CN104313156A - 猪产仔数性状的遗传标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子遗传标记制备技术领域，具体涉及一种猪产仔数性状的遗传标记及应用。以猪STIM1基因第10内含子末端序列的一个T碱基插入/缺失突变作为猪产仔数性状相关的遗传标记。本发明通过制备得到一种与猪产仔数性状相关的遗传标记，其中大白猪的遗传标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在其序列的256bp处存在一个T碱基插入突变；梅山猪的遗传标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，在其序列的256bp处不存在一个T碱基的缺失突变；该突变可显著影响猪产仔数性状。本发明还公开了该遗传标记的制备方法及其在猪产仔性状关联分析中的应用。为猪产仔数性状的分子标记辅助育种提供了一个新的遗传标记。

Description

猪产仔数性状的遗传标记及应用

技术领域

本发明属于家畜分子标记(遗传标记)制备技术领域，具体涉及一种猪产仔数性状的遗传标记及应用。所述的遗传标记克隆自猪STIM1基因。

背景技术

猪的产仔数是繁殖性状中重要的经济性状，直接关系到养猪业的经济收益，提高猪产仔数对提高养猪业的总体经济效益意义重大。据统计，在我国如果母猪产仔数每胎提高1头，每年将增收190亿人民币的纯利(王莉兴和鲁绍雄，2008)。母猪产仔数性状是一个由排卵、受精、着床、胎儿发育等多个具有时间顺序特征的组分性状构成的复合性状，属于遗传力很低(0.1左右)的数量性状，难以用常规育种技术进行遗传改良，所以寻找控制猪繁殖率的主效基因及其遗传标记对提高猪产仔数具有重要意义。

STIM1(Stromal interaction molecule 1)基因参与调节胞内Ca²⁺浓度，在哺乳动物卵母细胞中表达，可能参与调节卵母细胞成熟和受精过程。STIM1蛋白能感受内质网内钙库Ca²⁺浓度，从而调节Ca²⁺内流，参与形成Ca²⁺释放激活Ca²⁺通道(CRAC)，引发钙库控制的Ca²⁺内流(SOCE)，调控膜内外的Ca²⁺浓度，与钙振荡相关(Strange et al.,2007；陈晓芳等，2009；高尚邦和李臣鸿，2009)。而卵母细胞的减数分裂激活和成熟，以及受精过程均受到钙振荡的调节(李妍等，2007；Ajduk et al.,2008)。2009年，Koh等首次报道STIM1存在于哺乳动物卵母细胞中，并且在猪卵母细胞中STIM1能探测内质网Ca²⁺浓度，并触发SOCE(Koh et al.,2009)。2012年最新研究表明，STIM1在鼠成熟卵母细胞中的表达量远高于未成熟卵母细胞，且仅在成熟卵母细胞中才能检测到SOCE(Gómez-Fernández et al.,2012)。小鼠中，精子刺激后，STIM1在小鼠卵母细胞中迅速迁移，并参与受精过程钙振荡的维持(Gómez-Fernández et al.,2009)。在秀丽新小杆线虫中发现，STIM1干扰后导致生殖腺形态异常，无法正常排卵，也无法受精(Yan et al.,2006)，STIM1是秀丽新小杆线虫正常排卵和繁殖力所必须的(Lorin-Nebel et al.,2007)。另外，大量研究报道STIM1对肿瘤有抑制作用，如子宫颈癌(Chen et al.,2011)、乳腺癌(McAndrew et al.,2011)、卵巢癌(Ritchie et al.,2011)等。

综上所述，STIM1基因与动物繁殖性能有着密切联系，参与调控卵母细胞成熟及受精过程。目前猪STIM1基因对母猪产仔数的影响还未见报道。因此，申请人克隆了猪STIM1部分基因序列，利用该序列进行了多态性和关联分析等研究，以期获得与猪产仔数相关的新分子标记。

发明内容

本发明的目的在于扩增猪STIMQ基因的DNA序列，以寻找该基因序列突变位点多态性，获得一种与猪产仔数性状相关的遗传标记，并利用该遗传标记作为猪标记辅助选择。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明获得了一种猪产仔数性状的遗传标记，它是猪DTIM1基因的部分DNA片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1(长度为691bp)和SEQ ID NO：2(长度为690bp)所示。在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2第256bp处存在一个T碱基的插入/缺失突变(如图3所示)，该位点位于猪STIM1基因第10内含子与第11外显子交界处。

申请人提供了一种扩增猪STIM1基因部分DNA片段的引物对，该引物对的DNA序列如SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4所示。

申请人提供了一种筛选猪产仔数性状相关基因STIM1遗传标记的方法，其步骤如下：

参考GenBank数据库中猪STIM1基因(登录号NC_010451.3)的DNA序列设计特异引物(该引物的序列如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示)，以大白猪、梅山猪、中国瘦肉猪新品系DVI系(简称DVI系，即D4系)猪基因组DNA为模板进行降落PCR(Touchdown PCR)扩增，对PCR产物回收并克隆测序，得到如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的基因片段。根据测序结果筛查DNA序列变异，在256bp处存在一个T碱基的插入/缺失突变(突变位点如图3所示)，并在大白猪和DVI系两个猪群中进行基因型与产仔数性状的关联分析检测。

本发明为猪产仔数性状的分子标记辅助育种提供了一个新的遗传标记。

更详细技术细节如《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是扩增的一个“大白猪”STIM1基因的核苷酸序列，序列长度为691bp。在该序列第256碱基处存在一个T碱基的插入突变。

序列表SEQ ID NO：2是扩增的一个“梅山猪”STIM1基因的核苷酸序列，序列长度为690bp，在该序列第256碱基处不存在一个T碱基的插入(T碱基缺失突变)，是一个插入/缺失突变位点。

序列表SEQ ID NO：3是扩增SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2特异基因片段所用的上游(正向)引物序列。

序列表SEQ ID NO：4是扩增SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2特异基因片段所用的下游(反向)引物序列。

图1：是本发明的总体技术流程图。

图2：是猪STIM1基因片段PCR扩增结果图。图中标记说明：泳道1-6分别为大白猪1、大白猪2、梅山猪1、梅山猪2、DVI系1和DVI系2个体的扩增片段，片段大小为691bp或690bp。

图3：是猪STIM1基因片段核苷酸序列。图中加粗带框字母T代表插入/缺失位置，带下划线序列代表引物位置。

图4：是三种基因型的测序图谱。缺失碱基T的为MM基因型，插入碱基T的为NN型，双峰图谱的为杂合基因型MN。

图5：是本发明制备的遗传标记的核苷酸序列(大白猪)，序列长度为691bp,其中在第256碱基处存在一个T碱基的插入突变。

图6：是本发明制备的遗传标记的核苷酸序列(梅山猪)，序列长度为690bp,其中在该序列第256碱基处不存在一个T碱基的插入(T碱基缺失突变)，是一个插入/缺失突变位点。

具体实施方式

实施例1猪STIM1基因片段的获得及多态性检测方法的建立

1.猪基因组DNA的提取

本发明的试验猪品种为大白猪、梅山猪和DVI系猪(样本来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所和华中农业大学，大白猪为国外血缘猪种、梅山猪为中国地方猪血缘猪种，DVI系猪为大白猪与通城猪杂交选育的新品种)。猪基因组DNA的提取采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：

(1)采取猪的耳或尾组织，放入2ml的离心管中，加入200μl裂解液TL，用枪头吹打均匀；

(2)加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)，剧烈颠倒充分混匀，55℃水浴锅中消化过夜；

(3)加入200μl结合液CB，充分颠倒混匀，70℃放置10min；

(4)冷却后加入100μl异丙醇，剧烈颠倒充分混匀；

(5)用1mL的枪头吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；

(6)加入500uL抑制物去除液IR(该试剂盒自带)，12000rpm离心30s，弃废液；

(7)加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，倒掉废液；

(8)重复操作步骤7；

(9)将吸附柱AC放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，以免残留的乙醇抑制下游反应；

(10)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加50-100μl洗脱缓冲液EB(该试剂盒自带)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中；

(11)对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于-20℃下保存备用。

2.猪STIM1基因片段的获得

(1)PCR扩增

根据猪STIM1基因的基因组序列(GenBank登陆号：NC_010451.3)设计以下引物对：

上游(正向)引物：5'GCCTTGCCATCCCCTTGA 3'，

下游(反向)引物：5'AGAGACCGCCGATACCCC 3'。

利用上述引物在大白猪、梅山猪和DVI系猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、10×buffer(含Mg2+)4μL、上述上下游引物各0.5μM、2.5μM dNTPs、1U TaqDNA聚合酶。

PCR的运行程序为：95℃预热4min；95℃变性30s，64℃-54℃退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸40s，共20个循环；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共15个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检，结果见图2所示。

(2)PCR产物纯化

上述PCR产物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化(按照该试剂盒的说明书操作)，具体步骤如下：首先从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管，加入400μL溶胶液，50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；12000r/min离心1min，此时DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入700μL洗脱液，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的废液，12000r/min离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液或双蒸水(pH＞7.0)，室温或37℃放置2-3min；12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

3.利用PCR产物直接测序法检测分子标记

将上述获得的PCR纯化产物直接送到北京奥科公司进行测序，直接从测序色谱图(见图4)上进行基因型分析。

实施例2本发明制备的遗传标记在不同猪群中的多态性分布检测应用

申请人在大白猪、DVI系、梅山猪3个群体中检测了猪STIM1基因两种等位基因的分布频率，检测结果如表1所示，结果表明：N等位基因频率在大白猪中较低，仅为18.97％，DVI系中为40.19％，在梅山猪中最高，达56.25％。这三个群体中，大白猪、DVI系和梅山猪平均每胎产仔数分别为10.99±1.95头、11.67±1.77头和15.21±3.14头。由此可见，产仔数越高的群体，N等位基因频率越高。

表1猪STIM1基因两个等位基因在不同群体中的分布

实施例3本发明制备的遗传标记与猪产仔数性状的关联分析及应用

申请人在174头大白猪群(来自湖北省农业科学院畜牧兽医研究所)和107头中国瘦肉猪新品系DIV系(来自华中农业大学)两个猪群，及其共计726胎次繁殖性状记录中分析本发明制备的遗传标记与猪产仔数性状的相关关系。采用实施例1建立的PCR直接测序方法进行基因分型检测，采用SPSS统计软件(Statistical Package for the Social Sciences,Version 17.0)一般线性模型GLM进行统计分析，其中固定效应包括场次、年度和产仔季节效应。

关联分析结果总结于表2，由表中可以看出，在两个猪群中，NN基因型个体产仔数均极显著高于MM基因型个体(P<0.01)，且存在产仔数NN>MN>MM的趋势。在大白猪群中，NN基因型个体产活仔数显著高于MM个MN基因型个体(P<0.05)；在中国瘦肉猪新品系DIV系中，NN基因型个体产活仔数极显著高于MM基因个体(P<0.01)，存在产仔数NN>MN>MM的趋势。综上，MM基因型个体的产仔数较低，NN基因型个体的产仔数较高，N等位基因是产仔数性状的一个优势等位基因。

表2猪STIM1基因插入/缺失突变与产仔数性状的统计分析结果

注：以上数值为最小二乘均值±标准差；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

主要参考文献：

陈晓芳等.钙释放激活钙离子通道的发现及研究现状.河南师范大学学报(自然科学版)，2009，37：103-107.

高尚邦等，释放激活钙通道研究进展.现代生物医学进展，2009，9：350-354.

李妍等.钙离子在卵母细胞成熟过程中的作用.国外医学计划生育/生殖健康分册，2007，26：188-191.王莉兴等.猪产仔数相关候选基因的研究进展,2008,4:11-14.

Ajduk A,Malagocki A,Maleszewski M.Cytoplasmic maturation of mammalianoocytes:development of amechanism responsible for sperm-induced Ca2+oscillations.Reprod Biol,2008,8:3-22.

Chen YF,Chiu WT,Chen YT,Lin PY,Huang HJ,Chou CY,Chang HC,Tang MJ,Shen MR.Calcium storesensor stromal-interaction molecule 1-dependent signaling plays an important role in cervical cancergrowth,migration,and angiogenesis.Proc Natl Acad Sci USA,2011,108:15225-15230.

Gómez-Fernández C,López-Guerrero AM,Pozo-Guisado E,Alvarez IS,Martín-Romero FJ.Calciumsignalling in mouse oocyte maturation:the roles of STIM1,ORAI1and SOCE.Mol Hum Reprod,2012,18(4):194-203.

Gómez-Fernández C,Pozo-Guisado E,-Parra M,Perianes MJ,Alvarez IS,Martín-Romero FJ.Relocalization of STIM1in mouse oocytes at fertilization:early involvement of store-operated calciumentry.Reproduction,2009,138:211-221.

Koh S,Lee K,Wang C,Cabot R A,Machaty Z.STIM1regulates store-operated Ca2+entry in oocytes.DevBiol,2009,330:368-376.

Lorin-Nebel C,Xing J,Yan X,Strange K.CRAC channel activity in C.elegans is mediated by Orai1andSTIM1homologues and is essential for ovulation and fertility.J Physiol,2007,580:67-85.

McAndrew D,Grice DM,Peters AA,Davis FM,Stewart T,Rice M,Smart CE,Brown MA,Kenny PA,

Ritchie MF,Zhou Y,Soboloff J.WT1/EGR1-mediated control of STIM1expression and function in cancercells.Front Biosci,2011,17:2402-2415.

Roberts-Thomson SJ,Monteith GR.ORAI1-mediated calcium influx in lactation and in breast cancer.MolCancer Ther,2011,10:448-460.

Strange K,Yan X,Lorin-Nebel C,Xing J.Physiological roles of STIM1and Orai1homologs and CRACchannels in the genetic model organism Caenorhabditis elegans.Cell Calcium,2007,42:193-203.

Yan X,Xing J,Lorin-Nebel C,Estevez AY,Nehrke K,Lamitina T,Strange K.Function of a STIM1homologue in C.elegans:evidence that storeoperated Ca2+entry is not essential for oscillatory Ca2+Signaling and ER Ca2+homeostasis.J Gen Physiol,2006,128:443-459.

Claims (5)

1.一种猪产仔数性状的遗传标记，它是猪DTIM1基因的部分DNA序列，其中大白猪的遗传标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第256bp处存在一个T碱基的插入突变；梅山猪的遗传标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，在该序列的第256bp处不存在一个T碱基的缺失突变。

2.一种扩增猪STIM1基因部分DNA序列的引物对，其特征在于：所述引物对的DNA序列如下：

上游引物：GCCTTGCCATCCCCTTGA，

下游引物：AGAGACCGCCGATACCCC。

3.一种筛选猪产仔数性状相关基因STIM1的遗传标记的方法，其特征在于：按照以下步骤：

以GenBank数据库中登录号NC_010451.3的猪STIM1基因的DNA序列设计特异引物，该引物的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；以猪基因组DNA为模板进行降落PCR(TouchdownPCR)扩增，对PCR产物回收，将PCR回收产物直接进行测序鉴定基因型。

4.权利要求1所述的遗传标记在在猪产仔数性状标记辅助选择中的应用。

5.权利要求2所述的引物对在猪产仔数性状标记辅助选择中的应用。