CN112342231A - 一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法 - Google Patents
一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112342231A CN112342231A CN202011191136.7A CN202011191136A CN112342231A CN 112342231 A CN112342231 A CN 112342231A CN 202011191136 A CN202011191136 A CN 202011191136A CN 112342231 A CN112342231 A CN 112342231A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- expression
- rcod
- ung
- purifying
- thermolabile
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 33
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 12
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 9
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 claims description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 claims description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 5
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 101150032615 ung gene Proteins 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical group O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 241000276438 Gadus morhua Species 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
- C12Y302/02027—Uracil-DNA glycosylase (3.2.2.27)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种不耐热UNG融合蛋白的重组载体及表达纯化方法。该方法包括将Cod UNG的基因序列克隆到pCold‑sumo质粒构建重组质粒pCold‑sumo‑Cod UNG，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，该感受态同时转化了表达分子伴侣质粒pG‑Tf2，经低温诱导表达得到可溶性的sumo‑Cod UNG融合蛋白。本发明成功克服了Cod UNG表达产物不溶的问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种不耐热UNG融合蛋白的表达纯化方法。
背景技术
如今，许多临床和科学研究都依赖于在有限的样本量中对微量分析物的检测和定量，DNA和RNA的分析通常使用实时定量聚合酶链反应，数字聚合酶链反应和第二代测序。分析有限样本量的微量DNA和RNA分子(例如液体活检和单细胞)通常需要进行预扩增，以产生足够量的靶分子，对多个靶标实现可重现、特异性和灵敏的方式进行单重定量。由于这可能需要将目标序列倍增几个数量级，因此后续的样品处理将成为潜在的污染危害，其中高浓度的PCR产物可能会污染下游反应。
在PCR中，脱氧胸苷三磷酸(dTTP)可以用脱氧尿苷三磷酸(dUTP)代替。在开始PCR之前，使用尿嘧啶DNA N-糖基化酶(UNG)可以降解任何含尿嘧啶的PCR产物，即可消除残留污染物，仅扩增源自原始生物样品的含胸腺嘧啶的靶DNA。
由于传统UNG酶无法完全失活，会造成扩增子的损失因而不利于后续定量。在含有大西洋鳕鱼UNG基因修饰的重组大肠杆菌菌株中产生的Cod UNG，通过适度的热处理可以完全且不可逆地使其失活，则可避免这个问题。
在现有的UNG蛋白表达纯化方法中，常出现表达蛋白构象错误，表达量低，纯化后的UNG酶有降解和杂蛋白，酶活性低等不良结果。使得UNG酶在实际生产和运用上与理想效果存在显著差距。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种不耐热UNG融合蛋白的表达纯化方法。纯化出的UNG酶纯度高，活性强，无DNase和RNase污染，易失活对PCR无抑制作用。
为实现上述目的，本发明提供一种rCod UNG的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备含有rCod UNG蛋白的重组载体，该重组载体还带有His tag和sumo tag标签；
诱导表达
纯化：利用His tag标签对融合蛋白进行纯化，获得高纯度的rCod UNG蛋白。
进一步，所述rCod UNG蛋白的序列为SEQ ID NO:3；所述pCold-sumo载体的序列为SEQ ID NO:4。
进一步，所诱导表达的诱导培养基为重量体积百分比的1％NaCl；重量体积百分比的1％蛋白胨；重量体积百分比的0.5％酵母提取物。
进一步，所述诱导表达的条件为OD600为0.5-0.7，加入0.25mM IPTG，15℃，230rpm，培养16h诱导蛋白表达。
进一步，所述纯化包括裂解菌体，融合蛋白的提取，融合蛋白的纯化步骤。
进一步，所述裂解菌体步骤为，将诱导表达所得的菌液第一次离心收集菌体，用预冷的Binding buffer重悬后，在冰水浴中超声破碎，再第二次离心，取上清第三次离心，再次取上清，向其中加入聚乙烯亚胺(PEI)孵育15-20min后第四次离心；
优选地，第一次离心的条件为2500g，4℃离心10min；
优选地，第二次离心的条件为11000g，4℃离心10min；
优选地，第三次离心的条件为1100g，4℃离心10min；
优选地，第四次离心的条件为1100g，4℃离心15min；
优选地，诱导表达所得的菌液：Binding buffer的体积比为1:20。
优选地，超声破碎的功率为50％，频率为超2s停3s，时间20-25min。
优选地，所述聚乙烯亚胺(PEI):滤液的体积比为1:1000-2000，优选1:1000。
进一步，所述融合蛋白的提取步骤为，将上清液加入Ni-NTA蛋白提取柱，直至所有上清流过Ni-beeds；再加入与Ni-beeds等体积的Wash buffer洗去杂蛋白，重复1-2次；
再加入Elution buffer洗脱，重复洗脱4-6次，收集所有洗脱液；
进一步，所述融合蛋白的纯化为，用rCod UNG蛋白的贮存液透析即可
本发明通过申请人的设计，制备出含rCod UNG基因的重组载体，转化到含分子伴侣质粒pG-Tf2的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，依靠SUMO tag和分子伴侣的特性，帮助rCod UNG正确折叠组装，在纯化过程中促进蛋白溶解，提高rCod UNG蛋白酶产量。表达出的产物通过His tag标签纯化，获得比天然UNG蛋白酶活性更高的产品。
本发明：
①将rCod UNG表达基因克隆到含6XHis tag和SUMO tag的pCold-SUMO载体上。
②pCold-SUMO载体适合低温诱导表达，有利于诱导表达出的rCod UNG蛋白酶活性的保持。
③质粒转化的感受态细胞：一般方法直接将表达载体转化到感受态细胞，而本发明的方法，感受态细胞中含分子伴侣质粒，诱导表达时，分子伴侣也会表达，并帮助目的蛋白折叠组装，促进蛋白溶解。
④本发明中，SUMO标签和分子伴侣并不会对酶活性产生影响，反而通过帮助蛋白质正确折叠减少蛋白错误构像，一定程度上使酶活性高于野生型UNG酶。
附图说明
图1是本发明pCold-6XHis-SUMO-rCod UNG表达载体图谱。
图2是一般法诱导rCod UNG小量提取的SDS-PAGE凝胶电泳图。
图3是本发明诱导rCod UNG小量提取的SDS-PAGE凝胶电泳图。
图4是本发明纯化rCod UNG蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。
图5是对本发明纯化得到的rCod UNG蛋白酶进行活性检测。
图6是对本发明纯化得到的rCod UNG蛋白酶进行DNase污染检测。
图7是对本发明纯化得到的rCod UNG蛋白酶进行RNase污染检测。
图8是对本发明纯化的rCod UNG失活温度检测，并与Thermo公司售卖的UNG作比较。
图9是本发明纯化所得酶对PCR反应抑制效果的测试结果。
图10是本发明对rCod UNG蛋白酶消化能力测试结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中，其中相同的标号表示相同的元件。参考附图描述的实施例旨在解释本发明，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件。
以下实施例的SEQ ID NO:1由上海生工生物工程有限公司合成，SEQ ID NO:2由苏州金唯智生物技术有限公司合成。其中所述rCod UNG对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示，pCold-sumo载体序列如SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO:1
tagtgagctcggtaccATGttcggagagacttggag
SEQ ID NO:2
Acctatctagactgcattagagtgctctccagttta
SEQ ID NO:3
ATGttcggagagacttggagaagagagctggctgcagagtttgaaaagccatacttcaaacaattgatgtcctttgtagctgatgagaggagccgtcacaccgtctacccaccggctgatcaagtgtacagttggacagagatgtgtgacattcaagatgtgaaagtagtgattctaggccaggacccttaccacggtcccaaccaagcacatggactctgtttcagtgtgcaaaagccagttccccctccccccagtctcgtgaacatatacaaagaattgtgtaccgacattgatggcttcaagcatcctggacatggagatctaagcggatgggcaaaacaaggggtgctgctgcttaacgcggtgctgaccgtgcgggcccatcaggccaactcccacaaggacagaggctgggagaccttcaccgacgctgtgatcaagtggctgagcgtcaaccgggaaggagtggttttcctgttgtggggctcatacgcccataagaagggagcgaccatcgacaggaaacgtcaccatgtcttgcaagctgttcatccatctcctttgtctgctcatcgtgggttccttggttgtaagcacttctccaaggctaacgggctgctgaaactatctgggacggagcctataaactggagagcactctaa
SEQ ID NO:4
aaggaatggtgtggccgattaatcataaatatgaaaaataattgttgcatcacccgccaatgcgtggcttaatgcacatcaaattgtgagcggataacaatttgatgtgctagcgcatatccagtgtagtaaggcaagtcccttcaagagttatcgttgatacccctcgtagtgcacattcctttaacgcttcaaaatctgtaaagcacgccatatcgccgaaaggcacacttaattattaagaggtaatacaccatgaatcacaaagtgcatcatcatcatcatcatatcgaaggtaggcatatgggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcggtatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggtactagtgagctcggtaccctcgagggatccgaattcaagcttgtcgacctgcagtctagataggtaatctctgcttaaaagcacagaatctaagatccctgccatttggcggggatttttttatttgttttcaggaaataaataatcgatcgcgtaataaaatctattattatttttgtgaagaataaatttgggtgcaatgagaatgcgcaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccataaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacccaaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtactatggttgctttgacgtatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgc
SEQ ID NO:5
aaggaatggtgtggccgattaatcataaatatgaaaaataattgttgcatcacccgccaatgcgtggcttaatgcacatcaaattgtgagcggataacaatttgatgtgctagcgcatatccagtgtagtaaggcaagtcccttcaagagttatcgttgatacccctcgtagtgcacattcctttaacgcttcaaaatctgtaaagcacgccatatcgccgaaaggcacacttaattattaagaggtaatacaccatgaatcacaaagtgcatcatcatcatcatcatatcgaaggtaggcatatgggcggtggcggtagcggcggtggcggtagcggtatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggtactagtgagctcggtaccATGttcggagagacttggagaagagagctggctgcagagtttgaaaagccatacttcaaacaattgatgtcctttgtagctgatgagaggagccgtcacaccgtctacccaccggctgatcaagtgtacagttggacagagatgtgtgacattcaagatgtgaaagtagtgattctaggccaggacccttaccacggtcccaaccaagcacatggactctgtttcagtgtgcaaaagccagttccccctccccccagtctcgtgaacatatacaaagaattgtgtaccgacattgatggcttcaagcatcctggacatggagatctaagcggatgggcaaaacaaggggtgctgctgcttaacgcggtgctgaccgtgcgggcccatcaggccaactcccacaaggacagaggctgggagaccttcaccgacgctgtgatcaagtggctgagcgtcaaccgggaaggagtggttttcctgttgtggggctcatacgcccataagaagggagcgaccatcgacaggaaacgtcaccatgtcttgcaagctgttcatccatctcctttgtctgctcatcgtgggttccttggttgtaagcacttctccaaggctaacgggctgctgaaactatctgggacggagcctataaactggagagcactctaatgcagtctagataggtaatctctgcttaaaagcacagaatctaagatccctgccatttggcggggatttttttatttgttttcaggaaataaataatcgatcgcgtaataaaatctattattatttttgtgaagaataaatttgggtgcaatgagaatgcgcaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccataaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacccaaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtactatggttgctttgacgtatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgc
限制性内切酶PstI-HF(货号R3140S)和KpnI-HF(货号R3142S)均由NEB公司生产。
PFX DNA聚合酶由厦门大学生命科学学院张永有课题组纯化。
实施例1：pCold-SUMO-rCod UNG载体的构建
PCR扩增rCOD UNG基因序列，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，以SEQ ID NO:3(上海生工生物工程有限公司合成)为模板，以PFX为DNA聚合酶，扩增体系50ul，扩增条件为98℃，2min；98℃，15s；64℃，15s；72℃，15s；72℃，2min，共35个循环，得到PCR产物1。
以1.2％(w/v)琼脂糖凝胶进行电泳，切下目的条带进行胶回收，得到产物1。
双酶切载体pCold-SUMO(SEQ ID NO:4)，PstI-HF和KpnI-HF各20U消化3ug pCold-SUMO质粒，于37℃水浴反应4hr，1.2％琼脂糖凝胶电泳后切下目的条带进行胶回收，得到产物2，并将酶切产物转化TOP10感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司，货号：DL1010)，涂板后培养过夜，观察酶切是否彻底。
所诱导表达的培养基为重量体积百分比的1％NaCl；重量体积百分比的1％胰蛋白胨；重量体积百分比的0.5％酵母提取物。诱导表达条件为OD600为0.5-0.7，加入0.25mM IPTG，15℃，230rpm，培养16h。
使用不依赖连接酶的连接反应进行重组质粒克隆，反应体系如下：30ng双酶切pCold-SUMO载体回收产物(产物2)，20ng rCod-UNG PCR回收产物(产物1)，20U EoxIII(购自TAKARA公司)，1ul 10X EoxIII reaction buffer，加水补足至10μL。冰浴反应1h，加1ul0.5M EDTA(pH 8.0)，65℃反应10min后插回冰上备用。
取100ul TOP10感受态细胞，冰上融化后加入到上述连接产物中，冰浴30min后42℃热激90s，插回冰上静置2min，涂布于氨苄青霉素LB培养基，37℃恒温培养箱倒置过夜。
挑取单克隆，用5ml氨苄培养基，37℃，200rpm摇菌12h，取1ul进行菌液PCR，电泳正确的送去测序(厦门铂瑞生物技术有限公司)，测序正确的命名为pCold-6XHis-sumo-rCod-UNG，载体图谱见图1。
其余菌液利用质粒小提试剂盒(购自天根生化科技有限公司，货号DP103-03)提取pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达载体。
实施例2：6XHis-SUMO-rCod-UNG的小量表达
pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达载体的菌株制备：取实施例1所得pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达载体25ng，加入到100μL 5种含不同分子伴侣质粒(见图3)的BL21(DE3)感受态细胞(购自上海近岸科技有限公司)，冰浴30min后42℃热激90s，插回冰上静置2min，涂布于氨苄青霉素(30μg/ml)和氯霉素(10μg/ml)双抗性LB培养基，37℃恒温培养箱倒置过夜。
对比例：一般法制备pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达菌株
pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达载体的菌株制备：取实施例1所得pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达载体25ng，加入到100μL BL21(DE3)感受态(购自Invitrogen)，冰浴30min后42℃热激90s，插回冰上静置2min，涂布于氨苄青霉素(30μg/ml)和氯霉素(10μg/ml)双抗性LB培养基，37℃恒温培养箱倒置过夜。
挑取单克隆，用5ml氨苄青霉素(30μg/ml)和氯霉素(10μg/ml)双抗性LB培养液，37℃，200rpm培养12h，转接到5ml氨苄青霉素(30μg/ml)和氯霉素(10μg/ml)双抗性LB培养液，培养至OD600在0.5-0.7之间时，取出菌液冰上预冷5min，然后加入工作浓度为0.25mMIPTG，15℃诱导过夜。
rCod-UNG小量提取：
①裂解菌体：取上述过夜的5mL菌液，配平后于2500g，4℃离心15min收集菌体。放入-80℃冷冻30min，取出冷冻的菌体用预冷的0.5ml His tag Binding buffer(50mMTris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，5mM咪唑，10％甘油(v/v)，1mM PMSF，0.2mMβ-ME)充分重悬菌体(诱导表达菌液体积：His tag Binding buffer体积＝10：1)，在冰水浴中超声破碎，功率为10％，频率为超2s停3s，时间5min。
11000g，4℃，10min离心，取上清40μl加入10μL 5XSDS-PAGE上样缓冲液(Tris-HCl(pH6.8)(50mM)；SDS(2％)；溴酚兰(0.1％)；甘油(25％)；β-巯基乙醇(14.4mM)，沉淀用1XSDS-PAGE上样缓冲液重悬，95℃，10min使蛋白变性，然后插回冰上备用。
实施例2与对比例小提获得的蛋白上清和沉淀每个样品取10μL进行SDS-PAGE电泳，上层胶90V，20min；下层胶150V，50min。
考马斯亮蓝染色，电泳结束取下凝胶，加30ml考马斯亮蓝(考马斯亮蓝R 250100mg溶于500ml甲醇中，加100ml冰醋酸，水补足至1L)室温染色1h，然后加入40ml脱色液(甲醇：乙酸：水＝5：1：4)，室温脱色，每隔30min换一次脱色液，脱色3-4次，结果见图3。由图3可以看出：本发明制备的rCod UNG蛋白表达菌经诱导表达后，蛋白溶解度明显提高。
实施例3：6XHis-SUMO-rCod-UNG的纯化
①蛋白的大量诱导表达：取实施例2所得pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达菌株，过夜培养获得种子液，按1：100的比例转接到1L含氨苄青霉素(30μg/ml)和氯霉素(10μg/ml)的液体LB中，37℃摇床，200rpm培养至OD600到0.5-0.7时取出置于冰上冷却15min，然后加入终浓度为0.25mM的IPTG，置于15℃，200rpm摇床培养16h诱导蛋白表达。
②裂解菌体：第一次离心收集菌体，收集的细胞置于-80℃，冻存30min以上，取出冷冻过的菌体用预冷的50ml His-tag Binding buffer重悬细胞(诱导表达菌液体积：Histag Binding buffer体积＝20：1)。在冰水浴中超声破碎细胞，50％功率，超声2秒，停3秒，共超声20min。超声结束进行第二次离心，离心完取上清进行第三次离心，上清转移到另一干净离心管，一边搅拌一边向其中加入聚乙烯亚胺(PEI)(来源于安耐吉化学，编号：D110141，批号：E8NRD7RK，聚乙烯亚胺：上清液＝1：1000)，混匀后置于冰上15-20min后进行第四次离心；
第一次离心的条件为2500g，4℃离心10min；
第二次离心的条件为11000g，4℃离心10min；
第三次离心的条件为1100g，4℃离心10min；
第四次离心的条件为1100g，4℃离心15min；
③纯化：取1ml Ni-NTA agarose(Lot No.160042951)加入滤柱，分别用Elutionbuffer(50mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，250mM咪唑，10％甘油(v/v)，1mM PMSF，0.2mMβ-ME)、Wash buffer(50mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，25mM咪唑，10％甘油(v/v)和Histag Binding buffer各10ml洗Ni-NTA柱，加入上清使其流过Ni-NTA agarose，然后加2mlWash buffer洗脱杂蛋白，最后用2ml Elution buffer分四次洗脱目的蛋白。
得到的蛋白经SDS-PAGE检测后，转移到透析袋中4℃透析过夜，更换新的透析液再透析4h，从透析袋取出补加甘油使其终浓度为50％。BCA法测定蛋白浓度(BCA蛋白定量试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，货号E713DA0001)后，按需稀释，-80℃长期保存。SDS-PAGE电泳结果见图4，可以看到，本发明纯化出的rCod UNG无明显降解及杂蛋白产生。
对本发明纯化所得rCod UNG进行活性检测，结果见图5。
对本发明纯化所得rCod UNG进行DNase污染检测，结果见图6。
对本发明纯化所得rCod UNG进行RNase污染检测，结果见图7。
对本发明纯化所得rCod UNG进行失活温度检测，将UNG置于50℃放置10min或不处理后进行活性的检测，同时比较市售UNG酶(Thermo)失活温度，结果见图8。
对本发明纯化所得rCod UNG进行PCR抑制能力进行测试，结果见图9。
对本发明纯化所得rCod UNG消化能力进行测试，模板为含U的纯化后的PCR产物，结果见图10。
综上，本发明建立了不耐热UNG蛋白表达方法，解决了不耐热UNG蛋白表达不溶解的问题。并从核酸酶污染、热失火温度、对PCR抑制能力、消化能力几个方面对所纯化的SUMO-UNG进行检测。可以看到，本发明表达纯化得到的rCod UNG酶可溶解、无DNase和RNase污染且具有活性，并且不耐热，易从反应中去除，对PCR反应无抑制作用。
序列表
<110> 厦门大学
厦门致善生物科技股份有限公司
<120> 一种不耐热UNG融合蛋白的重组载体及表达纯化方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagtgagctc ggtaccatgt tcggagagac ttggag 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acctatctag actgcattag agtgctctcc agttta 36
<210> 3
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgttcggag agacttggag aagagagctg gctgcagagt ttgaaaagcc atacttcaaa 60
caattgatgt cctttgtagc tgatgagagg agccgtcaca ccgtctaccc accggctgat 120
caagtgtaca gttggacaga gatgtgtgac attcaagatg tgaaagtagt gattctaggc 180
caggaccctt accacggtcc caaccaagca catggactct gtttcagtgt gcaaaagcca 240
gttccccctc cccccagtct cgtgaacata tacaaagaat tgtgtaccga cattgatggc 300
ttcaagcatc ctggacatgg agatctaagc ggatgggcaa aacaaggggt gctgctgctt 360
aacgcggtgc tgaccgtgcg ggcccatcag gccaactccc acaaggacag aggctgggag 420
accttcaccg acgctgtgat caagtggctg agcgtcaacc gggaaggagt ggttttcctg 480
ttgtggggct catacgccca taagaaggga gcgaccatcg acaggaaacg tcaccatgtc 540
ttgcaagctg ttcatccatc tcctttgtct gctcatcgtg ggttccttgg ttgtaagcac 600
ttctccaagg ctaacgggct gctgaaacta tctgggacgg agcctataaa ctggagagca 660
ctctaa 666
<210> 4
<211> 4740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaggaatggt gtggccgatt aatcataaat atgaaaaata attgttgcat cacccgccaa 60
tgcgtggctt aatgcacatc aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat 120
ccagtgtagt aaggcaagtc ccttcaagag ttatcgttga tacccctcgt agtgcacatt 180
cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca cttaattatt 240
aagaggtaat acaccatgaa tcacaaagtg catcatcatc atcatcatat cgaaggtagg 300
catatgggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggta tgtcggactc agaagtcaat 360
caagaagcta agccagaggt caagccagaa gtcaagcctg agactcacat caatttaaag 420
gtgtccgatg gatcttcaga gatcttcttc aagatcaaaa agaccactcc tttaagaagg 480
ctgatggaag cgttcgctaa aagacagggt aaggaaatgg actccttaag attcttgtac 540
gacggtatta gaattcaagc tgatcagacc cctgaagatt tggacatgga ggataacgat 600
attattgagg ctcacagaga acagattggt ggtactagtg agctcggtac cctcgaggga 660
tccgaattca agcttgtcga cctgcagtct agataggtaa tctctgctta aaagcacaga 720
atctaagatc cctgccattt ggcggggatt tttttatttg ttttcaggaa ataaataatc 780
gatcgcgtaa taaaatctat tattattttt gtgaagaata aatttgggtg caatgagaat 840
gcgcaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 900
gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 960
gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca 1020
gattgtactg agagtgcacc ataaaattgt aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt 1080
aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta 1140
taaatcaaaa gaatagcccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc 1200
actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg 1260
cccactacgt gaaccatcac ccaaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact 1320
aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt 1380
ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc 1440
ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgta 1500
ctatggttgc tttgacgtat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 1560
cgcatcaggc gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 1620
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 1680
aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 1740
tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 1800
atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 1860
agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 1920
tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 1980
tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 2040
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 2100
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 2160
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 2220
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 2280
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 2340
aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 2400
ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 2460
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 2520
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 2580
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 2640
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 2700
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 2760
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 2820
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 2880
ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 2940
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 3000
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 3060
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 3120
gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 3180
gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 3240
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 3300
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 3360
tttgctggcc ttttgctcac atagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag ctgactgggt 3420
tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta atgagtgagc taacttacat 3480
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 3540
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgccag ggtggttttt 3600
cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc ctgagagagt 3660
tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt gatggtggtt 3720
aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac cgagatatcc 3780
gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc catctgatcg 3840
ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat ggtttgttga 3900
aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat ttgattgcga 3960
gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg agacagaact taatgggccc 4020
gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc cagtcgcgta 4080
ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac atcaagaaat 4140
aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc atccagcgga 4200
tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc cgctttacag 4260
gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc tggcacccag ttgatcggcg 4320
cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact ggaggtggca 4380
acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt gggaatgtaa 4440
ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac gtggctggcc 4500
tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg catactctgc gacatcgtat 4560
aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct cttccgggcg ctatcatgcc 4620
ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga tctcgacgct ctcccttatg 4680
cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc 4740
<210> 5
<211> 5375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaggaatggt gtggccgatt aatcataaat atgaaaaata attgttgcat cacccgccaa 60
tgcgtggctt aatgcacatc aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat 120
ccagtgtagt aaggcaagtc ccttcaagag ttatcgttga tacccctcgt agtgcacatt 180
cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca cttaattatt 240
aagaggtaat acaccatgaa tcacaaagtg catcatcatc atcatcatat cgaaggtagg 300
catatgggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggta tgtcggactc agaagtcaat 360
caagaagcta agccagaggt caagccagaa gtcaagcctg agactcacat caatttaaag 420
gtgtccgatg gatcttcaga gatcttcttc aagatcaaaa agaccactcc tttaagaagg 480
ctgatggaag cgttcgctaa aagacagggt aaggaaatgg actccttaag attcttgtac 540
gacggtatta gaattcaagc tgatcagacc cctgaagatt tggacatgga ggataacgat 600
attattgagg ctcacagaga acagattggt ggtactagtg agctcggtac catgttcgga 660
gagacttgga gaagagagct ggctgcagag tttgaaaagc catacttcaa acaattgatg 720
tcctttgtag ctgatgagag gagccgtcac accgtctacc caccggctga tcaagtgtac 780
agttggacag agatgtgtga cattcaagat gtgaaagtag tgattctagg ccaggaccct 840
taccacggtc ccaaccaagc acatggactc tgtttcagtg tgcaaaagcc agttccccct 900
ccccccagtc tcgtgaacat atacaaagaa ttgtgtaccg acattgatgg cttcaagcat 960
cctggacatg gagatctaag cggatgggca aaacaagggg tgctgctgct taacgcggtg 1020
ctgaccgtgc gggcccatca ggccaactcc cacaaggaca gaggctggga gaccttcacc 1080
gacgctgtga tcaagtggct gagcgtcaac cgggaaggag tggttttcct gttgtggggc 1140
tcatacgccc ataagaaggg agcgaccatc gacaggaaac gtcaccatgt cttgcaagct 1200
gttcatccat ctcctttgtc tgctcatcgt gggttccttg gttgtaagca cttctccaag 1260
gctaacgggc tgctgaaact atctgggacg gagcctataa actggagagc actctaatgc 1320
agtctagata ggtaatctct gcttaaaagc acagaatcta agatccctgc catttggcgg 1380
ggattttttt atttgttttc aggaaataaa taatcgatcg cgtaataaaa tctattatta 1440
tttttgtgaa gaataaattt gggtgcaatg agaatgcgca ggccctttcg tctcgcgcgt 1500
ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt 1560
ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg 1620
tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccataaa 1680
attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt 1740
tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gcccgagata 1800
gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac 1860
gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcacccaaa 1920
tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 1980
cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 2040
aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca 2100
cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtactatg gttgctttga cgtatgcggt 2160
gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgtcag gtggcacttt 2220
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 2280
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 2340
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 2400
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 2460
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 2520
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 2580
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 2640
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 2700
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 2760
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 2820
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 2880
tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 2940
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 3000
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 3060
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 3120
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 3180
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 3240
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 3300
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 3360
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 3420
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 3480
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg 3540
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 3600
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 3660
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 3720
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 3780
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 3840
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 3900
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 3960
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatagt 4020
catgccccgc gcccaccgga aggagctgac tgggttgaag gctctcaagg gcatcggtcg 4080
agatcccggt gcctaatgag tgagctaact tacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 4140
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 4200
aggcggtttg cgtattgggc gccagggtgg tttttctttt caccagtgag acgggcaaca 4260
gctgattgcc cttcaccgcc tggccctgag agagttgcag caagcggtcc acgctggttt 4320
gccccagcag gcgaaaatcc tgtttgatgg tggttaacgg cgggatataa catgagctgt 4380
cttcggtatc gtcgtatccc actaccgaga tatccgcacc aacgcgcagc ccggactcgg 4440
taatggcgcg cattgcgccc agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc gcagtgggaa 4500
cgatgccctc attcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca ctccagtcgc 4560
cttcccgttc cgctatcggc tgaatttgat tgcgagtgag atatttatgc cagccagcca 4620
gacgcagacg cgccgagaca gaacttaatg ggcccgctaa cagcgcgatt tgctggtgac 4680
ccaatgcgac cagatgctcc acgcccagtc gcgtaccgtc ttcatgggag aaaataatac 4740
tgttgatggg tgtctggtca gagacatcaa gaaataacgc cggaacatta gtgcaggcag 4800
cttccacagc aatggcatcc tggtcatcca gcggatagtt aatgatcagc ccactgacgc 4860
gttgcgcgag aagattgtgc accgccgctt tacaggcttc gacgccgctt cgttctacca 4920
tcgacaccac cacgctggca cccagttgat cggcgcgaga tttaatcgcc gcgacaattt 4980
gcgacggcgc gtgcagggcc agactggagg tggcaacgcc aatcagcaac gactgtttgc 5040
ccgccagttg ttgtgccacg cggttgggaa tgtaattcag ctccgccatc gccgcttcca 5100
ctttttcccg cgttttcgca gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg gaaacggtct 5160
gataagagac accggcatac tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc acattcacca 5220
ccctgaattg actctcttcc gggcgctatc atgccatacc gcgaaaggtt ttgcgccatt 5280
cgatggtgtc cgggatctcg acgctctccc ttatgcgact cctgcattag gaagcagccc 5340
agtagtaggt tgaggccgtt gagcaccgcc gccgc 5375
Claims (10)
1.含有rCod UNG水解酶的重组载体，其序列见SEQ ID NO:5。
2.一种不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备含有rCod UNG水解酶的重组载体；该载体带有His tag标签和sumo tag标签；将该重组载体导入含有pG-Tf2分子伴侣质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中；
2)诱导表达；
3)纯化：利用His tag标签对融合蛋白进行纯化，获得高纯度的rCod UNG酶。
3.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述rCod UNG水解酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3；所述重组载体的序列为SEQ ID NO:5。
4.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，步骤2中，诱导表达的培养基为重量体积百分比的1％NaCl；重量体积百分比的1％胰蛋白胨；重量体积百分比的0.5％酵母提取物。
5.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述诱导表达条件为OD600为0.5-0.7，加入0.25mM IPTG,15℃，230rpm，诱导表达16h。
6.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述纯化包括裂解菌体，融合蛋白的提取，融合蛋白的纯化步骤。
7.如权利要求6所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述裂解菌体步骤为将诱导表达所得的菌液第一次离心收集菌体，用预冷的Binding buffer重悬后，在冰水浴中超声破碎，超声结束进行第二次离心，离心完取上清进行第三次离心，取上清向其中加入聚乙烯亚胺孵育15-20min后第四次离心；
第一次离心的条件为2500g，4℃离心10min；
第二次离心的条件为11000g，4℃离心10min；
第三次离心的条件为1100g，4℃离心10min；
第四次离心的条件为1100g，4℃离心15min。
8.如权利要求7所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，
诱导表达菌液体积：Binding buffer的体积比为20：1；
超声破碎的功率为50％，频率为超2s停3s，时间20-25min；
所述聚乙烯亚胺:滤液的体积比为1:1000-2000，优选1:1000。
9.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述融合蛋白的提取步骤为，将上清加入装有Ni-NTA的蛋白提取柱，直至所有上清流过Ni-beeds；再加入与Ni-beeds等体积的Wash buffer洗去杂蛋白，重复1-2次；
再加入Elution buffer洗脱，重复洗脱4-6次，收集所有洗脱液。
10.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述融合蛋白的纯化为，用rCod UNG蛋白的贮存液透析两次。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011191136.7A CN112342231A (zh) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法 |
| PCT/CN2021/127313 WO2022089573A1 (zh) | 2020-10-30 | 2021-10-29 | 一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法 |
| EP21885299.4A EP4239074A4 (en) | 2020-10-30 | 2021-10-29 | RECOMBINANT VECTOR AND EXPRESSION PURIFICATION METHOD FOR HEAT-LABILE UNG FUSION PROTEIN |
| US18/051,933 US20230193234A1 (en) | 2020-10-30 | 2022-11-02 | Recombinant vector of thermolabile ung fused protein and an expressing and purifying method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011191136.7A CN112342231A (zh) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112342231A true CN112342231A (zh) | 2021-02-09 |
Family
ID=74356616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011191136.7A Pending CN112342231A (zh) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230193234A1 (zh) |
| EP (1) | EP4239074A4 (zh) |
| CN (1) | CN112342231A (zh) |
| WO (1) | WO2022089573A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022089573A1 (zh) * | 2020-10-30 | 2022-05-05 | 厦门大学 | 一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117417919A (zh) * | 2023-10-13 | 2024-01-19 | 江苏省海洋资源开发研究院(连云港) | 一种热敏感尿嘧啶dna糖苷酶及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180221438A1 (en) * | 2015-04-27 | 2018-08-09 | Adaerata Limited Partnership | Modulating uracil-dna glycosylase and uses thereof |
| CN108913712A (zh) * | 2018-07-17 | 2018-11-30 | 厦门生命互联科技有限公司 | 一种重组Tn5转座酶的表达纯化方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO314091B1 (no) * | 2000-01-12 | 2003-01-27 | Biotec Pharmacon Asa | Varmelabil uracil-DNA-glykosylase, DNA-sekvens som koder for enzymet, mikroorganisme som inneholder DNA-sekvensen, samt anvendelse av enzymet |
| CN102250846A (zh) * | 2011-07-19 | 2011-11-23 | 上海近岸科技有限公司 | 重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法 |
| CN102839189A (zh) * | 2012-07-18 | 2012-12-26 | 华南农业大学 | 利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法 |
| CN108504670B (zh) * | 2018-02-27 | 2022-01-04 | 温州医科大学 | 一种大肠杆菌冷休克助溶型表达质粒的构建方法及其应用 |
| CN112342231A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-02-09 | 厦门大学 | 一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法 |
-
2020
- 2020-10-30 CN CN202011191136.7A patent/CN112342231A/zh active Pending
-
2021
- 2021-10-29 EP EP21885299.4A patent/EP4239074A4/en active Pending
- 2021-10-29 WO PCT/CN2021/127313 patent/WO2022089573A1/zh unknown
-
2022
- 2022-11-02 US US18/051,933 patent/US20230193234A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180221438A1 (en) * | 2015-04-27 | 2018-08-09 | Adaerata Limited Partnership | Modulating uracil-dna glycosylase and uses thereof |
| CN108913712A (zh) * | 2018-07-17 | 2018-11-30 | 厦门生命互联科技有限公司 | 一种重组Tn5转座酶的表达纯化方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| INGAR LEIROS 等: "\"The structure of uracil-DNA glycosylase from Atlantic cod (Gadus morhua) reveals cold-adaptation features\"", 《BIOLOGICAL CRYSTALLOGRAPHY》 * |
| 鲍洪波 等: ""尿嘧啶N糖基化酶(UNG)的研究进展"", 《中国生物工程杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022089573A1 (zh) * | 2020-10-30 | 2022-05-05 | 厦门大学 | 一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4239074A4 (en) | 2024-05-01 |
| WO2022089573A1 (zh) | 2022-05-05 |
| EP4239074A1 (en) | 2023-09-06 |
| US20230193234A1 (en) | 2023-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102550926B1 (ko) | 이중 항체 구축물을 발현하는 aav를 포함하는 조성물 및 이들의 용도 | |
| RU2761632C2 (ru) | Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания в-клеток, и их применение | |
| KR20190101410A (ko) | 윌슨병을 치료하기 위한 유전자 치료 | |
| CN110564770B (zh) | 一种适用地中海贫血和镰刀型贫血基因治疗的慢病毒载体 | |
| US11939594B2 (en) | Engraftable cell-based immunotherapy for long-term delivery of therapeutic proteins | |
| CN102414314A (zh) | 用于生产丙酮的细胞和方法 | |
| CN111304141B (zh) | 产n-乙酰-5-羟色胺的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 | |
| CN113980991B (zh) | 大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用 | |
| KR20210154176A (ko) | 표적화된 생체내 후성유전학적 억제에 의한 장기지속성 진통 | |
| CN112342231A (zh) | 一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法 | |
| CN106591344A (zh) | 一种融合分子伴侣标签的大肠杆菌热诱导可溶性蛋白表达载体及其应用 | |
| US20040028695A1 (en) | Recombinant immunogenic compositions and methods for protecting against lethal infections from Bacillus anthracis | |
| CN115298307A (zh) | 核酸调节元件的新组合及其方法和用途 | |
| CN112725344B (zh) | 密码子优化的smn1基因、腺相关病毒表达质粒及基因药物 | |
| KR20220142502A (ko) | 근육 특이적 핵산 조절 요소 및 이의 방법 및 용도 | |
| CN114008209A (zh) | Aav介导的枫糖尿症(msud)基因疗法 | |
| KR102194740B1 (ko) | 7-adca 제조를 위한 데아세트옥시세팔로스포린 c의 고농도 생산 재조합 아크레모니움 크리소제눔 균주의 제조방법 및 이 방법으로 제조된 균주 | |
| KR20220041214A (ko) | Il-1 수퍼패밀리의 사이토카인의 시공적 제한 활성으로 무장된 면역반응성 세포 | |
| KR20220058461A (ko) | 모노머형 스트렙타비딘을 발현하는 균주 및 비오틴화된 화합물을 포함하는 암 세포 표적용 조성물 | |
| CN108159434B (zh) | 一种基因载体及其用于治疗青光眼的基因治疗药物 | |
| CN113215265B (zh) | 奶牛bta-miRNA29d-3p在奶牛乳腺上皮细胞脂质积累调节过程中的应用 | |
| CN114990157B (zh) | 用于构建lmna基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用 | |
| CN114891776B (zh) | 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法 | |
| CN111500629B (zh) | 一种高表达层粘连蛋白-511变体的方法及其应用 | |
| KR20220058460A (ko) | 모노머형 스트렙타비딘을 발현하기 위한 컨스트럭트 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210209 |