CN109837347B

CN109837347B - Catsper4基因第三外显子的snp作为猪精液品质性状的遗传标记

Info

Publication number: CN109837347B
Application number: CN201910002484.6A
Authority: CN
Inventors: 李凤娥; 赵丽萍; 宋慧彬; 冯越; 陈大可
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-01-02
Filing date: 2019-01-02
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2039-01-02
Also published as: CN109837347A

Abstract

本发明属于猪遗传标记制备与应用技术领域，涉及CATSPER4基因第三外显子的SNP作为猪精液品质性状的遗传标记。该遗传标记从猪CATSPER4基因外显子3上克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。公开了猪CATSPER4基因外显子3上SNP位点及其SNP分型的检测方法，CATSPER4基因外显子3上存在一个等位基因的突变，该突变引起AlwNI‑RFLP多态性。本发明筛选步骤包括：从猪血液中提取基因组DNA，从测序结果里寻找SNP位点，确定该SNP位点的内切酶，通过设计引物，PCR扩增，单核苷酸多态性检测，对基因型与精液品质性状间进行相关性分析。本发明筛选的标记可在猪标记辅助选择中应用。

Description

CATSPER4基因第三外显子的SNP作为猪精液品质性状的遗传标记

技术领域

本发明涉及猪遗传标记制备技术领域，具体涉及一种CATSPER4基因第三外显子的SNP 作为猪精液品质性状的遗传标记及应用，它包括猪CATSPER4基因突变位点的检测方法与应用。

背景技术

公猪的繁殖性能对猪群规模和猪场效益具有重要作用，一般通过鉴定精液品质来衡量公猪的繁殖性能。精液品质的指标包括精子浓度、精子活力、畸形精子率和精子形态以及动力学参数和DNA完整性等。精液品质主要是由遗传作用和环境作用两个因素决定，环境因素可以进行人为的控制和改善，但只有不断改良遗传作用才是提高精液品质和公猪的繁殖性能的关键。公猪繁殖性状遗传力低，使得常规的选择方法很难在短期内获得较大进展。随着分子生物学和分子遗传学的快速发展，标记辅助选择成为了提高公猪精液质量的有效方法。

CATSPER4基因是精子特异性阳离子通道家族4，在梅山公猪睾丸组织中的发育性表达分析表明了其在初生时启动，受到发育阶段的调控，具有阶段特异性。有研究表明CATSPER4 极有可能参与受精过程，因为其mRNA在成熟的精子细胞中表达，且其蛋白在睾丸和附睾中是特异表达的(Song C et al.Molecular cloning,spatial and temporalexpression analysis of CatSper genes in the Chinese Meishan pigs.Reprod BiolEndocrinol,2011,9:132)。CATSPER4 蛋白主要定位于精子头部顶体(Liu J etal.CatSperbeta,a novel transmembrane protein in the CatSper channel complex.JBiol Chem,2007,282(26):18945-52)，参与精子超活化的调控(Jin JL etal.Catsper3and catsper4encode two cation channel-like proteins exclusivelyexpressed in the testis.Biol Reprod,2005,73(6):1235-42)。敲除CATSPER4，直接影响顶体反应的调控过程，精子将出现超活化运动的缺失以及雄性完全不育(Qi H et al.Allfour CatSper ion channel proteins are required for male fertility and spermcell hyperactivated motility.Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(4):1219-23)。所以本发明推测CATSPER4基因在精子发生过程中发挥着重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于获得一种猪精液品质性状关联的遗传标记，根据测序结果，寻找 CATSPER4基因的突变位点，检测基因的多态性，为猪的标记辅助选择提供一种新的标记资源和选择方法。

本发明的技术方案如下所述：

本发明获得了一种猪精液品质性状的遗传标记，它是基于60日龄大白猪和180日龄大白猪睾丸组织RNA测序的结果，在测序结果里发现CATSPER4基因上存在多态位点，其外显子3上的第294位碱基处存在一个等位基因G/T的突变，该突变导致PCR-AlwNI-RFLP多态性。

申请人提供了一种筛选猪精液品质性状的遗传标记的方法，按照以下步骤：

从猪血液中提取基因组DNA。登录Ensembl数据库中下载猪CATSPER4基因序列(登录号为ENSSSCG00000026526)作为靶序列，在序列中找出从测序结果中筛选出的SNP位点，即外显子3上的G/T等位基因(位于该序列的第294位碱基处)突变(如图1)，对该SNP位点设计特异引物(该特异引物的序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示)，以常用的杜洛克猪、大白猪和长白猪基因组DNA为模板扩增(如图2所示)，根据其所获得的目的片段发现该突变引起了AlwNI酶切位点(CAGNNN↓CTG)多态性，然后对该G/T突变的AlwNI-RFLP (限制性内切酶酶切片段长度多态性)进行检测，所得SNP位点的检测结果如图3所示。

本发明提供了鉴定上述序列G/T突变的AlwNI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法，通过在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR扩增片段经AlwNI酶切分型及检测。并利用AlwNI-RFLP方法确定杜洛克猪、大白猪和长白猪的不同基因型个体与精液品质性状间的关联分析的应用。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：本发明筛选的与猪精液品质性状关联的SNP遗传标记的核苷酸序列。

图2：实施猪CATSPER4基因基因型分型的引物扩增片段琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为1.5％。附图标记说明：M泳道为DNA Marker DL2,000；泳道1-10为序列表SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为410bp。

图3：猪CATSPER4基因片段AlwNI-RFLP检测结果的琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为2.0％。附图标记说明：泳道M为DNA Marker DL2,000；泳道1为TT基因型，片段大小分别为410bp；泳道3、4、6、7、8、9、10为TG基因型，片段大小分别为410bp，291bp，119bp；泳道2、5为GG基因型，片段大小为291bp，119bp。

根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，从而可以达到较好的选择效果。

具体实施方式

对序列表序列的说明：

序列表SEQ ID NO：1：是扩增的国外血缘猪品种“杜洛克猪”、“大白猪”和“长白猪”的核苷酸序列。该序列就是本发明克隆得到的与猪精液品质性状关联的SNP遗传标记的序列，在该序列的294位碱基处存在一个等位基因G/T的突变，该突变导致的AlwNI-RFLP的多态性。

序列表SEQ ID NO：2：是实施猪CATSPER4基因外显子3上G/T突变的AlwNI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：3是实施猪CATSPER4基因外显子3上G/T突变的AlwNI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物序列。

实施例1：猪CATSPER4基因片段的获得及多态性检测方法的建立

登录Ensembl数据库中下载猪CATSPER4基因序列(登录号为ENSSSCG00000026526)，在序列中找出所筛选的SNP位点，利用Primer Premier 5软件设计引物。正向引物序列如序列表SEQ ID NO：2所示，即，CATSPER4-AlwNI-F：GCA ATG ACC ACAGCG AAG A，反向引物序列如序列表SEQ ID NO：3所示，即，CATSPER4-AlwNI-R：TGC TCAGGC CCG TTA GAT C。扩增得到一个410bp的目的片段(该片段的序列如SEQ ID NO:1所示(见图2)。 PCR反应体系为25μl，其中模板DNA为1μl，每条引物为0.5μl，PCR Mix为12.5μl，最后再加10.5μl去离子水至总体积为25μl；PCR反应程序：94℃预变性5min；然后94℃变性40s、 58℃退火30s、72℃延伸30s，共36个循环；最后72℃延伸10min。上述扩增片段大小为410bp，而SNP位点是位于该片段的294bp处的一个G/T突变(见图1)，该突变引起了AlwNI 酶切位点(CAGNNN↓CTG)多态性。

PCR扩增后，对获得的目的片段进行AlwNI-RFLP酶切分型。具体步骤为：取6μl PCR产物加入0.4μl限制性内切酶和1μl 10×buffer，再加入2.6μl的去离子水构成10μl的酶切体系，37℃酶切4h，取10μl酶切产物用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，记录酶切结果(如图3所示)，扩增片段大小为410bp。当294bp位点的碱基为G时，会有一个AlwNI酶切位点产生，酶切得到两条片段，长度分别为291bp和119bp(G等位基因)；当此位点为T碱基时，不存在AlwNI酶切位点，酶切得到长度为410bp的一个片段(T等位基因)。

实施例2：本发明制备的遗传标记在不同猪群中的多态性分布

猪基因组DNA的提取(样本如表1所示)，方法参照熊远著，《猪生化及分子遗传实验导论》，中国农业出版社，1999，报道的方法进行。

在3个国外血缘猪群体中检测猪CATSPER4基因PCR-AlwNI-RFLP多态性，检测结果如表1所示。

表1猪CATSPER4基因PCR-AlwNI-RFLP在不同猪种中的分布结果

注：上述群体材料均为中国公开推广的品种。

结果表明：在杜洛克猪、大白猪和长白猪中存在3种基因型。在杜洛克猪群体中，G等位基因频率为0.83，是优势等位基因；在大白猪群体中，G等位基因频率和T等位基因频率分别为0.45和0.55，无明显优势等位基因；在长白猪群体中G等位基因频率为0.79，是优势等位基因(见表1)。

实施例3：本发明制备的遗传标记与精液品质性状的关联分析

为了确定猪CATSPER4基因PCR-AlwNI-RFLP与猪精液品质差异是否相关，选择广西扬翔股份有限公司种猪场培育的杜洛克猪、大白猪和长白猪群为试验材料，采用实施例1建立的AlwNI-RFLP方法进行多态性检测，并分析猪AlwNI-RFLP不同基因型与猪精液品质性状的相关关系。采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 9.4)GLM程序进行单标记方差分析，同时采用REG程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为：

Y_ij＝μ+G_i+F_j+e_ij

Y_ij为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表GG、TG和TT基因型，显性效应用1，-1和1分别代表GG、TG 和TT基因型)；F_j为猪场综合效应；e_ij为残差效应。

在杜洛克猪、大白猪和长白猪中进行不同基因型与精液品质性状间的关联分析，统计分析结果总结于表2。

表2猪CATSPER4基因PCR-AlwNI-RFLP基因型精液品质性状的统计分析表

注：以上数值为最小二乘均值±标准误；含有相同字母表示差异不显著，小写字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著；加性效应正值表示G等位基因增加性状表型值。**表示 P<0.01，^*表示P<0.05。

由表2可以看出，在杜洛克猪中，GG基因型的精液量极显著多于TT基因型(P<0.01)； TT基因型的精子密度极显著大于GG基因型(P<0.01)；TG基因型的精子密度极显著大于 GG基因型(P<0.01)；TT基因型的精子活力极显著大于GG基因型(P<0.01)；TG基因型的精子活力极显著大于GG基因型(P<0.01)；TT基因型的畸形精子率极显著大于GG基因型 (P<0.01)；TG基因型的畸形精子率极显著大于GG基因型(P<0.01)。在大白猪中，TT基因型的精子密度显著大于GG基因型(P<0.05)；TG基因型的精子密度显著大于GG基因型 (P<0.05)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> CATSPER4基因第三外显子的SNP作为猪精液品质性状的遗传标记

<141> 2018-12-31

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 410

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(410)

<220>

<221> mutation

<222> (294)..(294)

<400> 1

gcaatgacca cagcgaagac ctcccagcag tgacccactt tagtggccac ttgggtagtg 60

accgctacgc tgatgccccc attccatggt cccctctcag gcaacttctt cccacaggag 120

tggcccccaa gagtccctat tcactgagag caaacttcca ggcagaggcc tcctacagtg 180

acacctgcct gaaggaagtc ccccaccctc tcccaggata cctgggacat gcaggagttc 240

atcactcgca tgtatgtcaa gcagctgctc cgacacccgg ccttccagct gctgctggcc 300

acgctgctgg tggtcaatgc catcaccatc gctctccgca ccaactccgc ccttggccag 360

gtgggacttc agcctgattt ccgtccccac tgatctaacg ggcctgagca 410

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<400> 2

gcaatgacca cagcgaaga 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<400> 3

tgctcaggcc cgttagatc 19

Claims

1.一种遗传标记在猪精液品质性状标记辅助选择中的应用，所述猪的品种为杜洛克猪，所述猪精液品质性状为：猪精液量、精子密度、精子活力和猪精子畸形率；或者所述猪的品种为大白猪，所述猪精液品质性状为大白猪精子密度；所述遗传标记的核苷酸序列如下所示：

GCAATGACCACAGCGAAGACCTCCCAGCAGTGACCCACTTTAGTGGCCACTTGGGTAGTGACCGCTACGCTGATGCCCCCATTCCATGGTCCCCTCTCAGGCAACTTCTTCCCACAGGAGTGGCCCCCAAGAGTCCCTATTCACTGAGAGCAAACTTCCAGGCAGAGGCCTCCTACAGTGACACCTGCCTGAAGGAAGTCCCCCACCCTCTCCCAGGATACCTGGGACATGCAGGAGTTCATCACTCGCATGTATGTCAAGCAGCTGCTCCGACACCCGGCCTTCCAGCTGCTRCTGGCCACGCTGCTGGTGGTCAATGCCATCACCATCGCTCTCCGCACCAACTCCGCCCTTGGCCAGGTGGGACTTCAGCCTGATTTCCGTCCCCACTGATCTAACGGGCCTGAGCA，

上述序列中的294位的碱基R是G或T，该突变导致AlwNI-RFLP多态性；在杜洛克猪中，GG基因型的精液量多于TT基因型，TT基因型的精子密度大于GG基因型，TG基因型的精子密度多于GG基因型，TT基因型的精子活力大于GG基因型，TG基因型的精子活力大于GG基因型，TT基因型的畸形精子率多于GG基因型，TG基因型的畸形精子率多于GG基因型；在大白猪中，TT基因型的精子密度大于GG基因型， TG基因型的精子密度大于GG基因型。