CN106544412B

CN106544412B - 一种与公猪精子活力性状相关的分子标记及应用

Info

Publication number: CN106544412B
Application number: CN201610783188.0A
Authority: CN
Inventors: 刘榜; 薄东东; 张宇; 陈曦; 李家连; 徐学文
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2036-08-30
Also published as: CN106544412A

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种与公猪精子活力性状相关的分子标记及应用。所述的分子标记从PRM2基因中筛选得到，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。在该序列表的第169位碱基处存在一个等位基因突变R，所述的R是G或A，该突变导致NaeI‑RFLP多态性。本发明还公开了扩增PRM2基因SNP的的引物对，该引物对也是检测本发明筛选的分子标记的引物对。本发明建立了一种用于与公猪精子活力性状多态性检测的方法。关联分析应用表明，本发明的分子标记可以作为为公猪精子活力性状辅助选择的标记。

Description

一种与公猪精子活力性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明属于猪的分子标记的筛选与应用技术领域，具体涉及一种与公猪精子活力性状相关的分子标记及应用。本发明筛选的分子标记克隆自PRM2基因。

背景技术

养猪业对于我国农业具有举足轻重的地位。2015年全国生猪出栏量达70825万头，占同期世界各国生猪出栏量第一位，我国已成为名符其实的养猪大国。提高种公猪的繁殖力是猪生产的关键，而精子活力是种公猪繁殖力的主要体现。研究表明种公猪的精子活力与大白、长白和杜洛克母猪的窝产仔数、窝产活仔数等呈极显著相关，而精子密度亦与长白母猪的第1、3胎窝产仔数呈极显著相关(李光轩，公猪精液品质与母猪繁殖力相关性研究.[硕士].西北农林科技大学.2014)。在本交的情况下，一头成年种公猪每年需要承担大约30头母猪的配种，而在人工授精技术应用广泛的现在，一头成年种公猪每年担负的配种任务达到200～300头母猪，精液品质优异的种公猪可以大幅减少完成配种任务所需的种公猪饲养量，从而在很大程度上降低饲养成本。因此提高公猪精液品质对于增加母猪产仔数、降低饲养成本乃至提高经济效益均具有重要意义。

在猪的3号染色体上，PRM1、PRM2、PRM3基因组成了PRM基因家族，共同参与调控精子发生过程，其中PRM1、PRM2编码富含精氨酸和赖氨酸的肽链，PRM3编码以谷氨酸和天冬氨酸为主的肽链。鱼精蛋白2属于一种核蛋白，主要在精子头部表达，在精子细胞发育为长形精子细胞以至成熟精子的阶段参与精子的头部遗传物质的浓缩，PRM2蛋白替代组蛋白，结合在DNA序列上，这种结合可以抵消磷酸骨架所带的负电荷，使精子细胞中的DNA分子能够实现聚缩，这使得DNA分子始终处于失活的状态(Balhorn R,The protamine family ofsperm nuclear proteins.Genome biology.2007,8:227)，此机制使得精子DNA能够保持在沉默状态。鱼精蛋白2(protamine 2，PRM2)基因全长612bp，包含两个外显子和一个内含子，转录后产生479bp的mRNA，编码93个氨基酸。

在人和动物的多项研究都表明，PRM2基因的突变与雄性不育相关(Aoki VW等,Identification of novel polymorphisms in the nuclear protein genes and theirrelationship with human sperm protamine deficiency and severe maleinfertility.Fertility and sterility.2006,86:1416-1422；Aston KI等,Evaluationof 172 candidate polymorphisms for association with oligozoospermia orazoospermia in a large cohort of men of European descent.Human reproduction(Oxford,England).2010,25:1383-1397；Ravel C等,Mutations in the protamine 1gene associated with male infertility.Molecular human reproduction.2007,13:461-464)，同时在小鼠的研究中发现，Prm2基因缺失单倍型个体存在精子形态学缺陷、精子活力不足和少精甚至无精的现象(Cho C等,Haploinsufficiency of protamine-1 or-2causes infertility in mice.Nature genetics.2001,28:82-86；Cho C等,Protamine 2deficiency leads to sperm DNA damage and embryo death in mice.Biology ofreproduction.2003,69:211-217；Seki Y等,Cellular dynamics associated with thegenome-wide epigenetic reprogramming in migrating primordial germ cells inmice.Development(Cambridge,England).2007,134:2627-2638)。而Kempisty等人的研究发现，猪的精卵融合时期，精原核中PRM2基因的转录物被转移到卵母细胞，表明PRM2基因可能在合子和胚胎的早期发育中发挥重要作用(Kempisty B等,Analysis of selectedtranscript levels in porcine spermatozoa,oocytes,zygotes and two-cell stageembryos.Reproduction,fertility,and development.2008,20:513-518，也有研究表明Prm2表达不足能导致小鼠的精子细胞中的DNA损伤和胚胎死亡(Cho C等,Protamine 2deficiency leads to sperm DNA damage and embryo death in mice.Biology ofreproduction.2003,69:211-217)，而DNA损伤所带来的高DNA破碎化指数(DFI)与复发性流产显著相关(Kumar K等,Expression pattern of PRM2,HSP90 and WNT5A in malepartners of couples experiencing idiopathic recurrent miscarriages.Journal ofgenetics.2012,91:363)。

PRM2基因参与了精子DNA聚缩的过程，在公猪精子发生和精液形成过程中发挥着不可或缺的作用。研究该基因的变异位点在群体中的多态性，并与公猪精子活力性状进行关联分析，为通过标记辅助选择改良公猪精子活力提供有用的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于根据PRM2基因已知序列，寻找PRM2基因的变异位点以及基因多态性的检测方法，筛选得到一个与公猪精子活力性状相关的分子标记。本发明的目的还包括该分子标记在猪精子活力性状关联分析中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

通过在长白猪公猪群体中随机挑选个体，克隆PRM2基因DNA片段，进行混池测序以筛查SNPs，本发明的分子标记序列如序列表SEQ ID NO：1和图3所示。在SEQ ID NO：1(基因片段)所示序列的第169位碱基处存在一个等位基因突变(该突变位点也就是猪PRM2基因全序列的第287位碱基处，属于外显子区域，未能引起所编码的氨基酸的改变)但是，该突变导致NaeI-RFLP多态性。

申请人提供了一种克隆PRM2基因片段用以筛查SNPs的引物对，该引物对的序列如下所示：

正向引物PRM2_seq-F 5'GGACAGACCCGACCAACACTAT 3'，

反向引物PRM2_seq-R 5'GCTTGAGATGAGAAACTCGCTGG 3'；

一种用于检测上述与公猪精子活力性状相关分子标记多态性的引物对，其序列如下所示：

正向引物PRM2_SNP-F 5'CTCTGGGCAGCAGCGCGAAA 3'，

反向引物PRM2_SNP-R 5'CCTTCCGCACCCTGGTCTGGA 3'。

申请人提供了一种检测与公猪精子活力性状相关的分子标记的方法，包括以下步骤：

从Ensembl数据库中获取猪PRM2基因的序列，设计引物，分别提取长白猪公猪的基因组DNA，以基因组DNA为模板设计引物(正向引物PRM2_seq-F，反向引物PRM2_seq-R)，随机挑选10头长白猪公猪扩增PRM2基因的DNA片段，进行克隆和混池测序；分析测序结果，在PRM2基因序列的287位碱基处存在一个等位基因突变(G-A)，从Ensembl数据库中获取猪PRM2基因序列，设计引物(正向引物PRM2_SNP-F和反向引物PRM2_SNP-R)，PCR扩增，应用PCR-NaeI-RFLP的方法检测该变异位点在群体中的多态性，对该突变位点与公猪精子活力性状之间进行关联分析。

本发明为猪的分子辅助选择提供了新的标记。

本发明的分子标记可在公猪精子活力性状辅助选择中应用。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明检测上述与公猪精子活力性状相关分子标记多态性的DNA序列。该序列也是本发明的分子标记序列。

图1：本发明的技术流程框图。

图2：筛查猪PRM2基因SNPs的测序峰图(箭头所指碱基为突变位点)。

图3：本发明中猪PRM2基因用于检测上述与公猪精子活力性状相关分子标记多态性的DNA片段。所用的引物序列用下划线标注，突变位点用加粗字和括号标出。

图4：是本发明中猪PRM2基因NaeI-RFLP的三种基因型(GG AG AA)电泳结果。附图标记说明：图4中的DNA分子量的标准为DL2000。

具体实施方式

实施例1、PRM2基因SNPs的筛选

1.1利用苯酚抽提法提取长白猪公猪精子总DNA

取1mL精液，置于一支2mL离心管中，5000rpm离心7分钟，弃上清；每支离心管加入1000uL生理盐水，反复吹打，混匀，12000rpm离心7分钟，弃上清；重复以上洗涤步骤1～2次；每支离心管加入1000uL精子裂解液(800uL双蒸水，20uL 0.5M EDTA溶液，10uL 1M Tris-Cl溶液，100uL 10％SDS溶液，20uLβ-巯基乙醇，20uL 5M NaCl溶液)和15～20uL蛋白酶K(10mg/mL)，充分吹打混匀，55℃消化过夜(12h左右)；每支离心管加入样品等体积约1000uL苯酚，剧烈颠倒震荡10分钟使两相充分混匀，直至形成乳白色偏黄的乳浊液，4℃12000rpm离心15分钟，转移上清液至另一干净离心管；分别加入上清液等体积(约500～900uL)的苯酚和氯仿异戊醇(体积比24:1)，充分颠倒震荡10分钟，4℃12000rpm离心10分钟，转移上清液至另一干净离心管；往上清液中加入等体积(约500～800uL)的氯仿异戊醇(体积比24:1)，重复上述抽提步骤；向最后获得的上清液中加入2.5倍体积(约1300uL)的无水乙醇(-20℃过夜预冷)和十分之一体积(约60uL)的NaAC(pH 5.2)以沉淀DNA，颠倒晃动离心管，若提取成功，应能看到絮状成团的DNA分子。将DNA挑出至1.5mL离心管或者直接离心至DNA贴在管底，然后用约500uL的75％酒精(-20℃过夜预冷)洗涤1～2次；让DNA在室温下自然晾干，使酒精挥发完，然后加入80～100uL灭菌双蒸水，溶解DNA。或者37℃助溶。

1.2引物设计

根据Ensembl数据库中猪PRM2基因的序列信息，设计一对引物，用来克隆长白猪PRM2基因，设计的引物对的序列如下所示：

正向引物PRM2_seq-F 5'GGACAGACCCGACCAACACTAT 3'，

反向引物PRM2_seq-R 5'GCTTGAGATGAGAAACTCGCTGG 3'。

1.3 PCR扩增

PCR反应体系总体积为10ul：双蒸水3.6ul，2x Taq PCR mix 5ul(购自北京艾德莱生物科技有限公司)，上述1.2所述的正向引物0.2ul(终浓度0.02pmol/ul)，反向引物0.2ul(终浓度0.02pmol/ul)，长白猪公猪基因组DNA 1ul(终浓度5ng/ul)。扩增程序：94℃预变性5min、94℃变性30s、61℃退火30s、72℃延伸15s、35个循环、72℃再延伸5min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。得到712bp特异扩增片段。

1.4 PCR产物的纯化

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司，按该试剂盒的说明书操作)纯化PCR产物，所得纯化PCR产物于-20℃下保存备用。

1.5 DNA序列测定

序列测定由武汉擎科创新生物科技有限公司完成。

实施例2 PRM2基因PCR-RFLP检测方法的建立

2.1引物序列

设计了一个针对PRM2g.287G>A位点的引物对，检测该变异位点在群体中的多态性。该引物对的序列如下所示：

正向引物PRM2_SNP-F 5'CTCTGGGCAGCAGCGCGAAA 3'，

反向引物PRM2_SNP-R 5'CCTTCCGCACCCTGGTCTGGA 3'。

2.2 PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中长白猪基因组DNA约50ng,含2x Taq PCR Mix 5ul(购自北京艾德莱生物科技有限公司)，上述2.1所述的正向引物0.2ul(终浓度0.02pmol/ul)，反向引物0.2ul(终浓度0.02pmol/ul)，长白猪公猪基因组DNA 1ul(终浓度5ng/ul)。PCR扩增程序：94℃5min，30×[94℃30s,71℃(-0.5℃/cycle)30s,72℃15s]，10×(94℃30s,61℃30s,72℃15s)，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到272bp的特异扩增片段(见图3)，该片段中第169位碱基突变可造成NaeI(GCC/GGC)酶切位点的丢失。

2.3 PCR-RFLP检测条件

PCR产物酶切反应体积是10μl,其中10x CutSmart Buffer 1μl，PCR产物5μl,限制性内切酶NaeI为0.1μl(1U),用灭菌的双蒸水定容至10μl,将样品混匀后离心，37℃孵育12h,用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，在凝胶成像系统中拍照并记录基因型。当第169bp位置是碱基G时，存在NaeI酶切位点，NaeI酶切后可得到2个片段，其片段长度分别为179bp和93bp(即等位基因G)。当存在169G-169A的替换时，其结果导致NaeI酶切位点的丢失，酶切后检测结果只有1个片段，其长度为272bp(即等位基因A)；三种基因型的带型分别为：AA(272bp)，AG(272bp+179bp+93bp)，GG(179+93bp)，结果如图4所示。

2.4本发明的分子标记在与公猪精子活力关联分析中的应用

试验共检测了长白猪公猪201头个体的PRM2g.287 G>A位点的基因型，并进行基因型与精子活力的关联分析。建立如下所述的固定效应模型：

Y_i＝μ+G_i+ε_i

其中，Y_i为性状观察值，μ为性状总平均值，G_i为基因型效应，ε_i为随机误差，假定服从N(0,σ2)分布。

表1 PRM2基因SNP与公猪精子活力关联分析结果

表1说明：同一列中上标字母不同且为小写者表示差异显著(P<0.05)。表中性状值为平均数±标准差。

表2 PRM2基因的SNP在群体中基因型频率和基因频率分布

基因型检测结果表明在201个个体中，AA基因型有12个个体，其中AG基因型有47个个体，GG基因型有142个个体。基因突变位点与性状关联分析的结果是：PRM2基因在NaeI-RFLP多态位点与精子活力显著相关(P值见表1)，AA基因型个体的精子活力显著低于AG和GG基因型个体(P<0.05)，详情见表1。等位基因G与等位基因A在群体中的分布情况见表2，由表2可以看出在长白猪公猪群体中，GG基因型为优势基因型，G等位基因为优势等位基因。

Claims

1.如下所述核苷酸序列在非诊断目的的检测与公猪精子活力性状关联的SNP中的应用，其特征在于所述的核苷酸序列如下所示：

CTCTGGGCAGCAGCGCGAAAACGAGCGCCAGGACCAGGACCAGGAGCTGAGGCCGGAGGATGTCCCGGTCTATGGCAGGACCCACAGGGGCCGCTACCACTACAGACACAGGAGCCACACGCGGCGGCGGCGCCGCTCCTGCCGGAGGCGCAGGAGACGCGCCTGCCG R(G/A)CACAGGCGGCACCGCAGAGGTCCGTGCCCCCCACCTCGCCCCCACGCCTCCAGACCAGGGTGCGGAAGG；

上述序列的第169位碱基处的R为G或A的碱基替换，该替换引起所示序列产生NaeI-RFLP多态性。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，其中检测如权利要求1所述核苷酸序列的引物组合如下所示：

正向引物PRM2_SNP-F CTCTGGGCAGCAGCGCGAAA，

反向引物PRM2_SNP-R CCTTCCGCACCCTGGTCTGGA。