CN113718027A - 新型fbn2基因突变标志物及其在cca辅助诊断中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新型FBN2基因突变标志物及其在CCA辅助诊断中的应用，本发明通过对10个家庭的27名CCA患者进行全外显子组测序分析，发现FBN2上存在如下罕见突变：c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A，通过CCA临床评分系统对所述突变位点分别进行了验证，证明了所述FBN2基因突变在诊断CCA中的准确性和可靠性，本发明一方面有助于解释CCA患者的病因，另一方面可将所述突变位点用作CCA的生物标志物，用于CCA的诊断或辅助诊断、患有CCA的风险性的评估、孕前预警。

Description

新型FBN2基因突变标志物及其在CCA辅助诊断中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及新型FBN2基因突变，具体而言，涉及新型FBN2基因突变标志物及其在CCA辅助诊断中的应用。
背景技术
先天性挛缩蜘蛛指畸形综合征(Congenital contractural arachnodactyly，CCA)，又称Beals Hecht综合征(Beals hecht syndrome，BHS)，是一种罕见的常染色体显性遗传的结缔组织疾病，临床诊断主要基于以下临床表现：蜘蛛样指、皱耳、大关节挛缩(包括骶尾关节、膝关节、踝关节或肘关节)、屈曲指、脊柱侧凸或脊柱后凸、胸廓畸形、细长指(趾)、高腭穹、小颌等(Jurko A,Krsiakova J,Minarik M,et al.Congenitalcontractural arachnodactyly(Beals-Hecht syndrome):a rare connective tissuedisorder[J].Wiener klinische Wochenschrift,2013,125(9):288-290.；
Figure BDA0003248941240000011
E,Alanay Y.Congenital contractural arachnodactyly(Beals syndrome)[J].Orphanetjournal of rare diseases,2006,1(1):1-3.)，与另一种遗传性疾病马凡氏综合征(Marfan syndrome，MFS)在临床表型上有部分重叠，但CCA和MFS两种疾病之间仍存在一些区别：(1)与MFS相比，CCA患者心脏畸形很少出现主动脉基底部明显扩张；(2)MFS患者出现晶状体移位的几率远高于CCA；(3)CCA患者外耳存在特有的褶皱。
CCA与MFS在临床症状上具有一些重叠的表型是由于两种疾病分别受两个非常相似的同源基因控制，即原纤维蛋白-1(Fibrillin-1，FBN1)和原纤维蛋白-2(Fibrillin-2，FBN2)，MFS是由FBN1基因突变所致，FBN1基因位于15q15-21.3，有65个外显子，突变集中在22-36号外显子，而CCA的致病基因为FBN2，该基因位于5q23-31，有65个外显子(CallewaertB L,Loeys B L,Ficcadenti A,et al.Comprehensive clinical and molecularassessment of 32probands with congenital contractural arachnodactyly:reportof 14novel mutations and review of the literature[J].Human mutation,2009,30(3):334-341.)，原纤维蛋白-1和原纤维蛋白-2这两种蛋白是细胞外微纤维的主要结构成分，平均直径10nm，具有超强的结构，几乎每个结构域均由一个单独的外显子编码。纤维蛋白是细胞外基质微纤维的组分，在弹性纤维的形成和原弹性蛋白的沉积中起到重要的作用，并在一些组织中发挥锚定功能，原纤维蛋白-1参与组织刚性，而原纤维蛋白-2与组织弹性相关，已知的与CCA相关的变异多发生在第23-35外显子，该段序列编码钙结合表皮生长因子样(cbEGF)结构域，这种变异可导致原纤维蛋白-2的异常，影响微纤维的形成，从而降低纤维的弹性，引发CCA相关的症状。
CCA的早期诊断和对症治疗是降低患病率和病死率的有效途径，目前，CCA的诊断多以临床标准为主，但是分子水平的检测对于该疾病的意义重大，尤其是对于产前诊断、临床表型尚未完全显现的儿童或无症状的家族直系成员，分子生物学诊断是提供早期诊断证据最准确的途径。对于一些没有明确诊断的患者，往往只表现为部分疾病特征，临床表现尚不能满足目前CCA的诊断标准，这些患者同样需要基因检测来辅助其进一步的诊断，以便于及早治疗。鉴于此，本发明通过对10个家庭的27名CCA患者进行研究发现FBN2上能够用于CCA的辅助诊断的致病突变，所述致病突变经验证具有较好的准确性和可靠性。
发明内容
针对目前本领域存在的技术问题，本发明的目的在于提供新型FBN2基因突变标志物及其在CCA辅助诊断中的应用，所述FBN2基因突变包括c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A，通过CCA临床评分系统对上述突变位点分别进行了验证，证明了所述FBN2基因突变在诊断CCA中的准确性和可靠性，表明了本发明所述FBN2基因突变为致病突变，能用于CCA的辅助诊断中。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了用于诊断或辅助诊断CCA的基因突变。
进一步，所述基因突变是FBN2基因上的突变；
优选地，所述突变包括c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A。
进一步，所述突变c.3353A>G为FBN2基因的第3353位的核苷酸由A突变为T，所述突变c.3350A>G为FBN2基因的第3350位的核苷酸由A突变为G，所述突变c.3088G>A为FBN2基因的第3088位的核苷酸由G突变为A，所述突变c.2759G>A为FBN2基因的第2759位的核苷酸由G突变为A，所述突变c.3467G>A为FBN2基因的第3467位的核苷酸由G突变为A。
进一步，所述FBN2基因上的突变c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A包含多种可实施的方式。
进一步，所述多种可实施的方式包括：c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意一种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意两种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意三种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意四种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A五种。
本发明的第二方面提供了用于诊断或辅助诊断CCA的FBN2蛋白质突变，其特征在于，所述蛋白质突变包括p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr。
进一步，所述蛋白质突变p.Glu1118Gly为FBN2蛋白质的第1118位的氨基酸残基由Glu突变为Gly，所述蛋白质突变p.Asp1117Gly为FBN2蛋白质的第1117位的氨基酸残基由Asp突变为Gly，所述蛋白质突变p.Gly1030Arg为FBN2蛋白质的第1030位的氨基酸残基由Gly突变为Arg，所述蛋白质突变p.Cys920Tyr为FBN2蛋白质的第920位的氨基酸残基由Cys突变为Tyr，所述蛋白质突变p.Cys1156Tyr为FBN2蛋白质的第1156位的氨基酸残基由Cys突变为Tyr。
进一步，所述FBN2蛋白质突变p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr包含多种可实施的方式。
进一步，所述多种可实施的方式包括：p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意一种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意两种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意三种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意四种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr五种。
本发明的第三方面提供了本发明第一方面所述的基因突变或本发明第二方面所述的蛋白质突变的检测试剂。
进一步，所述检测试剂包括所述基因突变的特异性扩增引物和/或特异性识别探针、或特异性识别FBN2蛋白质突变的试剂；
优选地，所述基因突变包括c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A；
优选地，所述蛋白质突变包括p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr。
进一步，所述检测试剂还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
进一步，所述基因突变c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A包含多种可实施的方式。
进一步，所述多种可实施的方式包括：c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意一种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意两种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意三种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意四种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A五种。
进一步，所述FBN2蛋白质突变p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr包含多种可实施的方式。
进一步，所述多种可实施的方式包括：p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意一种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意两种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意三种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意四种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr五种。
进一步，本发明可利用本领域内已知的任何方法对基因及其编码的蛋白进行检测。本领域技术人员应当理解，检测基因的手段不是本发明的重要方面。本发明中的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括(但不限于)：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、免疫检测技术。
进一步，检测基因突变或蛋白突变的方法包括(但不限于)：Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM或联合应用上述方法。
进一步，所述检测试剂还包括可应用于本发明的上述检测所述基因突变或蛋白质突变的方法中所使用的试剂。
本发明的第四方面提供了本发明第一方面所述的基因突变在制备本发明第三方面所述的检测试剂中的应用。
本发明的第五方面提供了本发明第二方面所述的基因突变在制备本发明第三方面所述的检测试剂中的应用。
本发明的第六方面提供了本发明第一方面所述的基因突变或本发明第二方面所述的蛋白质突变或本发明第三方面所述的检测试剂在制备CCA诊断或辅助诊断产品中的应用。
进一步，所述诊断或辅助诊断产品通过检测样本中本发明第一方面所述的基因突变或本发明第二方面所述的蛋白质突变来诊断或辅助诊断受试者个体是否患有CCA；
优选地，所述样本来源于受试者的血液。
本发明的第七方面提供了一种CCA的诊断或辅助诊断产品。
进一步，所述诊断或辅助诊断产品包括本发明第三方面所述的检测试剂；
优选地，所述诊断或辅助诊断产品包括试剂盒、芯片、试纸。
进一步，所述试剂盒包括有效量的检测上述FBN2基因突变和FBN2蛋白质突变的一种或多种检测试剂；
进一步，所述试剂盒还包括选自以下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。
进一步，本发明所述试剂盒中附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，以及如何利用检测结果对CCA进行判断、对患有CCA的风险性的评估、孕前预警。
采用本发明所述的试剂盒，可通过本领域内已知的任何方法对基因及其编码的蛋白进行检测。本领域技术人员应当理解，检测基因的手段不是本发明的重要方面。本发明中的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括(但不限于)：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、免疫检测技术。
进一步，检测基因突变或蛋白突变的方法包括(但不限于)：Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM或联合应用上述方法。
进一步，本发明所述的试剂盒还包含临床上用于CCA的诊断、患有CCA的风险性的评估、孕前预警、治疗方案的选择的其它试剂，以辅助或验证通过检测上述突变所得到的结果，本领域普通技术人员可根据具体需要进行常规选择。
通常，可利用本发明所述的检测试剂盒，采用如下方法进行CCA的诊断或辅助诊断：
(1)从受试者中获得待测样本；
(2)使待测样本与本发明所述的检测试剂盒中的检测试剂接触；
(3)检测该待测样本中上述基因突变位点或蛋白质突变位点；
(4)根据检测结果进行CCA的诊断或辅助诊断：若检测结果显示受试者样本中携带上述基因突变位点或蛋白质突变位点，则提示所述受试者患有CCA。
进一步，所述待测样本来源于受试者的血液。
进一步，所述基因突变位点为FBN2基因上的突变位点，所述蛋白质突变位点位为FBN2蛋白质上的突变位点。
进一步，所述基因突变位点包括c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A，所述蛋白质突变位点包括p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr。
进一步，所述基因突变位点c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A包含多种可实施的方式，所述多种可实施的方式包括：c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意一种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意两种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意三种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A中的任意四种；c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A五种。
进一步，所述蛋白质突变位点p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr包含多种可实施的方式，所述多种可实施的方式包括：p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意一种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意两种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意三种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr中的任意四种；p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr五种。
进一步，所述芯片的制备可采用本领域技术人员已知的生物芯片的常规制备方法，包括(但不限于)：采用修饰玻片或硅片的固相载体，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明所述的芯片；如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control ofgene expression on a genomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
除非另有定义，本发明上下文中的所使用的所有的技术和科学术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例，不是旨在于限制本发明，此外，对部分术语解释如下。
本发明中使用的术语“诊断”或“辅助诊断”，是指分子或病理状态、疾病或状况的鉴定或分类。“诊断”或“辅助诊断”还可以指特定亚型的疾病的分类，例如通过分子特征(例如以特定基因或核酸区域中的核苷酸变异表征的患者亚群)来进行。
本发明中使用的术语“外显子”，是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA对应于基因中的部分。内含子是在mRNA加工过程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。外显子和内含子都是对于基因而言的，编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没有遗传效应。
本文中使用的术语“有效量”，是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素，包括但不限于治疗对象的特征因素(如身高、体重、性别、年龄和用药史)、罹患疾病的严重程度。
本发明的优点和有益效果：
本发明通过对10个家庭的27名CCA患者进行全外显子组测序分析，发现FBN2上存在如下罕见突变：c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A，通过CCA临床评分系统对上述突变位点分别进行了验证，证明了所述FBN2基因突变在诊断CCA中的准确性和可靠性，表明了本发明所述FBN2基因突变为致病突变，能用于CCA的辅助诊断中；
本发明的结果一方面有助于解释CCA患者的病因，另一方面可将上述突变位点的突变型FBN2基因以及相应的突变型FBN2蛋白质作为CCA的生物标志物，用于CCA的诊断或辅助诊断、患有CCA的风险性的评估、孕前预警、治疗方案的选择，指示该突变型FBN2基因携带者的后代患有CCA的风险。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示的是CCA患者的家系图，其中，△表示该个体接受了基因检测(Sanger测序和全外显子组测序)，●表示该个体接受了表型评估；
图2显示的是本发明中患者的表型和文献中已报道的患者的表型统计示意图，其中，▲表示本发明研究的患者表型数据，■表示文献中已报道的患者表型数据；
图3显示的是本发明中筛选得到的FBN2基因突变和文献已报道的FBN2基因突变，其中，▲表示本发明筛选得到的FBN2基因突变；
图4显示的是FBN2 c.3467G>A突变检测的结果图；
图5显示的是FBN2 c.2759G>A突变检测的结果图；
图6显示的是FBN2 c.3350A>G突变检测的结果图；
图7显示的是FBN2 c.3088G>A突变检测的结果图；
图8显示的是FBN2 c.3353A>G突变检测的结果图；
图9显示的是CCA临床表型计分统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1筛选与CCA相关的FBN2基因突变
1、研究对象
招募了10名经临床和分子诊断为CCA的先证者，分别来自北京积水潭医院手外科和北京协和医院骨科，由两名研究者(LS和YH)分别通过体格检查或X线照片评估先证者的临床表型，并对其家系进行了相关调查，所有受试者或其监护人均签署了知情同意书，本研究经北京积水潭医院审查委员会的批准。
2、DNA提取
经知情同意后，抽取患者及其家系成员的外周静脉血，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，按照生产制造商的说明，使用DNeasy血液/组织基因组DNA提取试剂盒(德国，QIAGEN)提取DNA，A260/A280比值范围在1.8-2.0之间。
3、基因检测
将提取的DNA样品制备到Illumina配对末端文库中，并采用Agilent V5进行全外显子组捕获，然后在Illumina HiSeq 4000平台(Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)上进行测序。使用内部开发的北京协和医院分析管道(Peking Union Medical CollegePipeline，PUMP)对变体进行调用和注释。
4、ES数据分析
采用公共基因组数据库1000个基因组中次要等位基因频率小于0.01的罕见变体、基因组聚合数据库(gnomAD，http://gnomad.broadinstitute.org/)、外显子集成联合数据库(ExAC，http://exac.broadinstitute.org/)、涉及脊柱侧凸和合并症疾病内部数据库(DISCO，http://discostudy.org/，>2000个外显子组)对筛选出的FBN2变异位点进行了进一步的筛选，本发明还根据美国遗传学与基因组学学会(ACMG)于2015年制定的基因变异解读标准和指南对筛选出的突变位点进行了注释、筛选和解读。突变效应的预测利用了如下计算预测工具：联合注释依赖耗竭(CADD，https://cadd.gs.washington.edu/)、预测突变危害的生物信息学工具(SIFT，http://sift.jcvi.org/)和预测突变危害的生物信息学工具PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)。
5、实验结果
招募患者的家系见图1，本研究包括27例患者(14名女性)，分别来自10个相互之间无亲属关系的家庭，其中，8个先证者有CCA家族史，患者入院时年龄的中位数为4.95岁，所有被招募的患者几乎均表现为蜘蛛样指(27/27，100％)、皱耳(26/27，96.3％)、屈曲指(26/27，96.3％)、细长指(趾)(24/27，89％)和降口角肌发育不全(22/26，85％)，超过一半的患者(16/25，64％)表现为大关节挛缩，包括肘、腕、膝、踝、肩，54％的患者(13/24)患有脊柱后凸或脊柱侧凸，29％的患者(7/24)表现为胸畸形，其中鸡胸4例，漏斗胸3例，74％的患者(17/24)表现为高腭穹，71％的患者(17/24)表现为小颌，33％的患者(9/27)表现为扁平足(见图2)，膝内翻2例，此外，除了CCA的临床特征外，其中1例患者还表现为隐睾、整体发育迟缓、房间隔缺损、蒜头鼻和宽眉。
结果显示，在研究对象中检测到10个FBN2基因变异(见表1)，经验证发现，上述10个FBN2基因变异在小鼠、恒河猴、牛、狗和大鼠等物种中都是极为保守的，其中，经现有数据库验证证明了c.3353A>G(p.Glu1118Gly)、c.3350A>G(p.Asp1117Gly)、c.3088G>A(p.Gly1030Arg)、c.2759G>A(p.Cys920Tyr)、c.3467G>A(p.Cys1156Tyr)为未被报道过的新变异(见图3)，在FBN2基因的第24-32外显子区域中发现的FBN2基因变异有c.3353A>G(p.Glu1118Gly)、c.3350A>G(p.Asp1117Gly)、c.3088G>A(p.Gly1030Arg)、c.3467G>A(p.Cys1156Tyr)，在FBN2基因的第24-32外显子区域外发现的FBN2基因变异有c.2759G>A(p.Cys920Tyr)，其中，c.3353A>G(p.Glu1118Gly)、c.3350A>G(p.Asp1117Gly)和c.3467G>A(p.Cys1156Tyr)会改变高度保守的cbEGF样结构域中的半胱氨酸残基，进而破坏二硫键损害原纤维蛋白-2的自然折叠，减少了原纤维蛋白-2微纤维的数量并降低了纤维的弹性，导致CCA表型的产生，c.3088G>A(p.Gly1030Arg)和c.2759G>A(p.Cys920Tyr)改变了TB结构域，通过对其致病性的预测，验证了所述FBN2基因变异为致病性的变异。
表1 CCA患者中筛选出的FBN2基因和ANKRD11基因上的突变
Figure BDA0003248941240000111
p.？：表示由于剪接突变改变，无法预测蛋白质的改变。
基于《ACMG遗传变异分类标准与指南》，我们对所发现的10个突变的致病性进行评估，所有突变都被评估为致病或可能致病突变(表2)。
表2所有FBN2突变的ACMG变异分类及证据
Figure BDA0003248941240000121
实施例2Sanger测序验证
1、引物设计
采用Primer 5软件进行PCR引物设计。所使用引物序列如下：
c.3353A>G、c.3350A>G、c.3467G>A所用引物
FBN2-1-F:GTATGGTTTCAAGCTGGCGA(SEQ ID NO:1)
FBN2-1-R:TTTTGGCAGTTGGGGAAAGG(SEQ ID NO:2)
c.2759G>A所用引物
FBN2-2-F:AGAAGGCCTGCTTATGTACCA(SEQ ID NO:3)
FBN2-2-F:GGTAAGAGCTCCCCAACCTT(SEQ ID NO:4)
c.3088G>A所用引物
FBN2-3-F:ACCTTTGTAAAATGGCCGCC(SEQ ID NO:5)
FBN2-3-R:ACGCTTGACATGTGACTGT(SEQ ID NO:6)
2、Sanger测序
实验步骤如下：
a)按照下表3配置PCR反应体系；
表3基因PCR反应体系
Figure BDA0003248941240000131
b)PCR反应条件见表4；
表4 FBN2基因PCR反应条件
Figure BDA0003248941240000132
c)配置1％的琼脂糖凝胶；
d)PCR反应结束后，吸取3μL上样缓冲液+2μL PCR产物进行上样，随后110V条件下电泳30分钟；
e)在Kodak凝胶成像仪下观察PCR结果；
f)将片段大小符合预期、条带清晰PCR产物送至北京擎科生物公司进行Sanger测序，测序仪器为Axygen AP-GX-50kit(货号05915KE1)。
3、实验结果
实验结果显示，Sanger测序的结果证实了患者中FBN2基因上的突变位点c.3467G>A、c.2759G>A、c.3350A>G、c.3088G>A、c.3353A>G的存在(分别见图4-图8)，证明了上述突变为真性突变。
实施例3通过CCA临床评分系统对致病FBN2基因突变进行验证
在本实施例中，根据记录的受试者表型，计算了每个受试者的CCA临床评分，根据临床评分的结果，对本发明所述的致病FBN2基因进行了验证，所述CCA临床评分根据文献“Meerschaut I,De Coninck S,Steyaert W,et al.A clinical scoring system forcongenital contractural arachnodactyly[J].Genetics in Medicine,2020,22(1):124-131.”中报道的CCA临床评分系统进行计算。
1、实验方法
具体评分标准见表5，总分≥7分高度可疑CCA。
表5 CCA临床评分标准
Figure BDA0003248941240000141
Figure BDA0003248941240000151
2、实验结果
剔除临床表型评估不全的11位患者，剩余16位患者的CCA临床表型计算所得分见图9，最高17分，最低8分，中位数为14分，通过该CCA临床评分系统进一步验证了本发明所述的FBN2基因上的突变位点c.3467G>A、c.2759G>A、c.3350A>G、c.3088G>A、c.3353A>G为致病突变，可将上述突变位点用于CCA的诊断中。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> 新型FBN2基因突变标志物及其在CCA辅助诊断中的应用
<141> 2021-09-06
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtatggtttc aagctggcga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttttggcagt tggggaaagg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaaggcctg cttatgtacc a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtaagagct ccccaacctt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acctttgtaa aatggccgcc 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgcttgaca tgtgactgt 19

Claims (10)

1.用于诊断或辅助诊断CCA的基因突变，其特征在于，所述基因突变是FBN2基因上的突变；
优选地，所述突变包括c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A。
2.用于诊断或辅助诊断CCA的FBN2蛋白质突变，其特征在于，所述蛋白质突变包括p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr。
3.权利要求1所述的基因突变或权利要求2所述的蛋白质突变的检测试剂。
4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括所述基因突变的特异性扩增引物和/或特异性识别探针、或特异性识别FBN2蛋白质突变的试剂；
优选地，所述基因突变包括c.3353A>G、c.3350A>G、c.3088G>A、c.2759G>A、c.3467G>A；
优选地，所述蛋白质突变包括p.Glu1118Gly、p.Asp1117Gly、p.Gly1030Arg、p.Cys920Tyr、p.Cys1156Tyr。
5.根据权利要求3或4所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
6.权利要求1所述的基因突变在制备权利要求3-5中任一项所述的检测试剂中的应用。
7.权利要求2所述的蛋白质突变在制备权利要求3-5中任一项所述的检测试剂中的应用。
8.权利要求1所述的基因突变或权利要求2所述的蛋白质突变或权利要求3-5中任一项所述的检测试剂在制备CCA诊断或辅助诊断产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述诊断或辅助诊断产品通过检测样本中权利要求1所述的基因突变或权利要求2所述的蛋白质突变来诊断或辅助诊断受试者个体是否患有CCA；
优选地，所述样本来源于受试者的血液。
10.一种CCA的诊断或辅助诊断产品，其特征在于，所述诊断或辅助诊断产品包括权利要求3-5中任一项所述的检测试剂；
优选地，所述诊断或辅助诊断产品包括试剂盒、芯片、试纸。
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