CN104846080B - 一种与猪产仔数相关的cnv标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与猪产仔数相关的CNV标记及其应用，所述CNV标记是指猪AHR基因(GenBank：NC_010451.3)候选区域内的拷贝数变异，所述CNV标记的拷贝数为1或2，表现为拷贝数缺失型和拷贝数正常型。对大白猪繁殖性状和拷贝数的关联分析显示，AHR基因不同拷贝数对其产仔数有显著影响，其中拷贝数为2的个体总产仔数和产活仔数极显著高于拷贝数为1的个体(P＜0.01)。本发明还提供了用于检测所述CNV标记的引物及含有该引物的试剂盒。本发明还提供了所述CNV标记在鉴定产仔数高的猪品种中的应用。本发明获得的CNV可作为大白猪产仔数性状的标记辅助选择的重要候选分子标记。

Description

一种与猪产仔数相关的CNV标记及其应用

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种与猪产仔数相关的CNV标记及其应用。

背景技术

猪繁殖性状是现代猪生产中重要的经济性状，繁殖性能的高低直接影响到猪场的生产效率和经济效益。同时繁殖性状是一个低遗传力的数量性状，容易受到环境条件的影响，其主要包括产仔数、产活仔数、初生重、初生窝重、20日龄窝重、断奶头数、断奶重和断奶窝重等指标，如何提高母猪繁殖性能是养猪业健康高效、可持续发展的关键，也是当前遗传育种研究的重点和热点。研究猪繁殖性状相关的基因的拷贝数变异对于揭示影响猪繁殖性能遗传机制和高繁殖力猪的选育具有重要意义。

自20世纪80年代以来，由于生物技术的发展，特别是人类基因组计划的启动(1991)，基因组DNA序列的遗传变异即分子多态性，被大量开发出来。除了限制性片段长度多态性(RFLP)、单核苷酸多态性(SNPs)、微卫星(Microsatellite)等这些常规的遗传标记外，新近在人类基因组中又发现了另外一类丰富的多态性来源—拷贝数变异(Copy numbervariations，CNVs)。CNVs是指基因组中与参考序列相比>1kb的DNA片段插入、缺失和/或扩增，及其相互组合衍生出的复杂染色体结构变异。相邻的、部分重叠的CNVs合并在一起成为一个更大的基因组片段成为拷贝数变异区间(Copy Number Variation Region,CNVR)。拷贝数变异具有基因组覆盖范围广(人类基因组上CNVs覆盖率约13％)、突变率高、分布于基因组特定位置、可遗传及相对稳定的特点。近年来国内外科学家的研究表明，CNVs广泛存在于正常个体的基因组中，其和一些遗传性疾病以及繁殖性状等复杂性状有着密切的关系，成为又一种重要的分子标记。

实时荧光定量PCR(qPCR)技术是一种常用的CNVs检测技术。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green荧光染料，SYBR Green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入DNA链中的SYBR分子不发射荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，进而通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对检测样本的目的基因(具有拷贝数多态)及参考基因(无拷贝数多态，2个拷贝)进行相对定量，根据2^-△△Ct方法统计检测样本候选基因的拷贝数。该方法具有简单易操作、成本低的优势，可以检测目的片段的绝对拷贝数，但不适用于大样本的高通量检测。

芳香烃受体(AHR,aryl hydrocarbon receptor)基因，在雌性哺乳动物生殖系统的各个器官中均有表达，在生殖过程中发挥着极其重要的作用。猪AHR基因位于9号染色体，Onteru等对猪繁殖性状的全基因组关联分析中定位出AHR基因与猪的繁殖性状有显著关联(Onteru et al.2012)，Jablonska等发现在母猪发情周期中，AHR基因在生殖系统和神经内分泌组织中表达显著不同，进而证明其参与了母猪繁殖功能的调节(Jablonska etal.2011)，Bosse等在对亚洲猪种对欧洲商业猪种基因渗入的研究中揭示了源自亚洲的AHR基因的非同义突变与欧洲商业猪种产仔数的提高相关(Bosse et al.2014)。

猪作为一种重要的经济动物和人类医学研究的模式动物，它的一些重要的经济性状如繁殖、生长、肉质、抗病等备受研究者们关注。因此，对猪基因组CNVs的检测，不仅有利于了解CNVs这一遗传变异对猪基因组的影响，而且为开展CNVs与经济性状和疾病表型之间的关联分析研究提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种与猪产仔数相关的CNV标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种与猪产仔数相关的CNV标记，是指猪AHR基因(GenBank：NC_010451.3)候选区域内的拷贝数变异，所述CNV标记的拷贝数为1或2。用于扩增所述CNV标记的引物对为：正向引物F：5’-ACTACCACCCATCTTCACCCG-3’和反向引物R：5’-CAACACACATCAATGCTTCCC-3’。

具体地，该区域拷贝数为1，则表现为拷贝数缺失型。该区域拷贝数为2的猪产仔数显著高于拷贝数为1的个体。

本发明还提供用于检测与猪产仔数性状相关的CNV标记的引物对，所述引物对为：正向引物F：5’-ACTACCACCCATCTTCACCCG-3’和反向引物R：5’-CAACACACATCAATGCTTCCC-3’。

本发明还提供用于实时荧光定量PCR检测前述与猪产仔数相关的CNV标记的试剂盒，所述试剂盒含有上述引物F和R。

优选地，所述试剂盒还包括2×SYBR Green qPCR Mix、去离子水、对照样本中的一种或几种。所述对照样本为已知无拷贝数变异的样品。

本发明还提供所述CNV标记在鉴定产仔数和产活仔数高的猪品种中的应用。

前述的应用包括以下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)以待测猪的基因组DNA为模板，利用引物F和R，进行实时荧光定量PCR检测猪基因组CNVs；

(3)根据猪基因组CNVs的检测结果，如果拷贝数为2，则待测猪表现为高产仔数和产活仔数；如果拷贝数为1，则待测个体表现为低产仔数和产活仔数。

步骤(2)中进行实时荧光定量PCR所使用的扩增体系以20μl计为：50ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，2×SYBR Green qPCR Mix 10μl，去离子水7μl。

进行实时荧光定量PCR采用的反应条件：1)预变性：95℃5分钟；2)扩增反应：95℃10秒，60℃10秒，72℃10秒，45个循环；72℃10分钟；3)绘制熔解曲线：95℃5秒，65℃1分钟，97℃10秒。

本发明进一步提供所述CNV标记在与猪产仔数性状相关的分子标记辅助育种中的应用。

前述的应用包括以下步骤：

1)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况，筛选到与猪产仔数性状相关的CNV标记；

2)利用SAS9.3软件将拷贝数与猪总产仔数和产活仔数等繁殖性状进行关联分析；

3)根据拷贝数进行高产仔数优势母猪的选育。

在本发明的实施例中，以猪AHR基因区域拷贝数变异位点为候选位点，通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在群体(大白猪484头、长白猪259头、杜洛克172头和梅山猪29头)中的拷贝数变异情况，并与大白猪总产仔数和产活仔数等繁殖性状进行关联分析；检测AHR基因候选位点的拷贝数变异，如果待测个体拷贝数为2，则待测猪属于总产仔数和产活仔数高的优势个体。

本发明对猪的AHR基因候选区域的拷贝数变异进行检测，并对该基因的拷贝数与奶猪的产仔性状进行关联分析，通过SAS9.3软件GLM过程进行线性模拟分析发现，拷贝数为2的个体的产仔数和产活仔数极显著高于拷贝数为1的个体(P<0.01)。该拷贝数变异位点的检出，为揭示猪产仔数分子机理和标记辅助选择的实施提供理论基础。

检测猪AHR基因拷贝数变异，将与产仔数相关的CNV作为分子标记，为猪的产仔性状标记辅助选择提供了科学依据。

本发明具有以下优点：

(一)本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别限制，可用于母猪的早期选育，甚至在刚出生时就可准确地进行后备母猪的筛选，从而提高养猪经济效益。

(二)检测猪AHR基因拷贝数变异的方法准确可靠，操作简便。

(三)猪AHR基因的拷贝数变异位点的检出，为猪产仔数的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

图1为本发明实施例1中进行qPCR绘制的扩增曲线。

图2为本发明实施例1中进行qPCR绘制的标准曲线。

图3为本发明实施例1中进行qPCR绘制的熔解曲线。

图4为本发明实施例2中杜洛克、长白、大白和梅山猪四个品种间AHR基因拷贝数的多重比较结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1与猪产仔数相关的CNV标记的获得

1、猪耳组织基因组DNA提取

本试验采用购自QIAGEN公司的血液与组织DNA提取试剂盒，从猪耳组织中提取基因组DNA，具体方法如下：

1)取小于25mg的耳组织置于2ml的离心管中，用手术剪刀充分剪碎；

2)加入180μl缓冲液ATL及20μl蛋白酶K，漩涡混匀，56℃消化2-4小时(每隔0.5小时混匀一次)至组织块消化完全；

3)加入200μl缓冲液AL，漩涡混匀，56℃消化10min；

4)加入200μl无水乙醇，漩涡混匀；

5)将消化液倒入吸附柱中，置于2ml离心管，8000rpm离心1min；

6)取出吸附柱并置于新的2ml离心管，加入500μl缓冲液AW1，8000rpm离心1min；

7)取出吸附柱并置于新的2ml离心管，加入500μl缓冲液AW2，14000rpm离心3min；

8)将吸附柱转移到新的2ml离心管中，加入100μl缓冲液AE，室温放置5-10min，8000rpm离心1min；

9)基因组DNA存在于离心管中溶液中，4℃保存备用或-20℃长期保存。

2、目标序列及参考序列的扩增

根据NCBI数据库收录的AHR基因(NC_010451.3)序列设计引物，正向引物F：5’-ACTACCACCCATCTTCACCCG-3’，反向引物R：5’-CAACACACATCAATGCTTCCC-3’。通过对标准品进行qPCR扩增，绘制标准曲线检测引物的扩增效率、扩增曲线和溶解峰来确定引物是否适用于qPCR分析。目标序列和内参序列的引物扩增效率在2.0(1.9-2.1)左右，3个倍比稀释而成的浓度梯度模板进行qPCR时，其扩增曲线有好的梯度，即DNA每稀释2倍，Ct值增加1左右(图1)；绘制的标准曲线3个点在一条直线上(图2)；绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图3)。

内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即胰高血糖素基因(Glucagon,GCG)中的一段147bp的序列，如NC_010457.4(GenBank)所示。正、反向扩增通用引物分别为：5’-GAATCAACACCATCGGTCAAAT-3’和5’-CTCCACCCATAGAATGCCCAGT-3’。

其中，实时荧光定量PCR反应体系以20μl计为：50ng/μl模板DNA1ul，10pmol/μl正、反向引物各1μl，2×SYBR Green qPCR Mix 10μl，去离子水7μl。

PCR反应条件为：(1)预变性：95℃5分钟；(2)扩增反应：95℃10秒，60℃10秒，72℃10秒，45个循环；72℃10分钟(3)绘制熔解曲线：95℃5秒，65℃1分钟，97℃10秒。

3、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列和参考序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2^-△△Ct方法进行拷贝数的分析。其中△△Ct＝(Ct目标序列-Ct参考序列)试验组-(Ct目标序列-Ct参考序列)对照组。试验组即为待检测有无CNVs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本。2^-△△Ct表示的是试验组目标序列的拷贝数相对于对照组的倍数。

当目标序列为正常(拷贝数为2)序列时，根据2^-△△Ct计算出归一化比值为1左右。目标序列存在单拷贝缺失时(拷贝数为1)，Ct值增加1，经2^-△△Ct计算归一化比值为0.5左右。目标序列为双拷贝缺失时(拷贝数为0)，即没有目标序列，经2^-△△Ct计算归一化比值为0左右。当目标序列为单拷贝增加时(拷贝数为3)，Ct值降低0.5左右，经2^-△△Ct计算归一化比值在1.5左右；双拷贝增加时(拷贝数为4)，其Ct值降低1，归一化比值为2左右，其他情况的拷贝数依次类推。

4、上述CNV标记在母猪选育中的应用

获得的CNV可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响猪产仔数相关的数量性状基因座，以对猪进行标记辅助选择，从而加快高产仔数母猪的选育进程。

实施例2猪不同拷贝数变异与产仔数的关联分析与检测应用

按照实施例1的方法，以采自河北邢台旺族种猪场及北京房山六马种猪的共944头母猪(大白484头、长白259头、杜洛克172头和梅山29头)为试验材料，以AHR基因(如NC_010451.3所示序列)区域拷贝数变异位点为候选区域，应用实时荧光定量PCR技术检测该位点在群体中的拷贝数变异情况。结果显示猪AHR基因候选区域存在拷贝数变异，变异范围为1-2，表现为正常拷贝数型和拷贝数缺失型。

将四个品种间AHR基因拷贝数的进行多重比较发现杜洛克、长白、大白和梅山猪四个品种间拷贝数差异显著，产仔数、活仔数差异也显著，两者变化趋势一致，说明可能是不同品种猪间AHR基因的拷贝数的差异，导致品种间产仔数的变化。结果如图4所示。

运用SAS9.3软件GLM过程进行线性模拟分析AHR基因拷贝数与大白猪繁殖性状(总仔数、活仔数、出生窝重、断奶仔猪数和妊娠天数)关联关系，采用的模型如下：

y＝c+p+Y+CNV+e

其中，y为表型值；c为场效应；p为胎次效应；Y为年效应；CNV为拷贝数效应；e为随机残差。结果显示，AHR因不同拷贝数对产仔数、活仔数有显著影响，如表1所示。

表1 AHR基因拷贝数和大白繁殖性状的关联分析(最小二乘均值±标准误)

注：P<0.05表示CNV位点2种拷贝数变异与性状存在显著相关，P<0.01表示存在极显著相关；P>0.05表示2种拷贝数变异与性状无显著性相关。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

Bosse M.,Megens H.J.,Frantz L.A.F.,Madsen O.,Larson G.,Paudel Y.,Duijvesteijn N.,Harlizius B.,Hagemeijer Y.,Crooijmans R.P.M.A.&Groenen M.A.M.(2014)Genomic analysis reveals selection for Asian genes in European pigsfollowing human-mediated introgression.Nature Communications5.

Jablonska O.,Piasecka J.,Ostrowska M.,Sobocinska N.,Wasowska B.&Ciereszko R.E.(2011)The expression of the aryl hydrocarbon receptor inreproductive and neuroendocrine tissues during the estrous cycle in the pig(vol 126,pg 221,2011).Animal Reproduction Science129,104-.

Onteru S.K.,Fan B.,Du Z.Q.,Garrick D.J.,Stalder K.J.&Rothschild M.F.(2012)A whole-genome association study for pig reproductive traits.AnimGenet43,18-26.

Claims (10)

1.一种与猪产仔数相关的CNV标记，其特征在于，所述CNV标记是指猪AHR基因候选区域内的拷贝数变异，所述CNV标记的拷贝数为1或2；

用于扩增所述CNV标记的引物对为：正向引物F：5’-ACTACCACCCATCTTCACCCG-3’和反向引物R：5’-CAACACACATCAATGCTTCCC-3’。

2.用于检测与猪产仔数性状相关的CNV标记的引物对，其特征在于，所述引物对为：正向引物F：5’-ACTACCACCCATCTTCACCCG-3’和反向引物R：5’-CAACACACATCAATGCTTCCC-3’。

3.用于实时荧光定量PCR检测权利要求1所述CNV标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×SYBR Green qPCRMix、去离子水、对照样本中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述对照样本为已知无拷贝数变异的样品。

6.权利要求1所述CNV标记在鉴定产仔数和产活仔数高的猪品种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)以待测猪的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物F和R，进行实时荧光定量PCR检测所述与猪产仔数相关的CNV标记；

(3)根据所述与猪产仔数相关的CNV标记的检测结果，如果拷贝数为2，则待测猪表现为高产仔数和产活仔数；如果拷贝数为1，则待测个体表现为低产仔数和产活仔数。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中进行实时荧光定量PCR所使用的扩增体系以20μl计为：50ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，2×SYBR GreenqPCR Mix 10μl，去离子水7μl。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中进行实时荧光定量PCR所采用的反应条件为：1)预变性：95℃5分钟；2)扩增反应：95℃10秒，60℃10秒，72℃10秒，45个循环；72℃10分钟；3)绘制熔解曲线：95℃5秒，65℃1分钟，97℃10秒。

10.权利要求1所述CNV标记在与猪产仔数性状相关的分子标记辅助育种中的应用。