因工程领域研究的热点。现有技术中相继构建成了大肠杆菌--金黄色葡萄珠菌穿梭质粒载体pHV33和大肠杆菌-- 芽抱杆菌穿梭质粒载体pJKK502以及革兰氏阴性菌--革兰氏阳性菌穿梭表达质粒载体pREP9等,刘成君构建了大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4。虽然目前已经构建出很多穿梭质粒载体，但存在的问题也是参差不齐，有的只含有单一抗生素标记位点，有的在大肠杆菌中转化效率高，但在芽孢杆菌中转化效率低。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体，包括一系列可在不同芽孢杆菌中共存，穿梭及进行消除的穿梭质粒载体，可解决现有多数穿梭质粒载体宿主范围窄，不容易消除等问题。
本发明还提供所述大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体的构建方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述的一种大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体，包括大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体pTC、pBE、pTN和pTK中的任意一种，其碱基序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。
其中，所述pTC穿梭质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因AmpR和用于芽孢杆菌筛选的氯霉素抗性基因ClR和人工合成多克隆位点MCS。
其中，所述pBE穿梭质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因AmpR和用于芽孢杆菌筛选的红霉素抗性基因ErmR和人工合成多克隆位点MCS。
其中，所述pTN穿梭质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因AmpR和用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因NeoR和人工合成多克隆位点MCS。
其中，所述pTK穿梭质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因AmpR和用于芽孢杆菌筛选的卡那霉素抗性基因KaR和人工合成多克隆位点MCS。
本发明所述的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体的构建方法，包括以下步骤：从质粒PUC19中获得大肠杆菌复制起点ori和用于大肠杆菌筛选的氨苄青霉素抗性基因AmpR，从质粒pMarA中获得芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、红霉素抗性基因ErmR及卡那霉素抗性基因KaR，从质粒载体pBEST502(ECE48)和质粒载体pSG1164(ECE155)中分别获得新霉素抗性基因NeoR和氯霉素抗性基因ClR，经过酶切和酶链接构建了系列大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体pTC、pBE、pTN 和pTK。
作为优选，本发明设计了带有多克隆位点的引物从出发质粒pUC19中扩增到大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的片段，设计了带有多克隆位点的引物从出发质粒pSG1164(ECE155)中扩增到氯霉素抗性基因 (ClR)的片段，设计引物从出发质粒pMarA中扩增到带有芽孢杆菌温敏复制起点(rep-ts)的片段，经过酶切和酶链接构建了大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体 pTC，如SEQ ID NO.1所示序列。
作为优选，本发明设计了带有多克隆位点的引物从出发质粒pUC19中扩增到大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的片段，设计了带有多克隆位点的引物从出发质粒pMarA扩增到带有芽孢杆菌温敏复制起点 (rep-ts)和红霉素抗性基因(ErmR)的片段，经过酶切和酶链接构建了大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体pBE，如SEQ ID NO.2所示序列。
作为优选，本发明设计了带有多克隆位点的引物从出发质粒pUC19中扩增到大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的片段，设计了带有多克隆位点的引物从pBEST502(ECE48)中扩增到新霉素抗性基因(NeoR)的片段,设计引物从出发质粒pMarA中扩增到带有芽孢杆菌温敏复制起点(rep-ts) 的片段，经过酶切和酶链接构建了大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体pTN，如SEQ ID NO.3所示序列。
本发明设计了带有多克隆位点的引物从出发质粒pUC19中扩增到大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的片段，设计了带有多克隆位点的引物从出发质粒pMarA扩增到带有芽孢杆菌温敏复制起点(rep-ts)和卡那霉素抗性基因(KaR)的片段，经过酶切和酶链接构建了大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体pTK，如SEQ ID NO.4所示序列。
本发明所述的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体在芽孢杆菌中穿梭、共存以及进行消除中的应用。
本发明所述的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体在外源蛋白的表达，实现对芽孢杆菌基因组DNA的编辑中的应用。
本发明中的设计的穿梭质粒载体含有不同的抗性标记基因，是一种整合表达载体，目前很少有有关整合表达载体的文献报道。一般的穿梭质粒载体在菌落中不可消除，本发明所构建的穿梭质粒载体含有不同的转录复制起点，可识别热敏复制起点进行质粒消除。同时，本发明穿梭质粒载体的四种抗性基因可协同在一起。同时本发明设计了大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体的构建方法，实现了穿梭质粒载体在不同芽孢杆菌中穿梭，共存和消除的目的，并可潜在应用于外源蛋白的表达及基因编辑方面的研究。
本发明中的所构建的穿梭质粒载体不仅含有可以在大肠杆菌识别的氨苄青霉素抗性基因，还设计了在芽孢杆菌中识别的红霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素抗性基因，并且带有多克隆位点，可为后续的基因编辑作基础。本发明设计的全新的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体在大肠杆菌和芽孢杆菌中都有着较好的转化效率，重点是所构建的质粒能够在不同芽孢杆菌中穿梭，并且解决现有多数穿梭质粒载体宿主范围窄，不容易消除等问题。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明构建的四种全新序列的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体，其质粒载体的重要优势在于可在不同芽孢杆菌中穿梭，包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，说明所构建的质粒载体可在不同芽孢杆菌中繁殖，宿主范围广。另外，构建的四种穿梭质粒载体可在同一个芽孢杆菌菌株中共存，说明四个载体可以在同一种芽孢杆菌中共同使用，协同作用，为后续不同外源功能蛋白在同一芽孢杆菌菌株共表达奠定基础；同时本发明构建的穿梭质粒载体具有热不稳定性，当质粒执行完功能后，采用高温可在芽孢杆菌中进行消除，这样遗传修饰的基因芽孢杆菌将不再含有外源质粒，可防止质粒携带的抗性基因飘移，对环境友好。此外，本发明构建的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体的方法简单高效。
附图说明
图1为A.穿梭质粒PBE的构建过程；B.M、DNA 5000bp Marker,1、PUC19 质粒中扩增到氨苄青霉素抗性基因+大肠杆菌复制起点基因片段(2871bp)，2、 PmarA质粒中扩增到枯草芽孢杆菌热敏复制起点+红霉素抗性基因片段 (2665bp)；C.M、DNA 5000bp Marker,1、2、穿梭质粒载体PBE(5536bp)；
图2为A.穿梭质粒载体PTK的构建过程；B.M、DNA 2000bp Marker，1、 PmarA质粒中扩增到枯草芽孢杆菌热敏复制起点基因片段(1439bp)，2、PmarA 质粒中扩增到卡那霉素抗性基因片段(1294bp)；C.M、DNA 5000bp Marker， 1、2、PUC19质粒中扩增到氨苄青霉素抗性基因+大肠杆菌复制起点基因片段 (2665bp)；D.M、DNA 5000bp Marker,1、2、穿梭质粒载体PTK(5398bp)；
图3为A.穿梭质粒载体PTN的构建过程；B.M、DNA 2000bp Marker，1、 PmarA质粒中扩增到枯草芽孢杆菌热敏复制起点基因片段(1439bp)，2、 pBEST502(ECE48)质粒中扩增到新霉素抗性基因片段(1319bp)；C.M、DNA 5000bp Marker，1、2、PUC19质粒中扩增到氨苄青霉素抗性基因+大肠杆菌复制起点基因片段(2665bp)；D.M、DNA 5000bp Marker,1、2、穿梭质粒载体PTN(5423bp)；
图4为A.穿梭质粒载体PTC的构建过程；B.M、DNA 2000bp Marker，1、 2、PUC19质粒中扩增到氨苄青霉素抗性基因+大肠杆菌复制起点基因片段 (2665bp)，3、PmarA质粒中扩增到枯草芽孢杆菌热敏复制起点基因片段 (1433bp)，4、pSG1164(ECE155)质粒中扩增到氯霉素抗性基因片段(1535bp)； C.M、DNA 10000bp Marker,1、穿梭质粒载体PTC(5633bp)；
图5中左图为枯草芽孢杆菌转化质粒PBE长出平板，右图为枯草芽孢杆菌转化质粒PBE消除平板；
图6中左图为解淀粉芽孢杆菌转化质粒PTC长出平板，右图为解淀粉芽孢杆菌CPLK1314转化质粒PTC消除平板；
图7中左图为多粘芽孢杆菌转化质粒PTK长出平板，右图为多粘芽孢杆菌 BCLL转化质粒PTK消除平板；
图8中左图为地衣芽孢杆菌转化质粒PTN长出平板，右图为地衣芽孢杆菌 CPL618转化质粒PTN消除平板消除效果；
图9为同时含有四种所构建的质粒载体的枯草芽孢杆菌。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
本发明中的抗性基因和人工合成多克隆位点均是现有已知基因。
本发明中使用的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均为常规的野生型菌株由淮阴工学院提供，均由常规方法制备成芽孢杆菌感受态细胞。
芽孢杆菌感受态细胞制备方法
以枯草芽孢杆菌为例：具体步骤；将低温保存于甘油中的枯草芽抱杆菌 JCL16划线接种于LB固体培养基，37℃培养12h；挑单菌落接种于新鲜、预热的SPC肉汤培养基中(20mL)，调整菌体浓度，使菌体OD600值约为0.5；恒温水浴振荡培养(37℃，180r/min)，每间隔30min测定一次OD值，取对数生长期的菌液2mL接种于200mL预热的SpⅡ培养基中，在恒温水浴振荡器中继续培养(37℃，180r/min)90min，8000r离心5min收集菌体沉淀；取1.8mL上清液轻轻重悬菌体沉淀，此时的枯草芽抱杆菌己呈感受态状态可直接用于转化，100 μL小份分装，-20℃保存。其余三种芽孢杆菌感受态细胞制备方法相同。
本发明所用基础载体质粒PUC19、质粒pMarA、质粒载体 pBEST502(ECE48)、质粒载体pSG1164(ECE155)均购自美国芽孢杆菌遗传资源保藏中心(BGSC)。
实施例1
PBE穿梭质粒载体的构建
以质粒PUC19为模板，设计带有多克隆位点的大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素(AmpR)基因片段的引物pBE19F和pBE19R；以质粒pMarA为模板，设计带有多克隆位点的枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)和红霉素(ErmR) 抗性基因片段的引物pBEMF和pBEMR。分别以pBE19F和pBE19R，pBEMF 和pBEMR这两对引物进行PCR扩增出所需目的片段，经凝胶电泳检测大小正确，用胶回收试剂盒获得纯化的目的片段，将目的片段分别进行EcoRⅠ/KpnⅠ双酶切，将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，参见图1所示，并送生物公司测序，序列如SEQ ID NO.2所示。
所用引物序列为：
pBE19F：TTTGGTACCACTGGCCGTCGTTTTACAAC
pBE19R:TTTGAATTCTCTAGACCATGGGGATCCCCGCGGGCATGCAAGC TTGGCGTAAT
pBEMF：
TTTGAATTCACTAGTGGGCCCAGATCTCTCGAGGTCCAGAAGGTCGAT AGAAA
pBEMR:TTTGGTACCCATCGCTTTATGTTCTCGTTC
实施例2
pTK穿梭质粒载体的构建
以质粒载体pMarA为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的卡那霉素(KanaR) 抗性基因片段的引物pTKKF和pTKKR，扩增出卡那霉素(KanaR)抗性基因通过酶切连接(EcorRⅠ/SmaⅠ)插入到质粒PUC19多克隆位点；以质粒载体pMarA 为模板，设计枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因片段的引物pTKMF和 pTKMR，扩增出枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因通过酶切连接 (SmaⅠ/PstⅠ)上一步的重组PUC19中；以质粒PUC19为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素(AmpR)抗性基因的引物pTK19F和pTK19R，将pcr扩增所得到的目的产物与前两步所得到的重组质粒载体分别EcorRⅠ/KpnⅠ双酶切，将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，参见图2所示，并送生物公司测序，序列如SEQ ID NO.4所示。
所用引物序列为：
pTKKF:
TTTGAATTCACTAGTGGGCCCAGATCTCTCGAGGATAAACCCAGCGAA CCATTT
pTKKR:TTTCCCGGGATCGATACAAATTCCTCGTAG
pTKMF:TTTCCCGGGGTCCAGAAGGTCGATAGAAA
pTKMR:TTTCTGCAGGGTACCGTTAAGGGATGCATAAACTG
pTK19F:TTTGGTACCACTGGCCGTCGTTTTACAAC
pTK19R:TTTGAATTCTCTAGACCATGGGGATCCCCGCGGGCATGCAAG CTTGGCGTAAT
实施例3
pTN穿梭质粒载体的构建
以质粒载体pBEST502(ECE48)为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的新霉素(NeoR)抗性基因片段的引物pTNNF和pTNNR，扩增出新霉素(NeoR) 抗性基因通过酶切连接(EcoRⅠ/PstⅠ)插入到质粒PUC19多克隆位点；以质粒载体pMarA为模板，设计枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因片段的引物pTNMF和pTNMR，扩增出枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因通过酶切连接(PstⅠ/HindⅢ)插入到上一步的重组PUC19中；以质粒PUC19为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素(AmpR) 抗性基因的引物pTN19F和pTN19R，将pcr扩增所得到的目的产物与前两步所得到的重组质粒载体分别EcorRⅠ/KpnⅠ双酶切，将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，参见图3所示，并送生物公司测序，序列如SEQ ID NO.3所示。所用引物序列为：
pTNNF:
TTTGAATTCACTAGTGCTAGCAGATCTCTCGAGGAGATCAGGGAATG AGTTTAT
pTNNR:TTTCTGCAGGATAATTACTAATACTAGGAGAA
pTNMF:TTTCTGCAGGTCCAGAAGGTCGATAGAAA
pTNMR:TTTAAGCTTGGTACCGTTAAGGGATGCATAAACTG
pTN19F:TTTGGTACCACTGGCCGTCGTTTTACAAC
pTN19R:TTTGAATTCTCTAGACCATGGGGATCCCCGCGGGCATGCAAG CTTGGCGTAAT
实施例4
pTC穿梭质粒载体的构建
以质粒载体pSG1164(ECE155)为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的氯霉素(ClR)抗性基因片段的引物pTCCF和pTCCR，扩增出氯霉素(ClR)抗性基因通过酶切链接(EcoRⅠ/SmaⅠ)到质粒PUC19多克隆位点；以质粒载体 pMarA为模板，设计枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因片段的引物pTCMF 和pTCMR，扩增出枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)基因通过酶切连接(Sma Ⅰ/PstⅠ)插入上一步的重组PUC19中；以质粒PUC19为模板，设计带有多克隆位点(MCS)的大肠杆菌复制起点(ori)和氨苄青霉素(AmpR)抗性基因的引物pTC19F和pTC19R，将pcr扩增所得到的目的产物与前两步所得到的重组质粒载体分别EcorRⅠ/KpnⅠ双酶切，将两段酶切产物与T4连接酶混合，16℃恒温过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，然后涂布于含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养，筛选重组子，经酶切初步验证正确，参见图4所示，并送生物公司测序，序列如SEQ ID NO.1所示。
所用引物序列为：
pTCCF：
TTTGAATTCACTAGTGGGCCCAGATCTCTCGAGTTAAGCCAGCCCCGA CAC
pTCCR:TTTCCCGGGTAAATATTTCTTGTGATAAAGTT
pTCMF:TTTCCCGGGGTCCAGAAGGTCGATAGAAA
pTCMR：TTTCTGCAGGGTACCGTTAAGGGATGCAT AAACTG
pTC19F：TTTGGTACCACTGGCCGTCGTTTTACAAC
pTC19R： TTTGAATTCTCTAGAGCTAGCGGATCCCCGCGGGCATGCAAGCTTGGCGT AAT 实施例5
四个穿梭质粒载体可在不同芽孢杆菌中进行穿梭
对于实施例1-4所构建的穿梭质粒载体进行表达能力验证，将验证正确的穿梭质粒载体转化至大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素(AmpR)的LB平板上，37℃恒温培养12h，挑取单菌落接种于5ml含有 100μg/mL氨苄青霉素(AmpR)LB液体培养基中，37℃恒温过夜培养，提取质粒；将质粒再转入不同芽孢杆菌感受态细胞(包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌)中，分别涂布于含有质粒所携带的抗性平板上(例如pBE质粒载体，转入芽孢杆菌感受态细胞后涂布于含10μg/mL红霉素(ErmR)LB抗性平板上，pTK涂布含卡那霉素10μg/mL LB抗性平板上，pTN 涂布含新霉素20μg/mL LB抗性平板上，pTC涂布含氯霉素25μg/mL LB抗性平板上)，37℃恒温培养可观察到抗性平板中可长出含有质粒载体的转化菌株，说明四种质粒均可在不同芽孢杆菌中穿梭生长，如图5左图所示，枯草芽孢杆菌转化质粒PBE长出平板，其余三种质粒在枯草芽孢杆菌中生长情况均与图5 左图类似。图6左图为解淀粉芽孢杆菌转化质粒PTC长出平板，其余三种质粒在解淀粉芽孢杆菌中生长情况均与图6左图类似。图7左图为多粘芽孢杆菌转化质粒PTK长出平板，其余三种质粒在多粘芽孢杆菌中生长情况均与图7左图类似。图8中左图为地衣芽孢杆菌转化质粒PTN长出平板，其余三种质粒在地衣芽孢杆菌中生长情况均与图8左图类似。
实施例6
四个穿梭质粒载体可在不同芽孢杆菌中进行消除
此系列穿梭质粒载体可在不同芽孢杆菌中进行消除(热消除法)，取实施例 5中转化的质粒单菌落(四种质粒载体的不同芽孢杆菌转化子)接种到5mL含有质粒本身所带的抗生素(红霉素10μg/mL、氯霉素25μg/mL、新霉素20μg/mL、卡那霉素10μg/mL)的LB液体培养基中，37℃过夜培养12h，将培养液再次转接入含抗生素(红霉素10μg/mL、氯霉素25μg/mL、新霉素20μg/mL、卡那霉素10μg/mL)的LB液体培养液中，30℃培养至OD值达到0.5-0.6，取OD值在 0.5-0.6之间的培养物100μL分别加入到含一种抗生素(红霉素10μg/mL、氯霉素25μg/mL、新霉素20μg/mL、卡那霉素10μg/mL)的5mL的LB培养基中，提高培养温度至37℃，200rpm/min振荡培养12h，取转化后的培养物涂布于、加了抗生素(红霉素10μg/mL、氯霉素25μg/mL、新霉素20μg/mL、卡那霉素 10μg/mL)的LB平板(消除组)50℃静置，12h后观察平板质粒生长情况，同时设置对照组以上述相同的条件在37℃静置，12h后察平板质粒生长情况，发现在50℃四种质粒载体转化的不同芽孢杆菌几乎无法生长，而37℃培养的生长较好，说明本发明的质粒载体采用高温可在芽孢杆菌中进行消除，消除率可以达到 90％以上。图5枯草芽孢杆菌消除效果；图6为解淀粉芽孢杆菌消除效果；图7 为多粘芽孢杆菌消除效果；图8为地衣芽孢杆菌消除效果。从附图5-8的右图中可以清楚的看到在不同芽孢杆菌中质粒经过高温消除得到很好的消除效果，其余三种质粒在各个芽孢杆菌中消除情况均与图5-8右图类似。此外，如图5-8左图的菌株平板直接在50℃静置，12h后观察平板菌落生长情况，菌落也几乎全部消失。
实施例7
四种穿梭质粒载体可在不同芽孢杆菌中共存
实施例1-4构建的四种穿梭质粒含有不同的抗性基因，可在不同的芽孢杆菌中共同生长。例如，将实施例1-4制备的四种穿梭质粒载体分别依次转入枯草芽孢杆菌中，可得到同时含有四种穿梭质粒载体的枯草芽孢杆菌，先将质粒载体 PBE转入枯草芽孢杆菌感受态细胞，转化出含有PBE质粒载体的枯草芽孢杆菌，再将含有PBE的枯草芽孢杆菌制成感受态细胞，继续将质粒载体PTC转入含有 PBE质粒载体的枯草芽孢杆菌感受态细胞中，得到了同时含有PBE和PTC两种质粒载体的枯草芽孢杆菌，同样的方法，依次将剩余两种质粒转入枯草芽孢杆菌中，得到同时含有四种所构建的质粒载体的枯草芽孢杆菌，如图9所示，同样的方法，四种质粒载体也可以分别同时在其余三种芽孢杆菌中共存，并且可以在同时含四种抗生素(红霉素10μg/mL、氯霉素25μg/mL、新霉素20μg/mL、卡那霉素10μg/mL)的LB抗性平板上有效生长。
序列表
<110> 淮阴工学院
江苏省农业科学院
<120> 大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5633
<212> DNA
<213> 人工序列(PTCArtificial Sequence)
<400> 1
gaattcacta gtgggcccag atctctcgag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 60
gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg ctcacagaca agctgtgacc 120
gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 180
aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 240
acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 300
atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataataa 360
aaaaggattg attctaatga agaaagcaga caagtaagcc tcctaaattc actttagata 420
aaaatttagg aggcatatca aatgaacttt aataaaattg atttagacaa ttggaagaga 480
aaagagatat ttaatcatta tttgaaccaa caaacgactt ttagtataac cacagaaatt 540
gatattagtg ttttataccg aaacataaaa caagaaggat ataaatttta ccctgcattt 600
attttcttag tgacaagggt gataaactca aatacagctt ttagaactgg ttacaatagc 660
gacggagagt taggttattg ggataagtta gagccacttt atacaatttt tgatggtgta 720
tctaaaacat tctctggtat ttggactcct gtaaagaatg acttcaaaga gttttatgat 780
ttataccttt ctgatgtaga gaaatataat ggttcgggga aattgtttcc caaaacacct 840
atacctgaaa atgctttttc tctttctatt attccatgga cttcatttac tgggtttaac 900
ttaaatatca ataataatag taattacctt ctacccatta ttacagcagg aaaattcatt 960
aataaaggta attcaatata tttaccgcta tctttacagg tacatcattc tgtttgtgat 1020
ggttatcatg caggattgtt tatgaactct attcaggaat tgtcagatag gcctaatgac 1080
tggcttttat aatatgagat aatgccgact gtacttttta cagtcggttt tctaatgtca 1140
ctaacctgcc ccgttagttg aagaaggttt ttatattaca gctccagatc catatccttc 1200
tttttctgaa ccgacttctc ctttttcgct tctttattcc aattgcttta ttgacgttga 1260
gcctcggaac ccttaacaat cccaaaactt gtcgaatggt cggcttaata gctcacgcta 1320
tgccgacatt cgtctgcaag tttagttaag ggttcttctc aacgcacaat aaattttctc 1380
ggcataaatg cgtggtctaa tttttatttt taataacctt gatagcaaaa aatgccattc 1440
caatacaaaa ccacatacct ataatcgata accacataac agtcataaaa ccactccttt 1500
ttaacaaact ttatcacaag aaatatttac ccggggtcca gaaggtcgat agaaagcgtg 1560
agaaacagcg tacagacgat ttagagatgt agaggtactt ttatgccgag aaaacttttt 1620
gcgtgtgaca gtccttaaaa tatacttaga gcgtaagcga aagtagtagc gacagctatt 1680
aactttcggt tgcaaagctc taggattttt aatggacgca gcgcatcaca cgcaaaaagg 1740
aaattggaat aaatgcgaaa tttgagatgt taattaaaga cctttttgag gtcttttttt 1800
cttagatttt tggggttatt taggggagaa aacatagggg ggtactacga cctcccccct 1860
aggtgtccat tgtccattgt ccaaacaaat aaataaatat tgggttttta atgttaaaag 1920
gttgtttttt atgttaaagt gaaaaaaaca gatgttggga ggtacagtga tggttgtaga 1980
tagaaaagaa gagaaaaaag ttgctgttac tttaagactt acaacagaag aaaatgagat 2040
attaaataga atcaaagaaa aatataatat tagcaaatca gatgcaaccg gtattctaat 2100
aaaaaaatat gcaaaggagg aatacggtgc attttaaaca aaaaaagata gacagcactg 2160
gcatgctgcc tatctatgac taaattttgt taagtgtatt agcaccgtta ttatatcatg 2220
agcgaaaatg taataaaaga aactgaaaac aagaaaaatt caagaggacg taattggaca 2280
tttgttttat atccagaatc agcaaaagcc gagtggttag agtatttaaa agagttacac 2340
attcaatttg tagtgtctcc attacatgat agggatactg atacagaagg taggatgaaa 2400
aaagagcatt atcatattct agtgatgtat gagggtaata aatcttatga acagataaaa 2460
ataattaaca gaagaattga atgcgactat tccgcagatt gcaggaagtg tgaaaggtct 2520
tgtgagatat atgcttcaca tggacgatcc taataaattt aaatatcaaa aagaagatat 2580
gatagtttat ggcggtgtag atgttgatga attattaaag aaaacaacaa cagatagata 2640
taaattaatt aaagaaatga ttgagtttat tgatgaacaa ggaatcgtag aatttaagag 2700
tttaatggat tatgcaatga agtttaaatt tgatgattgg ttcccgcttt tatgtgataa 2760
ctcggcgtat gttattcaag aatatataaa atcaaatcgg tataaatctg accgatagat 2820
tttgaattta ggtgtcacaa gacactcttt tttcgcacca gcgaaaactg gtttaagccg 2880
actgcgcaaa agacataatc gattcacaaa aaataggcac acgaaaaaca agttaaggga 2940
tgcagtttat gcatccctta acggtaccac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg 3000
aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc 3060
gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg 3120
aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat 3180
ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 3240
caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 3300
ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 3360
cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 3420
tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 3480
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 3540
aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 3600
tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 3660
atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 3720
agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 3780
tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 3840
tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 3900
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 3960
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 4020
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 4080
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 4140
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 4200
aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 4260
ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 4320
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 4380
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 4440
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 4500
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 4560
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 4620
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 4680
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 4740
ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 4800
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 4860
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 4920
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 4980
gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 5040
gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 5100
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 5160
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 5220
tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 5280
gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg 5340
agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt 5400
ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc 5460
gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc 5520
ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct 5580
atgaccatga ttacgccaag cttgcatgcc cgcggggatc cgctagctct aga 5633
<210> 2
<211> 5536
<212> DNA
<213> 人工序列(PBEArtificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 5423
<212> DNA
<213> 人工序列(PTNArtificial Sequence)
<400> 3
gaattcacta gtgctagcag atctctcgag gagatcaggg aatgagttta taaaataaaa 60
aaagcacctg aaaaggtgtc tttttttgat ggttttgaac ttgttctttc ttatcttgat 120
acatatagaa ataacgtcat ttttatttta gttgctgaaa ggtgcgttga agtgttggta 180
tgtatgtgtt ttaaagtatt gaaaaccctt aaaattggtt gcacagaaaa accccatctg 240
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<211> 5398
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<213> 人工序列(PTKArtificial Sequence)
<400> 4
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ccacatagat ggcgtcgcta gtattaaatg catattattt ttatatagta ccaaccttca 120
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tctgctcatg agtgaggccg atggcgtcct ttgctcggaa gagtatgaag atgaacaaag 660
ccctgaaaag attatcgagc tgtatgcgga gtgcatcagg ctctttcact ccatcgacat 720
atcggattgt ccctatacga atagcttaga cagccgctta gccgaattgg attacttact 780
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gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 3360
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 3420
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 3480
cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 3540
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 3600
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 3660
tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 3720
tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 3780
caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 3840
accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 3900
attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 3960
ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 4020
taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 4080
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 4140
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 4200
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 4260
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 4320
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 4380
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 4440
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 4500
tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 4560
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 4620
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 4680
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 4740
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 4800
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 4860
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 4920
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 4980
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 5040
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 5100
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 5160
gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 5220
tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 5280
tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 5340
cagctatgac catgattacg ccaagcttgc atgcccgcgg ggatccccat ggtctaga 5398
Claims (6)
1.一种大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体在芽孢杆菌中穿梭、共存中的应用，所述大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体为pBE穿梭质粒载体、pTN穿梭质粒载体和pTK穿梭质粒载体中的任意一种或者多种，其碱基序列分别如SEQ ID NO.2-4所示，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
2.一种权利要求1中所述的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体在芽孢杆菌中进行消除中的应用，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
3.一种权利要求1中所述的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体在外源蛋白的表达，实现对芽孢杆菌基因组DNA的编辑中的应用，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体在芽孢杆菌中穿梭、共存中的应用，其特征在于，所述pBE穿梭质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因AmpR和用于芽孢杆菌筛选的红霉素抗性基因ErmR和人工合成多克隆位点MCS。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体在芽孢杆菌中穿梭、共存中的应用，其特征在于，所述pTN穿梭质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因AmpR和用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因NeoR和人工合成多克隆位点MCS。
6.根据权利要求1所述的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体在芽孢杆菌中穿梭、共存中的应用，其特征在于，所述pTK穿梭质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、芽孢杆菌热敏复制起点rep-ts、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因AmpR和用于芽孢杆菌筛选的卡那霉素抗性基因KaR和人工合成多克隆位点MCS。
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