CN107354172B - 重组表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种优化的动物蛋白基因OCX‑36及其原核表达载体的构建方法和应用，采取的技术方案是对OCX‑36基因稀有密码子进行改造优化，并切除了信号肽，将优化的OCX‑36基因与载体连接，构建重组质粒pMD‑19T‑OCX‑36，转入到大肠杆菌C41(DE3)感受态细胞中，筛选阳性克隆进行培养、蛋白表达，菌体细胞超声破碎、离心、收集上清液经一次镍柱亲和层析即可获得蛋白rOCX‑36。本发明通过对OCX‑36基因序列的优化，实现了蛋白rOCX‑36的可溶性表达，解决了其难于原核表达的技术问题，表达蛋白对患有结肠炎的小鼠具有明显改善病情的效果，显示rOCX‑36可用于制备治疗结肠炎的药物。

Description

重组表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种重组表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

随着现代生物技术的发展，对各种功能性蛋白质的需求逐年攀升，天然方式获取已经无法满足人类的需求，因此，建立高表达、低成本、安全性高的大规模生产高价值重组蛋白的外源表达系统就显得更加迫切。昆虫杆状病毒表达系统具有高效表达、基因克隆容量大、重组病毒易于筛选、安全性高、且有完备的翻译后加工修饰系统等特点，在生物制药和基因工程等方面具有广阔的应用前景，目前研究及应用最为广泛的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)。

OCX-36由453个氨基酸组成，其cDNA序列全长1995bp，与人脂多糖结合蛋白/杀菌通透性增加蛋白的结构相似，研究表明，OCX-36可以与金黄色葡萄球菌细胞壁脂磷壁酸结合，抑制金黄色葡萄球菌的生长，参与宿主防御抵御细菌。另一方面，OCX-36在蛋壳钙化时高度表达，对蛋壳碳酸钙晶体的形成及形态具有重要的作用。其三，OCX-36蛋白抗炎效果显著。因此，对OCX-36蛋白的研究不仅可以提高禽蛋质量，减少禽蛋食源性疾病的发生，降低蛋壳破损造成的经济损失，同时还可以应用于医疗领域，由于合成药物不可避免的副作用，食物来源的功能蛋白会是理想的替代品。尽管蛋白质在昆虫细胞表达过程中，糖基化修饰通常缺乏末端唾液酸化，但是OCX-36蛋白发挥功能作用并不是依赖于糖基化，而是其结构中心的脂质结合袋区域。

昆虫杆状病毒表达系统明显的一个缺点是：外源基因受到晚期病毒启动子ETL的调控，尽管强启动子具有很高的效率，但其启动时间较晚，表达产物产量出现峰值时，细胞却由于病毒侵染而即将死亡。获得高滴度的病毒液是大量表达的关键前提，这需要经过数次的病毒扩增的过程，但是病毒扩增的代数不能过多，因为病毒基因组变异较快，通过多次循环感染会产生“继代效应”，即病毒的感染能力下降，会造成收获的重组病毒液中存在大量的突变病毒，导致表达过程中目的蛋白产量的降低。其次，病毒感染的细胞数决定了细胞的生产力，这主要是由感染复数(MOI)起作用，高MOI可以在较短的生产周期得到很高产量，但是也要避免使用过高的MOI，高MOI更容易产生病毒缺损干扰因子，同时也会加速昆虫细胞的死亡，而较高的细胞存活率(>95％)才能够保证病毒在细胞内进行有效的繁殖扩增。

昆虫杆状病毒表达系统中，外源基因的可溶性表达是建立在对目的基因的了解基础之上的，包括是否需要进行稀有密码子优化，消除目的基因5’端二级结构，或者3’端添加蛋白标签帮助蛋白折叠等。OCX-36属于分泌型疏水蛋白，为简化实验操作，采取优化表达条件达到高效表达。

发明内容

本发明的目的是提供了一种重组表达载体pFastBac1-OCX-36及其构建方法，该重组表达载体pFastBac1-OCX-36能够成功表达OCX-36蛋白。

本发明提供了一种利用重组表达载体pFastBac1-OCX-36制备重组杆状病毒方法，并利用重组杆状病毒成功表达OCX-36蛋白。

为实现上述目的，本发明提供的一种重组表达载体pFastBac1-OCX-36，所述重组表达载体pFastBac1-OCX-36是由OCX-36基因序列插入表达载体pFastBac1内；所述OCX-36基因序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述OCX-36基因插入表达载体pFastBac1的酶切位点Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ之间。

本发明还提供了一种上述重组表达载体pFastBac1-OCX-36的制备方法，包括以下步骤：

1)OCX-36序列设计特异性引物对，该引物对分别加入保护碱基和相应的限制酶切位点，引物序列分别为：

F-Xho Ⅰ:CGGGATCCATGAAGCCGCTGAAGCTTTT；

R-EcoR Ⅰ:CGGAATTCTCACACGGAGATCGCCAACA；

2)以动物蛋白基因OCX-36的序列为模板，进行PCR，得到PCR产物；

3)将PCR产物连接到质粒pMD-19T上，得到质粒pMD-19T-OCX-36，

4)Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ分别对pMD-19T-OCX-36和pFastBac1进行双酶切，回收得到酶切化的OCX-36和线性化的pFastBac1；

5)将酶切化的OCX-36和线性化的pFastBac1用T4连接酶4℃连接过夜，得到连接产物；转化验证，得到重组表达载体pFastBac1-OCX-36。

本发明还提供了一种利用上述重组表达载体pFastBac1-OCX-36制备重组杆状病毒Bacmid-OCX-36的方法，包括以下步骤：

1)将重组表达载体pFastBac1-OCX-36含有Bacmid质粒的E.Coli DH10Bac感受态细胞中，得到重组杆状病毒质粒Bacmid-OCX-36；

2)将对数生长期的昆虫细胞加入到六孔板中，重组杆状病毒质粒Bacmid-OCX-36转染昆虫细胞，培养，离心收集上清，为P1代重组杆状病毒；

3)将得到的P1代重组杆状病毒转染昆虫细胞，表达得到P2代重组杆状病毒；即为重组杆状病毒Bacmid-OCX-36。

本发明还提供了一种上述重组杆状病毒Bacmid-OCX-36制备蛋白OCX-36的方法，包括以下步骤：

1)取对数生长期悬浮培养的昆虫细胞，重组杆状病毒Bacmid-OCX-36进行转染，离心得到转染病毒的上清液，

2)将上清液超滤离心管浓缩，上样至亲和层析柱，洗脱目的蛋白，将目的蛋白放入透析过夜，SDS-PAGE和Western Blot检测，为OCX-36蛋白。

本发明还提供了一种上述制备得到OCX-36蛋白在制备抗炎药品中的应用。

作为优选方案，OCX-36蛋白在制备结膜炎的药品中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明的杆状病毒表达载体pFastBac1具有高水平表达的AcMNPV的pH/p10启动子，以及大量的克隆位点，对外源基因的容纳能力较强，保证外源基因的高效表达。

(2)本发明构建的重组杆状病毒载体，利用重组杆状病毒转染至昆虫细胞表达，表达蛋白有效地折叠翻译。

(3)本发明构建的OCX-36表达载体为首次报道，建立了高效获取OCX-36蛋白的表达、纯化方法。

附图说明

图1：根据设计的引物对PCR扩增得到的DNA琼脂糖凝胶电泳图,

图中，M表示核酸Marker，1表示扩增产物OCX-36；

图2：pFastBac1-OCX-36的质粒构建图谱，其中Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ为双酶切位点，OCX-36为目的基因；

图3：pFastBac1-OCX-36载体Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切鉴定图；

图4：部分测序结果；

图5：正常及感染重组杆状病毒后的sf9细胞。a为感染72h后的sf9细胞，b为正常的sf9细胞；

图6：P1代病毒表达的Western Blot检测结果；

图中，1.阳性对照，2.阴性对照，3～6.不同实验组超声破菌后的上清液，7.阴性对照，8～11.不同实验组超声后的沉淀。

图7：不同感染复数条件下表达产物的Western Blot检测结果；

图8：P2代病毒表达Western Blot检测结果；

图9：纯化后重组蛋白SDS-PAGE图；

图10：纯化后重组蛋白的Western Blot检测结果；

图11：OCX-36蛋白对巨噬细胞RAW264.7细胞活力的影响；

图12：OCX-36蛋白对RAW264.7细胞凋亡的影响；

图中，图12A为PBS处理的对照组、图12B为脂多糖活化的巨噬细胞、图12C为脂多糖和OCX-36蛋白共同处理的巨噬细胞；

图13：OCX-36蛋白对脂多糖活化的RAW264.7细胞TNF-α表达水平的影响；

图14：OCX-36蛋白对脂多糖活化的RAW264.7细胞IL-β表达水平的影响；

图15：OCX-36蛋白对脂多糖活化的RAW264.7细胞IL-6表达水平的影响；

图16：OCX-36蛋白对脂多糖活化的RAW264.7细胞炎症基因mRNA表达的影响；

图中，图16A为iNOS的mRNA表达水平、图16B为TNF-α的mRNA表达水平、图16C为IL-β、图16D为IL-6；

图17：小鼠结膜切片H&E染色结果图；

图中，图17A为正常小鼠结膜细胞、图17B为患有角膜炎小鼠的结膜细胞、图17C为OCX-36蛋白治疗患有角膜炎小鼠之后的结膜细胞。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1：构建重组表达载体pFastBac1-OCX-36和重组杆状病毒质粒Bacmid-OCX-36

(1)获得OCX-36基因序列

根据NCBI公布的OCX-36基因序列(GenBank Accession:NM_001030861.1)设计引物对，从蛋鸡子宫组织通过聚合酶链式反应扩增出得到的产物即为OCX-36，其中，上游引物加入Xho Ⅰ酶切位点后序列为：5’-CGGGATCCATGAAGCCGCTGAAGCTTTT-3’；下游引物加入EcoRⅠ酶切位点后的序列为：5’-CGGAATTCTCACACGGAGATCGCCAACA-3’；PCR结果如图1所示。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性90s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min，15℃保存。

PCR反应体系为：dH2O(14.2μL)，10×KOD Buffer(2μL)，KOD(0.2μL)，dNTP(1.6μL)，cDNA(1μL)，F-BamH Ⅰ(0.5μL)，R-EcoR Ⅰ(0.5μL)。

(2)构建pMD-19T-OCX-36

在微量离心管中配制下表所示的DNA溶液，全量为10μL，6℃反应30分钟后转移至100μL JM109感受态细胞中，冰上放置30分钟。42℃加热45秒后，再在冰上放置1分钟。加入890μL SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落，挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

(2)构建重组表达载体pFastBac1-OCX-36

同时对质粒pFastBac1和含有OCX-36基因的重组质粒pMD-19T-OCX-36进行Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切，酶切产物切胶回收，DNA试剂盒连接两个片段，得到构建的重组表达载体pFastBac1-OCX-36，连接体系为：

反应物16℃反应过夜，然后将连接产物转化感受态DH5α，37℃过夜，挑取菌落，PCR验证。挑选阳性克隆株，Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切鉴定，如图2所示，酶切之后，大小片段的位置与预期结果一致。将鉴定正确的菌液进行基因测序，结果如图4所示。

(3)构建重组杆状病毒质粒Bacmid-OCX-36

将重组表达载体pFastBac1-OCX-36质粒转座含有Bacmid质粒的DH10Bac感受态中，37℃震荡培养4h，涂布于含有X-gal、IPTG及四环素、卡那霉素、庆大霉素的LB琼脂平板上，37℃培养48h，经2次蓝白斑筛选并挑取单个白色菌落于含有四环素、卡那霉素、庆大霉素的LB培养液中扩大培养。

实施例2：OCX-36蛋白在昆虫细胞中的表达及纯化

(1)获得重组杆状病毒

对数生长期的sf9细胞加入到六孔板中，每孔8×10⁵个。取两个灭菌离心管，一个离心管中加入5μL Bacmid-OCX-36和100μL的昆虫细胞培养基，另一个离心管中加入6μL细胞转染试剂CellfectinⅡReagent。将两种混合液混合均匀，得到转染混合物，滴加到细胞中，27℃孵育3-5h。弃去转染混合物，加入2mL新的昆虫细胞培养基，27℃培养72h。

光学显微镜下观察，待75％细胞发生病毒侵染时，收获上清，即得到第一代重组杆状病毒(P1病毒)，取P1病毒再次侵染贴壁sf9细胞，重复上述操作即获得第二代重组杆状病毒(P2病毒)。

(2)OCX-36蛋白的表达

取对数生长期悬浮培养的昆虫细胞，P2病毒进行转染，27℃、无CO₂、110rpm/min悬浮培养，取同样生长状态下的细胞，用不同感染复数MOI侵染细胞，72～96h后收获蛋白(图7)。

Western Blot检测，方法为将细胞裂解产物进行SDS-PAGE，电泳产物转印至硝酸纤维素膜，鼠抗6×His-tag为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，经二氨基联苯氨(DAB)显色，观察特异性条带，鉴定结果如图6所示。

(3)OCX-36蛋白的纯化

取转染病毒的上清液，超滤离心管(Milipore)浓缩，上样至His Trap FF crude(GE)亲和层析柱，20mM PB预平衡，0.1M甘氨酸-盐酸洗脱。洗脱下的目的蛋白放入透析过夜，SDS-PAGE和Western Blot检测(图9、10)。

实施例3：OCX-36蛋白的体外抗炎效果

(1)OCX-36的细胞毒性评价

巨噬细胞RAW264.7与0～500μg/mL不同浓度的OCX36孵育72h，CCK-8法检测细胞活力，酶标仪在450nm波长处测定各孔吸光度值OD450。

通过吸光度值计算细胞活力，计算公式为：

实验结果如图11所示，表明各个浓度的OCX36蛋白对巨噬细胞没有毒性。

(2)OCX36对脂多糖活化的巨噬细胞凋亡的影响

RWA264.7细胞分别与LPS(0.1μg/mL)，LPS(0.1μg/mL)+OCX-36(25μg/mL)孵育24h，PBS作空白对照，Annexin V-FITC/PI对RWA264.7进行双染色，流式细胞术检测细胞凋亡，

结果图12所示：PBS空白对照组、LPS活化组以及OCX-36+LPS共同作用组早期凋亡的巨噬细胞比例分别为0％、(23.96±0.33)％、(12.79±0.41)％，差异具有统计学意义(p＜0.01)；晚期凋亡的比例分别为0％、(5.52±0.25)％、(4.54±0.36)％，差异具有统计学意义(p＜0.05)，OCX-36对LPS活化的巨噬细胞凋亡抑制作用明显，早期凋亡率降低了187％，晚期凋亡率降低了122％。

(3)OCX36对脂多糖活化的巨噬细胞促炎因子表达的影响

TNF-α、IL-1β和IL-6是由巨噬细胞释放，并参与调控炎症反应进程的促炎因子。使用LPS(0.1μg/mL)刺激RAW 264.7细胞，ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平，然后与各浓度的OCX-36实验组进行比较，β-actin作为内参基因。

结果如图13-15所示，不同浓度OCX-36对炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6释放量均具有显著的(p＜0.01或p＜0.05)抑制效果，抑制作用具有蛋白浓度依赖性。

(4)OCX-36对脂多糖活化的巨噬细胞炎症基因mRNA表达的影响

RT-PCR技术检测iNOS，TNF-α，IL-1β和IL-6炎症细胞因子在基因水平上的调控，β-actin作为内参基因，OCX-36对这些炎症因子mRNA转录水平的影响；

如图16A-D所示：在0.1μg/mL的LPS的诱导下，RAW 264.7细胞内的iNOS，TNF-α，IL-1β和IL-6mRNA大量表达。而25～100μg/mL的OCX-36蛋白对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的mRNA表达具有抑制作用，并且呈现剂量依赖性。

实施例4：OCX-36蛋白治疗结膜炎效果

对结膜炎模型小鼠眼部滴入剂量浓度为400μg/ml的重组OCX-36蛋白，治疗一周后，处死小鼠，摘眼球法采血，结膜用石蜡包埋，连续切片，进行H&E染色，显微镜下观察切片，结果如图17所示。

正常小鼠的结膜表现为无明显充血水肿，结膜切片观察结果无明显嗜酸性粒细胞；而患有结膜炎的小鼠表现为结膜充血水肿，显微镜观察发现结膜出现明显的炎性细胞浸润，可以观察到嗜酸性粒细胞、中性粒细胞以及单核细胞；经过OCX-36蛋白治疗后的小鼠炎性现象减轻，嗜酸性粒细胞明显变少。综上，OCX-36蛋白能够有效控制、缓解结膜炎。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

<110> 华中农业大学

<120> 重组表达载体及其构建方法和应用

<211> 1380bp

<212> DNA

<213> OCX-36基因

<400> 1

ATGAAGCCGC TGAAGCTTTT TGGAATGGTC GTCTTCTGTG GGCTGCTCTC ACCCACCCAG 60

GGGGTCCTTT CCGGCCTGTC CTGTGCCATC AGTCCCAGGG CCATGCAACA AGTGCTGTCC 120

GATGCCATCA TTCAGACCGG GCTCCTCGAG AAGCACCTGC AGGGCATGGC GCTGCCAAAC 180

ATCATGAGTG ATCGGGGTCT GCTGAGCTCC CCCACCATCA TCACGGGGCT GCACCTGGAG 240

CGCTCCTGGC TGCCCACGCT GTCGATAGCA CTGCTGCCGG GGATTGGGAT GCAGTTGGTC 300

GTCACCGTGC ACCTGGATCT CAGTGGCAAC TGCTTGATGG GCATTCTGTC TGAGGTGATC 360

GCTATCTCCC TGGATGTGAC CATTACCTCC AACATCAAAA GCACAAGTTT TGAGTTGGGT 420

ACAGTCCACG TCACTGTTGA TGACTGCTTC TGCATTCTTG GTGCTGTAAA GATCAAGCTG 480

ATCTCTGGCT TACTGTCCCT GTCAGTGCAT GACATGGTGT TCAGCCACCT GACAGCAACG 540

CTGCCTGGTT TGCTGTGTCC AGTGATGGAT GCTGTCTCAG AGATAGTGAA CGTCCAGCTC 600

CTGAGCACTC TGAATGTGGT GATGCCAGTC GGCTTGAAGG GGATGGTTCA CTACCACCTG 660

GTCGGCCCAC CATTCACCTC CGGTTCGTCC CTGATGATGG ATTTAGATGG CACGGTGCAG 720

CAGATGGGAG GCAGCATCAT CCCCCACGAC TCGTATGCCT CCACGTTGCC CCCGCTGCTG 780

GACGGGCTGC TGGTCATCAT TTTGCGCCAG AGCTTCCTCA GCTCCCTGCT GGCCCTGCTG 840

CTCCATATCC AGCCATACAC CTTCCCCTGC TCGTCGGAAG CTTTCTCTGG GGCCAACCAG 900

CTGAGAGATT CCATCACAGA CCTTTATCCC ACTGGGTGCA CCAGCTGCCC CGCAGCCAGC 960

CCTCTAAGCA TCCGTGTGGA GTGTGTGGGG AACCCCATCC TCCTCTTGGA ACCCAACAAA 1020

GCCACCGTTG AGCTGTCAGT CCTGCTCCAG GTGTTCGTTA AGCGCCCGGA TGGGTCCGTC 1080

ATCATCCTGC TGCTCCTGAA GGCAGACCTC AGTCTGAACG TCCGCCTGTC GATCTCCAGG 1140

GGCAGTCTGA TGCTGGCCTT CTCTCTGAGC AGGGTTTCCC TCTTCTTGGA GTCATCTGAC 1200

ATTGGCATCA GTGAGATCTC CAACCTGAAG CCACACCTCA CTAAGCTGCT GGTGGAGATC 1260

TACCTGCCAC GTCTCAATGC TGTTGCAGCC GATGGGATAC CCCTGCCAGA CGTGTTCGGA 1320

ATAACTCTGA TGGGAGCGGA ACTCCAGATC TTGTTGGGAC TGTTGGCGAT CTCCGTGTGA 1380

<210> 2

<211> 5946

<212> DNA

<213> pFastBac-OCX-36

<400> 2

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420

aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat 480

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 540

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 600

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 660

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 720

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 780

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 840

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 900

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 960

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1020

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1080

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 1140

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1200

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1260

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 1320

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 1380

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1440

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1500

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1560

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1620

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1680

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1740

agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1800

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1860

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 1920

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 1980

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2040

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2100

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2160

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2220

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2280

ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2340

cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg 2400

cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct 2460

ggcaaaatcg gttacggttg agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga 2520

caataaagtc ttaaactgaa caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag 2580

acagaatagt tgtaaactga aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt 2640

tgttatggct aaagcaaact cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga 2700

ggggcgtggc caagggcatg gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac 2760

aactccgcgg ccgggaagcc gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg 2820

tcgatatcaa agtgcatcac ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg 2880

ggatcgtcac cgtaatctgc ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca 2940

tgcttgagga gattgatgag cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact 3000

gcgagatcat agatatagat ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc 3060

gcgagagcgc caacaaccgc ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta 3120

cggagcaagt tcccgaggta atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct 3180

ccgaactcac gaccgaaaag atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg 3240

agcctacatg tgcgaatgat gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg 3300

ccctgctgcg taacatcgtt gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca 3360

tcgacccacg gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa 3420

acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa 3480

ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca 3540

ggcttatgtc aactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac 3600

cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc 3660

ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg 3720

cacggatctg ccctggcttc aggagatcgg aagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt 3780

ggtgctgacc ccggatgaag tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt 3840

gttcgcccag gactctagct atagttctag tggttggcta cgtatactcc ggaatattaa 3900

tagatcatgg agataattaa aatgataacc atctcgcaaa taaataagta ttttactgtt 3960

ttcgtaacag ttttgtaata aaaaaaccta taaatattcc ggattattca taccgtccca 4020

ccatcgggcg cggatcccgg tccgaagcgc gcggaattct cacacggaga tcgccaacag 4080

tcccaacaag atctggagtt ccgctcccat cagagttatt ccgaacacgt ctggcagggg 4140

tatcccatcg gctgcaacag cattgagacg tggcaggtag atctccacca gcagcttagt 4200

gaggtgtggc ttcaggttgg agatctcact gatgccaatg tcagatgact ccaagaagag 4260

ggaaaccctg ctcagagaga aggccagcat cagactgccc ctggagatcg acaggcggac 4320

gttcagactg aggtctgcct tcaggagcag caggatgatg acggacccat ccgggcgctt 4380

aacgaacacc tggagcagga ctgacagctc aacggtggct ttgttgggtt ccaagaggag 4440

gatggggttc cccacacact ccacacggat gcttagaggg ctggctgcgg ggcagctggt 4500

gcacccagtg ggataaaggt ctgtgatgga atctctcagc tggttggccc cagagaaagc 4560

ttccgacgag caggggaagg tgtatggctg gatatggagc agcagggcca gcagggagct 4620

gaggaagctc tggcgcaaaa tgatgaccag cagcccgtcc agcagcgggg gcaacgtgga 4680

ggcatacgag tcgtggggga tgatgctgcc tcccatctgc tgcaccgtgc catctaaatc 4740

catcatcagg gacgaaccgg aggtgaatgg tgggccgacc aggtggtagt gaaccatccc 4800

cttcaagccg actggcatca ccacattcag agtgctcagg agctggacgt tcactatctc 4860

tgagacagca tccatcactg gacacagcaa accaggcagc gttgctgtca ggtggctgaa 4920

caccatgtca tgcactgaca gggacagtaa gccagagatc agcttgatct ttacagcacc 4980

aagaatgcag aagcagtcat caacagtgac gtggactgta cccaactcaa aacttgtgct 5040

tttgatgttg gaggtaatgg tcacatccag ggagatagcg atcacctcag acagaatgcc 5100

catcaagcag ttgccactga gatccaggtg cacggtgacg accaactgca tcccaatccc 5160

cggcagcagt gctatcgaca gcgtgggcag ccaggagcgc tccaggtgca gccccgtgat 5220

gatggtgggg gagctcagca gaccccgatc actcatgatg tttggcagcg ccatgccctg 5280

caggtgcttc tcgaggcatg cggtaccaag cttgtcgaga agtactagag gatcataatc 5340

agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg 5400

aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat 5460

ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 5520

tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat ctgatcactg 5580

cttgagccta ggagatccga accagataag tgaaatctag ttccaaacta ttttgtcatt 5640

tttaattttc gtattagctt acgacgctac acccagttcc catctatttt gtcactcttc 5700

cctaaataat ccttaaaaac tccatttcca cccctcccag ttcccaacta ttttgtccgc 5760

ccacagcggg gcatttttct tcctgttatg tttttaatca aacatcctgc caactccatg 5820

tgacaaaccg tcatcttcgg ctactttttc tctgtcacag aatgaaaatt tttctgtcat 5880

ctcttcgtta ttaatgtttg taattgactg aatatcaacg cttatttgca gcctgaatgg 5940

cgaatg 5946

Claims (1)

1.一种蛋白OCX-36在制备结膜炎的药品中的应用，其特征在于：所述蛋白OCX-36由以下步骤制备而成：

1)重组表达载体pFastBac1-OCX-36的制备：

a.以SEQ ID NO.1所示OCX-36基因序列设计特异性引物对，该引物对分别加入保护碱基和相应的限制酶切位点，引物序列分别为：

F-XhoⅠ:CGGGATCCATGAAGCCGCTGAAGCTTTT；

R-EcoRⅠ:CGGAATTCTCACACGGAGATCGCCAACA；

b.以动物蛋白基因OCX-36的序列为模板，进行PCR，得到PCR产物；

c.将PCR产物连接到质粒pMD-19T上，得到质粒pMD-19T-OCX-36；

d.XhoⅠ和EcoRⅠ分别对pMD-19T-OCX-36和pFastBac1进行双酶切，回收得到酶切化的OCX-36和线性化的pFastBac1；

e.将酶切化的OCX-36和线性化的pFastBac1用T4连接酶4℃连接过夜，得到连接产物；转化验证，得到重组表达载体pFastBac1-OCX-36；

2)重组杆状病毒Bacmid-OCX-36的制备：

A.将重组表达载体pFastBac1-OCX-36含有Bacmid质粒的E.Coli DH10Bac感受态细胞中，得到重组杆状病毒质粒Bacmid-OCX-36；

B.将对数生长期的昆虫细胞加入到六孔板中，重组杆状病毒质粒Bacmid-OCX-36转染昆虫细胞，培养，离心收集上清，为P1代重组杆状病毒；

C.将得到的P1代重组杆状病毒转染昆虫细胞，表达得到P2代重组杆状病毒；即为重组杆状病毒Bacmid-OCX-36；

3)蛋白OCX-36的制备：

i.取对数生长期悬浮培养的昆虫细胞，重组杆状病毒Bacmid-OCX-36进行转染，离心得到转染病毒的上清液，

ii.将上清液超滤离心管浓缩，上样至亲和层析柱，洗脱目的蛋白，将目的蛋白放入透析过夜，SDS-PAGE和Western Blot检测，即为蛋白OCX-36。

Images