CN107447038B - 猪mmp20基因片段作为产仔数性状的遗传标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于家畜分子遗传标记筛选技术领域，具体涉及猪MMP20基因片段作为猪产仔数性状的遗传标记及应用。发明通过筛选得到一种如SEQ ID NO：1所述的与猪产仔数性状相关的遗传标记，在该基因片段257bp处存在一个G>C碱基突变，在该基因片段的292bp处存在一个C>T碱基突变；和SEQ ID NO：2所述的另一个与猪产仔数性状相关的遗传标记，在该基因片段的257bp处存在一个C>G碱基突变，在292bp处存在一个T>C碱基突变。上述两个突变位点完全连锁，可显著影响猪产仔数性状。本发明还公开了该遗传标记的筛选方法及其在猪产仔性状关联分析中的应用。为猪产仔数性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记。
Description
技术领域
本发明属于家畜遗传标记筛选技术领域，具体涉及一种猪产仔数性状的遗传标记及应用。所述的猪遗传标记位于猪MMP20基因核苷酸片段上。
背景技术
猪的产仔数是直接关系到养猪业的经济收益的重要经济性状，提高猪产仔数对提高养猪业的总体经济效益意义重大。然而，母猪产仔数性状是一个低遗传力(0.1左右)的复合性状，很难用常规育种技术进行遗传改良，所以寻找控制猪产仔数性状的关键分子遗传标记，将可应用于该性状的分子辅助育种，对提高猪产仔数具有重要意义。
MMP20(Matrix Metallopeptidase 20，基质金属蛋白酶-20)是基质金属蛋白酶家族中的一员，主要与牙齿发育密切相关，在降解釉原蛋白方面发挥重要作用。例如，在MMP20基因的突变可导致釉质发育不良(Gao et al.,2014)；在MMP20基因敲除小鼠模型中，釉质形成缺陷(Caterina et al.,2002)，表现在釉质矿化含量和矿化硬度降低(Bartlett etal.,2004)；
Filho等(2017)发现人MMP20基因rs1784418位点与防龋有密切关系；Prajapati等(2016)发现MMP20通过防止磷灰石晶体内蛋白质的封闭介导牙釉质矿化。另外，近期也有文献报道MMP20基因缺失与神经母细胞瘤有关(Chang et al.,2017)。而有关MMP20基因对繁殖性能的影响还未见报道。
由上，申请人克隆了猪MMP20基因的部分核苷酸序列，利用该序列进行了多态性变异位点的筛选鉴定及与母猪产仔数性状的关联分析研究，以期获得与猪产仔数相关的新分子标记。
发明内容
本发明的目的在于扩增猪MMP20基因的DNA序列，以寻找该基因序列突变位点多态性，获得一种与猪产仔数性状相关的遗传标记，并利用该遗传标记作为猪标记辅助选择中。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明获得了一种猪产仔数性状的遗传标记，它是猪MMP20基因的部分DNA片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1(长度为643bp)和SEQ ID NO：2(长度为643bp)所示。在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2第257碱基处存在一个C>G碱基突变，在该序列第292碱基处存在一个C>T碱基突变(如图2所示)。
申请人提供了一种扩增猪MMP20基因部分DNA片段的引物对，该引物对的DNA序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
申请人提供了一种制备猪产仔数性状相关基因MMP20遗传标记的方法，其步骤如下：
参考GenBank数据库中猪MMP20基因(登录号NC_010451)的DNA序列设计特异引物(该引物的序列如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示)，以大白猪、梅山猪、中国瘦肉猪新品系DVI系(简称DVI系，即D4系)猪基因组DNA为模板进行降落PCR(Touchdown PCR)扩增，对PCR产物回收并进行DNA测序分析，得到如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的基因片段。根据测序结果筛查DNA序列变异，在257bp处存在一个C>G碱基突变(即等位基因突变)，在292bp处存在一个C>T碱基突变(即等位基因突变)，所述的遗传标记如图2所示，利用该遗传标记在对大白猪群中基因型与产仔数性状进行了关联分析检测。
本发明为猪产仔数性状的分子标记辅助育种提供了一个新的遗传标记。
更详细技术细节如《具体实施方式》所述。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是扩增的一个“大白猪”MMP20基因的核苷酸序列，序列长度为643bp。在该序列第257碱基处存在一个G>C碱基的替换，在该序列第292碱基处存在一个C>T碱基的替换(在序列表SEQ ID NO：1中显示的结果是已经替换的碱基)。
序列表SEQ ID NO：2是扩增的一个“梅山猪”MMP20基因的核苷酸序列，序列长度为643bp，在该序列第257碱基处存在一个C>G碱基的替换，在该序列第292碱基处存在一个T>C碱基的替换(在序列表SEQ ID NO：1中显示的结果是已经替换的碱基)。
序列表SEQ ID NO：3是扩增SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2特异基因片段所用的正向引物序列。
序列表SEQ ID NO：4是扩增SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2特异基因片段所用的反向引物序列。
图1：是本发明的总体技术流程图。
图2：是本发明中猪MMP20基因序列2个突变位点的测序图谱。
图3：是猪MMP20基因片段核苷酸序列直观图(与上述SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列表相对应)。图中加粗带框字母A代表C>G突变，加粗带框字母Y代表C>T突变，突变位置分为位于该序列的第257碱基和第292碱基处，带下划线序列代表引物位置。
具体实施方式
实施例1猪MMP20基因片段的获得及多态性检测方法的建立
1.猪基因组DNA的提取
本发明的试验猪品种为大白猪、梅山猪和中国瘦肉猪新品系DVI系(简称DVI系猪)，样本来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所和华中农业大学，大白猪为国外血缘猪种、梅山猪为中国地方猪血缘猪种，DVI系猪为大白猪与通城猪杂交选育的新品种。猪基因组DNA的提取采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：
(1)采取猪的耳或尾组织，放入2mL的离心管中，加入200μL裂解液TL，用枪头吹打均匀；
(2)加入20μL蛋白酶K(20mg/ml)，剧烈颠倒充分混匀，55℃水浴锅中消化过夜；
(3)加入200μL结合液CB(试剂盒自带)，充分颠倒混匀，70℃放置10min；
(4)冷却后加入100μL异丙醇，剧烈颠倒充分混匀；
(5)用1mL的枪头吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；
(6)加入500μL抑制物去除液IR(该试剂盒自带)，12000rpm离心30s，弃废液；
(7)加入700μL漂洗液WB(试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液；
(8)重复操作步骤7；
(9)将吸附柱AC放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，以免残留的乙醇抑制下游反应；
(10)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加50-100μL洗脱缓冲液EB(该试剂盒自带)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中；
(11)对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于-20℃下保存备用。
2.猪MMP20基因片段的获得
(1)PCR扩增
根据猪MMP20基因的基因组序列(GenBank登陆号：NC_010451)设计以下引物对：
正向引物MMP20-4F：5'TCTTACAGTAGACCTTGTGCCA 3'，
反向引物MMP20-4R：5'TGGCTTGGGACGTTGAACCT 3'。
利用上述引物在大白猪、梅山猪和DVI系猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、10×buffer(含Mg2+)4μL、上述上下游引物各0.5μM、2.5μM dNTPs、1U TaqDNA聚合酶。
PCR的运行程序为：95℃预热2min；94℃变性20s，62℃-57℃退火40s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸60s，共11个循环；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)PCR产物纯化
上述PCR产物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化(按照该试剂盒的说明书操作)，具体步骤如下：首先从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管，加入400μL溶胶液，50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；12000r/min离心1min，此时DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入700μL洗脱液，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的废液，12000r/min离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液或双蒸水(pH＞7.0)，室温或37℃放置2-3min；12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。
3.猪MMP20基因片段变异位点的获得
将上述回收获得的DNA片段送到上海天昊生物科技有限公司采用ABI3730XL测序仪测序，发现了2个单碱基突变位点(图2)，分别位于MMP20基因组核苷酸序列(即全序列)(GenBank NC_010451)的第14334bp处的C>G突变，以及第14369bp处的C>T突变(对应于本发明的MMP20基因片段的突变位点分别是：在SEQ ID NO：1是257bp处存在一个G>C碱基突变(即等位基因突变)，在292bp处存在一个C>T碱基突变(即等位基因突变)；在SEQ ID NO：2是257bp处存处存在一个C>G碱基突变(即等位基因突变)，在292bp处存在一个T>C碱基突变(即等位基因突变)。
4.分子标记基因分型
将待检测个体的DNA样本作为模板，按照以上步骤2所述方法进行猪MMP20基因序列片段的扩增，将获得的PCR纯化产物直接送上海天昊生物科技有限公司进行测序，直接从测序结果中读取基因分型结果。
实施例2本发明制备的遗传标记在猪产仔数性状的关联分析中的应用
申请人在185头大白猪群(来自湖北省农业科学院畜牧兽医研究所)，及其共计497胎次繁殖性状记录中分析本发明制备的遗传标记与猪产仔数性状的相关关系。采用实施例1建立的PCR直接测序方法来进行基因分型检测，采用SPSS统计软件(Statistical Packagefor the Social Sciences,Version 17.0)一般线性模型GLM进行统计分析，其中固定效应包括场次、年度和产仔季节效应。
关联分析结果总结于表2。
表2猪MMP20基因突变与产仔数性状的统计分析结果
表2注：*P<0.05，表示差异显著。
由表2中可以看出，在大白猪群中，猪MMP20基因全序列存在的两个突变位点(14334bp C>G和14369bp C>T)为紧密连锁，群体中只存在GG/CC、GC/CT、CC/TT三种单倍型，且不同单倍型母猪产仔数性状差异显著(P<0.05)。GG/CC型个体产仔数与产活仔数均显著低于GC/CT和CC/TT基因型个体(P<0.05)，产仔数存在GG/CC<GC/CT<CC/TT的趋势。综上，MMP20基因全序列第14334bp处的C等位基因以及第14369bp处的T等位基因是产仔数的优势等位基因，在育种中应予以保留携带这些优势等位基因的个体，有利于提高群体的产仔数性状。
主要参考文献：
Bartlett J D,Beniash E,Lee D H,et al.Decreased mineral content inMMP-20 null mouse enamel is prominent during the maturation stage[J].Journalof dental research,2004,83(12):909-913.
Caterina J J,Skobe Z,Shi J,et al.Enamelysin(matrix metalloproteinase20)-deficient mice display an amelogenesis imperfecta phenotype[J].Journal ofBiological Chemistry,2002,277(51):49598-49604.
Chang X,Zhao Y,Hou C,et al.Common variants in MMP20 at 11q22.2predispose to 11q deletion and neuroblastoma risk[J].Nat Commun,2017,8(1):569.
Gao Y,Zhang L,Xiang L,et al.Transforming growth factor-β1 regulatesexpression of the matrix metalloproteinase 20(Mmp20)gene through a mechanisminvolving the transcription factor,myocyte enhancer factor-2C,in ameloblastlineage cells[J].European journal of oral sciences,2014,122(2):114-120.
Prajapati S,Tao J,Ruan Q,et al.Matrix metalloproteinase-20 mediatesdental enamel biomineralization by preventing protein occlusion insideapatite crystals[J].Biomaterials,2016,75:260-270。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 猪MMP20基因片段作为产仔数性状的遗传标记及应用
<130>
<141> 2020-08-04
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 643
<212> DNA
<213> 猪（Sus scrofa）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(643)
<223>
<220>
<221> mutation
<222> (257)..(257)
<223>
<220>
<221> mutation
<222> (292)..(292)
<223>
<400> 1
tcttacagta gaccttgtgc caattaataa agagtgcaag agttctcact gtggcccagc 60
aggttaagga tccaacgttg cctcagccgc agctcagatt caatccctgg cctgggaact 120
tccatatgcc atgggtgcag ccccccagat aaacactgta atgagaacaa taacaaaaga 180
acattttttt atttttaatg cttactatct ttaaaataca aaacattcct cttaattttt 240
tgatggacag atcactgatt gacatgtgag ctgcttctta tacataataa acatggaaaa 300
gtaaatctat ttgtatgaga agtgtcaatg ctattcaaaa cagtgtccgt tccctgtgat 360
atcatgtacc cctcaaaaac tgctagaaga actaaatcct gttggtattt ctccccactt 420
atttagatca cggggattcc tatccattcg atgggcctcg agggactcta gcccatgcat 480
ttgcacctgg agaaggcctg ggaggagata cacatttcga caatgctgag aagtggacta 540
tgggaatgaa tggtatatat gcacaattca ccataacctg gaaaatattg taccttcttc 600
tgggcctcca tcatgaaacc ttgaggttca acgtcccaag cca 643
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<212> DNA
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<220>
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<223>
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tcttacagta gaccttgtgc caattaataa agagtgcaag agttctcact gtggcccagc 60
aggttaagga tccaacgttg cctcagccgc agctcagatt caatccctgg cctgggaact 120
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tggcttggga cgttgaacct 20
Claims (2)
1.猪MMP20基因片段作为遗传标记在大白猪产仔数性状标记辅助选择中的应用，其特征在于，所述遗传标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在所述序列的第257bp处有一个由C到G的碱基替换。
2.猪MMP20基因片段作为遗传标记在大白猪产仔数性状标记辅助选择中的应用，其特征在于，所述遗传标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，在所述序列的第292bp处有一个由C到T的碱基替换。
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| MMP20 rs1784418 Protects Certain Populations against Caries;Filho AV等;《Caries Res》;20161220;第51卷(第1期);第46-51页 * |
| 单核苷酸多态性在猪育种中的应用;何芳明等;《中国猪业》;20130624;第9卷(第6期);第36-40页 * |
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