CN112666348A

CN112666348A - 新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测蛋白组及应用

Info

Publication number: CN112666348A
Application number: CN202011165862.1A
Authority: CN
Inventors: 仝舟; 高山; 杨勃; 张德梅; 张智超; 闫红
Original assignee: Shanxi Institute Of Higher Innovation
Current assignee: Shanxi Institute Of Higher Innovation
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的检测蛋白组及应用，其用于检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的检测方法为酶联免疫吸附剂测定法。本发明对N蛋白进行了优化，并针对新型冠状病毒S基因，通过结构分析，选取了S蛋白的受体结合区域(RBD 331aa‑532aa)进行表达，能够进一步增加检测的特异性；使用酶联免疫吸附剂测定法，通过优化包被浓度和时间、一抗二抗孵育时间，显色时间等条件，可以高效准确的测定待测血清是否为阳性。

Description

新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测蛋白组及应用

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测领域，具体涉及新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测蛋白组及应用。

背景技术

最近由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎暴发对全球公共卫生构成了巨大威胁。因此，快速准确地识别病原病毒在选择适当的治疗方法，挽救生命和预防流行病方面起着至关重要的作用。建立快速的标准诊断测试以检测传染病(COVID-19)，以防止随后的继发性传播很重要。

ELISA是酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初由VAN MEEMEM、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继报道后，现已引起广泛重视。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，不仅适用于临床样本的检测，而且由于一天之内可以检测几百甚至上千份样品，因此是一种早期诊断的良好方法。

但是被检测者是否被感染和所处于的感染阶段，我们目前的方法通常是检测病人新型冠状病毒核酸含量，实际工作中由于采集样品类型、采集后间隔时间都会导致核酸阳性率降低；同时核酸检测的时间长，对实验室生物安全等级要求高，不便于各基层医院普遍开展。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于解决现有检测方法由于检测时间长导致的阳性率降低，要求高的问题，从而提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测蛋白组及应用，其检测方法具体为一种采用酶联免疫吸附剂测定的检测方法，具有检测快速和准确度高的优势。

为此，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测蛋白组，包括：

(1)、氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的S蛋白RBD 331aa-532aa区域；

(2)、如(1)中所述的氨基酸序列中经过至少一个氨基酸的取代、缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

本发明还提供一种与上述的蛋白组相关的生物材料，包括如下任意一种：

a1、编码权利要求1所述的蛋白组的基因；

a2、含有a1中所述的基因的表达盒；

a3、含有a1中所述的基因或a2中所述的表达盒的重组载体；

a4、含有a1中所述的基因、a2中所述的表达盒或a3中所述的重组载体的微生物。

进一步，编码权利要求1所述的蛋白组的基因如下任意一种：

b1、N蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，S蛋白RBD 331aa-532aa区域的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

b2、与b1中的基因序列具有85％以上的同源性，且能够编码权利要求1所述的蛋白组。

本发明还提供上述的蛋白组或生物材料在制备检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的产品中的用途；

可选的，所述的产品为引物、探针或试剂盒。

本发明还提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的酶联免疫吸附检测试剂盒，包括上述的蛋白组。

进一步地，包括：含3-5wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液、包被液、封闭液封闭液、显色剂、终止液、空白对照、阴性对照、阳性对照或二抗中的至少一种；

可选的，封闭液为含5wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液；

可选的，显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；

可选的，空白对照为含3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液；

可选的，阴性对照为使用3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液稀释10000倍的无关抗体；

可选的，阳性对照为使用3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液稀释10000倍的新型冠状病毒单抗；

可选的，二抗为山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG、山羊抗人IgM和山羊抗人IgG。

本发明还一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的酶联免疫吸附检测方法，包括如下步骤:

S1：使用纯化后的N蛋白和S蛋白RBD 331aa-532aa区域制备预包被新冠病毒抗原的包被板；

S2：在包被板中分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照和空白对照，进行一抗孵育，并洗板；

S3：在包被板中分别加入山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG、山羊抗人IgM和山羊抗人IgG进行二抗孵育，并洗板；

S4：加显色剂显色后，加入终止液，读板。

进一步，S1中所述预包被新冠病毒抗原的包被板的制备方法为，

使用包被液分别将纯化后的N蛋白和S蛋白RBD 331aa-532aa区域稀释到1ng/μL，将包被板平均分为两部分，一半加入100μL/孔稀释后的N蛋白，一半加入100μL/孔稀释后的S蛋白RBD 331aa-532aa区域，在4℃下静置5小时后洗板3-5次；

加入5wt％脱脂奶粉100μL的磷酸盐吐温缓冲液在4-5℃过夜封闭，然后洗板3-5次。

S2中所述待测样品为使用3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液稀释100倍的待测血清样品；

所述阴性对照为使用3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液稀释10000倍的无关抗体；

所述阳性对照为使用3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液稀释10000倍的新型冠状病毒单抗；

所述空白对照为3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液；

所述一次孵育为，将待测样品、阴性对照、阳性对照和空白对照各100μL分别加入包被板不同的孔中，每种样品在包被N蛋白和S蛋白RBD 331aa-532aa区域各滴加至少2个孔，在室温静置30-40min。

S3中所述山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG、山羊抗人IgM和山羊抗人IgG均为使用3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液稀释10000倍的样品，所述二次孵育为，取山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG、山羊抗人IgM和山羊抗人IgG各100μL，山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG分别加入包被板中滴加阴性对照、阳性对照和空白对照的孔，山羊抗人IgM和山羊抗人IgG分别加入包被板中滴加待测样品的孔，在室温静置30-40min。

S4中所述显色为加入50μL/孔的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液作为显色剂显色2-4min，然后加入50μL/孔的终止剂溶液，所述读板为使用酶标机测量各孔的OD450值。

进一步地，所述洗板为加入150μL/孔的磷酸盐吐温缓冲液，每两次洗板间隔2-3min，所述磷酸盐吐温缓冲液含有1wt％的吐温20。

优选地，还包括所述N蛋白的纯化，包括：

将OD值0.5-0.7的含有质粒pET-30a-nCoV-N的菌株在含有卡那霉素的LB培养基中培养，培养温度为36-38℃，以150-200r/min的转速震荡培养；

当光密度的OD值为0.55-0.65时，向LB培养基中加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷，在15-20℃过夜诱导；

最后经超声破碎、洗脱和凝胶层析达到分离纯化；

优选地，所述洗脱为使用1mol/LNaCl作为洗脱液的His-HP柱洗脱。

还包括所述S蛋白RBD 331aa-532aa区域的纯化，包括

将40μg的pEZT-sp-nCoV RBD质粒加入DMEM培养基混合，使其最终体积为1mL得到溶液一，然后120ug聚乙烯亚胺加入DMEM培养基混合，使其最终体积为1mL得到溶液二；

然后将溶液二滴入溶液一中，在室温中放置15-20min得到溶液三；

将溶液三滴入提前1天铺的293T细胞中，静置36-48小时；

收集上清液通过洗脱达到分离纯化；

优选地，所述洗脱为使用0.15mol/LNaCl作为洗脱液的His-HP柱洗脱。

进一步地，所述卡那霉素在LB培养基中的浓度为45-55μg/mL，异丙基硫代半乳糖苷在LB培养基中的浓度为0.5-1.5mmol/L。

本发明技术方案，具有如下优点：

(1)本申请对N蛋白进行了优化，并针对新型冠状病毒S基因，通过结构分析，选取了S蛋白的受体结合区域(RBD 331aa-532aa)进行表达，能够进一步增加检测的特异性。

(2)本发明使用酶联免疫吸附剂测定法，通过优化包被浓度和时间、一抗二抗孵育时间，显色时间等条件，可以高效准确的测定待测血清是否为阳性。

(3)由于N蛋白在表达过程中容易降解并且与核酸结合能力强，导致蛋白不稳定和降解，通过对其纯化，能够极大的增加蛋白的表达量和可溶性，同时在纯化过程中采用盐洗来有效的降低与核酸的结合。

(4)本申请通过检测发现其不同时期血清中N蛋白和S蛋白抗体含量，可以直观看到病人在一段时间内的抗体水平变化和临床血清学表现。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为试验例2中病人1不同抽血日期的血清样品的其N蛋白和S蛋白的IgG和IgM的OD450值；

图2为试验例2中病人2不同抽血日期的血清样品的其N蛋白和S蛋白的IgG和IgM的OD450值；

图3为pET-30a载体的质粒图谱；

图4为pEZT-sp载体的质粒图谱。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。

本发明使用的试剂和仪器如下：

pET-30a-nCoV-N为按照常规方法将N蛋白的基因核苷酸序列(如SEQ ID NO.3所示)插入pET-30a载体(质粒图谱如图3所示)中的Nco I和BamH I之间后获得的重组载体，所述重组载体用以表达N蛋白(如SEQ ID NO.1所示)；

pEZT-sp-nCoV RBD为按照常规方法将RBD 331aa-532aa区域的基因核苷酸序列(如SEQ ID NO.4所示)插入pEZT-sp载体(序列如SEQ ID NO.5所示，质粒图谱如图4所示)中的XhoI和Kpn I之间后获得的重组载体，所述重组载体用以表达S蛋白RBD 331aa-532aa区域的蛋白(如SEQ ID NO.2所示)；

上述的pET-30a-nCoV-N和pEZT-sp-nCoV RBD均为委托苏州金唯智合成；

使用的菌株为BL21(DE3)，生产公司为北京天根生物有限公司；

无关抗体为CST 97335；

新型冠状病毒单抗来自Sino Biological，40143-R019，1mg/mL；

山羊抗兔IgM来自abcam，ab97195；

山羊抗兔IgG来自柏奥易杰，be0101；

山羊抗人IgM来自博士德，ba1077；

山羊抗人IgG来自中杉金桥，zb2304；

3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液为TMB显色液来自碧云天，P0209；

包被液来自索莱宝，C1055；

终止液来自索莱宝，C1058；

DMEM培养基来自gibco，C11995500BT；

293T细胞为人胚肾细胞，来自丰晖生物，CL0005；

聚乙烯亚胺来自polysciences，23966-1；

其余试剂均为市售标准试剂。

本申请使用的待测血清样品来自山西省血液中心。

以下实施例中，卡那霉素在LB培养基中的浓度均为50μg/mL，异丙基硫代半乳糖苷在LB培养基中的浓度均为1mmol/L；

所述磷酸盐吐温缓冲液含有1wt％的吐温20；

所述待测样品为使用3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液稀释100倍的待测血清样品；

所述空白对照为3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液；

所述山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG、山羊抗人IgM和山羊抗人IgG均为使用3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液稀释10000倍的样品；

所述洗板为加入150μL/孔的磷酸盐吐温缓冲液，每两次洗板之间间隔2分钟。

以下具体实施例是对本发明的进一步说明，所举案例并不能列举出本发明的全部实施方式，仅以其中部分实施方式为例进行说明，具体实施例如下：

实施例1

本发明提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法，所述检测方法为酶联免疫吸附剂测定法，包括如下步骤：

(1)将含有质粒pET-30a-nCoV-N的菌株在含有卡那霉素的LB培养基中培养，培养温度为37℃，以180r/min的转速震荡培养；

当光密度的OD值为0.6时，向LB培养基中加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷，在18℃过夜诱导；

最后经超声破碎、使用1mol/LNaCl作为洗脱液的His-HP柱洗脱和凝胶层析后得到纯化后的N蛋白；

(2)将40μg的pEZT-sp-nCoV RBD质粒加入DMEM培养基混合，使其最终体积为1mL得到溶液一，然后120ug聚乙烯亚胺加入DMEM培养基混合，使其最终体积为1mL得到溶液二；

然后将溶液二滴入溶液一中，在室温中放置15min得到溶液三；

将溶液三滴入提前1天铺的293T细胞中，静置36小时；

收集上清液通过使用0.15mol/LNaCl作为洗脱液的His-HP柱洗脱得到纯化后的S蛋白RBD 331aa-532aa区域；

(3)使用包被液分别将纯化后的N蛋白和S蛋白RBD 331aa-532aa区域稀释到1ng/μL，将包被板平均分为两部分，一半加入100μL/孔稀释后的N蛋白，一半加入100μL/孔稀释后的S蛋白RBD 331aa-532aa区域，在4℃下静置5小时后洗板3次；

加入5wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液4℃过夜封闭，然后洗板5次；

(4)将待测样品、阴性对照、阳性对照和空白对照各100μL分别加入包被板不同的孔中，每种样品在包被N蛋白和S蛋白RBD 331aa-532aa区域各滴加2个孔，在室温静置30min；

(5)取山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG、山羊抗人IgM和山羊抗人IgG各100μL，山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG分别加入包被板中滴加阴性对照、阳性对照和空白对照的孔，山羊抗人IgM和山羊抗人IgG分别加入包被板中滴加待测样品的孔，在室温静置30min，并洗板5次；

(6)加入50μL/孔的3,3',5,5'-四甲基联苯胺作为显色剂显色3min，然后加入50μL/孔的终止剂，最后测量各孔的OD450值。

实施例2

(1)将含有质粒pET-30a-nCoV-N的菌株在含有卡那霉素的LB培养基中培养，培养温度为38℃，以200r/min的转速震荡培养；

当光密度的OD值为0.65时，向LB培养基中加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷，在20℃过夜诱导；

然后将溶液二滴入溶液一中，在室温中放置20min得到溶液三；

将溶液三滴入提前1天铺的293T细胞中，静置48小时；

(3)使用包被液分别将纯化后的N蛋白和S蛋白RBD 331aa-532aa区域稀释到1ng/μL，将包被板平均分为两部分，一半加入100μL/孔稀释后的N蛋白，一半加入100μL/孔稀释后的S蛋白RBD 331aa-532aa区域，在4℃下静置5小时后洗板5次；

加入5wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液5℃过夜封闭，然后洗板3次；

(5)取山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG、山羊抗人IgM和山羊抗人IgG各100μL，山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG分别加入包被板中滴加阴性对照、阳性对照和空白对照的孔，山羊抗人IgM和山羊抗人IgG分别加入包被板中滴加待测样品的孔，在室温静置40min，并洗板3次；

(6)加入50μL/孔的3,3',5,5'-四甲基联苯胺作为显色剂显色2min，然后加入50μL/孔的终止剂，最后测量各孔的OD450值。

实施例3

(1)将含有质粒pET-30a-nCoV-N的菌株在含有卡那霉素的LB培养基中培养，培养温度为36℃，以150r/min的转速震荡培养；

当光密度的OD值为0.55时，向LB培养基中加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷，在15℃过夜诱导；

然后将溶液二滴入溶液一中，在室温中放置18min得到溶液三；

将溶液三滴入提前1天铺的293T细胞中，静置40小时；

(3)使用包被液分别将纯化后的N蛋白和S蛋白RBD 331aa-532aa区域稀释到1ng/μL，将包被板平均分为两部分，一半加入100μL/孔稀释后的N蛋白，一半加入100μL/孔稀释后的S蛋白RBD 331aa-532aa区域，在4℃下静置5小时后洗板4次；

(4)将待测样品、阴性对照、阳性对照和空白对照各100μL分别加入包被板不同的孔中，每种样品在包被N蛋白和S蛋白RBD 331aa-532aa区域各滴加2个孔，在室温静置40min；

(6)加入50μL/孔的3,3',5,5'-四甲基联苯胺作为显色剂显色4min，然后加入50μL/孔的终止剂，最后测量各孔的OD450值。

试验例1

使用实施例1的检测方法对血液中心57例样品进行检测，其N蛋白和S蛋白的IgG和IgM的OD450值分别如下表1所示：

表1 57例血液样品的N蛋白和S蛋白的IgG和IgM的OD450值

新型冠状病毒特异性IgM抗体在发病3～5d后产生，IgG可在10～15d产生抗体，新型冠状病毒的S蛋白在发病前期发挥作用，N蛋白则是在病毒在机体复制过程中大量产生。S和N蛋白的抗体产生水平可以说明病人所处的发病时期。并且IgM优先于IgG生成，结果里的阳性率，是因为采集的病人血样时期不一定都相同，所以病人的四项指标不一定完全一致。但是我们只把4项结果都为阴性的病人归为非感染病人，当四项检测结果，有一项是阳性，则认为病人疑似阳性患者。每次试验结果的判断，每次试验设置至少5个不同阴性对照组，计算阴性样品读数的平均值和标准差。按照阳性结果＝平均值+3×标准差。通过稳定试验方法，将阳性值可以稳定在0.2左右以上，但每次测定还有根据阴性结果一起判断。

上表为本检测方法对血液中心提供的共57分血液样品进行检测，阳性率如上表所示，结果和血液中心提供参考进行比较，符合率高于80％。

试验例2

使用实施例1的检测方法对血液中心2名康复中的病人不同抽血日期的血清样品进行检测，其N蛋白和S蛋白的IgG和IgM的OD450值分别如图1，图2所示。

从图中可以直观看到病人在一段时间内的抗体水平变化和临床血清学表现，其中，图1的病人抗体水平变化不明显表明该阶段病人病情没有明显好转，图2的病人随时间增加抗体水平下降表明病人正在康复。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 山西高等创新研究院

<120> 新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测蛋白组及应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 2

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg

1 5 10 15

Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val

20 25 30

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

35 40 45

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

50 55 60

Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile

65 70 75 80

Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro

85 90 95

Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp

100 105 110

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

115 120 125

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

130 135 140

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

165 170 175

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

180 185 190

Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn

195 200

<210> 3

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtcagata acggccctca gaaccagcgc aacgctcctc gcattacatt tggcggccct 60

tcagattcaa caggctcaaa ccagaacggc gaacgctcag gcgctcgctc aaagcaaaga 120

cgccctcagg gccttcctaa caacacagct tcatggttta cagctcttac acagcatggc 180

aaagaagatc ttaaatttcc tcgcggccag ggcgttccta ttaacacaaa ctcatcacct 240

gatgatcaga ttggctatta tcgccgcgct acacgccgca ttcgcggcgg cgatggcaag 300

atgaaggatc tttcacctcg ctggtatttc tactaccttg gcacaggccc tgaagctggc 360

cttccttatg gcgctaacaa agatggcatt atttgggttg ctacagaagg cgctcttaac 420

acacctaaag atcatattgg cacacgcaac cctgctaaca acgctgctat tgttcttcag 480

cttcctcagg gcacaacact tcctaaaggc ttctacgcag aaggctcacg cggcggctca 540

caggcttcgt ctcgatccag cagtcgaagt aggaactcga gccgaaattc tactccgggc 600

tcatcacgcg gcacatcacc tgctcgcatg gctggcaacg gcggcgatgc tgctcttgct 660

cttcttcttc ttgatcgcct taaccagctt gaatcaaaga tgtctggcaa aggccagcag 720

cagcagggcc aaaccgtaac taagaagtca gcggctgaag cttcaaagaa gcccaggcag 780

aaacgcacag ctacaaaggc ctacaacgtt acacaggctt tcgggcgtcg cggccctgaa 840

cagacacagg gcaactttgg cgatcaggaa cttattcgcc agggcacaga ttataaacat 900

tggcctcaga ttgctcagtt tgctccttca gcttcagctt tcttcgggat gtcacgcatt 960

ggcatggaag ttacaccttc aggcacatgg cttacatata caggtgcgat aaagctagac 1020

gacaaggacc caaatttcaa ggaccaagtg atcctgctga ataagcacat tgatgcttat 1080

aagaccttcc ctcctacaga acctaagaag gacaagaaga agaaagcgga cgaaacacag 1140

gctcttcctc agcgccagaa gaagcaacag acggtaactt tactacctgc tgctgatctt 1200

gatgatttca gtaaacaact gcagcagtca atgtcatcag ctgattcaac acaggcttaa 1260

<210> 4

<211> 606

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacatcacaa acctgtgccc tttcggcgag gtgttcaacg ccacccggtt cgcctctgtg 60

tacgcctgga accggaagcg gatctctaac tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac 120

tccgcctctt tctctacatt caagtgctac ggcgtgtccc ctacaaagct gaacgacctg 180

tgcttcacca acgtgtacgc cgactctttc gtgattagag gcgacgaggt gaggcagatt 240

gcccccggcc agacaggcaa gatcgccgac tacaactaca agctgcccga cgacttcaca 300

ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaac ctggactcta aggtgggcgg caactacaac 360

tacctgtaca gactgttccg gaagtctaac ctgaagccat tcgagaggga cattagcacc 420

gagatttacc aggccggctc taccccatgc aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc 480

ccactgcagt cctacggctt ccagcctaca aacggcgtgg gctaccagcc ttaccgggtg 540

gtggtgctgt ctttcgagct gctccacgcc cccgccacag tgtgcggccc aaagaagagc 600

acaaac 606

<210> 5

<211> 7580

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttctctgtca cagaatgaaa atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga 60

ctgaatatca acgcttattt gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc 120

attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 180

agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 240

tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 300

ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 360

ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 420

aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 480

ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 540

attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 600

tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 660

gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 720

tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 780

aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 840

cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 900

agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 960

ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 1020

tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 1080

tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 1140

caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 1200

accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 1260

attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 1320

ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 1380

taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 1440

taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 1500

aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 1560

agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 1620

ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 1680

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 1740

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 1800

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 1860

tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1920

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1980

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 2040

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 2100

acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 2160

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 2220

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 2280

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 2340

ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 2400

taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 2460

cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 2520

tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct ggcaaaatcg gttacggttg 2580

agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa 2640

caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag acagaatagt tgtaaactga 2700

aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt tgttatggct aaagcaaact 2760

cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga ggggcgtggc caagggcatg 2820

gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac aactccgcgg ccgggaagcc 2880

gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg tcgatatcaa agtgcatcac 2940

ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg ggatcgtcac cgtaatctgc 3000

ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca tgcttgagga gattgatgag 3060

cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact gcgagatcat agatatagat 3120

ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc gcgagagcgc caacaaccgc 3180

ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta cggagcaagt tcccgaggta 3240

atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct ccgaactcac gaccgaaaag 3300

atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg agcctacatg tgcgaatgat 3360

gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt 3420

gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg 3480

cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa acagtcataa caagccatga 3540

aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg 3600

agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca ggcttatgtc aactgggttc 3660

gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg 3720

aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg 3780

cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg cacggatctg ccctggcttc 3840

aggagatcgg tagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag 3900

tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt gttcgcccag gactctagct 3960

atagttctag tggttggcct acgtacccgt agtggctatg gcagggcttg ccgccccgac 4020

gttggctgcg agccctgggc cttcacccga acttgggggt tggggtgggg aaaaggaaga 4080

aacgcgggcg tattggtccc aatggggtct cggtggggta tcgacagagt gccagccctg 4140

ggaccgaacc ccgcgtttat gaacaaacga cccaacaccc gtgcgtttta ttctgtcttt 4200

ttattgccgt catagcgcgg gttccttccg gtattgtctc cttccgtgtt tcagttagcc 4260

tcccccatct cccggttccg catgctatgc atccttgtac agctcgtcca tgccgagagt 4320

gatcccggcg gcggtcacga actccagcag gaccatgtga tcgcgcttct cgttggggtc 4380

tttgctcagc ttggactggg tgctcaggta gtggttgtcg ggcagcagca cggggccgtc 4440

gccgatgggg gtgttctgct ggtagtggtc ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt 4500

gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac 4560

gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa 4620

gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc 4680

gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc 4740

gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca 4800

ctgcacgccg taggtcaggg tggtcacgag ggtgggccag ggcacgggca gcttgccggt 4860

ggtgcagatg aacttcaggg tcagcttgcc gtaggtggca tcgccctcgc cctcgccgga 4920

cacgctgaac ttgtggccgt ttacgtcgcc gtccagctcg accaggatgg gcaccacccc 4980

ggtgaacagc tcctcgccct tgctcaccgg gtgatcaagt cttcgtcgag tgattgtaaa 5040

taaaatgtaa tttacagtat agtattttaa ttaatataca aatgatttga taataattct 5100

tatttaacta taatatattg tgttgggttg aattaaaggt ccgtatactc cggaatatta 5160

ataggatccc ggtccgaagc gcgcggaatt caatattggc cattagccat attattcatt 5220

ggttatatag cataaatcaa tattggctat tggccattgc atacgttgta tctatatcat 5280

aatatgtaca tttatattgg ctcatgtcca atatgaccgc catgttggca ttgattattg 5340

actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 5400

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 5460

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 5520

caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 5580

ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 5640

tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 5700

accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 5760

ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 5820

cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga cgcaaatggg cggtaggcgt 5880

gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cactagaagc 5940

tttattgcgg tagtttatca cagttaaatt gctaacgcag tcagtgcttc tgacacaaca 6000

gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt 6060

acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg 6120

cgtttctgat aggcacctat tggtcttact gacatccact ttgcctttct ctccacaggt 6180

gtccactccc agttcaatta cagctcttaa ggctagagta cttaatacga ctcactatag 6240

gctagcgcca ccatggggat ccttcccagc cctgggatgc ctgcgctgct ctccctcgtg 6300

agccttctct ccgtgctgct gatgggttgc gtagctgaac tcgaggtcga caccggtgcg 6360

gccgcatcta gaggcgcgcc tacgcgtccc gggggatccg gtacccatca ccaccatcat 6420

caccatcatt gaaagcttaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt 6480

attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtgaatacg ctgctttaat gcctttgtat 6540

catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg 6600

tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt 6660

gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact 6720

ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc 6780

tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg 6840

tcctttccat ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc 6900

tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg 6960

cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc 7020

tccccgcctg cagtctcgac aagcttgtcg agaagtacta gaggatcata atcagccata 7080

ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga 7140

aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 7200

aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 7260

gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatctgatca ctgcttgagc 7320

ctaggagatc cgaaccagat aagtgaaatc tagttccaaa ctattttgtc atttttaatt 7380

ttcgtattag cttacgacgc tacacccagt tcccatctat tttgtcactc ttccctaaat 7440

aatccttaaa aactccattt ccacccctcc cagttcccaa ctattttgtc cgcccacagc 7500

ggggcatttt tcttcctgtt atgtttttaa tcaaacatcc tgccaactcc atgtgacaaa 7560

ccgtcatctt cggctacttt 7580

Claims

1.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测蛋白组，其特征在于，包括：

(1)、氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N蛋白，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的S蛋白RBD 331aa-532aa区域；

2.一种与权利要求1所述的蛋白组相关的生物材料，其特征在于，包括如下任意一种：

a1、编码权利要求1所述的蛋白组的基因；

a2、含有a1中所述的基因的表达盒；

a3、含有a1中所述的基因或a2中所述的表达盒的重组载体；

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，编码权利要求1所述的蛋白组的基因如下任意一种：

4.权利要求1中所述的蛋白组或权利要求2或3所述的生物材料在制备检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的产品中的用途；

可选的，所述的产品为引物、探针或试剂盒。

5.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的酶联免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1中所述的蛋白组。

6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2的酶联免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，包括：含3-5wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液、包被液、封闭液、显色剂、终止液、空白对照、阴性对照、阳性对照或二抗中的至少一种；

可选的，封闭液为含5wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液；

可选的，显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；

可选的，空白对照为含3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液；

可选的，二抗为山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG、山羊抗人IgM或山羊抗人IgG。

7.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的酶联免疫吸附检测方法,其特征在于，包括如下步骤:

S4：加显色剂显色后，加入终止液，读板。

8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于，

S1中所述预包被新冠病毒抗原的包被板的制备方法为，

使用包被液分别将纯化后的N蛋白和S蛋白RBD 331aa-532aa区域稀释到1ng/μL，将包被板平均分为两部分，一半加入100μL/孔稀释后的N蛋白，一半加入100μL/孔稀释后的S蛋白RBD 331aa-532aa区域，在4℃下静置5小时后洗板3-5次，

加入5wt％脱脂奶粉100μL的磷酸盐吐温缓冲液在4-5℃过夜封闭，然后洗板3-5次；

所述空白对照为3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液；

所述一次孵育为，将待测样品、阴性对照、阳性对照和空白对照各100μL分别加入包被板不同的孔中，每种样品在包被N蛋白和S蛋白RBD331aa-532aa区域各滴加至少2个孔，在室温静置30-40min；

S3中所述山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG、山羊抗人IgM和山羊抗人IgG均为使用3wt％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液稀释10000倍的样品，所述二次孵育为，取山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG、山羊抗人IgM和山羊抗人IgG各100μL，山羊抗兔IgM、山羊抗兔IgG分别加入包被板中滴加阴性对照、阳性对照和空白对照的孔，山羊抗人IgM和山羊抗人IgG分别加入包被板中滴加待测样品的孔，在室温静置30-40min；

S4中所述显色为加入50μL/孔的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液作为显色剂显色2-4min，然后加入50μL/孔的终止剂溶液，所述读板为使用酶标机测量各孔的OD450值；

其中所述洗板为加入150μL/孔的磷酸盐吐温缓冲液，每两次洗板间隔2-3min，所述磷酸盐吐温缓冲液含有1wt％的吐温20。

9.根据权利要求7或8所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于，还包括所述N蛋白的纯化，包括：

最后经超声破碎、洗脱和凝胶层析达到分离纯化得到纯化后的N蛋白；

其中，所述卡那霉素在LB培养基中的浓度为45-55μg/mL，异丙基硫代半乳糖苷在LB培养基中的浓度为0.5-1.5mmol/L。

10.根据权利要求7-9任一所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于，还包括所述S蛋白RBD 331aa-532aa区域的纯化，包括，

将溶液三滴入提前1天铺的293T细胞中，静置36-48小时；

收集上清液通过洗脱达到分离纯化得到纯化后的S蛋白RBD331aa-532aa区域。