CN103923913A - 一种与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种猪HOXA10基因内含子基因片段作为猪产仔数性状的分子标记。本发明通过制备得到一种与猪产仔数性状相关的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，在序列表SEQ ID NO:1的第309bp处有一个T/C碱基突变，该突变导致PCR-EciⅠ-RFLP多态性。本发明还公开了该分子标记的制备方法及其在猪产仔数性状关联分析中的应用。本发明为猪产仔数性状标记检测提供了新的标记资源。

Description

一种与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及猪分子标记制备技术领域，具体涉及一种猪HOXA10基因编码区SNP作为猪产仔数性状相关的分子记及应用，它包括猪HOXA10基因编码区序列突变位点的检测方法与应用。

背景技术

国民经济的基础在于农业，作为农业基础性产业之一的畜牧业，其发展水平是判断国家和地区农业发达程度的关键指标(李顺,2010)。养猪业是畜牧业的重要组成部分，猪肉需求量在中国肉类制品中位居首位。以往遗传改良的重点为生产性状(指胴体形状和生长性状)，随着人们对繁殖性状的日益重视，产仔数作为最重要的繁殖性状正受到越来越多的关注和研究。决定产仔数的关键因素是胚胎成活率，而影响胚胎成活率最关键时期为胚胎附植(着床)时期(Bazer et al.,2009)。同源异形框基因HOXA10是受雌激素(E₂)、孕激素(P₄)调控并在着床窗口期高表达的转录因子(Achache and Revel,2006)，通过对HOXA11、EMX2、IGFBP1等靶基因的调控影响胚胎附植过程。对于建立子宫内膜容受性，胚胎定位与黏附的完成等都有着很关键的作用(Modi and Godbole,2009)。

HOXA10是同源框(Homeobox)基因a基因簇中位于胚胎体轴5’端腹部B类基因，在染色体上的位置为7p15～p14.2。HOXA10总长为2691bp的mRNA能够编码785个氨基酸。Satokata小鼠实验表明，HOXA10对建立子宫内膜容受性非常重要。通过总结大量临床案例，Gui等发现，人HOXA10基因表达出现问题会导致子宫内膜异位症进而引起容受性建立失败(Daftary et al.,2007；Gui et al.,1999；Kim et al.,2007；Rackow and Taylor,2010；Taylor et al.,1999)。因此HOXA10基因正常表达对于胚胎附植定位阶段的完成有很重要的作用(Wu et al.,2005)。胚泡释放妊娠信号标志着黏附阶段的开始。HOXA10基因在妊娠小鼠子宫内膜基质中表达与胚泡释放妊娠信号同步发生，均开始于妊娠后第2.5天(Satokata et al.,1995)。两者均能够影响基质细胞的增殖和分化从而影响黏附阶段的进行(Lim et al.,1999)。证据显示，抑制HOXA10基因的表达会阻碍小鼠胚泡的黏附(Bagot et al.,2000)。HOXA10基因的正常表达是保证黏附阶段顺利完成的重要影响因子之一。在胚胎附植侵入(蜕膜化)阶段，HOXA10基因在小鼠子宫内膜植入点附近蜕膜间质细胞中高表达，并将这种高表达蔓延至整个蜕膜。这将有助于维持间质细胞对母体分泌的孕激素(P₄)的应答反应，防止附植点出血导致的蜕膜化失败(Benson et al.,1996；Lim et al.,1999)。鉴于HOXA10基因在物种间的高度保守性，因此推测HOXA10基因的表达可能与猪的产仔数性状相关。

大部分繁殖性状的遗传结构是非常复杂的，通过对候选基因多态性的鉴定发现，不同的基因型与生理、免疫、内分泌方面不同的性状相互关联(et al.,2009)。目前，标记辅助选择(MAS)已作为常规选择法的辅助手段而被广泛应用，大大提高了产仔数性状的改良速度。标记辅助选择(MAS)包括随机引物扩增多态性(RAPD)标记、微卫星标记、PCR-RFLP标记、分子标记与QTL位点的连锁分析方法等(赵西彪,2008)。其中PCR-RFLP因检测不受发育阶段、性别等外部条件的影响，所标记的变异数目不受限制， 实用可靠而得到广泛的应用。

发明内容

本发明的目的在于获得一种与猪产仔数性状相关的分子标记，克隆HOXA10基因编码区序列，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪产仔数性状检测提供一种分子标记和方法。

本发明的技术方案如下：

本发明获得了一种与猪产仔数性状相关的分子标记，它包含猪(国外血缘猪大白猪和中国地方猪血缘猪陆川猪、隆林猪等)HOXA10基因404bp的序列(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:l或图4所示)；通过上述序列进行Cluster W比对提供了位于该扩增片段中的309bp处的T/C碱基变异(等位基因突变)，导致PCR-EciⅠ-RFLP多态性，其多态性检测结果如图1所示。

一种扩增猪(大白猪、陆川猪、隆林猪)HOXA10基因目的片段的引物，其DNA序列如序列表SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示。

申请人提供了一种筛选与猪产仔数性状相关的分子标记的方法，按照以下步骤：

选择三个猪品种(国外血缘猪代表品种大白猪、中国地方血缘猪代表品种陆川猪和隆林猪)为实验材料，从猪耳缘组织中提取DNA；根据猪HOXA10基因组序列设计引物(序列见SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示)并分段扩增；对PCR产物进行序列测定，进而进行序列比对，筛查SNP，然后再利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列进行片段扩增，将PCR扩增片段进行EciⅠ酶切分型及检测。

本发明提供了鉴定上述序列309bp处T/C变异的EciⅠ-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法。

进一步本发明提供了利用EciⅠ-RFLP方法确定的不同基因型个体与产仔数性状间的关联分析。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明扩增的国外血缘猪种大白猪和中国地方猪种陆川猪、隆林猪的核苷酸序列，序列长度为404bp。

序列表SEQ ID NO:2是本发明制备SEQ ID NO:1特异基因片段所用的正向引物，也是实施猪T/C变异EciⅠ-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物；

序列表SEQ ID NO:3是制备SEQ ID NO:1特异基因片段所用的反向引物，也是实施猪T/C变异EciⅠ-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物。

图1：为本发明三个猪种HOXA10基因序列测序结果和SNP位点；

图2：为本发明猪HOXA10基因扩增所得目的片段的琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为2％，图中标记M泳道为DNA Marker DL2000，泳道1为序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为404bp；

图3：为猪HOXA10基因EciⅠ-RFLP检测结果。琼脂糖凝胶浓度为3％，图中标记M泳道为DNA MarkerDL2000，CC基因型片段大小分别为294bp、94bp和16bp，TT基因型片段大小分别为388bp、16bp，而杂 合基因型TC片段大小分别388bp、294bp、94bp和16bp。

图4：为本发明扩增的猪的核苷酸序列，在该序列的309bp处存在一个等位基因突变(该序列中第309bp处的R是T或C)。

具体实施方式

实施例1：基因片段的获得及多态性检测方法的建立

猪HOXA10基因序列扩增

(1)采集耳组织样

选择一个国外血缘猪种(大白猪)和两个地方血缘猪种(陆川猪、隆林猪，来自翔猪基因公司西江泰和猪场)为试验材料，采取猪的耳缘组织；

(2)基因组DNA提取

从猪的耳缘组织中提取猪的基因组DNA，DNA样品全部采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)(按该试剂盒说明书进行操作)提取。

(3)引物设计

根据猪HOXA10基因(GenBank基因登录号为JN_836600)突变位点附近序列，设计一对特异引物。其中

正向引物为HOXA10-F1(5'-GCTCTGGGAGGCAAGCGCAATG-3')，

反向引物为HOXA10-R(5'-AGGCGGAAGTAGCCGGGCACA-3')；

(4)聚合酶链式反应

用此引物利用PCR法，以抽提的大白猪、陆川猪和隆林猪基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：2×GCBufferⅡ7.5ul，dnTP(2.5mM)2.5ul，上述制备的正向引物(10uM)0.5ul，上述制备的反向引物(10uM)0.5ul，DNA模板(50ng/ul)1ul，laTaqDNA聚合酶0.15ul，ddH2O2.85ul；PCR扩增程序：94℃预变性1min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s(步骤2-4循环30次)，72℃延伸10min，4℃保存。对长度为404bp的PCR产物进行序列测定，得到如SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列。将不同猪种的PCR产物序列测序峰图结果见图1。位于该片段的309bp处的T/C变异引起了EciⅠ酶切位点(GGCGGA(N)11')多态性。

(5)限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测

采用EciⅠ-RFLP方法对猪HOXA10基因SNP进行基因分型，酶切反应条件：PCR产物6ul，10×Cut Smart Buffer1ul，EciⅠ(2U/ul)0.5ul，ddH2O3.5ul，37℃酶切1h。取5ul酶切产物在3％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，之后进行基因型分析和鉴定。此扩增片段大小为404bp，EciⅠ酶切多态性位点位于该片段的309bp处，当该处变异位点为C碱基时，会产生限制性内切酶EciⅠ的酶切位点(GGCGGA(N)₁₁')，由于在扩增片段16p存在另外一个EciⅠ酶切位点，所以EciⅠ消化PCR产物后会产生3个片段(294bp、94bp和16bp)，基因型为CC；当该处变异位点为T碱基时，则不存在EciⅠ酶切位点，EciⅠ消化PCR产物后 会产生2个片段(388bp和16bp)，基因型为TT；当该处变异位点为T/C杂合基因型时，EciⅠ消化PCR产物后会产生4个片段(388bp、294bp、94bp和16bp)，基因型为TC。

实施例2：本发明制备的分子标记在不同猪群中的多态性分布检测

采用PCR-RFLP的方法对PCR-EciⅠ-RFLP多态性位点在国内外7个品种共442头猪中的基因型与等位基因频率分布情况进行了检测，其结果见表1。其包括中国地方猪种陆川猪、隆林猪、恩施黑猪、梅山猪和通城猪，国外猪种包括大白猪与杜洛克猪。检测结果表明，在大白群体中TC型分布较多，TT型分布较少，C基因频率略高于T基因频率；在陆川猪群体中CC型分布较广，TC型很少(只有1个)，优势等位基因为C；在隆林猪群体中，CC型分布较广，没有TC、TT基因型，优势等位基因为C；在恩施黑猪群体中，CC型分布较广，TT型分布很少(只有1个)，优势等位基因为C；在梅山猪群体中，CC、TC型分布较多，没有TT基因型，C基因频率高于T基因频率；在通城猪群体中，CC型分布较多，TT型分布较少，C基因频率高于T基因频率；在杜洛克群体中，CC型分布较广，TC型很少(只有1个)，没有TT基因型，优势等位等位基因为C。

表1HOXA10基因的基因型频率和基因频率

实施例3：本发明制备的分子标记与产仔数性状的关联分析

为了确定猪HOXA10基因PCR-EciⅠ-RFLP与猪表型差异是否相关，本申请人采用SAS软件对猪HOXA10基因PCR-EciⅠ-RFLP多态性位点与广东清远大白猪场大白母猪130头的产仔数和产活仔数等繁殖性状进行了初步的关联分析。所用模型为：

yi＝μ+αi+bj+pk+ei

yi代表性状值，μ代表总体平均数，αi代表基因型效应值(i＝TT,TC,CC)，

bj代表品种效应，pk代表第k个胎次固定效应，ei代表随机误差。

表2猪HOXA10基因564T/C SNP位点与经产胎次繁殖性状关联分析结果

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。表中性状均值组成为平均数±标准误。

Note：*represents P<0.05，**represents P<0.01.Values of traits were Means±SE.

从表2可以看出，该多态位点在130头长白猪中的CC基因型有34个，TT基因型有25个，而TC基因型有68个。HOXA10基因564T/C SNP与产仔数性状差异极显著(P<0.01)，CC型大于TC型，差异显著，TT型大于TC型，差异极显著。TT型大于CC型，差异不显著。未发现HOXA10基因564T/CSNP与活仔数、畸形胎数、死胎数、木乃伊数、初生窝重有显著相关。

参考文献

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Claims (5)

1.一种与猪产仔数性状相关的分子标记，其核苷酸序列如下所示：

GCTCTGGGAGGCAAGCGCAATGAGGCGGCGTCGCCCGGTGGCGGTGGTGGCAGCGGGGGCCTGGGGCCTGGGGCGCACAGCTATGCGCCCGCGCCTATAGACTTGTGGCTGGACGCGCCCCGGTCATGCCGGATGGAGCCGCCCGAAGGGGCGCCGCAGCAGCAGCCCCAGCAGCAGCCGCCGCCCCCGCCGCAACCACCCCAGCCCCCGCCGCAGGCCACCTCGTGCTCTTTCGCGCAGAACATCAAAGAGGAGAGCTCCTACTGCCTCTACGACTCGACTGACAAATGCCCCAAAGGCTCCTCCGCRGCTGCCGAGCTGGCCCCCTTCCCGCGGGGCCCGCCGCCCGACGGCTGCGCCCTGGGCACCTCCAGCGGGGTGCCTGTGCCCGGCTACTTCCGCCT

上述序列中的第309bp处的R是T或C，该突变导致PCR-EciⅠ-RFLP多态性。

2.一种扩增如权利要求所述分子标记的引物对，其DNA序列如下所示：

正向引物：GCTCTGGGAGGCAAGCGCAATG，

反向引物：AGGCGGAAGTAGCCGGGCACA。

3.一种猪与产仔数性状相关的遗传标记的制备方法，其特征在于以下步骤:

从大白猪、陆川猪、隆林猪耳缘组织中提取基因组DNA，在位于猪HOXA10基因突变位点附近设计一对引物，该引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，对猪基因组DNA进行PCR扩增和序列测定，得到如序列表SEQ ID NO:1所示的基因片段，通过序列比对，筛查SNP，再利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行EciⅠ酶切分型及检测。

4.权利要求1所述的分子标记在猪产仔数性状选择中的应用。

5.权利要求2所述的引物对在猪产仔数性状选择中的应用。