CN118028482A - Col1a1基因多态性作为杜洛克猪精液品质性状的遗传标记及应用 - Google Patents
Col1a1基因多态性作为杜洛克猪精液品质性状的遗传标记及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于猪分子标记筛选与应用领域，涉及COL1A1基因多态性作为杜洛克猪精液品质性状的遗传标记及应用,该遗传标记克隆自COL1A1基因第40外显子，所述遗传标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，在该序列的313位碱基处的R为等位基因(G/C)突变，该突变引起BsmAI‑RFLP多态性。本发明筛选步骤为：从杜洛克猪精液中提取基因组DNA，从测序结果里寻找SNP位点，确定该SNP位点的内切酶，设计特异引物进行PCR扩增，利用单核苷酸多态性检测，对基因型与猪精液品质性状进行相关性分析。本发明筛选的标记可在猪精液品质性状辅助选择中应用。
Description
技术领域
本发明属于猪遗传标记筛选与应用技术领域，具体涉及一种SNP遗传标记在杜洛克猪精液品质性状辅助选择中的应用，它包括猪COL1A1基因突变位点的检测方法与关联分析。
背景技术
猪精液品质的高低直接影响母猪产仔数和情期受胎率，从而影响猪场的生产水平。公猪的精液品质性状主要包括精液体积、精子密度、精子活力和精子畸形率等。猪精液品质性状受多种因素影响，如遗传改良、疾病防治、饲养管理水平、生产环境等，其中遗传改良占主导作用。在养猪生产中，公猪精液品质不良普遍存在。而精液品质性状遗传力比较低，通过常规选择进展较慢。因此，有必要利用标记辅助选择改良公猪精液品质。
COL1A1基因是I型胶原α1链的编码基因，在人类、猪、绵羊和小鼠中都高度保守(Xiang et al.,2022)。据报道，COL1A1编码的α1链不仅为结缔组织提供必要的结构支持，而且密切参与细胞锚定、分化与黏附等细胞功能(Kim and Kim,2022)。COL1A1在未成熟和成年小鼠的生精小管中表达，并调节精原细胞和前细线期精母细胞对基底膜的粘附(He etal.,2005)。COL1A1缺失导致精原细胞加速分化和自我更新受到抑制(Chen et al.,2012)。Ge等人通过iTRAQ蛋白质组学分析褪黑激素处理的绵羊附睾上皮细胞，发现COL1A1在处理组的表达上调，并推测COL1A1可能参与附睾中精子的成熟(Ge et al.,2022)。此外，有报道认为COL1A1在公牛劣质精液精浆中下调(Elango et al.,2023)。上述研究表明，COL1A1基因对精子发生有影响。所以本发明通过群体性状关联分析，鉴定SNP分子标记与杜洛克猪精液品质性状的相关性，为杜洛克猪精液品质性状的分子改良奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于获得一种与杜洛克猪精液品质性状关联的遗传标记，根据测序结果，寻找COL1A1基因突变位点，检测COL1A1基因多态性，为杜洛克猪的标记辅助选择提供一种新的遗传标记，以及基因分型和新的选择方法。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
本发明获得了一种猪精液品质性状的遗传标记，它是基于杜洛克猪睾丸组织RNA测序的结果，在测序结果里申请人发现COL1A1基因上存在一个多态位点，其中第40外显子(这个第40外显子是针对COL1A1基因的全序列而言，在COL1A1基因的全序列上，申请人设计引物扩增包含第40外显子部分片段测序，获得了长度为527bp的片段)上的存在一个G/C等位基因突变(313bp)，该突变可导致PCR-BsmAI-RFLP多态性。
具体地，本发明提供了一种与杜洛克猪精液品质性状相关的SNP标记，它的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述(具体序列和突变位点如下所示)，在该序列的313位碱基处存在一个碱基突变G(这里碱基G指代杜洛克公猪个体1突变后的碱基)，或它的核苷酸序列如SEQID NO:1所述(具体序列和突变位点如下所示)，在该序列的313位碱基处存在一个等位基因突变，即碱基突变C(这里碱基C指代杜洛克公猪个体2突变后的碱基)，引起BsmAI酶切位点多态性。
本发明提供了一种SNP遗传标记在杜洛克猪的精液品质性状辅助选择中的应用，所述SNP遗传标记的核苷酸具体序列如下所述：
TCAGATTTGGGGAGCAGTGGAGGGGAGGCCCCAGGAAGGCATGGAGAAAGGA
GCAGAAAGGGCAGAGTTGGGGTGTCATAAGCCCAACGGGCAGAAAAGGACTT
ACCCCCACATGGGTCTTCAAGCAAGTGGACCAAGCTTCCTTTTTTAAAAAGTTA
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TTTTGGTCATGTTCAGTTGGTCAAAGATTTAAAAACTAAGTTTGAGAGATGAATGCAAAGGAAAAAAATATTTTCCAAAGTCCATGTGAAATTGTCTR(G/C)CCATTTT TTGGCTTTTGGGGGGGTTTCCGTTTGGGGTGTTTGTTTGTTTCCAGGGTCAGGGGCAATTGGGTTGGGTGGGAGGGAGCCAGATTGGGGCGGAGGGAGTTTACAGGAAGCAGACAGGGCTAAGGTCGATGCCGAATTCTTGGTCGGGGGCGCCAACGTCCAAGGGGGCCACATCGATGATGGGCAGGCGGGAGGTCTTGGTGGTTTT，
上述序列第313碱基位存在一个等位基因突变(R)，即，由碱基G突变为碱基C。该突变引起BsmAI酶切位点多态性。
本发明提供了一种筛选猪精液品质性状SNP遗传标记的方法，具体步骤为：
从猪精液中提取基因组DNA，登录Ensembl数据库并下载猪COL1A1基因序列，在序列中找出从测序结果中筛选出的SNP位点，发现该基因40外显子上的G/C等位基因突变(如图1和图2)，对该SNP位点设计特异引物(该特异引物如说明书所示)；以杜洛克猪基因组DNA为模板扩增(结果见图3)，根据所获得的目的片段发现该突变引起了BsmAI酶切位点(GTCTCN↓)多态性，然后对该G/C突变的BsmAI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)进行检测，所得SNP位点的检测结果见图4所示。
本发明提供了鉴定上述序列G/C突变的BsmAI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型的方法的应用，通过在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR扩增片段经BsmAI酶切分型并检测。并利用BsmAI-RFLP方法确定杜洛克猪的不同基因型个体与精液品质性状间的关联分析的应用。
更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。
附图说明
图1：是扩增杜洛克猪个体1的目的片段的核苷酸序列，序列长度为527bp，在该序列的313位碱基处存在一个等位基因的突变“G”。
图2：是扩增杜洛克猪个体2的目的片段的核苷酸序列，序列长度为527bp，在该序列的313位碱基处存在一个等位基因的突变“C”。
图3：检测猪COL1A1基因基因型分型的引物扩增的片段琼脂糖凝胶电泳图谱。附图标记说明：琼脂糖凝胶浓度为1.2％；图3中的泳道说明：泳道M为DNA Marker DL2000；泳道1-8为使用特异性引物在杜洛克猪中的扩增片段，片段大小为527bp，结果如图1和图2所示，在图1显示的是杜洛克猪个体1扩增片段中的313bp处存在一个突变位点G(以R代表)；在杜洛克猪个体2中扩增片段中的313bp处存在另一个突变位点C(以R代表)，导致PCR-BsmAI-RFLP多态性。
图4：是猪COL1A1基因片段BsmAI-RFLP检测结果的琼脂糖凝胶电泳图谱。附图标记说明：琼脂糖凝胶浓度为1.2％；图4中的泳道说明：泳道M为DNA Marker DL2000；泳道3、4为GC基因型，片段大小分别为527bp，314bp，213bp；泳道5、7、8为CC基因型，片段大小分别为314bp，213bp；泳道1、2、6为GG基因型，片段大小为527bp。
根据本发明的方法可以用于开发成快捷的诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法或试剂盒来选择携带有利等位基因的猪，从而可以达到较好的选择效果。
具体实施方式
实施例1：COL1A1基因片段的获得及多态性检测方法的建立
登录Ensembl数据库并下载猪COL1A1基因序列(登录号为ENSSSCG00000036135)，在序列中找出所筛选的SNP位点，利用Primer Premier 5软件设计引物。正向引物序列即，COL1A1-BsmAI-F：TCAGATTTGGGGAGCAGT，反向引物序列即，COL1A1-BsmAI-R：AAAACCACCAAGACCTCC，通过PCR扩增得到一个527bp的目的片段(其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所述，电泳结果如图3所示)。PCR反应体系为25μl，其中模板DNA 1μl，上下游引物各0.5μl，PCR Mix 12.5μl，最后再加10.5μl去离子水至总体积25μl；PCR反应程序：94℃预变性5min；然后94℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸35s，共36个循环；最后72℃延伸5min。
上述扩增片段长度为527bp，而SNP位点是位于该片段的313bp处的一个G>C突变(替换)(如图1)，该突变引起了BsmAI酶切位点(GTCTCN↓)多态性。
本发明对PCR扩增目的片段进行了BsmAI-RFLP酶切分型。具体步骤为：取6μlPCR产物加入0.4μl限制性内切酶和1μl 10×buffer，再加入2.6μl的去离子水构成10μl的酶切体系，55℃酶切20min，酶切产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，记录酶切结果(如图4所示)，扩增片段大小为527bp。当313bp位点的碱基为C时，会有一个BsmAI酶切位点产生，酶切得到两条片段，长度分别为314bp和213bp(C等位基因)；当此位点为G碱基时，不存在BsmAI酶切位点，酶切得到长度为527bp的一个片段(G等位基因)。
实施例2：利用本发明筛选的遗传标记对猪精液品质性状进行关联分析
为了确定猪COL1A1基因PCR-BsmAI-RFLP多态性与杜洛克猪精液品质是否相关，本发明采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 9.4，一种公知公用的软件)GLM程序进行单标记方差分析，同时采用REG程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为：
Yij＝μ+Gi+Fj+eij
Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表GG、GC和CC基因型，显性效应用1，-1和1分别代表GG、GC和CC基因型)；Fj为猪场综合效应；eij为残差效应。
在杜洛克猪中进行不同基因型与精液品质性状的关联分析，统计分析结果见表1。
表1：COL1A1基因PCR-BsmAI-RFLP基因型与杜洛克猪精液品质性状的统计分析表
注：表1数值为最小二乘均值标准误；小写字母表示差异显著；加性效应正值表示G等位基因增加性状表型值。*表示P＜0.05。
由表1中可以看出，在杜洛克猪中，精液量GC基因型比CC基因型高20.61mL/头(P<0.05)，杜洛克猪精液量的显性效应值为-7.57±3.08mL/头(P<0.05)。
本发明鉴定了杜洛克猪群体中COL1A1基因的SNP多态性并分析其与精液量、精子密度、精子活力和精子畸形率性状的相关性。即：在杜洛克猪群体中，该SNP位点与精液量呈显著相关，GC基因型可能是提高精液量有益的基因型，提示该特异性核苷酸序列313位的SNP位点可以作为猪精量的候选标记位点。在实际对公猪选育的工作过程中，可根据公猪携带的基因型是否为GC基因型，而判断出该个体与其他个体相比期望有更加高的精液量。因此，本发明可用于指导杜洛克猪公猪的早期筛选的辅助选择，从而可以降低生猪养殖的生产成本，提高经济效益。
Claims (1)
1.一种SNP遗传标记在杜洛克猪精液品质性状辅助选择中的应用，所述猪精液品质性状为猪精液量、精子密度、精子活力和精子畸形率；其特征在于所述的遗传标记的核苷酸序列如下所示：
TCAGATTTGGGGAGCAGTGGAGGGGAGGCCCCAGGAAGGCATGGAGAAAGGAGCAGAAAGGGCAGAGTTGGGGTGTCATAAGCCCAACGGGCAGAAAAGGACTTACCCCCACATGGGTCTTCAAGCAAGTGGACCAAGCTTCCTTTTTTAAAAAGTTATTTATTTATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTAAGGTTTGAAATGCACTTTTGGTTTTTGGTCATGTTCAGTTGGTCAAAGATTTAAAAACTAAGTTTGAGAGATGAATGCAAAGGAAAAAAATATTTTCCAAAGTCCATGTGAAATTGTCTRCCATTTTTTGGCTTTTGGGGGGGTTTCCGTTTGGGGTGTTTGTTTGTTTCCAGGGTCAGGGGCAATTGGGTTGGGTGGGAGGGAGCCAGATTGGGGCGGAGGGAGTTTACAGGAAGCAGACAGGGCTAAGGTCGATGCCGAATTCTTGGTCGGGGGCGCCAACGTCCAAGGGGGCCACATCGATGATGGGCAGGCGGGAGGTCTTGGTGGTTTT，上述序列中第313碱基位的R是G或C，该突变引起BsmAI酶切位点多态性；
该标记应用在三种基因型的杜洛克猪上，即GG、GC和CC基因型，其中的G等位基因为优势等位基因。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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