CN103911382B

CN103911382B - 与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN103911382B
Application number: CN201410176235.6A
Authority: CN
Inventors: 赵书红; 陈尚上; 林瑞意; 朱猛进; 李新云; 曹建华; 李长春; 余梅
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2014-04-27
Filing date: 2014-04-27
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2034-04-27
Also published as: CN103911382A

Abstract

本发明属于猪分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用，所述的分子标记从猪PTGS2基因内含子基因片段筛选得到。所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO:1和图4所示，在该序列表SEQ？ID？NO:1的第486bp处有一个A/C碱基突变，该突变导致PCR-BmrⅠ-RFLP多态性。本发明还公开了该分子标记的制备方法及其在与猪产仔数性状关联分析中的应用。本发明为猪产仔数性状标记辅助检测提供了新的标记资源。

Description

与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及猪分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用，所述的分子标记从猪PTGS2基因中克隆得到，它包括猪PTGS2基因编码区序列突变位点的检测方法与应用。

背景技术

畜牧业的发展水平是判断国家和地区农业发达程度的关键指标(李顺,2010)。养猪业是畜牧业的重要组成部分，猪肉需求量在中国肉类制品中位居首位。随着人们对繁殖性状的日益重视，产仔数作为最重要的繁殖性状正受到越来越多的关注和研究。Chris指出，将母猪单胎产仔数增加1头，英国养猪业利润将增加7亿元左右。决定产仔数的关键因素是胚胎成活率，而影响胚胎成活率最关键时期为胚胎附植(着床)时期(Bazeretal.,2009)。PGs对于胚泡着床和蜕膜化有着很重要的作用，它能够增强毛细血管通透性及促有丝分裂活性以保证胚胎附植的顺利完成。PTGS2是合成PGs起始阶段重要的限速酶，PGs在生殖过程中能否发挥生理功能取决于PTGS2的表达。与此同时，缺乏PTGS2本身也会导致卵母细胞成熟度遭到破坏，排卵、受精、蜕膜化等过程发生异常。

猪PTGS2基因定位于9号染色体，全长11.3kb。包含十个外显子，九个内含子。mRNA全长为3596bp。PTGS包括结构型同工酶PTGS1和诱导型同工酶PTGS2。两者在表达调控功能上均有较显著差异。PTGS2能够促进形成癌症，是肿瘤生成的促进剂。另一方面，PTGS2与排卵、胚胎附植、分娩等生理过程密切相关。小鼠实验表明，前列腺素E2(PGE2)受体亚型EP3和EP4在HOXA10(-/-)小鼠子宫基质中受到P4异常调节，而HOXA11、孕激素受体(PR)等则未受影响。EP3和EP4在子宫中的表达量与野生型小鼠差异较大。这说明在小鼠子宫中HOXA10能特异性介导P4对EP3、EP4的调节。PGs对生殖过程有很重要的作用。卵泡分泌的PGF2a能够让卵巢平滑肌收缩有助于排卵；PGs能够增强毛细血管通透性及促有丝分裂活性以保证胚胎附植的顺利完成；子宫产生的PGF2a能够溶解黄体；分娩时PGF2a能够进一步收缩子宫以利于分娩。PTGS2是合成PGs起始阶段重要的限速酶，PGs生理功能的实现取决于PTGS2的表达。与此同时，缺乏PTGS2本身也会导致卵母细胞成熟度遭到破坏，排卵、受精、蜕膜化等一系列生理过程无法正常完成。PTGS2在胚泡着床及蜕膜化过程中的表达受HOXA10与P4调控。

常规选择法改良产仔数的缺点很明显，选择过程花费时间较长，耗费金钱较多，准确性有待提高(Johnsonetal.,1999；Linvilleetal.,2001)。目前，标记辅助选择(MAS)已作为常规选择法的辅助手段而被广泛应用，大大提高了产仔数性状的改良速度。标记辅助选择(MAS)包括随机引物扩增多态性(RAPD)标记、微卫星标记、PCR-RFLP标记、分子标记与QTL位点的连锁分析方法等(赵西彪,2008)。其中PCR-RFLP因检测不受发育阶段、性别等外部条件的影响，所标记的变异数目不受限制，实用可靠而得到广泛的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得一种与猪产仔数性状相关的分子标记，从猪PTGS2基因的编码区序列克隆得到本发明的分子标记，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪产仔数性状检测提供一种分子标记和检测方法。

本发明的技术方案如下：

申请人克隆得到一种与猪产仔数性状相关的分子标记，它包含猪(国外血缘猪大白猪和中国地方猪血缘猪陆川猪、隆林猪等)PTGS2基因1550bp的序列，其核苷酸序列如下所示：

GTGCACTACATACTTACCCACTTCAAGGGAGTCTGGAACATTGTCAATAATATTCCCTTCCTGCGGAATGCAATTATGAAATACGTATTGATATGTAAGTACAGATCTCTTTCTAGGGTTTTTAGCTGCCTCAAAGAAAAATGTCCTTTCTTAAACTTTAGCTTTTTAAACTTAATCCAAAAAATATTTAAGTATACTTTTTAGTTTTCCTTCTATCTTAATGGTCAAAACATTGATGTCTGAATCCCCTTGAAGATATAAAGTTCTGTCTCACAGTCAGAATTTTATTTCAATCCTGCGTGCTTCTTAAAACCTTCACTGTTCTTGACAATTGATGAAGTATGGTCCAGTTGTTTAGTGAATGCCCATGGGCCATAGAATGGCACTCATTAAAGTAAATGGATAAGAAGTTCCTATGGTGGCACAGCAGAAACAAATCCTATTAGTATGCATGAGGATGTGAGTTCCACCCCTGGCCTCACTCAR(A/C)TGGGTCCGGGATCCAGTGTTGCTGTAAGGTGTGTTATAGGTCACAAATGTGGCTCAGGTCGTGCATTGCTCTGGCTGTGGTGTAGGCCAGCAGCTGTAGCTTCTATCGACCTCTCGCCTGGGAACTTCCACATGCTGCGGGTGTGGCCTTAAAAATCAAAAATAAAATAAAATGAAATAAAGGAATAATTTGTATGAGGGTAAACAAGAAGATAACTTTATTTCTAAAGTGAGTCCTGGAGTTCCCTAGTGGCCTAGTAGTTAAGGATACAGCATTGTCACTGCTGTGGCTTGGCAGGATCCCTGGCCCAAGAAGTTTCCCATGCCAGAGGCATGGCTAAAAAAATTTTTTTCTTAATTTTTGTAAATAAAGTGAGGGCCAAGCCCAGACATTCCTCTCATAGGCCTCTTGAGCAATAAGTGGATGGTTATTTGAAAAATCAAGATGGCTAGACCATAACGTTTTTGGTAAAGTATATACACTTTATCAAAGATACATTTTGGCAGTTAGACTTTAAAATGTAATTATTTTATTTTATTATTATTTTTTGTCTTTTTCTAGGGCTGCGCCTGCAGCACATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGATCGAATTGGAGCTGTACCTGCTGGCCTATGCCACAGCCACAGCAACACCAGATCCAAGCAAGCTACGTCTGCGACCTACACCACAGCTCAGGGCAATGCTGGATCCTTAACCCACCGAGCGAGGCCAGGGATCCAACCTGCGTCCTCATGGATACTAGTCAGATTCATTTCCGCTGAGCCATGATGGGAACTCCTAAAGTGTAATTATTTTAAAATACAGTATCTTTGTTGGAATTAAAGTCACTCTCTAGTGCCACTTTGCACAGTTTACAATAAAAATAAACATATTTGTCTTGTGCACAGGAACAAATAATACCTCTTTTTTTTTCCTTGAAAATTTCAGCGAGATCACATCTGATTGATAGCCCACCAACTTACAATATGCACTATGGCTATAAAAGCTGGGAAGCCT

上述序列中的486位的R为A或C，该突变导致PCR-BmrⅠ-RFLP多态性。

通过上述序列进行ClusterW比对提供了位于该扩增片段内部486bp处的A/C碱基变异，导致PCR-BmrⅠ-RFLP多态性(图1)。

申请人设计了一种扩增上述基因片段和用于检测该基因片段的即分子标记的引物对，其DNA序列如下所示：

正向引物：GTGCACTACATACTTACCCACTTC，

反向引物：AGGCTTCCCAGCTTTTATA。

申请人提供了一种猪与产仔数性状相关的分子标记的制备方法，包括以下步骤:

从大白猪、陆川猪、隆林猪耳缘组织中提取基因组DNA，在位于猪PTGS2基因突变位点附近设计一对引物，该引物对的DNA序列如序列表SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，对猪基因组DNA进行PCR扩增和序列测定，得到如序列表SEQIDNO:1所示的基因片段(或如图4所示的序列)，通过序列比对，筛查SNP，再利用SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行BmrⅠ酶切分型及检测。

本发明的分子标记可用于猪产仔数性状标记辅助选择中。

所述的引物对也可应用于猪产仔数性状标记辅助选择中。

本发明提供了鉴定上述序列486bp处A/C变异的BmrⅠ-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法。

本发明提供了利用BmrⅠ-RFLP方法确定的不同基因型个体与产仔数性状间的关联分析。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQIDNO:1是本发明扩增的国外血缘猪种大白猪和中国地方猪种陆川猪、隆林猪的核苷酸序列(该序列表的第486位的碱基是突变后的替换碱基C)，序列长度为1550bp。

序列表SEQIDNO:2是本发明制备SEQIDNO:1特异基因片段所用的正向引物，也是实施猪A/C变异BmrⅠ-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物。

序列表SEQIDNO:3是制备SEQIDNO:1特异基因片段所用的反向引物，也是实施猪A/C变异BmrⅠ-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物。

图1：为本发明三个猪种PTGS2基因序列测序结果和SNP位点。说明：该突变位点所列的3646bp是针对该基因的全序列而言，在本发明克隆的基因片段中该突变位点应为486bp处。

图2：为本发明猪PTGS2基因扩增所得目的片段的琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为2％，图中标记：泳道M为DNAMarkerDL2000，泳道1为序列表SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为1550bp；

图3：为猪PTGS2基因BmrⅠ-RFLP检测结果。琼脂糖凝胶浓度为3％，图中标记：泳道M为DNAMarkerDL2000，CC基因型片段大小分别为486bp、1064bp，AA基因型片段大小分别为1550bp，而杂合基因型AC片段大小分别1550bp、486bp和1064bp。

图4：为本发明扩增的大白猪(但不限于大白猪，实际上应包括中国血缘地方猪)的核苷酸序列，在该序列的486bp处存在一个等位基因((A/C))突变(图4所示序列的486位的R为A或C)，该突变导致PCR-BmrⅠ-RFLP多态性。

具体实施方式

实施例1：基因片段的获得及多态性检测方法的建立

猪PTGS2基因序列的扩增

(1)采集耳组织样

选择一个国外血缘猪种(大白猪，上述材料来源于华中农业大学试验猪场，为常规品种)和两个中国猪种(陆川猪、隆林猪，上述材料来自翔猪基因公司西江泰和猪场，为常规品种)为试验材料，采取猪的耳缘组织；

(2)基因组DNA提取

从猪的耳缘组织中提取猪的基因组DNA，DNA样品全部采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANampGenomicDNAKit)，按该试剂盒说明书进行操作和提取。

(3)引物设计

根据猪PTGS2基因(登录号GeneID:397590)突变位点附近序列，设计一对特异引物。其DNA序列如下所示：

正向引物为PTGS2-F(5'-GTGCACTACATACTTACCCACTTC-3')，

反向引物为PTGS2-R(5'-AGGCTTCCCAGCTTTTATA-3')；

(4)聚合酶链式反应

采用PCR法，以抽提的大白猪、陆川猪和隆林猪基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：10×LABuffer1.5ul，dnTP(2.5mM)2.5ul，上述制备的正向引物(10uM)0.5ul，反向引物(10uM)0.5ul，DNA模板(50ng/ul)1ul，laTaqDNA聚合酶0.15ul，ddH2O8.85ul。PCR扩增程序：94℃预变性1min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min40s(步骤2-4循环30次)，72℃延伸10min，4℃保存。对长度为1550bp的PCR产物进行序列测定，得到如SEQIDNO:1所述的核苷酸序列。将不同猪种的PCR产物序列测序其峰图结果见图1。位于该片段的486bp处的A/C变异引起了BmrⅠ酶切位点(ACTGGG(N)₅')多态性。

(5)限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测

采用BmrⅠ-RFLP方法对猪PTGS2基因SNP进行基因分型，酶切反应条件：PCR产物6ul，10×NEBuffer2.11ul，BmrⅠ(5U/ul)0.25ul，ddH2O3.75ul，37℃酶切4h。取5ul酶切产物在3％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，之后进行基因型分析和鉴定。此扩增片段大小为1550bp，BmrⅠ酶切多态性位点位于该片段的486bp处，当该处变异位点为C碱基时，会产生限制性内切酶BmrⅠ的酶切位点(ACTGGG(N)₅')，BmrⅠ消化PCR产物后会产生2个片段(1064bp和486bp)，其基因型为CC；当该处变异位点为T碱基时，则不存在BmrⅠ酶切位点，BmrⅠ消化PCR产物后会产生1个片段(1550bp)，其基因型为AA；当该处变异位点为A/C杂合基因型时，BmrⅠ消化PCR产物后会产生3个片段(1550bp、1064bp和486bp)，其基因型为AC。

实施例2：本发明制备的分子标记在不同猪群中的多态性分布检测

采用常规PCR-RFLP的方法对PCR-BmrⅠ-RFLP多态性位点在国内外7个猪的品种共445头猪中的基因型与等位基因频率分布情况进行了检测，检测结果见表1。试验样本包括中国地方血缘猪种陆川猪、隆林猪、恩施黑猪、梅山猪和通城猪，国外血缘猪种包括大白猪与杜洛克猪。检测结果表明，PTGS2基因在大白群体中AA、AC型分布较多，CC型分布较少，A基因频率高于C基因频率；在陆川猪群体中CC型分布较广，AA型很少(只有3个)，C基因频率高于A基因频率；在隆林猪群体中，AC型分布较广，没有AA型，C基因频率高于A基因频率；在恩施黑猪群体中，AC型分布略多于AA型和CC型，C基因频率略高于A基因频率；在梅山猪群体中，CC型分布较广，没有AC型，优势等位基因为C；在通城猪群体中，AC型分布略多于CC、AA型，A基因频率略高于C基因频率；在杜洛克群体中，AA型分布较广，没有CC、AC基因型，优势等位等位基因为A。

表1PTGS2基因的基因型频率和基因频率(请将该表的绿框线改为黑色)

实施例3：本发明制备的分子标记与产仔数性状的关联分析

为了确定猪PTGS2基因PCR-BmrⅠ-RFLP与猪表型差异是否相关，本申请人采用SAS软件对猪PTGS2基因PCR-BmrⅠ-RFLP多态性位点与广东清远大白猪场大白母猪130头的产仔数和产活仔数等繁殖性状进行了初步的关联分析。所用模型为：

yi＝μ+αi+bj+pk+ei

yi代表性状值，μ代表总体平均数，αi代表基因型效应值(i＝TT,TC,CC)，

bj代表品种效应，pk代表第k个胎次固定效应，ei代表随机误差。

表2猪PTGS2基因3646A/CSNP位点与经产胎次繁殖性状关联分析结果(请将该表的绿框线改为黑色)

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。表中性状均值组成为平均数±标准误。

Note：*representsP<0.05，**representsP<0.01.ValuesoftraitswereMeans±SE.

从表2可以看出，该多态位点在130头长白猪中的CC基因型有13个，AA基因型有60个，而AC基因型有55个。PTGS2基因与初产胎次产仔数差异极显著(P<0.01)，AC型大于CC型，差异极显著，AC型大于AA型，差异极显著；PTGS2基因与初产胎次活仔数差异显著(P<0.05)，AC型大于CC型，差异显著，AC型大于AA型，差异极显著；初产胎次中，AC型初生窝重大于AA型，差异显著。

参考文献

1.BazerFW,SpencerTE,JohnsonGA,BurghardtRC,WuG.Comparativeaspectsofimplantation.Reproduction,2009,138:195-209

2.JohnsonRK,NielsenMK,CaseyDS.Responsesinovulationrate,embryonalsurvival,andlittertraitsinswineto14generationsofselectiontoincreaselittersize.JAnimSci,1999,77:541-557

3.LinvilleRC,PompD,JohnsonRK,RothschildMF.Candidategeneanalysisforlociaffectinglittersizeandovulationrateinswine.JAnimSci,2001,79:60-67

4.李顺.中国畜牧业发展历程分析及趋势预测.中国畜牧杂志,2010,12:25-28

5.赵西彪:AREG,ESR和FSHβ亚基基因与猪产仔数关系研究.扬州大学；2008.

Claims

1.一种与大白猪产仔数性状相关的分子标记，其核苷酸序列如下所示：

GTGCACTACATACTTACCCACTTCAAGGGAGTCTGGAACATTGTCAATAATATTCCCTTCCTGCGGAATGCAATTATGAAATACGTATTGATATGTAAGTACAGATCTCTTTCTAGGGTTTTTAGCTGCCTCAAAGAAAAATGTCCTTTCTTAAACTTTAGCTTTTTAAACTTAATCCAAAAAATATTTAAGTATACTTTTTAGTTTTCCTTCTATCTTAATGGTCAAAACATTGATGTCTGAATCCCCTTGAAGATATAAAGTTCTGTCTCACAGTCAGAATTTTATTTCAATCCTGCGTGCTTCTTAAAACCTTCACTGTTCTTGACAATTGATGAAGTATGGTCCAGTTGTTTAGTGAATGCCCATGGGCCATAGAATGGCACTCATTAAAGTAAATGGATAAGAAGTTCCTATGGTGGCACAGCAGAAACAAATCCTATTAGTATGCATGAGGATGTGAGTTCCACCCCTGGCCTCACTCARTGGGTCCGGGATCCAGTGTTGCTGTAAGGTGTGTTATAGGTCACAAATGTGGCTCAGGTCGTGCATTGCTCTGGCTGTGGTGTAGGCCAGCAGCTGTAGCTTCTATCGACCTCTCGCCTGGGAACTTCCACATGCTGCGGGTGTGGCCTTAAAAATCAAAAATAAAATAAAATGAAATAAAGGAATAATTTGTATGAGGGTAAACAAGAAGATAACTTTATTTCTAAAGTGAGTCCTGGAGTTCCCTAGTGGCCTAGTAGTTAAGGATACAGCATTGTCACTGCTGTGGCTTGGCAGGATCCCTGGCCCAAGAAGTTTCCCATGCCAGAGGCATGGCTAAAAAAATTTTTTTCTTAATTTTTGTAAATAAAGTGAGGGCCAAGCCCAGACATTCCTCTCATAGGCCTCTTGAGCAATAAGTGGATGGTTATTTGAAAAATCAAGATGGCTAGACCATAACGTTTTTGGTAAAGTATATACACTTTATCAAAGATACATTTTGGCAGTTAGACTTTAAAATGTAATTATTTTATTTTATTATTATTTTTTGTCTTTTTCTAGGGCTGCGCCTGCAGCACATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGATCGAATTGGAGCTGTACCTGCTGGCCTATGCCACAGCCACAGCAACACCAGATCCAAGCAAGCTACGTCTGCGACCTACACCACAGCTCAGGGCAATGCTGGATCCTTAACCCACCGAGCGAGGCCAGGGATCCAACCTGCGTCCTCATGGATACTAGTCAGATTCATTTCCGCTGAGCCATGATGGGAACTCCTAAAGTGTAATTATTTTAAAATACAGTATCTTTGTTGGAATTAAAGTCACTCTCTAGTGCCACTTTGCACAGTTTACAATAAAAATAAACATATTTGTCTTGTGCACAGGAACAAATAATACCTCTTTTTTTTTCCTTGAAAATTTCAGCGAGATCACATCTGATTGATAGCCCACCAACTTACAATATGCACTATGGCTATAAAAGCTGGGAAGCCT

2.一种与大白猪产仔数性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于以下步骤:

从大白猪耳缘组织中提取基因组DNA，在位于猪PTGS2基因突变位点附近设计一对引物，该引物的DNA序列如序列表SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，对猪基因组DNA进行PCR扩增和序列测定，得到如权利要求1或序列表SEQIDNO:1所示的片段，通过序列比对，筛查SNP，再利用SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行BmrⅠ酶切分型及检测。

3.权利要求1所述的分子标记在大白猪产仔数性状标记辅助选择中的应用。