CN112725344B - 密码子优化的smn1基因、腺相关病毒表达质粒及基因药物 - Google Patents

密码子优化的smn1基因、腺相关病毒表达质粒及基因药物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种密码子优化的SMN1基因，是与SEQ ID No:3所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。所述密码子优化的SMN1基因在哺乳动物细胞中和昆虫细胞中的表达都明显优于野生型SMN1基因，因而可相对减少SMA基因治疗药物的用量。同时，本发明还提供了一种携带密码子优化的SMN1基因的AAV病毒颗粒，可用作SMA基因治疗药物。

Description

密码子优化的SMN1基因、腺相关病毒表达质粒及基因药物
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及密码子优化的SMN1基因、腺相关病毒表达质粒、基因病毒和应用。
背景技术
脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一种单基因常染色体隐性遗传疾病，其特征是脊髓前角细胞变性和由此引起的肌肉萎缩和无力，该病发病率为1/6000-10000，携带率为1/40-50，是导致婴儿死亡的最主要遗传病。SMA的治疗主要分为优化临床管理和药物治疗两个方面，药物治疗方面包括利用小分子药物或反义核苷酸药物增加SMN2表达(导致更多全长SMN mRNA)，以及基因药物载体介导的替代全长SMN1的基因疗法。目前有些药物已经上市，有的药物正在进行临床试验，基于重组相关病毒载体的基因治疗药物已初露端倪。
脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)主要是由于SMN1基因的纯合子缺失而导致，人类SMN基因位于5q13，分为SMN1和SMN2，SMN1基因位于端粒侧，转录后产生全长mRNA，编码全长含294个氨基酸的SMN蛋白质，SMN2基因位于着丝粒侧，SMN2基因与SMN1基因在外显剪接增强子处有一个核苷酸的差异，从而使得转录后的SMN2缺失第7个外显子，编码截断的SMN蛋白，截断的SMN蛋白丧失全长SMN蛋白的功能，并且在细胞内迅速降解。有趣的是，SMN2 mRNA的第7个外显子在有些情况下并不是全部缺失，SMN2基因仍然能够产生一小部分(10-15％)全长mRNA，这部分mRNA可编码具有正常功能的SMN蛋白。
SMA作为一种单基因疾病，基因治疗有望彻底治愈SMA。病毒载体介导的SMN基因转移在临床前研究中已经非常成功。Foust及其同事利用自身互补腺相关病毒血清型9(scAAV9)作为载体成功拯救了SMA小鼠，这是SMA基因治疗发展的一个里程碑。在该研究中，SMA小鼠出生后第1天，静脉内注射携带SMN1基因的scAAV9，分析发现有60％的脊髓运动神经元表达SMN1蛋白质，且完全改善了肌肉的运动功能和强度，治疗后的小鼠寿命大于400天，而未治疗组小鼠寿命仅有16天。
AveXis Inc.基因治疗公司正在美国进行一项临床研究，这是第一个评估静脉输送scAAV9-SMN1至1型SMA病人的安全性的I期临床试验。这项研究总共有15名SMA婴儿参与进来；参与者分成两组，其中三名患者接受低剂量(6.7×1013virus genome(vg)每公斤体重)治疗，12人接受高剂量(2.0×1014virus genome(vg)/千克)治疗。截至2017年8月7日，所有15名患者在20个月大时仍然存活并无安全事件发生，而历史队列中存活率仅为8％。在高剂量组，基因治疗后进行费城儿童医院神经肌肉障碍测试(Children’s HospitalofPhiladelphia Infant Test ofNeuromuscular Disorders，CHOP INTEND)记录运动功能评分(范围从0到64，分数越高表明功能越好)，1个月时增加了9.8个点，3个月时增加了15.4个点，与此相比，历史队列CHOP INTEND评分逐渐降低。在接受高剂量治疗的12名患者中，11名能够端坐，9名可以翻身，11名能由口进食并且说话，2名能够独立走路。2018年1月16日AveXis Inc.公司又公布了针对SMN基因候选疗法AVXS-101的扩大临床试验计划。除正在开展的对1型患者的关键试验(STRIVE)和针对2型患者的1期试验(STRONG)外，公司计划再启动3项试验，涵盖新的SMA患者群体，针对AVXS-101进行更加深入的评估。此外，该公司还宣布针对2型患者的1期试验已经完成了首位患者的用药。良好的临床结果促使诺华公司于18年4月宣布以87亿美元的价格收购AveXis Inc.公司，目前FDA已正式批准诺华旗下AveXis公司的Zolgensma上市，治疗费用为212.5万美元。
基因治疗策略虽然治疗效果显著，但在价格方面过于昂贵，造成昂贵的价格的因素有很多，其中包括较高的AAV病毒生产成本，如果能降低AAV病毒生产成本，将会有效的降低基因治疗药物的价格。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种密码子优化的SMN1基因，密码子优化的SMN1基因较野生型的SMN1基因具有显著更高的表达水平，因而可相对减少SMA基因治疗药物的用量；同时，本发明还提供了一种基于AAV载体的SMA基因治疗药物的制备方法，采用杆状病毒昆虫系统制备AAV病毒颗粒，进一步降低SMA基因治疗药物的成本。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种密码子优化的SMN1基因，该基因是与SEQ ID No:3所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
优选地，密码子优化的SMN1基因与SEQ ID NO:3所示序列具有至少85％同源性，更优选是与SEQ ID NO:3所示序列具有至少90％同源性；再优选为与SEQ ID NO:3所示序列具有至少95％或至少98％的同源性。
在本申请中，密码子优化的SMN1基因简写为SMN1-OPT基因。
第二方面，本发明提供一种带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达质粒，其包含：含有CBA启动子的腺相关病毒基因组与密码子优化SMN1基因序列；所述含有CBA启动子的腺相关病毒基因组序列具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列；密码子优化SMN1基因是与SEQID No:3所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
优选地，上述带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达质粒的构建方法如下：将编码密码子优化的SMN1基因片段亚克隆至pAAV-CBA质粒中，得到AAV-CBA-SMN1-OPT质粒；该克隆过程包括如下步骤：
(1)将pAAV-CBA质粒用限制性内切酶HindIII和XhoI于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收pAAV-CBA载体片段；将密码子优化的SMN1基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和HindIII/XhoI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用HindIII和XhoI于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收密码子优化的SMN1基因片段；
(2)将胶回收试剂盒回收的pAAV-CBA载体片段和密码子优化的SMN1基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min；
(3)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；42℃±0.5热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB培养液37℃±0.5振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃±0.5倒置培养12-16h；
(4)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃±0.5振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取AAV-CBA-SMN1-OPT质粒，以EcoRI和SalI双酶切初步鉴定后进行DNA测序鉴定，至此慢病毒表达载体质粒构建成功。
第三方面，本发明提供一种带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒，其包括：pFast-Bac1载体序列与带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的基因序列；其中，pFast-Bac1载体具有如SEQ ID No:4所示的核苷酸序列。pfast是个穿梭载体，通过该穿梭载体将SMN1-OPT基因转导至杆状病毒上。
优选地，上述杆状病毒质粒的构建方法为：将带有码子优化的SMN1基因的腺相关病毒表达盒的基因片段无缝克隆至pFast Bac1质粒中，得到pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-OPT质粒；该克隆方法如下：
(1)将pFast Bac1质粒用限制性内切酶SnaBI和HpaI于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收pFast Bac1载体片段，回收后的pFast Bac1载体片段用碱性磷酸酶CIAP于50℃±0.5进行去磷处理60min，用65℃±0.5进行灭活处理15min；
(2)将带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端包含15bp与pFast bac1酶切载体同源序列，琼脂糖电泳后，切胶回收含有密码子优化的SMN1基因的腺相关病毒表达盒的基因片段；
(3)将碱性磷酸酶处理的pFast Bac1载体片段和含有密码子优化的SMN1基因的腺相关病毒表达盒的基因片段，采用无缝克隆重组酶连接，50℃反应8-12min，得无缝克隆连接产物；
(4)取无缝克隆连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；42℃±0.5热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB培养液37℃±0.5振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃±0.5倒置培养12-16h；
(5)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃±0.5振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-OPT质粒，进行SnaBI和HpaI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒构建成功。
第四方面，本发明提供一种基于AAV载体的SMA基因治疗药物，其包括：腺相关病毒，所述腺相关病毒具有AAV衣壳、包装在AAV衣壳中的含有启动子CBA的scAAV载体基因组、密码子优化的SMN1基因序列；所述密码子优化的SMN1基因是与SEQ ID No:3所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
优选地，密码子优化的SMN1基因与SEQ ID NO:3所示序列具有至少85％同源性，更优选是与SEQ ID NO:3所示序列具有至少90％同源性；再优选为与SEQ ID NO:3所示序列具有至少95％同源性。
优选地，所述启动子为组成型启动子CBA，启动子用于驱动密码子优化的SMN1基因的表达。
优选地，所述含有启动子CBA的scAAV载体基因组具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
第五方面，本发明提供一种基于AAV载体的SMA基因治疗药物的制备方法，其包括：将携带SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的三杆状病毒Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-OPT、Baculovirus-Rep与Baculovirus-Cap9，三者以1：1：1的比例，按照MOI1000感染Sf9昆虫细胞，感染后，收集细胞并裂解，上清液经AAV-X层析柱亲和纯化，得到基于AAV载体的基因治疗药物。
优选地，三杆状病毒Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-OPT是由pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-OPT质粒转化DH10bac感受态细胞，获取携带SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒Bacmid-AAV-CBA-SMN1-OPT，用Bacmid-AAV-CBA-SMN1-OPT转染Sf9昆虫细胞，转染预定时间后，收集上清，获得三杆状病毒Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-OPT。Bacmid载体质粒来自Addgene plasmid#118862。
(三)有益效果
本发明提出的密码子优化的SMN1基因在哺乳动物细胞中和昆虫细胞中的表达都明显优于野生型SMN1基因，因而可相对减少SMA基因治疗药物的用量。同时，本发明还提供了一种携带SMN1-OPT基因的基于AAV载体的SMA基因治疗药物的制备方法，采用杆状病毒昆虫系统制备AAV病毒颗粒，有利于降低SMA(脊肌萎缩症)基因治疗药物的成本。
附图说明
图1为将表达SMN1-WT基因和SMN1-OPT基因的质粒，转染293T细胞后，用SMN1和FLAG抗体进行Western Blot检测结果的比较。
图2为将表达SMN1-WT基因和SMN1-OPT基因的杆状病毒感染昆虫细胞sf9细胞后，利用Western Blot检测SMN1蛋白的表达结果比较。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明在野生型SMN1基因(如SEQ ID No:2所示核苷酸序列)基础上进行密码子优化，得到密码子优化的SMN1基因，该基因是与SEQ ID No:3所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。经在哺乳动物细胞细胞中和昆虫细胞中进行表达验证，发现密码子优化的SMN1基因的蛋白质表达量明显优于野生型SMN1基因。
现将野生型SMN1和SEQ ID No:3所示基因序列比对如下：
Figure BDA0002866551120000081
经比对计算，野生型SMN1和SEQ ID No:3所示基因序列确定只有74.5％同源性，说明优化密码子的碱基变化较大，但表达的氨基酸序列一致且SEQ ID NO:3所示基因序列相比野生型SMN1，无论在哺乳动物细胞还是昆虫细胞中都表现出更为优异的表达性。因而可以合理推断，与SEQ ID No:3具有至少80％、85％、90％、95％、甚至98％同源性的序列也应当具有与SEQ ID No:3所示序列相似的表达性。
基于上述发现，本申请还涉及含有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达质粒，其包含：含有CBA启动子的腺相关病毒基因组与密码子优化SMN1基因序列；所述含有CBA启动子的腺相关病毒基因组序列具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列；密码子优化SMN1基因序列是与SEQ ID No:3所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
优选地，上述带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达质粒的构建方法如下：将编码密码子优化的SMN1基因片段亚克隆至pAAV-CBA质粒中，得到AAV-CBA-SMN1-OPT质粒。
基于密码子优化的SMN1基因，本申请还涉及一种带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒，其包括：pFast-Bac1载体序列与带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的基因序列；其中，pFast-Bac1载体具有如SEQ ID No:4所示的核苷酸序列。
优选地，上述杆状病毒质粒的构建方法为：将带有码子优化的SMN1基因的腺相关病毒表达盒的基因片段无缝克隆至pFast Bac1质粒中，得到pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-OPT质粒。pFast Bac1为杆状病毒穿梭载体，通过穿梭载体将密码子优化的SMN1转导至杆状病毒上。
基于密码子优化的SMN1基因，本发明还提供一种基于AAV载体的SMA基因治疗药物，其包括：腺相关病毒，所述腺相关病毒具有AAV衣壳、包装在AAV衣壳中的含有CBA启动子的scAAV载体基因组、以及密码子优化的SMN1基因序列；所述密码子优化的SMN1基因序列具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
其中，启动子为组成型启动子CBA，启动子用于驱动表达。含有CBA启动子的scAAV载体基因组具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明提供一种基于AAV载体的SMA基因治疗药物的制备方法，其包括：将Baculovirus-AAV-CBA-SMN1、Baculovirus-Rep(Addgene plasmid#112865)与Baculovirus-Cap9(Cell Biolabs(Part No.340202))，用real-time PCR方法测定基因组滴度，三种病毒以1：1：1的比例，按照MOI1000感染Sf9昆虫细胞，感染96h后，收集细胞并裂解，将上清液采用AAV-X层析柱亲和纯化，得到基于AAV载体的基因治疗药物，病毒滴度通过real-time PCR方法测定，以vp/ml(virus particle/ml)表示。
腺相关病毒AAV到目前为止未发现导致人类疾病，AAV载体免疫原性较低，AAV以染色体外小体(episome)形式存在，极少整合到靶细胞基因组。因此，AAV载体在基因治疗药物具有很好的安全性。
三杆状病毒Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-OPT是由带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-OPT质粒转化DH10bac感受态细胞，获取携带SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒Bacmid-AAV-CBA-SMN1-OPT，用Bacmid-AAV-CBA-SMN1-OPT转染Sf9昆虫细胞，转染预定时间后，收集上清，获得三杆状病毒Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-OPT。
Bacmid载体质粒来自Addgene plasmid#118862。
上述AAV-X层析柱亲和纯化采用本申请单位自主知识产权的“澄清→核酸酶消化→阴离子交换层析→浓缩换液→分子排阻层析”五步式病毒的纯化方法，得到高纯度高滴度的基于AAV载体的密码子优化的SMN1基因病毒颗粒，用作SMA的基因治疗药物。
为了验证本发明密码子优化的SMN1基因在细胞中的表达情况，以下分两组情况进行说明，包括在哺乳动物细胞和昆虫细胞中的表达情况。
(一)密码子优化的SMN1基因与野生型SMN1基因在哺乳动物细胞239T中的表达比较
1、构建野生型SMN1基因与编码SMN1-OPT基因腺相关病毒表达质粒，野生型SMN1腺相关病毒表达质粒包括含有CBA启动子的腺相关病毒基因组与用于编码的野生型SMN1基因序列(见SEQ ID No:2)。编码SMN1-OPT基因腺相关病毒表达质粒包括含有CBA启动子的腺相关病毒基因组与用于编码的密码子优化SMN1基因序列(见SEQ ID No:3)。
上述腺相关病毒表达质粒构建方法为：将野生型SMN1基因和编码密码子优化的SMN1基因片段分别亚克隆至pAAV-CBA质粒中，得到AAV-CBA-SMN1-WT与AAV-CBA-SMN1-OPT质粒；该克隆过程包括如下步骤：
(1)将pAAV-CBA质粒用限制性内切酶HindIII和XhoI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收pAAV-CBA载体片段；
将编码野生型SMN1基因和密码子优化的SMN1基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和HindIII/XhoI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用HindIII和XhoI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后，切胶回收编码野生型SMN1基因和密码子优化的SMN1基因片段。
(2)将胶回收试剂盒分别回收的pAAV-CBA载体片段和编码野生型SMN1基因和密码子优化的SMN1基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应15min。
(3)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克90s，立刻冰浴3min，加入无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养14h。
(4)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h；用质粒提取试剂盒提取质粒AAV-CBA-SMN1-WT与AAV-CBA-SMN1-OPT质粒，进行HindIII和XhoI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此腺相关病毒表达载体质粒构建成功。
2、将等量的AAV-CBA-SMN1-WT和AAV-CBA-SMN1-OPT质粒转染293T细胞，转染预定时间后，收集细胞并裂解，并进行Western Blot比较，具体过程包括如下步骤：
(1)293T在转染前一天按照1×10^6/孔，铺一块6板。
(2)转染当天，用3μg的野生型SMN1基因和编码密码子优化SMN1的腺相关病毒质粒转染293T细胞，48h后收集细胞并裂解，获得293T SMN1-WT裂解液和293T SMN1-OPT裂解液。
(3)配制10％SDS-PAGE胶，将293T SMN1-WT裂解液和293T SMN1-OPT裂解液用BCA法进行蛋白浓度测定，向6％SDS-PAGE胶中加入相同蛋白量的细胞裂解液，用80V的电压跑至压缩胶与分离胶交界处，用120V电压跑至胶的底部。
(4)用400mA恒定电流将含有293T SMN1-WT蛋白和293T SMN1-OPT蛋白的SDS-PAGE胶转至NC膜上。
(5)将转有293T SMN1-WT蛋白和293T SMN1-OPT蛋白的NC膜用5％脱脂牛奶在室温孵育1h，用TBST清洗膜3次，每次5min。
(6)用SMN1的一抗于4℃孵育过夜。
(7)第二天用用TBST清洗膜3次，每次10min，用含有HRP的二抗室温孵育1h，用TBST清洗膜3次，每次5min。
(8)用ECL法进行显影，获得SMN1-WT和293T SMN1-OPT的293T表达水平比较结果。利用Western Blot检测SMN1蛋白和FLAG标签蛋白的表达。结果如图1所示，用SMN1和FLAG抗体进行Western Blot检测结果均显示，密码子优化的SMN1基因明显优于野生型SMN1基因的表达。
(二)密码子优化的SMN1基因与野生型SMN1基因在昆虫细胞sf9中的表达比较
1、构建带有野生型SMN1基因与密码子优化的SMN1基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒。带有野生型SMN1-WT的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1(WT)包括：含有pFast-Bac1与携带SMN1-WT的腺相关病毒表达盒序列；编码密码子优化的SMN1腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1(OPT)包括含有pFast-Bac1与密码子优化的SMN1腺相关病毒表达盒序列。
其中所述pFast-Bac1为商业化载体(invitrogen)序列为：SEQ ID No:4。
构建带有野生型SMN1基因与密码子优化的SMN1基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒的方法为：将带有SMN1-WT和SMN1-OPT的腺相关病毒表达盒的基因片段分别无缝克隆至pFast Bac1质粒中，得到pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-WT与pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-OPT质粒；该克隆过程包括如下步骤：
(1)将pFast Bac1质粒用限制性内切酶SnaBI和HpaI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收pFast Bac1载体片段，回收后的pFast Bac1载体片段用碱性磷酸酶CIAP于50℃进行去磷处理60min，用65℃进行灭活处理15min。
(2)将含有野生型SMN1和密码子优化的SMN1的腺相关病毒表达盒基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端包含15bp与pFast bac1酶切载体同源序列，琼脂糖电泳后切胶回收含有野生型SMN1和密码子优化的SMN1的腺相关病毒表达盒基因片段。
(3)将碱性磷酸酶处理的pFast Bac1载体片段和含有野生型SMN1和密码子优化的SMN1的腺相关病毒表达盒基因片段，采用无缝克隆重组酶连接，50℃反应10min，得到无缝连接重组产物。
(4)取无缝连接重组产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克80s，立刻冰浴4min，加入无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养14h。
(5)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h；用质粒提取试剂盒提取质粒pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-WT与pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-OPT质粒，进行SnaBI和HpaI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此带有野生型与编码密码子优化的SMN1腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒构建成功。
2、将pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1(WT)或SMN1(OPT)转化DH10bac感受态细胞，获取杆状病毒介导的腺相关病毒载体Bacmid-AAV-CBA-SMN1-WT与Bacmid-AAV-CBA-SMN1-OPT，随后用Bacmid-AAV-CBA-SMN1-WT和Bacmid-AAV-CBA-SMN1-OPT转染Sf9细胞，转染预定时间后，收集上清，获得三杆状病毒Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-WT与Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-OPT，用三杆状病毒Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-WT或SMN1-OPT再次感染Sf9细胞，感染预定时间后，收集细胞裂解，并进行Western Blot比较。
具体过程包括如下步骤：
(1)将pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-WT或SMN1-OPT质粒转化至DH10Bac感受态细胞：取pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-WT与pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-OPT质粒转化感受态DH10Bac，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克45s，立刻冰浴4min，加入无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB琼脂平板上，37℃±0.5倒置培养26h。
(2)挑取白色单克隆接种于含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的LB液体培养液中，37℃振荡16h，用酚氯仿抽提法提取Bacmid-AAV-CBA-SMN1-WT与Bacmid-AAV-CBA-SMN1-OPT，获取的Bacmid-AAV-CBA-SMN1-WT与Bacmid-AAV-CBA-SMN1-OPT用PCR方法进行鉴定。
(3)按照1x10^6/孔，铺一块6孔板细胞，用等量的20μl Bacmid-AAV-CBA-SMN1-WT与Bacmid-AAV-CBA-SMN1-OPT转染Sf9细胞，转染后6h换液，转染后96h收集上清，获得三杆状病毒Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-WT与Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-OPT。
(4)按照2x10^6/孔，铺一块6孔板细胞，将Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-WT与Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-OPT用相同的基因组滴度，按照MOI1000感染Sf9细胞，感染后72h，收集细胞裂解，分别获得Sf9 SMN1-WT裂解液和Sf9 SMN1-OPT裂解液。
(5)配制10％SDS-PAGE胶，将Sf9 SMN1-WT裂解液和Sf9SMN1-OPT裂解液用BCA法进行蛋白浓度测定，向6％SDS-PAGE胶中加入相同蛋白量的细胞裂解液，用80V的电压跑至压缩胶与分离胶交界处，用120V电压跑至胶的底部。
(6)用400mA恒定电流将含有Sf9 SMN1-WT蛋白和Sf9 SMN1-OPT蛋白的SDS-PAGE胶转至NC膜上。
(7)将转有Sf9 SMN1-WT蛋白和Sf9 SMN1-OPT蛋白的NC膜用5％脱脂牛奶在室温孵育1h，用TBST清洗膜3次，每次5min。
(8)用SMN1的一抗于4℃孵育过夜。
(9)第二天用用TBST清洗膜3次，每次10min，用含有HRP的二抗室温孵育1h，用TBST清洗膜3次，每次5min。
(10)用ECL法进行显影，获得SMN1-WT和293T SMN1-OPT的Sf9表达水平比较结果。利用Western Blot检测SMN1蛋白的表达。结果如图2所示，密码子优化的SMN1基因明显强于野生型SMN1基因的表达。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Figure BDA0002866551120000161
Figure BDA0002866551120000171
Figure BDA0002866551120000181
Figure BDA0002866551120000191
Figure BDA0002866551120000201
Figure BDA0002866551120000211
Figure BDA0002866551120000221
Figure BDA0002866551120000231
序列表
<110> 中吉智药（南京）生物技术有限公司
<120> 密码子优化的SMN1基因、腺相关病毒表达质粒及基因药物
<141> 2020-12-24
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4084
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggacta gtgcggccgc 120
acgcgtctag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300
gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480
ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 540
ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 600
gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 660
ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 720
cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 780
cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct 840
gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta 900
attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg 960
ggctccggga gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctctttc ctacagctcc 1020
tgggcaacgt gctggttgtt gtgctgtctc atcattttgg caaagaattc cccggggatc 1080
ctctagagtc gacctgcaga agcttgcctc gagctgtgcc ttctagttgc cagccatctg 1140
ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 1200
cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 1260
gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 1320
atgcggtggg ctctatgggc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 1380
tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt 1440
tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc gcctgatgcg 1500
gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag 1560
tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 1620
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 1680
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 1740
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg 1800
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 1860
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cgggctattc ttttgattta 1920
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 1980
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat ggtgcactct cagtacaatc 2040
tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 2100
tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 2160
tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg 2220
atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc 2280
acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 2340
atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 2400
agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 2460
cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 2520
gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 2580
cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 2640
tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 2700
ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 2760
ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 2820
atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 2880
cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 2940
atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 3000
gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 3060
cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 3120
tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 3180
tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 3240
gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 3300
gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 3360
atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 3420
atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 3480
aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 3540
aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 3600
ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 3660
ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 3720
tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 3780
ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 3840
acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 3900
gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 3960
cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 4020
aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 4080
atgt                                                              4084
<210> 2
<211> 885
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atggcgatga gcagcggcgg cagtggtggc ggcgtcccgg agcaggagga ttccgtgctg 60
ttccggcgcg gcacaggcca gagcgatgat tctgacattt gggatgatac agcactgata 120
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gataacatca agcccaaatc tgctccatgg aactcttttc tccctccacc accccccatg 600
ccagggccaa gactgggacc aggaaagcca ggtctaaaat tcaatggccc accaccgcca 660
ccgccaccac caccacccca cttactatca tgctggctgc ctccatttcc ttctggacca 720
ccaataattc ccccaccacc tcccatatgt ccagattctc ttgatgatgc tgatgctttg 780
ggaagtatgt taatttcatg gtacatgagt ggctatcata ctggctatta tatgggtttc 840
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<210> 3
<211> 885
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atggccatga gctccggagg aagcggcgga ggagtgcccg aacaagagga ctccgtgctg 60
tttcgtagag gcaccggcca gagcgatgac tccgacatct gggacgacac cgctttaatc 120
aaggcctacg acaaggccgt ggctagcttc aagcacgctt taaagaatgg cgacatctgc 180
gagaccagcg gcaagcccaa gaccaccccc aagagaaaac ccgccaagaa gaataagagc 240
cagaagaaga acaccgccgc ctctttacag cagtggaaag tcggcgacaa gtgcagcgcc 300
atctggagcg aggacggatg catctacccc gccaccatcg ccagcatcga cttcaagagg 360
gagacttgtg tggtggtgta cactggttac ggcaatcgtg aggagcagaa tctgagcgat 420
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<210> 4
<211> 4776
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420
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gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 540
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catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 660
ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 720
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tcgacccacg gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa 3420
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ggcttatgtc aactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac 3600
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cccagttccc atctattttg tcactcttcc ctaaataatc cttaaaaact ccatttccac 4560
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ctgtcacaga atgaaaattt ttctgtcatc tcttcgttat taatgtttgt aattgactga 4740
atatcaacgc ttatttgcag cctgaatggc gaatgg                           4776

Claims (7)

1.一种密码子优化的SMN1基因，其特征在于，该基因是SEQ ID No:3所示的核苷酸序列。
2.一种带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达质粒，其特征在于，其包含：含有CBA启动子的腺相关病毒基因组与密码子优化SMN1基因序列；所述含有CBA启动子的腺相关病毒载体scAAV基因组具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列；密码子优化SMN1基因序列是SEQ IDNo:3所示的核苷酸序列。
3.一种权利要求2所述带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达质粒的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)将pAAV-CBA质粒用限制性内切酶HindIII和XhoI于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收pAAV-CBA载体片段；将密码子优化的SMN1基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和HindIII/XhoI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用HindIII和XhoI于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收密码子优化的SMN1基因片段；
(2)将胶回收试剂盒回收的pAAV-CBA载体片段和密码子优化的SMN1基因片段，采用T4DNA连接酶连接，室温反应10-20min；
(3)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；42℃±0.5热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB培养液37℃±0.5振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃±0.5倒置培养12-16h；
(4)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃±0.5振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取AAV-CBA-SMN1-OPT质粒，以EcoRI和SalI双酶切初步鉴定后进行DNA测序鉴定，至此慢病毒表达载体质粒构建成功。
4.一种带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒，其特征在于，其包括：pFast-Bac1载体序列与SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒序列；其中，pFast-Bac1载体具有如SEQ ID No:4所示的核苷酸序列；所述SMN1-OPT基因是SEQ ID No:3所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒，其特征在于，其构建方法为：将带有码子优化的SMN1基因的腺相关病毒表达盒的基因片段无缝克隆至pFast Bac1质粒中，得到pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-OPT质粒；该克隆方法如下：
(1)将pFast Bac1质粒用限制性内切酶SnaBI和HpaI于37℃±0.5进行双酶切1h±0.2，琼脂糖电泳后切胶回收pFast Bac1载体片段，回收后的pFast Bac1载体片段用碱性磷酸酶CIAP于50℃±0.5进行去磷处理60min，用65℃±0.5进行灭活处理15min；
(2)将带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端包含15bp与pFast bac1酶切载体同源序列，琼脂糖电泳后，切胶回收含有密码子优化的SMN1基因的腺相关病毒表达盒的基因片段；
(3)将碱性磷酸酶处理的pFast Bac1载体片段和含有密码子优化的SMN1基因的腺相关病毒表达盒的基因片段，采用无缝克隆重组酶连接，50℃反应8-12min，得无缝克隆连接产物；
(4)取无缝克隆连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴25-35min；42℃±0.5热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB培养液37℃±0.5振荡40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃±0.5倒置培养12-16h；
(5)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃±0.5振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-OPT质粒，进行SnaBI和HpaI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此带有SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒构建成功。
6.一种基于AAV载体的SMA基因治疗药物，其特征在于，其包括：腺相关病毒，所述腺相关病毒具有AAV衣壳、包装在AAV衣壳中的含有启动子CBA的scAAV载体基因组、以及密码子优化的SMN1基因序列；所述密码子优化的SMN1基因序列是SEQ ID No:3所示的核苷酸序列；所述scAAV载体基因组具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
7.一种权利要求6所述基于AAV载体的SMA基因治疗药物的制备方法，其特征在于，其包括：将携带SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的三杆状病毒Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-OPT、Baculovirus-Rep与Baculovirus-Cap9，三者以1：1：1的比例，按照MOI1000感染Sf9昆虫细胞，感染后，收集细胞并裂解，上清液经层析柱亲和纯化，得到AAV-CBA-SMN1-OPT病毒颗粒，即基于AAV载体的基因治疗药物；
所述三杆状病毒Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-OPT是由pFast-Bac-AAV-CBA-SMN1-OPT质粒转化DH10bac感受态细胞后，获取携带SMN1-OPT基因的腺相关病毒表达盒的杆状病毒质粒Bacmid-AAV-CBA-SMN1-OPT，用Bacmid-AAV-CBA-SMN1-OPT转染Sf9昆虫细胞，转染预定时间后，收集上清，获得三杆状病毒Baculovirus-AAV-CBA-SMN1-OPT。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023061499A1 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 Shanghai Vitalgen Biopharma Co., Ltd. Recombinant adeno-associated viral vectors for treating spinal muscular atrophy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795946A (zh) * 2018-06-28 2018-11-13 北京瑞希罕见病基因治疗技术研究所 携带设计smn1基因表达框的重组腺相关病毒及应用
CN111065741A (zh) * 2017-07-08 2020-04-24 吉尼松公司 脊髓性肌萎缩症的治疗

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3272872T (pt) * 2005-10-20 2020-06-26 Uniqure Ip Bv Vetores aav melhorados produzidos em células de insetos
CN106916793B (zh) * 2015-12-24 2019-01-15 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种重组腺相关病毒的制备方法及重组杆状病毒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111065741A (zh) * 2017-07-08 2020-04-24 吉尼松公司 脊髓性肌萎缩症的治疗
CN108795946A (zh) * 2018-06-28 2018-11-13 北京瑞希罕见病基因治疗技术研究所 携带设计smn1基因表达框的重组腺相关病毒及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
人穿孔素在 sf9 昆虫细胞中的表达和纯化;陈风晔等;《基础医学与临床》;20200105;第40卷(第1期);第2-3页 *
石琼等.海洋芋螺资源图鉴.《海洋芋螺资源图鉴》.中山大学出版社,2019,第62-63页. *
胡静平.生物医学常用实验方法.《生物医学常用实验方法》.苏州大学出版社,2019,第13-15页. *

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