CN109897894B

CN109897894B - 一种成骨发育不全疾病的致病突变及其检测试剂

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Publication number: CN109897894B
Application number: CN201811608237.2A
Authority: CN
Inventors: 黄欢
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109897894A; WO2020133233A1

Abstract

本发明公开了一种成骨发育不全的致病突变及其检测试剂。一种新型突变型COL1A1基因，突变的COL1A1基因为单点突变c.1822G>A(chr17:48270211)，杂合突变即致病，为显性遗传方式，氨基酸变化p.Gly608Ser，其位点突变导致结缔组织中I型胶原合成障碍，形成病变。一种检测成骨发育不全的试剂盒包括：检测COL1A1基因CDS第1822bp位点的试剂；或检测COL1A1蛋白第608位氨基酸位点的试剂。本发明获得成骨发育不全疾病的致病突变(COL1A1基因上c.1822G>A)，通过检测该突变可以进行成骨发育不全疾病的诊断。

Description

一种成骨发育不全疾病的致病突变及其检测试剂

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种成骨发育不全疾病的致病突变及其检测试剂。

背景技术

成骨不全症(osteogenesis imperfecta，OI)，是一种少见的先天性骨骼发育障碍性疾病，又称脆骨病，瓷娃娃，或脆骨-蓝巩膜-耳聋综合征。特征为骨质脆弱、蓝巩膜、耳聋、关节松弛，是一种由于间充质组织发育不全，胶原形成障碍而造成的先天性遗传性疼痛。患儿易发骨折，轻微的碰撞，也会造成严重的骨折。目前OI无特殊治疗方法，主要是预防骨折，药物治疗疗效不肯定，干细胞治疗及基因治疗方法有待进一步研究、鉴定，短时间内还不能应用于临床。OI具有遗传性和家族性，但也有少数为单发病例。OI在我国乃至世界范围内均有较高的发病率，约10万分之3，发病男女的比例大约相同。我国是OI遗传资源大国，但目前OI相关的遗传学信息多来自西方国家，因此对我国OI患者进行深入的遗传学研究，探寻潜在的OI相关的新致病基因及致病突变显得尤为重要。

OI为单基因遗传病，其常见的遗传模式有常染色体显性遗传及常染色体隐性遗传。OI发生主要是由于组成I型胶原的α1或α2前胶原(Pro-α1或Pro-α2)链的基因(即COL1A1和COL1A2)的突变，导致I型胶原合成障碍，结缔组织中胶原量尤其是I型胶原含量下降，胶原是骨骼、皮肤、巩膜及牙本质等组织的主要胶原成分，因而这些部位的病变更明显。根据基因突变可分成4-11种类型，但有争议，且不同类型的成骨不全症严重程度和预后不同。。目前仍有很多OI患者的致病基因尚未找到，尤其在胎儿期，很多临床表现无法在子宫内通过超声等技术方法显现出来，因此有可能跟骨骼发育异常的多种遗传病混淆，提示存在大量OI等骨骼发育异常的新致病基因及新致病突变有待挖掘。

针对OI的分子遗传学研究必须建立在一定的分子生物学技术的基础上。研究OI致病基因的一个重要目的是进行OI的分子诊断，如何检测众多致病基因突变是目前的难题之一。基因连锁分析的定位克隆策略是鉴定单基因遗传病致病基因的经典方法，但是同时也面临一些困难：(1)通常需要多代家系，难以分析小家系和散发病例。(2)有时多代家系也不能定位致病位点。(3)难以在连锁区域内筛选出正确的致病基因。产前诊断依靠超声学检查胎儿的骨骼系统也仅可以发现少数骨发育障碍性疾病，且难以区分不同类型的骨骼发育异常。因此，鉴于胎儿期OI疾病难以区分的性质及传统分析技术的局限性，寻求一种全新的OI致病基因的研究方法显得尤为迫切。

COL1A1位于17号染色体长臂17q21-22位置，该基因长18kb,有51个外显子。每个Ⅰ型胶原的三胶螺旋区都含有338个连续重复的三氨基酸GXY,其中G为甘氨酸,X和Y通常为脯氨酸和羟脯氨酸。甘氨酸的存在对三胶螺旋的形成是必须的,在这一区域中点突变引起的甘氨酸残基被替代,以及剪切位点突变引起的外显子丢失,是Ⅰ型胶原基因突变的主要形式。其他突变如插入、缺失、重复等相对较少。COL1A1基因外显子很多,迄今为止,已有百余个突变被报道，然而c.1822G>A基因突变引起OI从未被报道或得到证实。

发明内容

本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种成骨发育不全疾病的新致病突变。

本发明的另一目的是提供该致病突变的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种用于检测成骨发育不全疾病的突变的COL1A1基因，突变的COL1A1为杂合突变或纯合突变c.1822G>A，野生型COL1A1基因在NCBI数据库中的基因编号为：NM_000088.3，该基因CDS第1822bp处的碱基由G突变为A，其他部分与野生型相同。野生型的COL1A1基因CDS序列如SEQ IDNO.1所示。

一种突变的COL1A1蛋白，野生型COL1A1蛋白在NCBI数据库中的基因转录本编号为：NP_000079，突变的COL1A1蛋白在该野生型蛋白的第608位氨基酸由甘氨酸突变为丝氨酸，其他部分与野生型相同。野生型的COL1A1蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,

检测本发明所述的突变的COL1A1基因或者所述的突变的COL1A1蛋白的试剂在制备成骨发育不全疾病检测试剂或检测设备中的应用。

其所述的检测试剂优选自引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片、高通量测序、Sanger测序中的一种或多种。

所述的检测设备优选包括含有检测突变的COL1A1基因的基因芯片、高通量测序、Sanger测序的检测平台。

一种检测成骨发育不全疾病的试剂盒，所述的试剂盒包括：

(1)检测COL1A1基因CDS第1822bp处核苷酸的试剂；或检测COL1A1蛋白第608位氨基酸位点的试剂；

(2)产品使用说明书,其中明确记载COL1A1基因CDS第1822bp处核苷酸由G突变为A,或者COL1A1蛋白第608位氨基酸位点由G变为S为成骨发育不全的致病突变。

其中，所述的试剂优选自引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片。

作为本发明的一种优选，所述的试剂为基于深度测序为平台的基因芯片杂交探针。

所述的试剂进一步优选检测COL1A1基因CDS第1822bp处核苷酸的的引物对；更进一步优选由5'-TGGCGCTGTCGTAAGTAT-3'(SEQ ID NO.3)和5'-CCTGTAGGTGGGAAATGG-3'(SEQID NO.4)组成的引物对。

所述的试剂盒中检测COL1A1基因CDS第1822bp处核苷酸的基因芯片杂交探针序列优选如SEQ ID NO.5所示。

一种以深度测序为平台筛查OI患者中COL1A1基因新突变，斑马鱼突变模型结合SIFT和Polyphen蛋白功能预测来验证该基因突变为致病基因突变的方法：包含以下步骤：

(1)对于胎儿超声显示骨骼发育异常，或有OI遗传病史的家系，收集临床资料及血液、组织等含有DNA的标本，提取基因组DNA；

(2)检测与骨发育异常的一系列相关基因，包括基因ADAMTSL2，AGPS，ANKH，ARSE，CCDC8，CHST3，COL10A1，COL2A1，COL9A1，COL9A2，COL9A3，COMP，CTSK，CUL7，DLL3，EBP，EVC，EVC2，FBN1，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FLNB，GNAS,GNPAT，HES7，LFNG，LMNA，MATN3，MESP2，OBSL1，PEX7，PTH1R，ROR2，RUNX2，SLC26A2，SLC35D1，SMARCAL1，SOST，SOX9，TGFB1，TNFRS，F11A，TRAPPC2，TREM2，TYROBP，WNT5A，WNT7A，ZMPSTE24，COL1A1，COL1A2，CRTAP，P3H1，SERPINF1，IFITM5，FKBP10，PPIB，SP7，BMP1，SERPINH1，TMEM38B，WNT1B，WNT1B，WNT1。

(3)将DNA打断并制备文库，然后通过芯片对目标基因编码区及临近剪切的DNA进行捕获和富集，最后使用高通量测序平台进行突变检测。

(4)对测序结果进行优化的生物信息学分析，筛选到一个新的OI致病突变为COL1A1.Gly608Ser。突变位于17号染色体，物理位置为48270211(NCBI数据库)的碱基由G突变为A；蛋白质水平：COL1A1基因编码蛋白第608位氨基酸由甘氨酸突变为丝氨酸。

(5)步骤(3)所述的高通量测序，测序目标区长度为131271bp，目标区覆盖度达到至少99.95％，目标区平均深度至少171.42X，目标区平均深度>30X位点所占比例至少为96.99％。

(6)对于新突变位点COL1A1.Gly608Ser，用SIFT和Polyphen对其进行蛋白功能预测。

(7)利用斑马鱼模型验证COL1A1基因上c.1822G>A点突变后影响骨骼发育，在ENSEMBL数据库中找到与人COL1A1基因高度相似的基因col1a1a(ENSDARG00000012405)，通过在野生型斑马鱼中表达col1a1a同样点突变基因来模拟在人体中的显性表达，观察斑马鱼胚胎的骨骼发育情况验证新突变位点COL1A1.c.1822G>A导致骨骼发育异常OI。

有益效果

1.OI是严重的先天性骨骼发育障碍性疾病，在我国遗传病中的发病率较高，危害了国民健康。目前OI没有有效的治疗手段，预防主要是进行产前诊断，预防患儿的出生。OI具有明显的遗传异质性，分为常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传，目前已知突变上百种，但仍存在大量未知的致病基因。挖掘OI新致病突变基因有利于进一步探索OI的分子遗传学病因，从而帮助了解发病机制、辅助临床诊断、产前诊断和转基因治疗。

2.首次报道了OI致病基因COL1A1中新的突变位点c.1822G>A，为常染色体显性遗传病，无论杂合突变还是纯合突变，均致病。

3.提供了一种发现新突变的方案，即通过设计针对某种人体系统的系列基因检测panel，对生物样本提取DNA进行高通量测序检测，生物信息学分析新发突变的有害性，在斑马鱼等动物模型上进行基因敲出验证。本发明提供了OI新的致病位点，为该疾病的诊断提供了新的分子生物学基础。

附图说明

图1胎儿超声结果图

图2家系Sanger测序结果

图3人COL1A1基因与斑马鱼中的同源基因突变位置的保守性，本发明所述突变位点(G1822A)及其在斑马鱼中的对应突变位点用下划线表示

图4斑马鱼突变处序列的核苷酸和氨基酸对应图

图5构建斑马鱼转录及显微注射质粒

图6新位点在各数据库中的突变频率

图7新位点在各数据库中SIFT预测结果。

图8新位点在各数据库中polyphen预测结果。

图9野生型斑马鱼及COL1A1基因c.1822G>A突变型斑马鱼

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种OI相关基因COL1A1的新突变位点，可用于诊断上述疾病，以及用于开发对于上述疾病有效的基因治疗药物。

在检测相关位点的变异时，检测可以针对基因组DNA，也可以针对cDNA或mRNA，或针对蛋白质。可用已有的技术如Western印迹法、Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变等。

可采用各种技术来检测野生型COL1A1基因(SEQ ID NO.1)第1822位是否存在G到A的突变，这些技术包含在本发明中。例如，基于相关位点制备基因芯片和高通量测序捕获探针。此外，可用相关位点特异的引物进行PCR来进行鉴定；或可根据相关位点设计可特异性结合的探针来进行鉴定；或可利用特异性的限制性内切酶来进行鉴定。

作为一种可选的方式，还可采用基于PCR技术的单碱基延伸技术来检测变异位点，其原理是设计一条引物，位于待测变异位点的上游，且该引物的3'端距离变异位点一个碱基。加入不同荧光标记的ddNTP进行反应，或者通过焦磷酸测序加入dNTP及相关反应用酶，只有当加入的ddNTP或dNTP与变异位点碱基互补时，引物才得以延伸。可通过检测延伸碱基所发出的荧光或者焦磷酸测序中系列酶反应发出的可见光来判断变异的类型。

本发明还包括用于在分析物中检测是否含有所述变异位点(COL1A1基因CDS第1822位是否存在G到A的突变)的试剂。所述的试剂例如是：对相关突变位点特异的引物，扩增出的扩增产物含有对应于COL1A1基因第1822位的碱基；对相关突变位点特异的探针，可与发生突变区域发生特异性结合而不可与未发生突变区域特异性结合，且所述探针带有可检测信号；或对相关突变位点特异的限制性内切酶。

所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、RNA、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。

此外，所述的试剂盒中还可包含使用说明书和核酸序列分析软件等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

对一个超声提示骨骼发育异常的胎儿进行遗传检测。

实验方法：

1.孕妇系列超声结果的收集，及家族遗传史等病例资料的采集：收集该家系中各成员的临床资料和血液样本，胎儿的父母采集外周血，对孕妇行脐带血穿刺取脐带血对胎儿进行遗传诊断。用血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)对家系中各成员的血液基因组DNA进行提取。

2.采用高通量测序技术挖掘该家系的致病突变：检测与骨发育异常相关的61个基因，首先将基因组DNA片段化，并进行末端标记，与基因组DNA进行液相杂交，将目标基因组区域的DNA片段进行富集后再利用第二代测序技术进行测序。具体方案是基于120mer的RNA寡核苷酸探针或者叫“baits”。Baits上连接的生物素，可以被链霉亲和素标记的磁珠吸附。打断后的基因组片段，与baits进行杂交，捕获目标片段。利用磁珠吸附出带有baits的DNA片段后，进行磁珠洗脱、RNA探针降解，最终获得目标区域DNA片段。

3.标准信息分析的流程包括：去除接头污染和低质量数据，数据通过BWA与UCSChg19数据库进行比对，数据产量统计分析、测序深度分析、覆盖度均一性分析，SNP变异信息检测(SAMtools、SOAPsnp、GATK)，SNP的RefGene注释，SNP数据库分析(与dbSNP、千人基因组数据、ESP外显子组数据库以及炎黄基因组(仅亚太地区)数据进行数据库注释分析)，SNP保守性预测、致病性分析(仅针对人类样本，软件：SIFT、Polyphen-2、Phylop、GERP scores、Mutation assessor、Condel、FATHMM)，SNP在各基因功能元件上的分布统计，InDel变异信息检测(SAMtools、GATK)，InDel的RefGene注释，InDel数据库分析(与dbSNP、千人基因组数据、ESP外显子组数据库、炎黄基因组(仅亚太地区)进行数据库注释分析)，InDel在各基因功能元件上的分布统计。

4.经Sanger测序验证，鉴定致病基因：PCR法分别针对筛选出的突变位点及邻近DNA序列在相应家系中进行扩增，所用引物序列采用Primer 5引物设计软件设计，检测本发明所述致病突变的引物对序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。所用PCR的反应体系(50μl体系)为：10*buffer 5μl，25mM MgCl₂ 3μl，Taq DNA聚合酶5U，dNTP混合物2mM，正反向引物各1.2μM，灭菌蒸馏水加至50μl。放入PCR仪中，94℃，3min；(94℃，25s；55℃，25s；72℃15s)35个循环；72℃ 7min；4℃保存。2％琼脂糖电泳后凝胶成像仪检测，加入Marker判定片段大小，单一条带且片段大小符合的样本进行Sanger测序，判定位点是否发生突变。

实验结果：

1.超声科主任对孕妇腹中胎儿进行超声检测，发现胎儿颅骨形态异常，呈“草莓”型，胎儿双侧股骨弯曲成角，双侧胫骨弯曲，四肢发育不良，胎儿心胸比增大，主、肺动脉管径比例异常，三尖瓣轻度反流(图1)，初步判断可能为成骨发育不全，而家族中未出现过类似症状的成员。

2.通过对胎儿脐血样本DNA进行目标区域捕获测序及生物信息学分析后，发现胎儿在COL1A1基因上存在c.1822G>A突变，为VOUS突变，即临床意义不明的突变，未发现其他可疑的致病基因突变位点。经Sanger测序验证证实该基因位点的突变从未在OI患者中发现，也未在胎儿父母的外周血DNA中发现(图2)。

3.根据本发明的设计方案，成功证实所检测到的该COL1A1基因c.1822G>A突变为OI新致病位点。

实施例2：

针对实施例1中所检测出的致病基因进行功能学研究及基因敲除动物模型研究，此处以检测到的COL1A1基因新突变c.1822G>A为例。

实验方法：

1.保守型分析：对该位点在各数据库中发生的频率进行评估。

2.根据SIFT和polyphen值预测突变的致病能力。

3.基因敲除的动物模型证实突变位点为致病突变位点。

(1)分析COL1A1在斑马鱼中的同源基因及点突变位置，选择正确的斑马鱼中同源基因用于制备点突变；在ENSEMBL网站中找到与human COL1A1基因高度相似基因，为ENSDARG00000012405，分析突变位置的保守性，如图3。上述比对结果表明，该位点在斑马鱼的基因中保守，暗示其位点功能的重要性。为验证斑马鱼该位点突变导致类似的表型，选择斑马鱼中与human COL1A1相似度较高的基因col1a1a(ENSDARG00000012405)进行实验。

(2)验证COL1A1(G1822A)点突变功能的方法：在人类中，COL1A1(G1822A)在胚胎期呈现显性的骨骼发育异常表型，因此可以通过在野生型斑马鱼中表达col1a1a同样点突变基因来模拟在人体中的显性表达，进而通过观察斑马鱼胚胎的骨骼发育情况来验证。以col1a1a基因的转录本ENSDART00000009393.8的序列为参照，设计引物克隆该基因全长以及构建col1a1a(G1774A)点突变，突变处序列的核苷酸和氨基酸对应图如图4所示。

(3)构建斑马鱼中表达col1a1a(G1774A)的质粒：突变点：G1774A，突变引物：已原始质粒为模板，扩增载体骨架，选用引物col1a1a-VF(5'-GCC CAG TCT GCT TCT TGT AAGGAT CCA CCG GAT CTA GAT A-3')和col1a1a-VR(5'-GCT TAA ACA AGA ATC TCT AG-3')；已原始质粒为模板，扩增启动子区，选用引物CMV-T7-F(5'-CTA GAG ATT CTT GTT TAA GCGACA TTG ATT ATT GAC TAG-3')和CMV-T7-R(5'-AAT ATC CAC AAA GCT GAA CAT GGT GGCAAG CTT AAC TAG CCA GCT TG-3')；已斑马鱼基因组DNA为模板，扩增col1a1aM片段1，选用引物col1a1a-F1(5'-ATG TTC AGC TTT GTG GAT AT-3')和col1a1a-R1(5'-TAG TGG CACCAA TAG CAC CC-3')；为了克服非特异性扩增，在col1a1aM片段2的两端延长一段序列设计引物，引物序列如下5'-GAG GAA GGC AAG AGA GGA CC-3'及5'-CCA GGG GGA TTT TAC ACGCT-3'，以斑马鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，以PCR回收产物为模板，用扩增col1a1aM片段2引物col1a1a-F2(5'-GGG TGC TAT TGG TGC CAC TAG CGC TCC TGG TAA GGA TGG T-3')和col1a1a-R2(5'-TTA CAA GAA GCA GAC TGG GC-3')进行扩增获得col1a1aM片段2。运用同源重组的方法合成质粒，质粒构建完成后，送至测序公司进行测序，经测序结果分析，质粒构建正确，构建成功的质粒序列如SEQ ID NO.5所示；菌种保存，质粒提取及纯化。质粒纯化后的浓度为400ng/μL。表达col1a1a(G1774A)的方法选用DNA显微注射(利用tol2转座酶介导高效转基因)，利用显微注射构建的过表达质粒(图5)和转座酶mRNA来表达，通过表型来确认是否有影响。

(4)表达col1a1a(G1774A)后的表型观察：显微注射后，持续观察其整体形态发育，尤其关注躯干骨骼发育情况(有无弯曲)。

实验结果：

1.COL1A1；NM_000088.3；c.1822G>A；p.Gly608Ser|p.G608S；EX27；CDS27：错义突变，暂无该位点致病性的相关文献报道。用SIFT和Polyphen对其进行蛋白功能预测，结果均为有害，该位点在正常人中发生的概率极低(图6-8)。COL1A1基因相关的成骨不全1/2/3/4型均为常染色体显性遗传。

2.通过脊柱弯曲表型分析发现，注射col1a1a质粒导致斑马鱼脊柱发生弯曲(图9)。

序列表

<110> 黄欢

<120> 一种成骨发育不全疾病的致病突变及其检测试剂

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4395

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

atgttcagct ttgtggacct ccggctcctg ctcctcttag cggccaccgc cctcctgacg 60

cacggccaag aggaaggcca agtcgagggc caagacgaag acatcccacc aatcacctgc 120

gtacagaacg gcctcaggta ccatgaccga gacgtgtgga aacccgagcc ctgccggatc 180

tgcgtctgcg acaacggcaa ggtgttgtgc gatgacgtga tctgtgacga gaccaagaac 240

tgccccggcg ccgaagtccc cgagggcgag tgctgtcccg tctgccccga cggctcagag 300

tcacccaccg accaagaaac caccggcgtc gagggaccca agggagacac tggcccccga 360

ggcccaaggg gacccgcagg cccccctggc cgagatggca tccctggaca gcctggactt 420

cccggacccc ccggaccccc cggacctccc ggaccccctg gcctcggagg aaactttgct 480

ccccagctgt cttatggcta tgatgagaaa tcaaccggag gaatttccgt gcctggcccc 540

atgggtccct ctggtcctcg tggtctccct ggcccccctg gtgcacctgg tccccaaggc 600

ttccaaggtc cccctggtga gcctggcgag cctggagctt caggtcccat gggtccccga 660

ggtcccccag gtccccctgg aaagaatgga gatgatgggg aagctggaaa acctggtcgt 720

cctggtgagc gtgggcctcc tgggcctcag ggtgctcgag gattgcccgg aacagctggc 780

ctccctggaa tgaagggaca cagaggtttc agtggtttgg atggtgccaa gggagatgct 840

ggtcctgctg gtcctaaggg tgagcctggc agccctggtg aaaatggagc tcctggtcag 900

atgggccccc gtggcctgcc tggtgagaga ggtcgccctg gagcccctgg ccctgctggt 960

gctcgtggaa atgatggtgc tactggtgct gccgggcccc ctggtcccac cggccccgct 1020

ggtcctcctg gcttccctgg tgctgttggt gctaagggtg aagctggtcc ccaagggccc 1080

cgaggctctg aaggtcccca gggtgtgcgt ggtgagcctg gcccccctgg ccctgctggt 1140

gctgctggcc ctgctggaaa ccctggtgct gatggacagc ctggtgctaa aggtgccaat 1200

ggtgctcctg gtattgctgg tgctcctggc ttccctggtg cccgaggccc ctctggaccc 1260

cagggccccg gcggccctcc tggtcccaag ggtaacagcg gtgaacctgg tgctcctggc 1320

agcaaaggag acactggtgc taagggagag cctggccctg ttggtgttca aggaccccct 1380

ggccctgctg gagaggaagg aaagcgagga gctcgaggtg aacccggacc cactggcctg 1440

cccggacccc ctggcgagcg tggtggacct ggtagccgtg gtttccctgg cgcagatggt 1500

gttgctggtc ccaagggtcc cgctggtgaa cgtggttctc ctggccctgc tggccccaaa 1560

ggatctcctg gtgaagctgg tcgtcccggt gaagctggtc tgcctggtgc caagggtctg 1620

actggaagcc ctggcagccc tggtcctgat ggcaaaactg gcccccctgg tcccgccggt 1680

caagatggtc gccccggacc cccaggccca cctggtgccc gtggtcaggc tggtgtgatg 1740

ggattccctg gacctaaagg tgctgctgga gagcccggca aggctggaga gcgaggtgtt 1800

cccggacccc ctggcgctgt cggtcctgct ggcaaagatg gagaggctgg agctcaggga 1860

ccccctggcc ctgctggtcc cgctggcgag agaggtgaac aaggccctgc tggctccccc 1920

ggattccagg gtctccctgg tcctgctggt cctccaggtg aagcaggcaa acctggtgaa 1980

cagggtgttc ctggagacct tggcgcccct ggcccctctg gagcaagagg cgagagaggt 2040

ttccctggcg agcgtggtgt gcaaggtccc cctggtcctg ctggtccccg aggggccaac 2100

ggtgctcccg gcaacgatgg tgctaagggt gatgctggtg cccctggagc tcccggtagc 2160

cagggcgccc ctggccttca gggaatgcct ggtgaacgtg gtgcagctgg tcttccaggg 2220

cctaagggtg acagaggtga tgctggtccc aaaggtgctg atggctctcc tggcaaagat 2280

ggcgtccgtg gtctgactgg ccccattggt cctcctggcc ctgctggtgc ccctggtgac 2340

aagggtgaaa gtggtcccag cggccctgct ggtcccactg gagctcgtgg tgcccccgga 2400

gaccgtggtg agcctggtcc ccccggccct gctggctttg ctggcccccc tggtgctgac 2460

ggccaacctg gtgctaaagg cgaacctggt gatgctggtg ctaaaggcga tgctggtccc 2520

cctggccctg ccggacccgc tggaccccct ggccccattg gtaatgttgg tgctcctgga 2580

gccaaaggtg ctcgcggcag cgctggtccc cctggtgcta ctggtttccc tggtgctgct 2640

ggccgagtcg gtcctcctgg cccctctgga aatgctggac cccctggccc tcctggtcct 2700

gctggcaaag aaggcggcaa aggtccccgt ggtgagactg gccctgctgg acgtcctggt 2760

gaagttggtc cccctggtcc ccctggccct gctggcgaga aaggatcccc tggtgctgat 2820

ggtcctgctg gtgctcctgg tactcccggg cctcaaggta ttgctggaca gcgtggtgtg 2880

gtcggcctgc ctggtcagag aggagagaga ggcttccctg gtcttcctgg cccctctggt 2940

gaacctggca aacaaggtcc ctctggagca agtggtgaac gtggtccccc tggtcccatg 3000

ggcccccctg gattggctgg accccctggt gaatctggac gtgagggggc tcctggtgcc 3060

gaaggttccc ctggacgaga cggttctcct ggcgccaagg gtgaccgtgg tgagaccggc 3120

cccgctggac cccctggtgc tcctggtgct cctggtgccc ctggccccgt tggccctgct 3180

ggcaagagtg gtgatcgtgg tgagactggt cctgctggtc ccgccggtcc tgtcggccct 3240

gttggcgccc gtggccccgc cggaccccaa ggcccccgtg gtgacaaggg tgagacaggc 3300

gaacagggcg acagaggcat aaagggtcac cgtggcttct ctggcctcca gggtccccct 3360

ggccctcctg gctctcctgg tgaacaaggt ccctctggag cctctggtcc tgctggtccc 3420

cgaggtcccc ctggctctgc tggtgctcct ggcaaagatg gactcaacgg tctccctggc 3480

cccattgggc cccctggtcc tcgcggtcgc actggtgatg ctggtcctgt tggtcccccc 3540

ggccctcctg gacctcctgg tccccctggt cctcccagcg ctggtttcga cttcagcttc 3600

ctgccccagc cacctcaaga gaaggctcac gatggtggcc gctactaccg ggctgatgat 3660

gccaatgtgg ttcgtgaccg tgacctcgag gtggacacca ccctcaagag cctgagccag 3720

cagatcgaga acatccggag cccagagggc agccgcaaga accccgcccg cacctgccgt 3780

gacctcaaga tgtgccactc tgactggaag agtggagagt actggattga ccccaaccaa 3840

ggctgcaacc tggatgccat caaagtcttc tgcaacatgg agactggtga gacctgcgtg 3900

taccccactc agcccagtgt ggcccagaag aactggtaca tcagcaagaa ccccaaggac 3960

aagaggcatg tctggttcgg cgagagcatg accgatggat tccagttcga gtatggcggc 4020

cagggctccg accctgccga tgtggccatc cagctgacct tcctgcgcct gatgtccacc 4080

gaggcctccc agaacatcac ctaccactgc aagaacagcg tggcctacat ggaccagcag 4140

actggcaacc tcaagaaggc cctgctcctc cagggctcca acgagatcga gatccgcgcc 4200

gagggcaaca gccgcttcac ctacagcgtc actgtcgatg gctgcacgag tcacaccgga 4260

gcctggggca agacagtgat tgaatacaaa accaccaaga cctcccgcct gcccatcatc 4320

gatgtggccc ccttggacgt tggtgcccca gaccaggaat tcggcttcga cgttggccct 4380

gtctgcttcc tgtaa 4395

<210> 2

<211> 1464

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 2

Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr

1 5 10 15

Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp

20 25 30

Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His

35 40 45

Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp

50 55 60

Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn

65 70 75 80

Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro

85 90 95

Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly

100 105 110

Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro

115 120 125

Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro

130 135 140

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala

145 150 155 160

Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser

165 170 175

Val Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro

180 185 190

Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro

195 200 205

Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly

210 215 220

Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg

225 230 235 240

Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro

245 250 255

Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly

260 265 270

Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu

275 280 285

Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg

290 295 300

Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly

305 310 315 320

Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro

325 330 335

Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys

340 345 350

Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly

355 360 365

Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro

370 375 380

Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn

385 390 395 400

Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly

405 410 415

Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn

420 425 430

Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys

435 440 445

Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly

450 455 460

Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu

465 470 475 480

Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro

485 490 495

Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly

500 505 510

Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg

515 520 525

Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro

530 535 540

Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly

545 550 555 560

Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln

565 570 575

Ala Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro

580 585 590

Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly

595 600 605

Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro

610 615 620

Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro

625 630 635 640

Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly

645 650 655

Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro

660 665 670

Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln

675 680 685

Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly

690 695 700

Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser

705 710 715 720

Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala

725 730 735

Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly

740 745 750

Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro

755 760 765

Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser

770 775 780

Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly

785 790 795 800

Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro

805 810 815

Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala

820 825 830

Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly

835 840 845

Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala

850 855 860

Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala

865 870 875 880

Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly

885 890 895

Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu

900 905 910

Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro

915 920 925

Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly

930 935 940

Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val

945 950 955 960

Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro

965 970 975

Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly

980 985 990

Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro

995 1000 1005

Pro Gly Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro

1010 1015 1020

Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly

1025 1030 1035 1040

Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro

1045 1050 1055

Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala

1060 1065 1070

Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly

1075 1080 1085

Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp

1090 1095 1100

Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro

1105 1110 1115 1120

Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly

1125 1130 1135

Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys

1140 1145 1150

Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg

1155 1160 1165

Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

1170 1175 1180

Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe

1185 1190 1195 1200

Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr

1205 1210 1215

Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp

1220 1225 1230

Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro

1235 1240 1245

Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met

1250 1255 1260

Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln

1265 1270 1275 1280

Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly

1285 1290 1295

Glu Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp

1300 1305 1310

Tyr Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu

1315 1320 1325

Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp

1330 1335 1340

Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr

1345 1350 1355 1360

Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr

1365 1370 1375

Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly

1380 1385 1390

Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr

1395 1400 1405

Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys

1410 1415 1420

Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile

1425 1430 1435 1440

Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe

1445 1450 1455

Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu

1460

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggcgctgtc gtaagtat 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgtaggtg ggaaatgg 18

<210> 5

<211> 8733

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatagtgagt cgtattacaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 60

cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 120

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 180

acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 240

ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 300

cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 360

gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 420

catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 480

gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 540

aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 600

acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac 660

gcatctgtgc ggtatttcac accgcatcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 720

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 780

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 840

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 900

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 960

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 1020

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 1080

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 1140

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 1200

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 1260

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 1320

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 1380

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 1440

ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 1500

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 1560

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 1620

tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 1680

tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 1740

aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 1800

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tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 1920

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 1980

agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 2040

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 2100

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 2160

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 2220

tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 2280

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 2340

gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 2400

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 2460

tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 2520

attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 2580

cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 2640

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aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 2760

ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 2820

acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctatt taggtgacac tatagaatac 2880

tcaagctatg catccaacgc gttgggagct ctcccatatg gtcgagcaga ggtgtaaaaa 2940

gtactcaaaa attttactca agtgaaagta caagtactta gggaaaattt tactcaatta 3000

aaagtaaaag tatctggcta gaatcttact tgagtaaaag taaaaaagta ctccattaaa 3060

attgtacttg agtattaagg aagtaaaagt aaaagcaaga aagaaaacta gagattcttg 3120

tttaagcgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 3180

catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 3240

ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 3300

atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 3360

gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 3420

cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 3480

tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 3540

ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 3600

ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 3660

acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctctggcta 3720

actagagaac ccactgctta ctggcttatc gaaattaata cgactcacta tagggagacc 3780

caagctggct agttaagctt gccaccatgt tcagctttgt ggatattcgg ctggcgctgt 3840

tgctcagcgc aacggtgctt ttggcaagag gacaaggcga ggacgatcgc actggcggca 3900

gctgcacatt ggacggccag gtctacaatg acagggacgt ctggaaacca gagccatgcc 3960

aaatctgcgt gtgcgacagc ggcaccgtaa tgtgcgacga agtgatctgc gaggacacaa 4020

gcgactgccc caacccagtg attccccacg acgagtgctg ccccgtctgc ccagacgacg 4080

atttccagga gcccagtgtt gagggaccta gaggttctcc cggtgacaag ggtgagaggg 4140

gtcctgctgg ccctcccggc aatgatggaa tccctggaca gcctggcctc cctgggcctc 4200

caggccctcc tggacctcct ggccttggtg gaaacttttc tcctcagatg tctggtggct 4260

ttgatgagaa atcctctcca atggctgtcc caggccccat gggacctatg ggcccccgtg 4320

gagcccctgg acctcctgga ccttccggac cccaaggatt tactggtccc cctggcgagc 4380

ctggtgaggc tggtgctcct ggtccaatgg gtccccgtgg cgctgctggt ccccctggaa 4440

agaatggaga ggatggtgag tctggcaaac ctggtcgccc tggtgagcgc ggaccccctg 4500

gaccacaggg tgctcgtgga ttccccggaa cccctggact tccaggcatc aagggacaca 4560

gaggattcag cggtctagat ggagctaagg gggatgctgg ccctgctgga cctaagggtg 4620

agcctggtgc acctggtgag aatggaactc ctggtgccat gggtccccgt ggtctgcctg 4680

gcgagagagg ccgtgctggt cctcctggtg ctgctggtgc tcgtggtaat gatggtgccg 4740

ctggagctgc tggtcctcct ggcccaactg gccctgctgg tcccccagga ttccctggcg 4800

gccctggatc taagggagag gttggtcctc agggatcccg tggtgcagag ggacctcagg 4860

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ctcctggttt ccctggaccc cgtggtcctc ctggagctgc tggagcggct ggtgcccctg 5040

gccctaaggg taacaccggt gaggctggtg ccccaggtgc caaaggagag gctggtgcta 5100

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agagaggacc ccgtggtgag cccggtgctg gtggtgcccg cggacctact ggtgaacgtg 5220

gtgctcctgg tgctcgtggt ttccctggtg ctgatggagc tgcaggtcca agaggtgccc 5280

ctggtgagcg tggaggccct ggagttgttg gacctaaggg tgccactggt gagcctggcc 5340

gcaatggtga acctggtatg ccaggatcca agggtatgac tggtagccct ggcagccctg 5400

gacctgatgg aaagaccgga cctggtggtg ctcctggaca agatggccgc cctggaccac 5460

ctggccctgt tggagccaga ggacagcctg gtgtcatggg attccctgga cctaagggtg 5520

ctgctggtga ggctggcaaa cctggtgaga gaggagtgat gggtgctatt ggtgccacta 5580

gcgctcctgg taaggatggt gatgttggtg cccctggtgc tcctggacct gctggacctg 5640

ctggtgagag aggtgaacaa ggagctgctg gtcctcctgg attccagggt ctgccaggac 5700

ctcagggtgc tactggtgag ccaggaaagt ctggtgagca gggtgctcct ggagaagctg 5760

gagctcctgg accttctggt tctagaggtg acagaggatt ccctggtgag cgtggtgccc 5820

ctggccctgc tggccctgtt ggtgcccgtg gttctcctgg ttcagctggt aacgatggtg 5880

ccaagggtga aagtggtgcc gcaggtgctc ctggtgccca gggtcctcct ggacttcaag 5940

gaatgcctgg agagcgtggg gctgctggcc tccctggtct taagggtgac agaggtgacc 6000

aaggtgccaa gggtgctgat ggtgctgctg gtaaagatgg cattcgtggt atgaccggac 6060

caattggacc ccccggacct gctggagctc ctggtgacaa gggagaatct ggtgctcaag 6120

gacttgttgg acctactggt gcccgtggac cacctggtga gcgtggagag actggtgctc 6180

ctggacctgc cggatttgct ggacctcctg gtgctgatgg tctgcctggt gccaagggag 6240

aacctggaga taatggtgct aagggtgatg ctggtgctcc aggacctgca ggagcaactg 6300

gtgcccctgg acctcagggt cccgttggtg ctactggacc caagggtgcc cgtggtgctg 6360

ctggtcctcc tggtgctact ggcttccctg gtgctgctgg cagagttgga cctcctggcc 6420

cttctggaaa ttctggaccc ccaggacctc ctggacccgc tggtaaggag ggccagaaag 6480

gtaaccgtgg tgagactgga cctgctggtc gtactggtga agttggtgct gctggaccac 6540

ctggtgcccc tggtgagaaa ggaaatcccg gagctgaggg tgccactggc cctgctggta 6600

tccctggacc tcaaggtatt ggtggtcagc gtggtattgt aggtctccct ggacaaagag 6660

gcgagcgtgg tttccccggt ctccctggcc catctggaga gattggcaaa cagggacctt 6720

ctggtccatc tggtgaacgt ggacctcctg gccccatggg accccctgga ctggctggac 6780

ctcctggtga gcctggtcgt gagggtactc caggaaatga gggctctgct ggacgtgacg 6840

gtgctgctgg ccccaagggt gaccgtggtg agactggccc atctggcact cctggagccc 6900

ctggacctcc tggtgctgct ggacctattg gccctgctgg aaagactggt gatcgtggag 6960

agaccggccc tgctggtgtc cccggccctg ctggcccctc tggtccccgc ggaccctctg 7020

gacccgctgg agctcgtgga gacaagggtg agactggtga ggctggtgag agaggcatga 7080

agggacacag aggattcact ggaatgccag gaccccctgg tcctcctgga ccctctggag 7140

agtctggacc cgctggtgct tctggacccg ctggaccaag aggcccagct ggatctgctg 7200

gatcagctgg taaggatggt atgagtggcc tccctggacc cattggacct cctggacccc 7260

gtggtcgcaa tggagaaatt ggaccagctg gacctcctgg acctcccggc ccccctggag 7320

cacctggacc ctctggtggt ggattcgaca ttggcttcat tgcccagcca caggagaagg 7380

cccctgatcc cttccgtcac ttccgtgccg acgatgccaa tgtgatgcgc gaccgtgatc 7440

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acggcaccaa gaagaaccct gcccgcactt gccgtgacct gaagatgtgc cacccagact 7560

ggaagagcgg cgagtactgg attgaccctg accagggctg caaccaggat gccatcaagg 7620

tctactgcaa catggaaact ggcgagactt gcgtcaaccc aactgagtct gctattccca 7680

agaagaactg gtacacaagc aagaacatta aggagaagaa acacgtctgg ttcggagagg 7740

ccatgaccga tggcttccag ttcgagtatg gcagcgaggg ctccaagcct gaggatgtca 7800

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tcctgcaggg ctccaacgaa attgagatca gagcagaggg caacagccgc ttcacataca 7980

gtgtcactga ggatggttgc acgtcgcaca ccggtgcatg gggcaagaca gtcattgact 8040

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cacctaatca ggaatttggc attgaagttg gcccagtctg cttcttgtaa ggatccaccg 8160

gatctagata actgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa 8220

aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta 8280

acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 8340

ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 8400

aacgcgatcc atggaattca ctagtgcgcg cggccgctct agatggccag atctatttaa 8460

attaaactgg gcatcagcgc aattcaattg gtttggtaat agcaagggaa aatagaatga 8520

agtgatctcc aaaaaataag tactttttga ctgtaaataa aattgtaagg agtaaaaagt 8580

actttttttt ctaaaaaaat gtaattaagt aaaagtaaaa gtattgattt ttaattgtac 8640

tcaagtaaag taaaaatccc caaaaataat acttaagtac agtaatcaag taaaattact 8700

caagtacttt acacctctgg gcccaattcg ccc 8733

Claims

1.检测突变的COL1A1基因的试剂在制备成骨发育不全疾病检测试剂中的应用；突变的COL1A1为杂合突变或纯合突变c.1822G>A，野生型COL1A1基因在NCBI数据库中的基因编号为：NM_000088.3，该基因CDS第1822bp处的碱基由G突变为A，其他部分与野生型相同。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于检测突变的COL1A1基因的试剂选自检测突变的COL1A1基因的探针、引物中的一种或多种。