CN113151288B - 突变的HoxA10基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了突变的HoxA10cDNA及应用。本发明公开了一种突变的HoxA10cDNA，其与野生型HoxA10cDNA相比至少具有下列突变:c.600C>A；其中，所述野生型HoxA10基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了一些突变的HoxA10cDNA的应用。本发明还公开了突变的HoxA10基因。

Description

突变的HoxA10基因及应用
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及突变的HoxA10基因及应用。
背景技术
软骨发育不全(achondroplasia,ACH)是最常见的骨骼发育不良，在活产儿中发病率约1/15000～1/30000。该病的病理特征是受累病例在其胚胎发育时期第22周左右开始出现软骨畸形和生长不足，无法进行适当骨化，导致长骨不成比例发育，最终引起躯干、四肢及头骨大小和形状异常。患者躯干与四肢不成比例，成年平均身高约128cm，四肢短小。肢体近端受累甚于远端，可有关节屈曲挛缩及脱位，下肢短而弯曲呈弓形，严重者影响关节正常功能。
目前唯一已知与ACH相关的遗传学病因是成纤维细胞生长因子受体-3(fibroblast growth factor receptor,FGFR-3)基因突变，呈常染色体显性遗传模式，绝大多数病例以散发为主，主要为新发突变。然而，FGFR3基因突变并不能解释全部病例，只能负责80％～90％软骨发育不全的病例。在临床实践中还存在10％～20％软骨发育不全的患者病因及分子改变至今未明。在产前遗传咨询中，评估此类不明原因软骨发育不全胎儿病例的临床预后具有极大的困难和挑战。
发明内容
基于此，针对临床实践中还存在10％～20％软骨发育不全的患者病因及分子改变至今未明的问题，本发明提供了突变的HoxA10基因及应用。
本发明提供一种突变的HoxA10 cDNA，其与野生型HoxA10 cDNA相比至少具有下列突变:c.600C>A；
其中，所述野生型HoxA10基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
如本文中所使用的，术语“c.600”是指cDNA序列的第600位碱基(以起始密码子ATG的碱基A为第1位碱基)，其中“c.”表示cDNA，数字“600”表示第600位碱基。c.600C>A指的是cDNA的第600位碱基由C突变为A。
本发明还提供一种包含所述的突变的HoxA10 cDNA的载体。
本发明还提供一种包含所述的突变的HoxA10 cDNA的宿主细胞。
本发明还提供一种包含所述的突变的HoxA10 cDNA的非人类动物作为软骨发育不全动物模型的应用。
本发明还提供一种所述的突变的HoxA10 cDNA作为治疗软骨发育不全疾病的药物靶点的应用。
本发明还提供一种特异性检测所述的突变的HoxA10 cDNA的诊断剂在制备用于诊断软骨发育不全的试剂或试剂盒中的应用。
在一些实施方案中，所述试剂包括引物或探针，和/或，所述试剂盒包括引物或探针。
在一些实施方案中，所述试剂用于检测HoxA10蛋白表达水平。
本发明还提供一种野生型HoxA10蛋白在制备用于治疗所述的突变的HoxA10 cDNA导致的软骨发育不全的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供一种基因编辑试剂在制备用于治疗所述的突变的HoxA10cDNA导致的软骨发育不全的试剂或试剂盒中的应用，所述基因编辑试剂包括能够纠正患者中所述的突变的HoxA10 cDNA对应的突变HoxA10基因而使所述突变HoxA10基因恢复为野生型HoxA10基因的试剂。
本发明还提供一种突变的HoxA10基因，其与野生型HoxA10基因相比，在cDNA水平上，至少具有下列突变:c.600C>A；
其中，所述野生型HoxA10基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明首次提供了人软骨发育不全的新致病基因HoxA10，并提供了新的杂合致病突变c.600C>A的检测方法，这个突变会导致HoxA10蛋白翻译提前终止。本发明提供的HoxA10基因特定突变增加了该病致病基因突变谱，可以为人软骨发育不全致病机理的解析、致病基因检测、治疗药物的开发以及针对性预防和治疗等提供依据和奠定基础。
附图说明
图1为本发明一实施例的软骨发育不全家系系谱图；
图2为本发明一实施例的HoxA10基因突变位点sanger验证图；
图3为本发明一实施例的RT-PCR分析证实ACH患者中HoxA10蛋白表达水平图；
图4为本发明一实施例的72hpf斑马鱼胚胎显微形态学比较图示；
图5为本发明一实施例的HoxA10基因突变C57BL/6小鼠模型F2代小鼠外观图示。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
目前唯一已知与软骨发育不全相关的遗传学病因是FGFR3基因突变。然而，FGFR3基因突变并不能解释全部病例，只能负责80％～90％软骨发育不全的病例。在临床实践中还存在10％～20％软骨发育不全的患者病因及分子改变至今未明。
新近发展起来的下一代高通量测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)能够直接在全基因组30亿个碱基范围内精确检测突变的基因和遗传变异位点，为探索和发现罕见疾病的致病基因提供了技术便利和可行性。其中外显子测序技术以其经济、有效的优势已广泛应用于遗传病及复杂疾病的研究。
本发明主要应用全外显子组测序技术(Whole exome sequencing,WES)在一个连续三代、包含8例不明原因的软骨发育不全患者的大家系中发现全部患者均发生相同的HoxA10基因截断突变c.600C>A(p.C200X)，而家系中其余没有表型的正常人均未检出该突变。HoxA10基因包括2个外显子，全长2408bp，该突变位点c.600C>A位于第一外显子，在脊椎动物间高度保守，在gnomAD、1000Genomes和dbSNP等人群数据库均未见收录，发生该突变后HoxA10蛋白翻译提前终止，为截断突变。发明人通过RT-PCR分析证实上述软骨发育不全患者中HoxA10蛋白表达显著下调，成骨信号关键分子Bmp2和正调控因子Runx2显著异常；成功构建HoxA10突变斑马鱼和小鼠模型，发现72hpf斑马鱼胚胎体长显著缩短，F2代HoxA10突变小鼠身材短小、躯干骨弯曲、近端关节膨大变形。基因干扰细胞模型研究提示HoxA10基因干扰可导致前成骨细胞增殖/凋亡紊乱。
本发明首次提供了人软骨发育不全的新致病基因HoxA10，并提供了新的杂合致病突变c.600C>A的检测方法，有望作为该病药物制备的靶点。
本发明实施例提供一种突变的HoxA10 cDNA，其与野生型HoxA10 cDNA相比具有至少1个杂合突变，并且所述突变的HoxA10 cDNA对应的突变HoxA10基因导致软骨发育不全的发生。
在本发明实施例中，所述杂合突变是选自下列突变:c.600C>A；
其中，所述野生型HoxA10基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明实施例还提供一种包含所述的突变的HoxA10 cDNA的载体。
在一些实施方案中，所述载体可特别选自pcDNA；pTT(Durocher等，Nucleic AcidsResearch 2002，Vol 30，No.2)；pTT3(具有额外的多克隆位点的pTT)；pEFBOS(Mizushima，S.和Nagata，S.，(1990)Nucleic Acids Research Vol 18，No.17)；pBV；pJV和pBJ。
本发明实施例还提供一种包含所述的突变的HoxA10 cDNA的宿主细胞。
在一些实施方案中，用本文所披露的载体转化宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为原核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方案中，宿主细胞为真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞(如哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞)、植物细胞和真菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS；或为真菌细胞，如酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；或为昆虫细胞如Sf9。本文所限定的宿主细胞为不具有发育全能型的细胞，不包括胚胎干细胞、受精卵等。
本发明实施例还提供一种包含所述的突变的HoxA10 cDNA的非人类动物作为软骨发育不全动物模型的应用。
在一些实施方案中，本文所述的非人类动物是啮齿类动物；在一些实施方案中，啮齿类动物为小鼠；在一些实施方案中，啮齿类动物为大鼠。在一些实施方案中，本文所述的小鼠选自129品系、BALB/C品系、C57BL/6品系和混合的129xC57BL/6品系；在某些实施方案中，小鼠选自C57BL/6品系。
本发明实施例还提供一种所述的突变的HoxA10 cDNA作为治疗软骨发育不全疾病的药物靶点的应用。
本发明实施例还提供一种特异性检测所述的突变的HoxA10 cDNA的诊断剂在制备用于诊断软骨发育不全的试剂或试剂盒中的应用。所述诊断剂于核酸水平进行检测。试剂、试剂盒包括引物或探针。
核酸水平(DNA或RNA水平)的诊断剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该DNA或RNA杂交，且标记有荧光标记的核酸(通常为探针或引物)等。并且本领域技术人员也容易想到将mRNA反转录成cDNA后对cDNA进行检测，这些技术手段的常规置换不超出本发明的保护范围。
在一些实施方式中，所述诊断剂用于执行以下任一种方法：
聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
在一些实施方式中，所述聚合酶链反应选自限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、Taqman探针法、竞争性等位基因特异性PCR和等位基因特异性PCR。
在一些实施方式中，所述生物质谱法选自飞行质谱仪检测。
在一些实施方式中，所述核酸测序法选自Snapshot法。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸测序法可以为转录组测序或基因组测序。在本发明另外一些实施方案中，所述核酸测序法是高通量测序，也称作二代测序(“NGS”)。二代测序在并行的测序过程中同时产生数千至数百万条序列。NGS区别于“Sanger测序”(一代测序)，后者是基于单个测序反应中的链终止产物的电泳分离。可用本发明的NGS的测序平台是商用可得的，包括但不限于Roche/454FLX、Illumina/Solexa GenomeAnalyzer和Applied Biosystems SOLID system等。转录组测序也可以通过二代测序平台快速全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，可以用于研究基因表达量、基因功能、结构、可变剪接和新转录本预测等。
本发明实施例还提供一种特异性检测所述的突变的HoxA10 cDNA的诊断剂在制备用于诊断软骨发育的试剂或试剂盒中的应用。所述诊断剂于蛋白水平进行检测。其包括用于检测HoxA10蛋白表达水平的试剂。
在一些实施方式中，所述诊断剂用于执行以下任一种方法：
生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。
用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测的方法进一步可以为免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫组化、ELISA以及Western Blot等。
在一些实施方案中，用于诊断软骨发育不全的试剂盒还包括样品的处理试剂；进一步地，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
在一些实施方案中，所述样品选自血液、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种。
本发明实施例还提供一种野生型HoxA10蛋白在制备用于治疗或缓解所述的突变的HoxA10 cDNA导致的软骨发育不全的试剂或试剂盒中的应用。即，野生型HoxA10蛋白作为治疗剂，可通过对患者直接施加野生型HoxA10蛋白来弥补突变的HoxA10 cDNA导致的HoxA10表达下降。
本发明还提供一种突变的HoxA10基因，其与野生型HoxA10基因相比，在cDNA水平上，至少具有下列突变:c.600C>A；
其中，所述野生型HoxA10基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
这里突变的HoxA10基因指的是可以经转录得到mRNA，该mRNA经反转录能够得到上述突变的cDNA的核苷酸序列，该突变的HoxA10基因可包含或者不包含内含子。
该突变的HoxA10基因具有与上述任一实施例的突变的HoxA10 cDNA基本相同的应用，即，包含该突变的HoxA10基因的载体。包含该突变的HoxA10基因的宿主细胞。包含该突变的HoxA10基因的非人类动物作为软骨发育不全动物模型的应用。特异性检测该突变的HoxA10基因的诊断剂在制备用于诊断软骨发育不全的试剂或试剂盒中的应用。野生型HoxA10蛋白在制备用于治疗该突变的HoxA10基因导致的软骨发育不全的试剂或试剂盒中的应用等等。
本发明实施例还提供一种基因编辑试剂在制备用于治疗上述的突变的HoxA10cDNA其对应的突变的HoxA10基因导致的软骨发育不全的试剂或试剂盒中的应用。所述基因编辑试剂包括能够纠正患者中所述的突变的HoxA10cDNA对应的突变HoxA10基因而使所述突变HoxA10基因恢复为野生型HoxA10基因的试剂，从而可以在患者中正常表达HoxA10蛋白。
在一些实施方案中，采用常用的基因编辑方法将野生型HoxA10蛋白基因替换突变的HoxA10基因或者直接敲入野生型HoxA10蛋白基因。基因编辑方法例如为CRISPR/Cas9技术。Crispr-Cas9系统所需的基因编辑试剂例如包括sgRNA和Cas9酶等。
以下将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
1、样本收集
发明人收集到一个连续三代、包括8例软骨发育不全患者的家系(图1)，本次发明经广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准，坚持1964年《赫尔辛基宣言》和其后修订内容中制定的标准。所有参与个体都由本人或他们的监护人签署了知情同意书。软骨发育不全家系中，先证者最初就诊时为产前妊娠24+周的胎儿病例，产前超声扫描提示该胎儿病例符合软骨发育不全的超声表现征象，产前诊断后，经充分产前遗传学咨询，孕妇选择继续妊娠，患儿目前出生后1岁10个月。收集患者的临床信息，包括年龄、性别和临床症状，采集24+周的胎儿脐带血和家系其他成员外周血样本。该家系全部患者共有的临床特征，X线检查特征、以及血液指标(生长激素GH、生长因子IGH-1、以及骨骼的钙磷代谢)等均支持软骨发育不全的临床诊断。共同的临床表现主要有成年患者身高均在110-130cm之间，四肢短小，膝关节屈曲挛缩及脱位，下肢短而弯曲呈弓形。骨骼X线检查共有的特征主要有双侧肱骨、挠骨、股骨、胫骨及腓骨骨端膨大，形态不规则，骨干缩短弯曲，近端骨骼变小，干骺端发育异常，关节间隙变窄，符合典型软骨发育不全的X线诊断标准。
2、微阵列分析(chromosome microarray analysis，CMA)
所有样本DNA的提取使用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒，基因组DNA杂交微阵列芯片使用Human CNV Association Microarray Kit(安捷伦，美国加利福尼亚)。芯片数据分析使用Genomic Workbench软件(安捷伦)。拷贝数变异(CNVs)结果致病性的判定通过与文献以及数据库的比较，比如人群多态性数据库DGV、病例数据库DECIPHER、基因剂量效应数据库ClinGen、人类孟德尔遗传在线数据库OMIM等。
通过微阵列分析(CMA)技术对该家系胎儿及患者进行检测，结果未检出明确致病性微缺失或微重复变异。
3、全外显子测序
发明人采用SureSelect XT Human All Exon 50Mb V5 Kit(安捷伦)捕获芯片对所有的DNA样本杂交获取目标区域序列，在Illumina HiSeq 2500测序仪上进行双末端150bp测序。测序后获得的原始数据使用fastp(V0.20)进行原始数据质控，去除含有接头或者低质量的reads，将质控后的clean data利用BWA(V0.7.17)比对到人类参考基因组GRCH37(hg19)，利用Samtools(V1.9)以及Picar d软件对比对后的数据排序以及标记重复序列，最后使用GATK(V3.8)的Haplot ypeCaller模块检测样本的变异信息；对得到的初始变异结果进行过滤留下高质量的信息，去掉条件满足以下之一的变异：突变总深度低于10,基因型质量值低于50以及比对质量值低于30。变异的注释使用VEP(Variant EffectPredictor)，同时注释疾病数据库，人群频率数据库，危害性或保守型预测软件以及变异位点数据库等信息；群体数据库包括千人基因组(1000genomics)、gnomAD和实验室的本地频率数据库；危害性或保守型预测软件包括SIFT,Polyphen2_HDIV,REVEL,MutationTaster以及MetaSVM等，变异位点数据库ClinVar和HGMD以及疾病数据库OMIM,Orphanet，MedGen,DDG2P等。
通过对上述所有家系成员的数据分析，优先关注可能影响蛋白功能的编码区以及剪切区域，同时群体数据频率小于0.05的变异，结合家系共分离信息，发明人按照常染色体显性遗传模式分析在该家系中未检出已知的骨骼发育异常相关基因突变，但发现全部患者均有HoxA10基因c.600C>A(p.C200X)杂合突变，HoxA10基因是同源盒基因(HomeoboxGenes)Hox家族成员之一，Hox基因家族是胚胎发育及器官形成的重要调控基因,在时间和空间上适当表达对脊椎动物的轴向骨骼发育发挥着极其重要的作用,目前仅知道HoxA13突变可导致人常染色体显性遗传性手-足-生殖器综合征(OMIM#140000,该综合征临床表现主要为拇指/脚趾缩短、掌指关节融合，以及生殖系统重复，例如女性纵膈子宫畸形)；以及零散病例报道HoxD13基因突变可引起肢端手指缩短。HoxA10基因缺陷所导致的人体疾病后果并不为人们所知。
因此，综合以上包含8例患者的大家系病例结果提示，同源盒基因HoxA10截断突变可能与软骨发育不全相关，并呈常染色体显性遗传模式。
4、HoxA10基因的扩增与sanger测序验证
HoxA10基因包括2个外显子Exons，这个突变c.600C>A位于Exon 1，设计引物，在上述家系所有成员内验证该位点，同时，发明人针对HoxA10基因在所在科室收集的额外暂未接受外显子测序的100例正常健康对照和100例骨骼发育异常病例中做该基因扩展筛查，结果未发现其他相关致病位点。通过PCR扩增，产物纯化获得HoxA10序列，然后sanger测序，根据序列测定结果判断位点属于突变型还是野生型。
1)DNA提取：所有样本DNA的提取使用QIAamp DNABlood Mini Kit试剂盒。
2)引物设计及PCR反应：引物设计参考人类基因组参考序列Hg19/GRCH37，设计基因外显子特异性引物，具体见下表1所示。
表1
Figure BDA0002954744670000091
按以下配比分别配置各基因组DNA样本的PCR反应体系：
反应体系1：33.1μL
Figure BDA0002954744670000101
反应体系2：50.1μL
Figure BDA0002954744670000102
将各PCR反应体系按照以下表2的反应条件分别进行PCR反应：
表2
Figure BDA0002954744670000103
Figure BDA0002954744670000111
3)sanger测序
将上述PCR扩增产物直接进行sanger测序(ABI 3730 DNA Analyzer)。
通过验证，大家系1的HoxA10基因c.600C>A突变位点信息见表3，Sanger测序验证峰图见图2(c.600C>A)。
表3
Figure BDA0002954744670000112
野生型HoxA10基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，1233nt，下划线及加粗标注为突变位置：
Figure BDA0002954744670000113
Figure BDA0002954744670000121
其编码的蛋白具有如下所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)，410aa，下划线及加粗标注为突变位置：
Figure BDA0002954744670000122
5、RT-PCR在软骨发育不全大家系病例中蛋白表达分析：
RT-PCR分析发现该类患者HoxA10表达显著下调，如图3。
实施例2构建HoxA10 c.600C>A(p.C200X)突变体斑马鱼：
通过CRISPR-Cas9基因编辑技术快速构建突变体斑马鱼模型，进行显微形态学评价72hpf突变型和正常对照野生型斑马鱼胚胎体长。结果发现突变体斑马鱼胚胎平均体长显著缩短，整体形态收缩，与成骨发育不全患者身材矮小的临床特征相类似，如图4。图4上图为正常对照野生型斑马鱼，下图为HoxA10c.600C>A突变体斑马鱼，与正常对照相比，突变体斑马鱼体长明显缩短，整体形态收缩。
实施例3构建HoxA10 c.600C>A基因突变C57BL/6小鼠模型：
发明人通过CRISPR/cas9基因敲除技术直接利用人HoxA10基因突变序列代替小鼠HoxA10基因序列，分别模拟软骨发育不全患者中的突变成功制备获得了HoxA10突变的C57BL/6小鼠模型。并观察到F2代HoxA10突变鼠发生明显的身材短小、生长缓慢、躯干骨骼弯曲、前肢关节活动受限，如图5。图5左边为HoxA10基因突变小鼠，右边为正常野生型对照小鼠外观。由图5可知F2代HoxA10突变鼠身材短小，生长缓慢、躯干骨骼弯曲、前肢关节活动受限。
使用野生型HoxA10蛋白肌肉注射至HoxA10 c.600C>A突变体小鼠中，经观察突变体小鼠软骨发育不全症状变弱，小鼠基本恢复至正常状态。
本发明首次提供了人软骨发育不全的新致病基因HoxA10，并提供了新的杂合致病突变c.600C>A的检测方法，这个突变会导致HoxA10蛋白翻译提前终止。蛋白分析证实携带该类突变患者HoxA10表达显著下调，成骨信号分子Bmp2和调控因子Runx2显著异常；进一步构建了HoxA10突变斑马鱼和小鼠模型，观察到突变体斑马鱼胚胎体长缩短，形态收缩。F2代突变小鼠发生明显的身材短小、躯干骨骼弯曲、近端关节膨大变形及活动受限等骨骼异常表型。因此，同源盒基因HoxA10截断突变可能与软骨发育不全相关，并呈常染色体显性遗传模式。本发明提供的HoxA10基因特定突变增加了该病致病基因突变谱，可以为人软骨发育不全致病机理的解析、致病基因检测、治疗药物的开发以及针对性预防和治疗等提供依据和奠定基础。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市妇女儿童医疗中心
<120> 突变的HoxA10 基因及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1233
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgtcagcca gaaagggcta tctgctccct tcgccaaatt atcccacaac aatgtcatgc 60
tcggagagcc ccgccgcgaa ctcttttttg gtcgactcgc tcatcagctc gggcagaggc 120
gaggcaggcg gcggtggtgg tggcgcgggg ggcggcggcg gtggcggtta ctacgcccac 180
ggcggggtct acctgccgcc cgccgccgac ctgccctacg ggctgcagag ctgcgggctc 240
ttccccacgc tgggcggcaa gcgcaatgag gcagcgtcgc cgggcagcgg tggcggtggc 300
gggggtctag gtcccggggc gcacggctac gggccctcgc ccatagacct gtggctagac 360
gcgccccggt cttgccggat ggagccgcct gacgggccgc cgccgccgcc ccagcagcag 420
ccgccgcccc cgccgcaacc accccagcca gcgccgcagg ccacctcgtg ctctttcgcg 480
cagaacatca aagaagagag ctcctactgc ctctacgact cggcggacaa atgccccaaa 540
gtctcggcca ccgccgccga actggctccc ttcccgcggg gcccgccgcc cgacggctgc 600
gccctgggca cctccagcgg ggtgccagtg cctggctact tccgcctttc tcaggcctac 660
ggcaccgcca agggctatgg cagcggcggc ggcggcgcgc agcaactcgg ggctggcccg 720
ttccccgcgc agcccccggg gcgcggtttc gatctcccgc ccgcgctagc ctccggctcg 780
gccgatgcgg cccggaagga gcgagccctc gattcgccgc cgccccccac gctggcttgc 840
ggcagcggcg ggggctcgca gggcgacgag gaggcgcacg cgtcgtcctc ggccgcggag 900
gagctctccc cggccccttc cgagagcagc aaagcctcgc cggagaagga ttccctgggc 960
aattccaaag gtgaaaacgc agccaactgg ctcacggcaa agagtggtcg gaagaagcgc 1020
tgcccctaca cgaagcacca gacactggag ctggagaagg agtttctgtt caatatgtac 1080
cttactcgag agcggcgcct agagattagc cgcagcgtcc acctcacgga cagacaagtg 1140
aaaatctggt ttcagaaccg caggatgaaa ctgaagaaaa tgaatcgaga aaaccggatc 1200
cgggagctca cagccaactt taatttttcc tga 1233
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gataggcaga cacgcagaca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tccaacctta gggagcaatg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gggactagtg gcagcttctg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcttacccag ggaatccttc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gactagggac gaggacacca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gatccggttt tctcgattca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cttttggagg aactgcttgc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tagggcccag acaaattacg 20
<210> 10
<211> 410
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Ser Ala Arg Lys Gly Tyr Leu Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Pro Thr
1 5 10 15
Thr Met Ser Cys Ser Glu Ser Pro Ala Ala Asn Ser Phe Leu Val Asp
20 25 30
Ser Leu Ile Ser Ser Gly Arg Gly Glu Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Tyr Ala His Gly Gly Val Tyr
50 55 60
Leu Pro Pro Ala Ala Asp Leu Pro Tyr Gly Leu Gln Ser Cys Gly Leu
65 70 75 80
Phe Pro Thr Leu Gly Gly Lys Arg Asn Glu Ala Ala Ser Pro Gly Ser
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Gly Pro Gly Ala His Gly Tyr Gly Pro
100 105 110
Ser Pro Ile Asp Leu Trp Leu Asp Ala Pro Arg Ser Cys Arg Met Glu
115 120 125
Pro Pro Asp Gly Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro
130 135 140
Pro Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Gln Ala Thr Ser Cys Ser Phe Ala
145 150 155 160
Gln Asn Ile Lys Glu Glu Ser Ser Tyr Cys Leu Tyr Asp Ser Ala Asp
165 170 175
Lys Cys Pro Lys Val Ser Ala Thr Ala Ala Glu Leu Ala Pro Phe Pro
180 185 190
Arg Gly Pro Pro Pro Asp Gly Cys Ala Leu Gly Thr Ser Ser Gly Val
195 200 205
Pro Val Pro Gly Tyr Phe Arg Leu Ser Gln Ala Tyr Gly Thr Ala Lys
210 215 220
Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Leu Gly Ala Gly Pro
225 230 235 240
Phe Pro Ala Gln Pro Pro Gly Arg Gly Phe Asp Leu Pro Pro Ala Leu
245 250 255
Ala Ser Gly Ser Ala Asp Ala Ala Arg Lys Glu Arg Ala Leu Asp Ser
260 265 270
Pro Pro Pro Pro Thr Leu Ala Cys Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Gly
275 280 285
Asp Glu Glu Ala His Ala Ser Ser Ser Ala Ala Glu Glu Leu Ser Pro
290 295 300
Ala Pro Ser Glu Ser Ser Lys Ala Ser Pro Glu Lys Asp Ser Leu Gly
305 310 315 320
Asn Ser Lys Gly Glu Asn Ala Ala Asn Trp Leu Thr Ala Lys Ser Gly
325 330 335
Arg Lys Lys Arg Cys Pro Tyr Thr Lys His Gln Thr Leu Glu Leu Glu
340 345 350
Lys Glu Phe Leu Phe Asn Met Tyr Leu Thr Arg Glu Arg Arg Leu Glu
355 360 365
Ile Ser Arg Ser Val His Leu Thr Asp Arg Gln Val Lys Ile Trp Phe
370 375 380
Gln Asn Arg Arg Met Lys Leu Lys Lys Met Asn Arg Glu Asn Arg Ile
385 390 395 400
Arg Glu Leu Thr Ala Asn Phe Asn Phe Ser
405 410

Claims (10)

1.突变的HoxA10 cDNA，其特征在于，所述突变的HoxA10 cDNA是由野生型HoxA10基因的cDNA发生下列突变:c.600C>A而形成；
其中，所述野生型HoxA10基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
2.包含权利要求1所述的突变的HoxA10 cDNA的载体。
3.包含权利要求1所述的突变的HoxA10 cDNA的宿主细胞。
4.一种软骨发育不全的非人类动物模型的制备方法，其特征在于，利用基因编辑技术将野生型非人类动物中的HoxA10基因替换为致病基因HoxA10，所述致病基因HoxA10的cDNA为权利要求1所述的突变的HoxA10 cDNA，所述非人类动物为小鼠或斑马鱼。
5.特异性检测权利要求1所述的突变的HoxA10 cDNA的诊断剂在制备用于诊断软骨发育不全的试剂或试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述试剂包括引物或探针，和/或，所述试剂盒包括引物或探针。
7.根据权利要求5所述的应用，所述试剂用于检测HoxA10蛋白表达水平。
8.野生型HoxA10蛋白在制备用于治疗权利要求1所述的突变的HoxA10cDNA导致的软骨发育不全的试剂或试剂盒中的应用。
9.基因编辑试剂在制备用于治疗权利要求1所述的突变的HoxA10 cDNA导致的软骨发育不全的试剂或试剂盒中的应用，所述基因编辑试剂包括能够纠正患者中权利要求1所述的突变的HoxA10 cDNA对应的突变而使所述突变恢复为野生型HoxA10基因的试剂。
10.突变的HoxA10基因，其特征在于，在cDNA水平上，所述突变的HoxA10基因的cDNA是由野生型HoxA10基因的cDNA发生下列突变:c.600C>A而成；
其中，所述野生型HoxA10基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
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