CN105821037B - Snp标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了SNP标记及其应用。其中，该SNP标记为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第31位碱基A或G。本发明的SNP标记与猪的繁殖性状紧密相关，能够有效用于猪的分子标记辅助育种。
Description
技术领域
本发明涉及SNP标记及其应用。具体地，本发明涉及猪繁殖性状相关的SNP标记，一组用于检测该SNP标记的引物和试剂盒，前述SNP标记、引物、试剂盒在猪选育中的用途，以及检测猪繁殖性状的方法。
背景技术
我国是猪肉消费的第一大国，然而，猪的养殖繁育技术还不够成熟，规模化养殖生产效益低，无法满足国民对猪肉产品的需求。因而，目前提高猪养殖技术，扩大猪养殖规模，迅速发展猪养殖产业，对于促进养殖户增收，满足国民对猪肉产品需求，优化猪养殖业结构有重要意义。其中，繁殖性能是猪养殖的一个重要经济性状，其是决定规模化养猪生产效益的关键因素之一。即及时、早期选择繁殖性状优良的猪进行育种、养殖，对猪育种和实际生产来说非常重要。目前虽然传统数量遗传学在指导家畜育种中起到了重要作用，但是繁殖性状遗传力低、性状表现晚，通过常规选择难以有所进展。
分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良选育物种的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。目前，针对繁殖性状优良的猪的选育，人们希望通过寻找影响繁殖性能的主效基因，进而筛选获得与繁殖性状密切相关的分子标记辅助育种，以便实现早期选种、提高育种准确性，并有效加快育种进展，提高猪的繁殖性能，获得较大的经济效益。
然而，现阶段能够有效用于猪育种的繁殖性状相关的分子标记仍有待挖掘。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种与猪繁殖性状相关，能够有效用于猪选育的SNP标记。
其中，SNP(single nucleotide polymorphism,SNP，即单核苷酸多态性)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
发明人利用候选基因法，选取可能与繁殖性状相关的基因，通过NCBI的SNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，调取了这些基因相关的SNP位点，然后利用Blast方法，在ensembl数据库中(http://asia.ensembl.org/Multi/Tools/Blast？db＝core)获取SNP位点周围 1000bp的核苷酸序列，并设计扩增引物，采用飞行时间质谱技术，以大白猪、长白猪、杜洛克猪共338头的基因组DNA为样本，直接检测这些SNP的基因型数据；并分析了这些SNP的基因型与猪繁殖性状的相关性。结果发现，猪17号染色体上BMP2基因上的一个SNP―rs342665431(即SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第31位碱基A或G)与猪的繁殖性能显著相关。
为此，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种猪繁殖性状相关的SNP标记。根据本发明的实施例，该SNP标记为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第31位碱基A或G。根据本发明的实施例，SEQ ID NO：1所示核苷酸序列如下：TGACAGGCATCTCCTTCTACTGAATCAGGCTCTTCATATTTAAGTTTTGTGTGGGGACCATTTCCAACTGA A(SEQ ID NO：1)。
需要说明的是，本文中所采用的表达方式“猪繁殖性状”主要以猪的总产仔数，活仔数和断奶头数来衡量。
另外，如前所述，上述SNP标记位于猪17号染色体的BMP2基因上。BMP基因家族是一类骨形态发生蛋白基因家族，最初能诱导软骨的合成，后期能促进骨组织的合成。到目前为止，已有30多种BMP基因被克隆，除BMP1是蛋白酶外，其余都属于转移生长因子β(transforming growth factor-β,TGFβ)超家族成员。除骨发育以外，BMP家族与多个生物学过程相关，包括繁殖系统的发育与生理功能，一些基因甚至已被鉴定与家畜动物繁殖性能相关，如BMP15。BMP15在卵母细胞中表达，该基因可能涉及到卵泡细胞增殖、分化的调节，其突变或失活可能影响动物的繁殖性状。2000年Galloway SM等发现BMP15基因对Cambridge、Inverdale、Belclare等品种绵羊高繁殖力有显著的影响。BMP2基因是BMP基因家族一员，该基因的表达对于成骨细胞分化是必不可少的，已有文献证明其与猪的生长性能相关。然而，BMP2基因与猪繁殖性能的关系还未见报道。
发明人发现，该SNP标记的位点处基因型为AG的猪繁殖能力显著高于此处基因型为纯合AA的猪，而低于此处基因型为纯合GG的猪。进而，根据本发明的实施例，通过检测猪的上述SNP，能够有效地确定其繁殖性状，具体地，如前所述，该SNP位点为纯合GG的猪繁殖性能显著优于此处基因型为AG的猪，而该SNP位点为AG的猪繁殖性能显著优于此处基因型为纯合AA的猪，从而当该SNP位点的基因型为GG时，能够确定待测猪属于繁殖性能非常好的个体；当该SNP位点的基因型为AG时，能够确定待测猪的繁殖性能一般；而当该SNP位点的基因型为AA时，能够确定待测猪的繁殖性能较差。由此，发明人确定，本发明的SNP标记与猪的繁殖性状紧密相关，能够有效用于猪的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求早日选择具有相应繁殖性能的猪育种材料，即对育种材料进行早期选择，进而能够有效提高育种的效率和准确性，提高猪繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出猪优良品种，提高养殖产业的经济效益。此外，根据本发明的一些实施例，利用本发明的SNP标记进行猪分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一组用于检测前面所述的本发明的SNP标记 的引物。根据本发明的实施例，该组引物具有SEQ ID NO：2-4所示的核苷酸序列，具体如下：
5′-ACGTTGGATGAAGTAGCCTACCTTCTTGAG-3′(SEQ ID NO：2)，其中横线标注序列为该引物携带的10个碱基标签；
5′-ACGTTGGATGGCTTTTTGTCCACTCAGAGC-3′(SEQ ID NO：3)，其中横线标注序列为该引物携带的10个碱基标签；
5′-CACACAAAACTTAAATATGAAGA-3′(SEQ ID NO：4)。
根据本发明的实施例，本发明的上述引物具有非常好的特异性，利用本发明的引物能够准确有效地对待测猪的上述与繁殖性状相关的SNP标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序或飞行时间质谱检测能够有效实现对该SNP标记的检测，确定待测猪该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测猪的繁殖性状。具体地，利用SEQ ID NO：2-3所示的引物将待测猪的基因组DNA进行第一PCR扩增，然后利用SEQ ID NO：4所示的延伸引物对第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，其中SEQ ID NO：4所示的延伸引物可以识别该SNP标记位点，向后延伸1个碱基(ddntp)终止，这样不同基因型均可扩增出来，利用飞行时间质谱检测第二扩增产物即可容易地区分该SNP标记位点处任意2个碱基的区别，从而实现SNP基因分型。进一步，该SNP标记的AG基因型个体的繁殖能力显著高于AA基因型个体，而低于GG基因型个体。从而当该SNP位点的基因型为GG时，能够确定待测猪属于繁殖性能非常好的个体；当该SNP位点的基因型为AG时，能够确定待测猪的繁殖性能一般；而当该SNP位点的基因型为AA时，能够确定待测猪的繁殖性能较差。由此，用于检测前面所述的本发明的SNP标记的一组引物，能够有效用于猪的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育猪优良品种。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的SNP标记的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含：前面所述的用于检测本发明的SNP标记的引物。即本发明的试剂盒中包含具有SEQ ID NO：2-4所示的核苷酸序列的引物。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒中所包含的引物，能够有效实现对待测猪的上述与繁殖性状相关的SNP标记的多态性检测，确定待测猪该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测猪的繁殖性状。具体地，SNP标记的AG基因型个体的繁殖能力显著高于AA基因型个体，而低于GG基因型个体。从而当该SNP位点的基因型为GG时，能够确定待测猪属于繁殖性能非常好的个体；当该SNP位点的基因型为AG时，能够确定待测猪的繁殖性能一般；而当该SNP位点的基因型为AA时，能够确定待测猪的繁殖性能较差。由此，本发明的用于检测前面所述的本发明的SNP标记的试剂盒，能够有效用于猪的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育猪优良品种。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的本发明的SNP标记、引物或试剂盒，在猪选育中的用途。如前所述，通过能够用于检测本发明的与猪繁殖性状相关的SNP标记的试剂例如前述的一组引物或包含该组引物的试剂盒等，能够有效地检测确定待测猪的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测猪的繁殖性状，从而能够有效辅助猪选育。
进而，根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种检测猪繁殖性状的方法。根据本发明的实施例，该方法通过对待测猪进行前面所述的SNP标记的检测，确定所述待测猪的繁殖性状。具体地，可以通过能够用于检测本发明的与猪繁殖性状相关的SNP标记的试剂例如前述的一组引物或包含该组引物的试剂盒等，对待测猪进行PCR扩增、测序或飞行时间质谱检测，以便检测确定待测猪的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测猪的繁殖性状。其中，如前所述，SNP标记的AG基因型个体的繁殖能力显著高于AA基因型个体，而低于GG基因型个体。从而当该SNP位点的基因型为GG时，能够确定待测猪属于繁殖性能非常好的个体；当该SNP位点的基因型为AG时，能够确定待测猪的繁殖性能一般；而当该SNP位点的基因型为AA时，能够确定待测猪的繁殖性能较差。由此，利用本发明的检测猪繁殖性状的方法，能够快速、高效、准确地检测猪繁殖性状，进而该方法能够有效用于猪的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育猪优良品种。
另外，根据本发明上述实施例的检测猪繁殖性状的方法还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，对待测猪进行SNP标记检测的方法不受特别限制。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(PCR single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-restriTCion fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP)及飞行时间质谱等技术均可以实现SNP的检测。其中，飞行时间质谱是一种准确性高、灵活性强，步骤简单、操作方便、检测周期短的检测技术。只需在SNP位点的两侧设计一对引物，扩增目的片段，再用延伸引物紧邻SNP位点匹配，单碱基延伸SNP位点，之后利用飞行时间质谱技术(Sequenom公司质谱仪MT09)即可直接检测该SNP位点的基因型。因而，本发明采用飞行时间质谱法进行SNP标记检测。根据本发明的一些具体示例，通过对待测猪进行前面所述的SNP标记的检测，确定所述待测猪的繁殖性状，进一步包括：提取待测猪的基因组DNA；利用SEQ ID NO：2-3所示的引物，将所述待测猪的基因组DNA进行第一PCR扩增，以便获得第一PCR扩增产物；利用延伸引物对所述第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，以便获得第二PCR扩增产物，其中所述延伸引物具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列：CACACAAAACTTAAATATGAAG(SEQ ID NO：4)；对所述第二PCR扩增产物进行飞行时间质谱检测，以便确定所述待测猪的所述SNP标记的基因型；以及基于所述待测猪的所述SNP标记的基因型，确定所述待测猪的繁殖性状。由此，能够有效提高检测猪繁殖性状的效率。
根据本发明的实施例，提取待测猪的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采用常规酚氯仿方法抽提待测猪的基因组DNA。由此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组DNA，便于后续步骤进行。
根据本发明的实施例，所述SNP标记的AG基因型个体的繁殖能力显著高于AA基因型个体，而低于GG基因型个体。即本发明前面所述的SNP标记与猪的繁殖性状紧密相关。由此，基于确定的待测猪的该SNP标记的基因型，能够准确有效地确定待测猪的繁殖性状，例如当该SNP位点的基因型为GG时，能够确定待测猪属于繁殖性能非常好的个体；当该SNP位点的基因型为AG时，能够确定待测猪的繁殖性能一般；而当该SNP位点的基因型为AA时，能够确定待测猪的繁殖性能较差。进而本发明的方法能够有效用于猪的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育猪优良品种。
根据本发明的实施例，利用质谱仪进行所述飞行时间质谱检测。优选地，所述飞行时间质谱检测是利用Sequenom公司质谱仪MT09进行的。由此，能够快速、准确地确定待测猪的目标SNP标记的基因型，进而能够有效确定待测猪的繁殖性状，从而能够为猪的优良品种选育提供科学依据。
需要说明的是，本发明的与猪繁殖相关的SNP标记及其应用具有如下优点：
(1)本发明提供的SNP标记不受猪的品种、年龄等限制，可用于猪的早期选育，可显著促进猪的育种进程；
(2)检测猪如SEQ ID NO：1所示自5’端起第31位SNP位点的方法，准确可靠，操作方便；
(3)猪如SEQ ID NO.1所示自5’端起第31位的SNP位点的检出，为猪繁殖性状的标记辅助选择提供了科学依据。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1-3依次显示了根据本发明一个实施例，本发明的SNP标记位点处AA、AG和GG三种基因型的飞行时间质谱检测峰图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
1、猪繁殖相关SNP标记的检测
发明人利用候选基因法，选取可能与繁殖性状相关的基因，通过NCBI的SNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，调取了这些基因相关的SNP位点，然后利用Blast方法，在ensembl数据库中(http://asia.ensembl.org/Multi/Tools/Blast？db＝core)获取SNP位点周围1000bp的核苷酸序列，并设计扩增引物，采用飞行时间质谱技术，以大白猪、长白猪、杜洛克猪共338头的基因组DNA为样本，直接检测这些SNP的基因型数据；并分析了这些 SNP的基因型与猪繁殖性状的相关性。结果发现，猪17号染色体上BMP2基因上的一个SNP―rs342665431(即SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第31位碱基A或G)与猪的繁殖性能显著相关。具体如下：
首先，以猪BMP2的包含SNP―rs342665431的部分序列为依据，在ensembl数据库中(http://asia.ensembl.org/Multi/Tools/Blast？db＝core)获取SNP位点周围1000bp的核苷酸序列，以获取的1000bp序列为模板设计引物，引物序列如下：
1st-PCRP：5′-ACGTTGGATGAAGTAGCCTACCTTCTTGAG-3′(SEQ ID NO：2)，其中横线标注序列为该引物携带的10个碱基标签；
2nd-PCRP：5′-ACGTTGGATGGCTTTTTGTCCACTCAGAGC-3′(SEQ ID NO：3)，其中横线标注序列为该引物携带的10个碱基标签；
UEP-PCRP：5′-CACACAAAACTTAAATATGAAGA-3′(SEQ ID NO：4)。
接着，分别以大白猪、长白猪、杜洛克猪共338头的基因组DNA为模板(SNPs检测的群体和样品数见表5)，以1st-PCRP和2nd-PCRP为引物进行第一PCR扩增，以便获得第一PCR扩增产物，其中，模板DNA为50ng，第一PCR扩增的反应体系见表1，反应程序见表2：
表1第一PCR扩增的反应体系
表2.第一PCR扩增的程序：
94℃，2分
72℃，5分
12℃，保存。
第一PCR扩增产物片段序列如SEQ ID NO：5所示(ACGTTGGATGTGACAGGCATCTCCTTCTACTGAATCAGGCTCTTCATATTTAAGTTTTGTGTGGGGACCATTTCCAACTGAACATCCAACGT)，长93bp。
接下来，利用AP(Alkaline Phosphatse，碱性磷酸酶，用于纯化PCR产物)将第一PCR扩增产物中未反应dNTP消化后，对第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，即用延伸引物UEP-PCRP紧邻SNP位点匹配，单碱基延伸SNP位点，以便获得第二PCR扩增产物。其中，第二PCR扩增的反应体系见表3；第二PCR扩增的反应程序见表4。
表3.第二PCR扩增的反应体系
表4.第二PCR扩增的程序：
94℃，2分
72℃，5分
12℃，保存。
然后，利用飞行时间质谱技术(Sequenom公司质谱仪MT09)对上述第二PCR扩增产物进行SNP多态性检测，各基因型的代表性检测结果见图1-3。其中，图1为本发明的SNP标记位点处AA基因型的飞行时间质谱检测峰图，图2为本发明的SNP标记位点处AG基 因型的飞行时间质谱检测峰图，图3为本发明的SNP标记位点处GG基因型的飞行时间质谱检测峰图。结果显示在各第二扩增产物中均包含该突变位点，即各第二扩增产物的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第31位碱基A或G。由此，表明上述SNP标记与猪的繁殖性状显著相关。
由此，获得的3个猪品种的338个样本的基因型，然后对基因型检测结果进行统计分析，分析结果如下表6所示。由表6确定了BMP2多态性在3个猪品种中的分布情况。
表5.SNPs检测的群体和样品数
表6.BMP2多态性在3个猪品种中的分布
注：Df＝2，χ2＝5.991，p>0.05哈代温伯格检验平衡。
2、猪不同基因型与其繁殖性状的关联分析
试验猪群：该研究有3种国外猪品种共338头，即大白169头，长白96头，杜洛克73头(见表5)。
具体方法如下：
首先，对该338头猪的繁殖性状相关指标进行记录，包括初配日龄、受胎率、分娩率、总产仔数、活仔数、胎产总仔、胎产活仔、胎产死胎、胎木乃伊、断奶头数、每胎断奶数、平均胎间距、年产胎数、年产活仔、年断奶头数、出生窝重、断奶窝重等。
接着，采集该338头猪提取基因组DNA，按照步骤1所述的方法，通过飞行时间质谱技术检测各头猪的该SNP标记的基因型。
然后，将试验猪群基因型与上繁殖性状即经济性状进行关联分析。其中，该关联分析是应用SAS 6.0GLM程序对繁殖性状的不同基因型之间的差异进行最小二乘方差分析。
所采用的线性模型为：
Y＝μ+Breed+Farm+Mar ker+e
其中，Y是性状观察值，μ为总体均值，Sex为性别效应，Breed为品种效应，Farm为猪场效应，Marker为标记效应，e为随机误差，假定服从N(0，σ2)分布。
应用模型根据最小二乘分析法直接分析基因型的效应，同时进行基因型间的两两比较。基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表7。
表7.猪的基因型与猪群体繁殖性状的关联分析
注：*表示差异显著P<0.05，**表示差异极显著P<0.01。
结果发现，此SNP位点的不同基因型猪在总产仔数、活产仔数、断奶头数上差异极显著(P<0.01)，GG基因型猪的总产仔数、活产仔数、断奶头数均明显比AG基因型和AA基因型猪的高，并且GG基因型猪与AA基因型猪在总产仔数、活产仔数、断奶头数上均差异极显著(P<0.01)；AG基因型猪的总产仔数、活产仔数、断奶头数明显高于AA基因型猪，即GG基因型猪的繁殖性能比AA基因型和AG基因型猪的繁殖性能好，AG基因型猪比AA基因型猪的繁殖性能好。表明该SNP标记的AG基因型猪的繁殖能力显著高于AA基因型猪，而低于GG基因型猪。进一步证明了上述SNP标记与猪的繁殖性状显著相关。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (2)
1.一种SNP标记在猪选育中的用途，其特征在于，所述SNP标记为猪繁殖性状相关的SNP标记，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中该核苷酸序列自5’端起第31位碱基为A或G；所述SNP标记的AG基因型个体的繁殖能力显著高于AA基因型个体，而低于GG基因型个体；
所述猪繁殖性状包括猪的总产仔数，活仔数和/或断奶头数。
2.一种检测猪繁殖性状的方法，其特征在于，通过对待测猪进行SNP标记的检测，确定所述待测猪的繁殖性状，所述SNP标记为猪繁殖性状相关的SNP标记，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该核苷酸序列自5’端起第31位碱基为A或G；
所述猪繁殖性状包括猪的总产仔数，活仔数和/或断奶头数；
所述SNP标记的AG基因型个体的繁殖能力显著高于AA基因型个体，而低于GG基因型个体。
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