CN107828891B - 猪肋骨数性状相关的分子标记筛选与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记检测与应用技术领域，具体涉及猪肋骨数性状相关的分子标记筛选与应用。本发明包括与猪肋骨数相关的NR6A1基因变异位点的发现、检测方法及其在猪标记辅助选择中应用。本发明的分子标记从NR6A1基因中克隆和筛选得到，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第132位碱基处存在一个等位基因变异(132T‑132C)，该变异导致VspI‑RFLP多态性。本发明还公开了筛选与猪肋骨数性状相关的分子标记的方法。本发明的分子标记可以应用于猪肋骨数性状相关分子标记辅助选择中。

Description

猪肋骨数性状相关的分子标记筛选与应用

技术领域

本发明属于猪分子标记检测与应用技术领域，具体涉及一种猪肋骨数性状相关的分子标记筛选与应用。本发明包括与猪肋骨数性状相关的NR6A1基因变异位点的发现、检测方法及其在猪标记辅助选择中应用。

背景技术

猪肉占我国居民肉类消费的60％以上，是我国居民的主要肉品来源，猪肉的高需求导致猪的育种不断向提高瘦肉产量、效率和品质发展。猪体长影响猪的产肉量，而脊椎数与体长呈显著正相关，每增加一根脊椎数，可使体长增加80mm(Mikawa S等,Twoquantitative trait loci on chromosomes 1and 7affecting the number ofvertebrae.Journal of animal science.2005,83:2247-2254)。猪的脊椎包括颈椎、胸椎、腰椎、荐椎、尾椎，颈椎数较为固定一般为7根(Shaw A,A method of determining thevariations in the vertebral column of the live pig.Sci Agric.1930,10:690-695)，荐椎和尾椎数也较为固定，但胸椎和腰椎存在较大的变异。一般情况下，野猪的胸椎和腰椎总数为19根，而欧洲的一些商业猪种达到20～23根(King等,Carcass length inthe bacon pig；its association with vertebrae numbers and prediction fromradiographs of the young pig.Animal production.1960,2:59-65)。我国的大部分地方猪与西方的商品猪种相比其胸椎与腰椎数明显少(Berge S.Genetical researches onthe number of vertebrae in the pig.Journal of Animal Science.1948,7:233-238)，表现在外型即中国的地方猪，在体长上明显短于西方商品猪。同时肋骨与胸椎相连，肋骨数的多少也就代表了胸椎数的多少。“肋排”往往瘦肉率较高、肉质较好，深受消费者的青睐，相对于猪胴体的其他部位，价格较高，增加肋骨数能明显提高猪的经济价值。因此，肋骨数的增加对于体长、产肉量和经济效益的增加都具有重要意义。

NR6A1(nuclear receptor subfamily 6,group A,member 1)基因位于猪的1号染色体，编码产物是一种细胞核内的激素受体，该蛋白可以通过结合靶DNA序列，调控靶基因的表达，主要参与机体神经系统的形成以及生殖细胞的发育(Greschik H等,Characterization of the DNA-binding and dimerization properties of thenuclear orphan receptor germ cell nuclear factor.Molecular and cellularbiology.1999,19:690-703)。Mikawa等在其之前研究的基础上，进一步缩小了影响脊椎数目的QTL的范围，他们在大白猪与日本野猪杂交的后代F2的三个群体中，通过微卫星标记，将此QTL定位于SJ641到SJ820标记之间的300Kb，而NR6A1基因恰在此区域内(Mikawa S等,Bone morphogenetic protein‐4expression in the adult rat brain.Journal ofComparative Neurology.2006,499:613-625)。同时，Rubin等通过对欧洲家猪和野猪重测序并对脊椎数相关的选择信号的筛选，检测到NR6A1等基因具有强烈的选择信号(Rubin C-J等,Strong signatures of selection in the domestic pig genome.Proceedings ofthe National Academy of Sciences.2012,109:19529-19536)。

基于NR6A1基因可能对于猪肋骨数的变异存在一定的影响，我们检测该基因的变异位点在群体中的多态性，并与肋骨数性状关联分析，筛选猪肋骨数性状候选基因及分子标记，为分子标记辅助选择提供可用的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于根据NR6A1基因已知序列，寻找NR6A1基因的变异位点以及基因多态性的检测方法，获得一个与猪肋骨数性状相关的分子标记。

本发明通过以下技术方案实现：

从猪NR6A1基因片段中克隆得到一种作为猪标记辅助选择的与猪肋骨数性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和图2所示。在图2所示序列的第132位碱基处有一个132T-132C的碱基突变，该突变位于内含子内，该突变导致VspI-RFLP多态性。

申请人提供了扩增NR6A1基因部分DNA序列的引物对，该引物对也是检测本发明分子标记的引物对，该引物对的DNA序列如下所示：

正向引物NR6A1SNP-F 5'ACCCCACCAAATATCTCACAAC 3'，

反向引物NR6A1SNP-R 5'CTCATCGTGTTTCAGCGGTT 3'。

申请人提供了一种筛选猪肋骨数相关的分子标记的方法，包括以下步骤：

从NCBI数据库中调取NR6A1基因组DNA信息设计引物(正向引物NR6A1SNP-F和反向引物NR6A1SNP-R)，从“鄂通两头乌”猪群体组织中提取总DNA，PCR扩增，应用PCR-RFLP的方法检测该变异位点的基因型，对该变异位点与猪肋骨数性状之间进行关联分析。

本发明为猪的分子育种提供了新的分子标记。依照本发明，所述的猪肋骨数相关分子标记可应用在猪标记辅助选择中。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明筛选的一种与筛选猪肋骨数性状相关的分子标记的核苷酸序列。

图1：是本发明的技术流程框图。

图2：是本发明筛查NR6A1基因SNPs的DNA序列。在该序列的132位碱基处有一个132T-132C的碱基替换(括号内显示该等位基因的替换)，导致VspI-RFLP多态性。

图3：是本发明筛查NR6A1基因SNP的测序峰图(黑框指的碱基为碱基突变位点)。附图标记说明：图3A是中国地方猪品种“通城猪”DNA扩增产物的部分测序结果；图3B是外来猪品种“大白猪”DNA扩增产物的部分测序结果。

图4：是利用本发明的分子标记对猪NR6A1基因VspI-RFLP的三种基因型(TT TCCC)的电泳结果。附图标记说明：DNA分子量标准BM2000。

具体实施方式

实施例1、NR6A1基因PCR-RFLP检测方法的建立

1.1引物设计

根据NCBI数据库中NR6A1基因的DNA信息以及对Rubin公布的可能与体长相关的NR6A1基因的6个SNP位点(Rubin C-J等,Strong signatures of selection in thedomestic pig genome.Proceedings of the National Academy of Sciences.2012,109:19529-19536)信息的测序验证后，申请人发现候选位点在“鄂通两头乌”(利用通城猪为素材培育的新品种群体)和大白猪群体中存在变异，针对候选位点进行引物设计，用来扩增“鄂通两头乌”NR6A1基因。设计的引物对的序列如下所示：

正向引物NR6A1SNP-F 5'ACCCCACCAAATATCTCACAAC 3'，

反向引物NR6A1SNP-R 5'CTCATCGTGTTTCAGCGGTT 3'。

1.2PCR扩增

PCR反应总体积10μl,其中猪基因组DNA约50ng,含2×Taq PCR MasterMix(购自北京艾德莱生物科技有限公司)，引物终浓度为0.4μmol/L。

PCR扩增程序：95℃3min,35×(95℃30s,60℃30s,72℃30s),最后72℃延伸5min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，得到412bp特异扩增片段(如图4),该片段中第132位碱基存在一个等位基因突变(132T-132C)，可造成VspI(AT/TAAT)酶切位点的丢失。

1.3PCR-RFLP检测条件

PCR产物酶切反应体积是10μl,其中1×buffer 1μl，PCR产物4μl,限制性内切酶VspI为0.1μl(2U),用灭菌双蒸水定容至10μl,将样品混匀后离心，37℃水浴12h,用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，凝胶成像系统拍照并记录基因型。当第132位碱基位置是C时，VspI酶切位点不存在，Hin6I酶切后检测结果只有1个片段，其长度是412bp(定义为等位基因C)；当第132位碱基位置是T时，存在VspI酶切位点，得到2个片段，其长度分别为132bp和280bp(定义为等位基因T)；三种基因型的带型分别为：CC(412bp)，TC(412bp+280bp+132bp)，TT(280bp+132bp)，结果见图4。

1.4本发明的分子标记在与猪肋骨数性状关联分析中的应用

试验共检测了398头“鄂通两头乌”个体，屠宰准确记录每个个体的肋骨数，确定其基因型，并进行基因突变位点与肋骨数的关联分析。

建立如下所述的模型：Yi＝μ+Gi+εi,

其中，Yi为性状观察值，μ为性状总平均值，Gi为基因型效应，εi为随机误差，假定服从N(0，σ2)分布。

表1 NR6A1基因的SNP在群体中基因型频率和基因频率分布

表2 NR6A1基因SNP与肋骨数关联分析结果

表2的说明：

(1)加性效应a＝(TT-CC)/2；显性效应d＝CT-(CC+TT)/2；显性度D＝d/a。

(2)同一基因同行中肩标字母不同表示差异极显著(P<0.01)；

基因型检测结果表明在398个个体中CC基因型有136个个体，TC基因型有196个个体，TT基因型有66个个体，等位基因C与等位基因T在各个群体中的分布情况见表1，通过观察可以看出在“鄂通两头乌”中，C等位基因为优势等位基因。通过卡方检验，χ²值为0.06小于χ² _0.05(1)(χ² _0.05(1)＝3.84)，P>0.05,该试验群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。SNP位点与性状关联分析的结果是：NR6A1基因在VspI-RFLP多态位点与肋骨数显著相关(P＜0.01)，CC基因型个体与TT基因型个体间肋骨数差异极显著(P<0.01)，CC基因型个体与CT基因型个体间肋骨数差异显著(P<0.05)(见表2)。

Claims (2)

1.一种检测分子标记的试剂在猪肋骨数性状标记辅助选择中的应用，所述猪的品种为鄂通两头乌，所述分子标记的核苷酸序列如下所示，

ACCCCACCAAATATCTCACAACCCTACTCTTGACCCAAAGCATGGCTGGTTTGCTATGACTCCTTCCAGCTCTTTACTGTAAGTTTTTTAAAGTCATCATTTAAGGCCACTCTTCAGTGACTAAAAAGTCARtaattagaaatcatcttttaacacacaagttcttgagcccttctgcttcccctcaaaaaatttttttcatccagagtatatggaggttcccaggctaggggtccaatcagagctgtagccactggcctataccacagccagagcaacgcgggatccaagctgcgtctgcaactacagctcatggcaatgctggatgcctaacccactgagcgaggacagggatggaacctgcatcctcatggatactagttgggttcattAACCGCTGAAACACGATGAG

上述序列的132位碱基处的R是T或C，导致VspI-RFLP多态性。

2.一种检测引物组合的试剂在猪肋骨数性状标记辅助选择中的应用，所述猪的品种为鄂通两头乌，所述引物组合的序列如下所示，

正向引物NR6A1SNP ACCCCACCAAATATCTCACAAC，

反向引物NR6A1SNP CTCATCGTGTTTCAGCGGTT。

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