CN111549127A - 人col1a1和/或col1a2基因的扩增、检测突变用引物及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了人COL1A1和/或COL1A2基因的扩增、检测突变位点用引物及其试剂盒,属于基因检测技术领域。检测人COL1A1和/或COL1A2基因DNA突变的试剂盒,包括用于检测COL1A1与COL1A2基因第1至第52外显子突变的测序引物组。采用特异性引物组,针对COL1A1和COL1A2基因的第1~52外显子进行突变检测,确保了测定结果的准确性与特异性,针对COL1A1与COL1A2基因突变所导致的成骨不全I‑IV型、爱莱尔‑当洛综合征、卡菲氏病、成骨不全与爱莱尔‑当洛综合征合并症等遗传性疾病进行基因检测,可用于COL1A1与COL1A2基因基因突变相关联的复杂疾病的基因检测。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域,具体涉及人COL1A1和/或COL1A2基因的扩增、检测突变用引物及其试剂盒。
背景技术
胶原蛋白(Collagen)是一类重要的蛋白质。随着生物化学、分子生物学和细胞生物学技术的发展,目前已发现有27种不同类型的胶原,按照被发现的先后顺序分别称为I型胶原、II型胶原、III型胶原等。胶原通常由3条α-肽链组成,有些胶原分子的3条肽链是相同的,有些是不同的。按照国际惯例,胶原分子的3条肽链被称为α1-链、α2-链、α3-链。如果两种胶原相互叠加,那么在命名上附带上大写罗马数字,并用括号括起来,例如III型胶原的α1-链,称为α1(III),α2-链称为α2(III)。
从功能方面分类,可以将胶原划分为两组,一组胶原是成纤维胶原,另一组是非成纤维胶原。I、II、III、IV、XXIV和XXVII型胶原都是成纤维胶原,其余的都是非成纤维胶原。然而非成纤维胶原也可以细分为6种:①FACIT(纤维结合的胶原,具有中断的三股螺旋)族胶原,包括IX、XII、XIV、XVI、XX和XXI;②网状结构胶原,包括IV、VIII和X型胶原;③念珠状原纤维胶原,VI型胶原即属于这一种;④锚定原纤维或纤丝胶原,包括VII和XVII型胶原;⑤跨膜区胶原,包括XIII、XXIII和XXV型胶原;⑥结构尚未明确的胶原,包括XV、XVIII、XXII和XXVI型胶原。
I型胶原蛋白由三条肽链组成,其中有两条α1-链,一条α2-链构成。在机体内分布广泛,是皮肤、骨骼、肌腱、角膜等重要组成成分。COL1A1与COL1A2基因分别编码前α1-链与前α2-链。COL1A1或COL1A2基因突变与诸多遗传性骨病相关,如成骨不全(osteogenesisimperfecta,OI),爱莱尔-当洛综合征(Ehlers-Danlos syndrome,cvEDS)、卡菲氏病或婴儿骨皮质增生症(Caffey disease,infantile cortical hyperostosis,ICH))等。
成骨不全是一种胶原合成代谢障碍所导致的遗传性结缔组织罕见疾病。主要临床表型包括骨质疏松和骨的脆性增加、蓝巩膜、牙本质不全,早熟性耳硬化等症状。其中,I~IV型成骨不全是由于COL1A1或COL1A2基因突变所导致的常染色体显性遗传疾病。其中I型临床症状较轻,患者不骨折或有少数骨折史,肢体不变形。II型患者通常在围产期死亡,是最为严重的类型。III型患者因频繁骨折、肢体畸形、身材矮小。IV型为中等程度的成骨不全,介于I型与III型之间,骨折次数较少,通常不引起畸形。
心脏瓣膜型EDS(Cardiac-valvular type Ehlers-Danlos syndrome,cvEDS)具有心脏瓣膜缺损,关节活动过度、皮肤弹性强,薄弱,易形成疤痕,具有腹股沟疝,胸廓畸形,关节脱位及足部畸形等特征,该类型EDS主要是由于双等位COL1A2基因突变所致。关节松弛型EDS(The arthrochalasia type Ehlers-Danlos syndrome,aEDS)主要特征为髋脱位,关节松弛普遍,且多脱位或半脱位,皮肤易于拉伸。另外,组织脆性、易产生淤伤、肌肉张力降低、后凸畸形及骨量减少等也是该病的特征。OI/EDS疾病同时具有成骨不全以及爱菜尔-当洛综合征疾病的特征,突变多多发生在I型胶原蛋白氨基端与羧基端。
卡菲氏病又名婴儿骨皮质增生症,主要是由于COL1A1基因c.3040C>T(p.Arg836Cys)基因突变所致。主要特征是骨质增生,骨骼异常主要影响下颌骨、肩胛骨、锁骨以及胳膊和腿部的长骨骨干等部位,该病常发于婴儿5个月前,通常会在2周岁内症状自动恢复正常。
COL1A1或COL1A2基因的DNA位点突变常常导致疾病的发生,因此,采用基因检测手段了解COL1A1或COL1A2基因位点的发生突变,对疾病的辅助诊断具有重要临床意义。但是由于COL1A1或COL1A2基因全序列十分长,缺乏有效的扩增COL1A1或COL1A2基因长片段的引物,同时现有技术中关于COL1A1或COL1A2基因的突变位点的检测通常单一突变位点的检测,导致检测结果不全面有遗漏的情况,且产生测定结果的准确性与特异性不高的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种人COL1A1基因或人COL1A2基因扩增用引物组,极大的避免了针对单个外显子进行扩增的多次PCR反应,减少了PCR反应数量。
本发明发明的目的还在于提供一种检测人COL1A1基因或人COL1A2基因突变位点的引用组,确保了测定结果全面且准确,同时具有与检测片段高特异性结合能力。
本发明提供了人COL1A1基因的扩增用引物组,包括两对引物:扩增COL1A1基因1~25外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物FP1和核苷酸序如SEQ ID NO.2所示的下游引物RP1;扩增COL1A1基因26~52外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物FP2与核苷酸序如SEQ ID NO.4所示的下游引物RP2。
本发明提供了检测人COL1A1基因的DNA突变用引物组,包括如SEQ ID NO.1、SEQID NO.5~SEQ ID NO.33所示的15对检测COL1A1基因第1至第52外显子的引物。
本发明提供了人COL1A2基因的扩增用引物组,包括三对引物:扩增COL1A2基因1~12外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的上游引物FP18和核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示的下游引物RP18;扩增COL1A2基因13~34外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的引物FP19和核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的下游引物RP19;扩增COL1A2基因35~52外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示的上游引物FP20和核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示的下游引物RP20。
本发明提供了检测COL1A2基因DNA突变用引物组,包括如SEQ ID NO.34、SEQ IDNO.40~SEQ ID NO.100所示的31对用于COL1A2基因第1至第52外显子与内含子的测序的引物;
本发明提供了一种检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂盒,包括所述人COL1A1基因DNA突变用引物组和所述检测COL1A2基因DNA突变用引物组。
优选的,还包括DNA测序试剂;所述DNA测序试剂包括BigDye 3.1混合液、EDTA溶液、无水乙醇、体积浓度75%乙醇水溶液和Hi-Di甲酰胺。
优选的,还包括权利要求1所述引物组和权利要求3所述引物组。
优选的,还包括PCR扩增试剂;所述PCR扩增试剂包括dNTP Mix、含Mg2+的2×PhantaMax Buffer和DNA聚合酶。
优选的,还包括PCR产物纯化试剂;所述PCR产物纯化试剂包括SAP酶和ExoI酶。
本发明提供了所述扩增COL1A1基因的引物组和所述扩增COL1A2基因的引物组在制备检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂中的应用。
本发明提供的人COL1A1或COL1A2基因的扩增用引物组,针对COL1A1基因所覆盖的1~25号外显子和26~52号外显子分别扩增用引物,能够扩增得到两个长片段,或针对COL1A1基因所覆盖的1~12号外显子、13~34外显子和35~52号外显子分别设计扩增用引物,采用设计的特异性引物能够扩增得到两个或三个长片段,极大的避免了针对单个外显子进行扩增的多次PCR反应,减少了PCR反应数量,简化扩增操作。
本发明提供的人COL1A1或COL1A2基因的检测突变用引物组,包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.33所示的15对检测COL1A1基因第1至第52外显子的引物,或包括如SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.40~SEQ ID NO.100所示的31对用于COL1A2基因第1~52外显子与内含子的测序引物。采用上述特异性引物组,针对COL1A1或COL1A2基因的DNA第1到第52外显子进行突变检测,确保了测定结果的准确性与特异性。与传统的单一突变位点的检测而言,扩大了检测突变范围至COL1A1外显子区所有位点,覆盖已报道的突变位点与可能的突变位点,使检测结果更加全面准确,不会遗漏可能的突变位点。
同时,本发明提供的检测突变用引物组,与传统的通过荧光定量PCR采用探针法检测相比,降低了检测成本,同时PCR产物通过DNA序列测定以及后续序列比对完成,其准确性要高于荧光定量PCR。与高通量测序相比较,直接对COL1A1或COL1A2致病基因进行检测,避免了高通量测序中因原始数据筛选、阈值设定等问题而可能出现的假阳性与假阴性问题;同时节省了成本与人力。
同时,本发明所涉及的每对引物的扩增用PCR与测序引物的扩增条件完全一致,将COL1A1与COL1A2分段扩增极大地减少了PCR反应数,极大简化了检测操作步骤。同时,DNA测序中所采用的上、下游测序引物,也可用于该引物对所在基因外显子的扩增,也适用于高通量测序位点的验证、已知突变位点或是已知外显子所在突变位点的基因检测。
本发明提供了一种检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂盒,包括所述人COL1A1基因DNA突变用引物组和所述检测COL1A2基因DNA突变用引物组。所述检测试剂盒可用于COL1A1与COL1A2基因DNA突变所导致的成骨不全I型、II型、III型和IV型的基因突变检测,心脏瓣膜型与关节松弛型爱菜尔-当洛综合征、OI/EDS以及卡菲氏病等遗传性疾病的基因检测,进而辅助临床确诊该类疾病,为骨健康与神经健康提供保障。同时还为研究COL1A1与COL1A2基因突变与基因功能之间的关系以及基因型与表型之间的相互关系奠定基础。
附图说明
图1为全血基因组DNA不同引物对对COL1A1与COL1A2基因第1到第52外显子PCR扩增产物的0.5%琼脂糖凝胶电泳图谱;
图2是本发明检测的23例成骨不全患者COL1A1与COL1A2基因杂合突变检测结果。
具体实施方式
本发明提供了人COL1A1基因的扩增用引物组,包括两对引物:扩增COL1A1基因1~25外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物FP1和核苷酸序如SEQID NO.2所示的引物RP1;扩增COL1A1基因26~52外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物FP2与核苷酸序如SEQ ID NO.4所示的引物RP2。所述FP1和RP1扩增的PCR产物的长度为7903bp。所述FP2和RP2扩增的PCR产物的长度为7985bp。所述FP1和RP1扩增或FP2和RP2扩增的反应程序均为:95℃预变性3分钟;95℃变性15秒,65℃退火15秒,72℃延伸6.5分钟,循环次数35;72℃终延伸5分钟。所述FP1和RP1扩增或FP2和RP2扩增优选分别单独进行。本发明对所述引物的制备方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的人工合成方法即可。
本发明提供了人COL1A2基因的扩增用引物组,包括三对引物:扩增COL1A2基因1~12外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的上游引物FP18和核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示的下游引物RP18;扩增COL1A2基因13~34外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的引物FP19和核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的下游引物RP19;扩增COL1A2基因35~52外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示的上游引物FP20和核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示的下游引物RP20。所述FP18和RP18的PCR扩增产物的长度为11549bp,所述FP19和RP19的PCR扩增产物的长度为12218bp,所述FP20和RP20的PCR扩增产物的长度为10502bp。所述FP18和RP18扩增、FP19和RP19扩增或FP20和RP20扩增的反应程序均为:95℃预变性3分钟;95℃变性15秒,65℃退火15秒,72℃延伸6.5分钟,循环次数35;72℃终延伸5分钟。所述FP18和RP18扩增、FP19和RP19扩增或FP20和RP20扩增优选分别单独进行。本发明对所述引物的制备方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的人工合成方法即可。
在本发明中,优选提供一种人COL1A1和COL1A2基因的扩增用试剂盒,包括所述人COL1A1基因的扩增用引物组和人COL1A2基因的扩增用引物组。所述试剂盒优选还包括PCR扩增试剂;所述PCR扩增试剂包括10mM dNTP Mix、含Mg2+的2×Phanta Max Buffer和DNA聚合酶。所述试剂盒优选还包括PCR产物纯化试剂;所述PCR产物纯化试剂包括SAP酶和ExoI酶。所述扩增用试剂盒用于扩增人COL1A1和COL1A2基因的完整长片段,为后续检测人COL1A1和COL1A2基因的突变位点提供测序材料。
在本发明中,所述扩增用试剂盒的使用方法,优选包括以下步骤:
1)长片段PCR扩增,配制40μl PCR反应体系,其中包括:
10mM dNTP Mix 1μl、2×Phanta Max Buffer 20μl、Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase 1μl、上游引物4μl、下游引物4μl、DNA模板50~400ng,DEPC水补足至40μl;
2)将PCR反应体系在上述PCR扩增的反应程序下进行扩增,得到PCR扩增产物;
3)将所述PCR扩增产物进行纯化,配制20μl PCR纯化体系,其中包括:PCR产物8μl、1U/μl SAP酶1μl、10U/μl ExoI酶1μl和H2O 10μl;
纯化反应条件为:37℃消化60分钟,然后65℃灭活15分钟;
产物纯化后经1%琼脂糖凝胶电泳或是微量核酸定量仪进行浓度测定,得到待测序PCR反应产物。
本发明提供了检测人COL1A1基因的DNA突变用引物组,包括如SEQ ID NO.1、SEQID NO.5~SEQ ID NO.33所示的15对检测COL1A1基因第1至第52外显子的引物。
本发明提供了检测COL1A2基因DNA突变用引物组,包括如SEQ ID NO.34、SEQ IDNO.40~SEQ ID NO.100所示的31对用于COL1A2基因第1至第52外显子与内含子的测序的引物。
在本发明中,上述两组引物组的反应条件均优选为:96℃ 1分钟变性,96℃ 10秒,50℃ 5秒,60℃ 4分钟,共28个循环反应,PCR循环完并冷却到4℃。所述15对引物或31对引物中的每对引物优选独处PCR扩增。
本发明提供了一种检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂盒,包括所述人COL1A1基因DNA突变用引物组和所述检测COL1A2基因DNA突变用引物组。
在本发明中,优选还包括DNA测序试剂;所述DNA测序试剂包括BigDye 3.1混合液、0.125M EDTA溶液、无水乙醇、体积浓度75%乙醇水溶液和Hi-Di甲酰胺。本发明对所述试剂盒中涉及的试剂的来源没有特殊限制,采用本领域所熟知的商品途径获得即可。
在本发明中,所述检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂盒的使用方法,优选包括如下步骤:
A.配制10μl DNA测序反应体系,包括4μl BigDye、3.2pmol/L测序引物2μl、5~20ng纯化的PCR产物、用DEPC水补足至10μl;
B.将测序反应体系进行反应,反应程序:96℃ 1分钟变性,96℃ 10秒,50℃5秒,60℃ 4分钟,共28个循环反应,PCR循环完并冷却到4℃;
C.测序:将反应产物中加入2.5μl 0.125M的EDTA溶液,然后加入30μl无水乙醇,颠倒混匀后室温放置15分钟,在12000g离心10分钟后,移除上清,加入60μl 70%乙醇水溶液,4℃12000g离心15分钟后,移除上清;重复一次后,待乙醇挥发干净后将沉淀溶于10μlHi-Di甲酰胺;在95℃变性4分钟后采用ABI3130XL测序仪进行测序分析。
本发明提供了所述扩增COL1A1基因的引物组和所述扩增COL1A2基因的引物组在制备检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂中的应用。
在本发明中,所述试剂优选将所述引物组中各条引物单独包装。本发明对所述试剂的浓度没有特殊限制,采用本领域所熟知的试剂的浓度即可。
在本发明中,所述试剂或所述试剂盒用于检测COL1A1和COL1A2基因突变位点,来辅助诊断心脏瓣膜型与关节松弛型爱菜尔-当洛综合征、OI/EDS以及卡菲氏病等遗传性疾病的基因检测。
下面结合实施例对本发明提供的人COL1A1和/或COL1A2基因的扩增、检测突变用引物及其试剂盒进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
试剂来源说明
全血基因组DNA提取试剂盒购自Omega公司;
10mM dNTP Mix,含Mg2+的2×Phanta Max Buffer,Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase均来自Vazyme公司;
SAP(1U/μl,货号70092Y)、ExoI(10U/μl,货号70073Z)均购自USB公司。BigDye 3.1(货号4337455,ThermoFisher Scientific公司)、Na2EDTA·2H2O(货号15576028,ThermoFisher Scientific公司)、AM9740 Hi-Di Formamide(货号4404307,ABI公司),无水乙醇购自国药集团;
去RNase酶与DNase酶水(DEPC水)(货号10977015),购自ThermoFisherScientific公司;
琼脂糖为西班牙进口,引物由华大基因合成。
实施例1
根据NCBI GeneBank数据库COL1A1(NG_007400.1)基因DNA参考序列,设计2对长片段PCR扩增引物对FP1/RP1与FP2/RP2,扩增包含该基因全部内含子与外显子的基因DNA序列。2个PCR产物所覆盖的外显子分别为1-25与26-52,PCR扩增长度分别为7903bp与7985bp。每一基因各PCR扩增片段间相互重叠至少150bp,以保证后续上、下游测序引物能够测通基因各个外显子及其与内含子交界区域。针对2个长片段PCR扩增所包含的外显子,分别设计相应外显子的上、下游测序引物,测序引物设计位置位于外显子与内含子交界处60bp上游的区域。其中包括COL1A11-52外显子在内的长片段PCR反应产物所对应的上游、下游测序序列,共计15对,分别用于COL1A1外显子1、2-5、6-8、9-11、12-16、17-20、21-25、26-29、30-32、33-36、37-40、41-44、45-47、48-50、51-52上游与下游测序,每一对测序引物均可以采用单向或者双向拼接测序。COL1A1基因长片段PCR扩增2对引物及其对应的16对上、下游测序引物序列见表1。
表1 COL1A1基因外显子引物扩增及测序序列
图1为COL1A1/COL1A2基因长片段的扩增结果,其中图1A是COL1A1基因长片段PCR扩增的2对引物对FP1/RP1与FP2/RP2电泳图,其大小分别是7903bp和7985bp。
实施例2
根据NCBI GeneBank数据库COL1A2(NG 007405.1)基因DNA参考序列,设计3对长片段PCR扩增引物对FP18/RP18、FP19/RP19和FP20/RP20,扩增包含该基因全部内含子与外显子的基因DNA序列。3个PCR产物所覆盖的外显子分别为1-12、13-34与35-52,PCR扩增长度分别为11549bp、12218bp和10502bp。每一基因各PCR扩增片段间相互重叠至少150bp,以保证后续上、下游测序引物能够测通基因各个外显子及其与内含子交界区域。针对3个长片段PCR扩增所包含的外显子,分别设计相应外显子的上、下游测序引物,测序引物设计位置位于外显子与内含子交界处60bp上游的区域。其中包括COL1A21-52外显子在内的长片段PCR反应产物所对应的上游、下游测序序列,共计31对,分别用于COL1A2外显子1、2、3-4、5、6、7-10、11-12、13-15、16-17、18-20、21-23、24-25、26-27、28-29、30、31、32、33、34、35-37、38、39、40、41、42-44、45-46、47-48、49、50、51和52上游与下游测序,每一对测序引物均可以采用单向或者双向拼接测序。COL1A2基因长片段PCR扩增3对引物及其对应的31对上、下游测序引物序列见表2。
表2 COL1A2基因外显子引物扩增及测序序列
PCR产物的电冰结果见图1。图1B和图1C是COL1A2基因长片段PCR扩增的3对引物对FP19/RP19、FP20/RP20与FP21/RP21电泳图,其大小分别是11549bp、12218bp和10502bp。
实施例3
一种人COL1A1/COL1A2基因DNA长片段PCR扩增及其相应的试剂盒,包括:
1)实施例1中用于COL1A1基因长片段PCR扩增的2对引物对FP1/RP1与FP2/RP2;
2)实施例2用于COL1A2基因长片段PCR扩增的3对引物对FP18/RP18、FP19/RP19与FP20/RP20;
3)所述的PCR长片段扩增试剂,包括10mM dNTP Mix,含Mg2+的2×Phanta MaxBuffer,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase,去RNase与DNase水;所述PCR扩增体系中各组分的工作浓度为:10000μM dNTP Mix,2mM 2×Phanta Max Buffer,1U/μlPhanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase,上游引物和下游引物均为5μM,模板浓度为50~400ng/μl。
一种检测人COL1A1/COL1A2基因DNA突变的试剂盒,包括:
1)上述试剂盒扩增得到的长片段PCR产物纯化试剂包括:1U/μl SAP酶、10U/μlExoI酶和去RNase与DNase水;所述纯化体系中各组分的工作浓度为:0.05U/μl SAP酶、0.5U/μl ExoI酶;
2)实施例1用于检测COL1A1基因外显子1、2-5、6-8、9-11、12-16、17-20、21-25、26-29、30-32、33-36、37-40、41-44、45-47、48-50、51-52,52个外显子对应的上、下游测序引物FP1/RP3、FP4/RP4、FP5/RP5、FP6/RP6、FP7/RP7、FP8/RP8、FP9/RP9、FP10/RP10、FP11/RP11、FP12/RP12、FP13/RP13、FP14/RP14、FP15/RP15、FP16/RP16、FP17/RP17共15对;
3)实施例2用于检测COL1A2基因外显子1、2、3-4、5、6、7-10、11-12、13-15、16-17、18-20、21-23、24-25、26-27、28-29、30、31、32、33、34、35-37、38、39、40、41、42-44、45-46、47-48、49、50、51和52,52个外显子对应的上、下游测序引物FP18/RP21、FP22/RP22、FP23/RP23、FP24/RP24、FP25/RP25、FP26/RP26、FP27/RP27、FP28/RP28、FP29/RP29、FP30/RP30、FP31/RP31、FP32/RP32、FP33/RP33、FP34/RP34、FP35/RP35、FP36/RP36、FP37/RP37、FP38/RP38、FP39/RP39、FP40/RP40、FP41/RP41、FP42/RP42、FP43/RP43、FP44/RP44、FP45/RP45、FP46/RP46、FP47/RP47、FP48/RP48、FP49/RP49、FP50/RP50、FP51/RP51共31对;
4)所述DNA测序试剂包括:上述用于检测COL1A1、COL1A2基因突变的测序引物组、BigDye 3.1混合液、0.125M EDTA溶液、无水乙醇、体积百分比75%乙醇溶液、Hi-Di甲酰胺溶液、去RNase与DNase水;所述测序引物组中的测序引物工作浓度为0.64pmol/L。
本试剂盒于-20保存,尽量减少反复冻融。
实施例4
利用上述试剂盒用于人COL1A1/COL1A2基因长片段PCR扩增及其基因突变检测方法,具体步骤如下:
(1)外周血基因组DNA的提取
采集患者外周血5ml,采用Omega公司DNA提取试剂盒(D3392-01)进行全血基因组DNA的提取,采用NanoDrop 2000/2000c分光光度计进行DNA浓度和纯度测定;具体操作步骤条件参见产品说明书;
(2)长片段PCR扩增
PCR反应体系为40μl,其中包括:
10mM dNTP Mix 1μl,2×Phanta Max Buffer 20μl,Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase 1μl,上游引物4μl,下游引物4μl,DNA模板50ng-400ng,去RNase酶与DNase酶水补足至40μl。
采用BIO-RAD公司PIC-200型PCR仪,进行降落PCR,PCR反应条件如下:
95℃预变性3分钟;95℃变性15秒,65℃退火15秒,72℃延伸6.5分钟,循环次数35;72℃终延伸5分钟。
(3)PCR产物纯化
PCR纯化体系为20μl,其中包括:
PCR产物8μl,1U/μl SAP酶1μl,10U/μl ExoI酶1μl,H2O 10μl。
反应条件为:37℃消化60分钟,然后65℃灭活15分钟。产物纯化后经1%琼脂糖凝胶电泳或是微量核酸定量仪进行浓度测定。
(4)DNA测序反应及纯化
DNA测序反应的体系为10μl,包括4μl BigDye,3.2pmol/L测序引物2μl,5~20ng纯化的PCR产物,用去RNase酶与DNase酶水补足至10μl。
反应条件为:
96℃1分钟变性,96℃10秒,50℃5秒,60℃4分钟,共28个循环反应,PCR循环完并冷却到4℃,取下并马上进行短时间离心。
测序反应结束后将反应产物中加入2.5μl 0.125M的EDTA溶液,然后加入30μl无水乙醇,颠倒混匀后室温放置15分钟。在12000g离心10分钟后,移除上清。加入60μl70%乙醇水溶液,4℃12000g离心15分钟后,移除上清。重复一次后,待乙醇挥发干净后将沉淀溶于10μlHi-Di甲酰胺,经95℃变性4分钟后采用ABI3130XL测序仪进行测序分析。
(5)测序结果分析
测序结果采用Mutation Survey软件进行突变位点的识别。采用PolyPhen2、SIFT与Mutation taster对突变功能进行预测。ExAC数据库分析位点变异频率。
实验例4
采用实施例4所述方法及实施例3所述试剂盒,对来自天津市武清区人民医院、山东第一医科大学附属省立医院的临床诊断为成骨不全的23个家庭共计23个患者临进行了COL1A1与COL1A2基因检测。
基因突变结果以及患者基本信息表3。患者血液样本COL1A1与COL1A2基因测序峰图如图2所示。
表3 COL1A1/COL1A2基因变异患者临床特征
注:突变均属于碱基替代。将所有检测到的位点进行突变效应预测。Polyphen2中,具体数值代表了损害的程度,分值越接近1,则损害可能越大。SIFT预测中,只要分值小于0.05,均认为可能影响到编码蛋白质的功能。Mutation taster软件中,得分都靠近1,说明该位点对功能的影响都是disease causing。而发生在保守区的突变通常被认为是致病性的标记。加粗部分为新检测得到变异位点,属于首次报道的变异位点。
根据三种不同功能效应预测软件可知,所有位点的碱基替代都可能影响到功能。除了COL1A1的c.1072C>G和COL1A2的c.2329C>T与c.2456G>A碱基替代在ExAC数据库中检测到正常人群的8.44E-06、8.24E-06和7.413E-05的分布频率外,其它变异位点的频率均未有结果,其中COL1A2的c.2329C>T、COL1A1的c.1072C>G、c.1099delC、c.1177C>T、c.3559G>T和c.3718C>T为新检测得到的变异位点。根据临床诊断,结合临床表型以及本实验例的检测方法,能够成功的识别临床COL1A1与COL1A2基因突变的成骨不全患者,为该类疾病确诊与产前筛查奠定基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东第一医科大学(山东省医学科学院)
<120> 人COL1A1和/或COL1A2基因的扩增、检测突变用引物及其试剂盒
<160> 100
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgctctcca tcaggacagt at 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgccgagaag tctttcattt ta 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catctaacag ggaaaaggca ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgaatgcac ttttggtttt tg 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttcccttcaa tcccagcctt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccaccatgat gcaactcagt 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 12
ctcccaaggc tctttctcag 20
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<211> 20
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actctgggtc cctttggttt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 21
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<212> DNA
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
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tctctaatca cggccagacc 20
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aagaagggag gattagcgag a 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcctctcag gaaacccag 19
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<211> 21
<212> DNA
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acaatcccgt ctccaccctt c 21
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<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggatcccctg gtgctgatgg tc 22
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<211> 20
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cctgcctggg tgaagtccga 20
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agagagatcc agcagaggg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttctccaga gaggcaaagg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccagagccag cagggagggt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gctctgtcca tcacccttag ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtttgggtt gcttgtctgt ttcc 24
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<212> DNA
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ttcggctaag ttggaggtac tg 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctctcatagt ccccatcctt ga 22
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<212> DNA
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ccacatctcc ttagaacctg ga 22
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tttgagaagc ctcagtgcat ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccatactac ttaaccccca aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctttttctct tttgcccaca at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtctgccct ccaagtgtac c 21
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tgcataatgt aatgaattgt gaaggt 26
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aaatttccac cctacttgca c 21
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgccctcttt taaataacaa c 21
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<212> DNA
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tagctaaata aatggcgtgg t 21
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aaccacaaca atggcactgc 20
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tttctttatt agatgccttc g 21
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agccttcaaa agacctcaca g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agttaattgg aatatttcgg t 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaacaaaggt ggagtatggg g 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcattccag tttctccagc tg 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctggactgat tcgcagga 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaacaagca ggattcaaca 20
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ggctcattct ctccatcagc ac 22
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tcatgtagat actgccaggt t 21
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cagagacttg ttgcagggtc a 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatgcaaacc agggctcgga a 21
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cactggaatc ggattgctg 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctaccagacc acctgccaag 20
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aacaataatc tggaaatggc ctt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
attagtcata gacccaggag a 21
<210> 75
<211> 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
agaaccaaaa tacatcagag gc 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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attgctgggg ctctttggga c 21
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tactctgtga gatgtgcgtc a 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catagcaggc acttgacgga t 21
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gagatgcggg aatgatccac t 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctatatgaag ctgcctacct c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
tagcgaatat tagtgatgtg t 21
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
gccagggtat tattttattg catc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tctacttgag agcctgcaat 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taataggagg tcattagcct t 21
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gtgcgtggaa agaacaaa 18
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ctaggcccaa gatacccctc 20
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
acacttgggg atggtggagg agt 23
<210> 90
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
tgagatggag ttagccag 18
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
ggagaaaaga gccccac 17
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggggctaac tttaatggg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgagaacat gcttccgtgt g 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaatagccac cctcttcctc t 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atccatcttc taatgtgcaa t 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttgcccaca atttaagcaa g 21
Claims (10)
1.人COL1A1基因的扩增用引物组,其特征在于,包括两对引物:扩增COL1A1基因第1~25外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物FP1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物RP1;
扩增COL1A1基因第26~52外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物FP2与核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物RP2。
2.检测人COL1A1基因DNA突变用引物组,其特征在于,包括如下15对检测COL1A1基因第1~52外显子的引物;
用于外显子1的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物FP1和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物RP3;
用于外显子2~5的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物FP4和核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物RP4;
用于外显子6~8的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.8的上游引物FP5和核苷酸序列如SEQ ID NO.9的下游引物RP5;
用于外显子9~11的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.10的上游引物FP6和核苷酸序列如SEQ ID NO.11的下游引物RP6;
用于外显子12~16的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.12的上游引物FP7和核苷酸序列如SEQ ID NO.13的下游引物RP7;
用于外显子17~20的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.14的上游引物FP8和核苷酸序列如SEQ ID NO.15的下游引物RP8;
用于外显子21~25的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.16的上游引物FP9和核苷酸序列如SEQ ID NO.17的下游引物RP9;
用于外显子26~29的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.18的上游引物FP10和核苷酸序列如SEQ ID NO.19的下游引物RP10;
用于外显子30~32的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.20的上游引物FP11和核苷酸序列如SEQ ID NO.21的下游引物RP11;
用于外显子33~36的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.22的上游引物FP12和核苷酸序列如SEQ ID NO.23的下游引物RP12;
用于外显子37~40的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.24的上游引物FP13和核苷酸序列如SEQ ID NO.25的下游引物RP13;
用于外显子41~44的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.26的上游引物FP14和核苷酸序列如SEQ ID NO.27的下游引物RP14;
用于外显子45~47的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.28的上游引物FP15和核苷酸序列如SEQ ID NO.29的下游引物RP15;
用于外显子48~50的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.30的上游引物FP16和核苷酸序列如SEQ ID NO.31的下游引物RP16;
用于外显子51~52的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.32的上游引物FP17和核苷酸序列如SEQ ID NO.33的下游引物RP17。
3.人COL1A2基因的扩增用引物组,其特征在于,包括三对引物:
扩增COL1A2基因第1~12外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的上游引物FP18和核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示的下游引物RP18;
扩增COL1A2基因第13~34外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的引物FP19和核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示的下游引物RP19;
扩增COL1A2基因第35~52外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示的上游引物FP20和核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示的下游引物RP20。
4.检测COL1A2基因DNA突变用引物组,其特征在于,包括如下31对用于COL1A2基因第1~52外显子与内含子的测序引物;
用于外显子1的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的上游引物FP18和核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示的下游引物RP21;
用于外显子2的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.41的上游引物FP22和核苷酸序列如SEQ ID NO.42的下游引物RP22;
用于外显子3~4的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.43的上游引物FP23和核苷酸序列如SEQ ID NO.44的下游引物RP23;
用于外显子5的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.45的上游引物FP24和核苷酸序列如SEQ ID NO.46的下游引物RP24;
用于外显子6的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.47的上游引物FP25和核苷酸序列如SEQ ID NO.48的下游引物RP25;
用于外显子7~10的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.49的上游引物FP26和核苷酸序列如SEQ ID NO.50的下游引物RP26;
用于外显子11~12的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.51的上游引物FP27和核苷酸序列如SEQ ID NO.52的下游引物RP27;
用于外显子13~15的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.53的上游引物FP28和核苷酸序列如SEQ ID NO.54的下游引物RP28;
用于外显子16~17的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.55的上游引物FP29和核苷酸序列如SEQ ID NO.56的下游引物RP29;
用于外显子18~20的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.57的上游引物FP30和核苷酸序列如SEQ ID NO.58的下游引物RP30;
用于外显子21~23的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.59的上游引物FP31和核苷酸序列如SEQ ID NO.60的下游引物RP31;
用于外显子24~25的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.61的上游引物FP32和核苷酸序列如SEQ ID NO.62的下游引物RP32;
用于外显子26~27的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.63的上游引物FP33和核苷酸序列如SEQ ID NO.64的下游引物RP33;
用于外显子28~29的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.65的上游引物FP34和核苷酸序列如SEQ ID NO.66的下游引物RP34;
用于外显子30的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.67的上游引物FP35和核苷酸序列如SEQ ID NO.68的下游引物RP35;
用于外显子31的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.69的上游引物FP36和核苷酸序列如SEQ ID NO.70的下游引物RP36;
用于外显子32的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.71的上游引物FP37和核苷酸序列如SEQ ID NO.72的下游引物RP37;
用于外显子33的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.73的上游引物FP38和核苷酸序列如SEQ ID NO.74的下游引物RP38;
用于外显子34的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.75的上游引物FP39和核苷酸序列如SEQ ID NO.76的下游引物RP39;
用于外显子35~37的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.77的上游引物FP40和核苷酸序列如SEQ ID NO.78的下游引物RP40;
用于外显子38的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.79的上游引物FP41和核苷酸序列如SEQ ID NO.80的下游引物RP41;
用于外显子39的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.81的上游引物FP42和核苷酸序列如SEQ ID NO.82的下游引物RP42;
用于外显子40的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.83的上游引物FP43和核苷酸序列如SEQ ID NO.84的下游引物RP43;
用于外显子41的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.85的上游引物FP45和核苷酸序列如SEQ ID NO.86的下游引物RP44;
用于外显子42~44的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.87的上游引物FP45和核苷酸序列如SEQ ID NO.88的下游引物RP45;
用于外显子45~46的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.89的上游引物FP46和核苷酸序列如SEQ ID NO.90的下游引物RP46;
用于外显子47~48的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.91的上游引物F47和核苷酸序列如SEQ ID NO.92的下游引物RP47;
用于外显子49的PCR双向测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.93的上游引物FP48和核苷酸序列如SEQ ID NO.94的下游引物RP48;
用于外显子50的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.95的上游引物F49和核苷酸序列如SEQ ID NO.96的下游引物RP49;
用于外显子51的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.97的上游引物FP50和核苷酸序列如SEQ ID NO.98的下游引物RP50;
用于外显子52的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.99的上游引物FP51和核苷酸序列如SEQ ID NO.100的下游引物RP51。
5.一种检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂盒,其特征在于,包括权利要求2所述引物组和权利要求4所述引物组。
6.根据权利要求5所述试剂盒,其特征在于,还包括DNA测序试剂;所述DNA测序试剂包括BigDye 3.1混合液、EDTA溶液、无水乙醇、体积浓度75%乙醇水溶液和Hi-Di甲酰胺。
7.根据权利要求5或6所述试剂盒,其特征在于,还包括权利要求1所述引物组和权利要求3所述引物组。
8.根据权利要求7所述试剂盒,其特征在于,还包括PCR扩增试剂;所述PCR扩增试剂包括dNTP Mix、含Mg2+的2×Phanta Max Buffer和DNA聚合酶。
9.根据权利要求8所述试剂盒,其特征在于,还包括PCR产物纯化试剂;所述PCR产物纯化试剂包括SAP酶和ExoI酶。
10.权利要求2所述引物组和权利要求4所述引物组在制备检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂中的应用。
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