CN110016506A - Adipor1基因在肝癌sbrt疗效评估中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了mRNA ADIPOR1可以作为肝癌立体定向放疗疗效评价的分子标志物。本发明研究证明肝癌立体定向放疗后mRNA ADIPOR1差异表达。本发明提供了一种可用于定量检测血液样本mRNAADIPOR1表达水平的便捷方法，可用于立体定向放疗后迅速判断肝癌预后以及后续治疗方案的辅助确定，对提高肝癌的生存率，降低死亡率有重要意义。本发明涉及mRNA ADIPOR1、与其对应的分离的多核苷酸、特异性结合的寡核苷酸引物对、mRNA芯片、试剂盒，还涉及实时定量检测血液中对应mRNA的方法。

Description

ADIPOR1基因在肝癌SBRT疗效评估中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学的应用领域。具体地说，本发明涉及mRNAADIPOR1、与其对应 的分离的多核苷酸、与其特异性结合的寡核苷酸引物对、mRNA芯片、试剂盒，还涉及用所述试剂盒定量检测血液中对应mRNA的方法。

背景技术

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率分别排名全国恶性肿瘤第 4位和第2位。乙型、丙型肝炎病毒感染、黄曲霉素、饮酒、非酒精性脂肪肝肝、肥胖等因 素是肝癌的危险因素。目前，原发性肝癌的治疗方法多样，其中手术治疗包括根治性外科切 除、肝脏移植；非手术治疗，包括局部消融治疗、动脉化疗栓塞、基因分子靶向治疗、系统 性化疗、放疗等。手术切除已被证实是使肝癌患者长期存活的最优治疗方案。然而，超过70％ 的原发性肝癌患者由于肿瘤的部位、大小、数量以及肝功能受损而无法接受肝脏切除手术。 因此非手术疗法在肝癌治疗中的地位不言而喻。对于不可手术切除或无法接受外科手术的肝 癌患者，NCCN指南推荐外照射放疗作为治疗手段之一。随着计算机、放疗和影像技术的发 展，放疗技术的飞速发展使精确放疗成为可能，体现在靶区足够精准、射线剂量集中释放于 肿瘤靶区消灭肿瘤，其清除肿瘤的效果近似于“手术刀”般精准。从三维适形放射治疗开始， 放射治疗越来越多地被用于原发性肝癌的治疗。目前，原发性肝癌的放射治疗包括一系列先 进的技术，如调强放射治疗，体部立体定向放射治疗，粒子治疗等。目前的精准外照射技术 可以确保肿瘤局部给予高剂量照射，同时保护剩余正常肝脏组织免受或仅受到低剂量照射。 此外，外照射放疗适用于肝脏几乎所有位置的肿瘤。体部立体定向放射治疗(SBRT)，也可 作为消融/TACE等治疗手段的替代方案，消融/TACE等治疗失败后的选择方案，或者消融/ TACE禁忌证患者的治疗选择。

目前临床应用的超声检查、CT检查、核磁共振检查等手段能从不同角度对肝脏肿瘤的放 疗疗效进行判断，然而，到目前为止，放疗疗效的评估主要依赖于局部控制率和转归，如完 全治愈CR、部分治愈PR、稳定SD、进展PD等，总生存期(OS)，无病生存期(DFS)，无进展生存期(PFS)等指标，目前尚没有基于个体的、实时评估放疗疗效的生物学指标。因而，寻找出若干具有临床价值的生物标志物，判定其用于评价的效能，是研究人员关注已久的问题。

肿瘤标志物(tumor marker，TM)是指在恶性肿瘤的发生和增殖过程中，因肿瘤细胞的 相关基因表达或机体对肿瘤产生反应而异常变化的一类物质。其随着肿瘤的发生和发展进行 变化，主要表现为体液中某种正常活性物质的异常增多或者异常物质的出现。因此，肿瘤标 志物水平能在一定程度上反映出肿瘤细胞的增殖程度，并在肿瘤的诊断、治疗、预后判断中 起到重要的作用。肿瘤标志物检查简便易行，对身体伤害小，仅需要少量血液或者其他体液 即可做相关检测。

肿瘤是由环境因素和遗传因素相互作用所导致的一类疾病，从正常组织、癌前病变到恶 性肿瘤，多种mRNA参与了肿瘤的发生和发展。mRNA的作用在多种肿瘤中已被证实，但是 目前关于mRNA的研究主要集中于肿瘤与正常组织的比较，而已有的文献报道显示组织中的 mRNA表达水平与血液中的mRNA表达水平并不相同，两者并非都存在相关关系，这是因为 组织中的mRNA表达水平主要反映的是肿瘤局部组织的表达量，而血液中的mRNA则是机 体整体的表达情况。对于实施治疗后静脉血中mRNA水平变化是否对癌症预后以及治疗方案 的确定有指示作用仍有待研究，尤其是在SBRT治疗后肝癌患者血液中的mRNA的变化尚未 见报道。

发明内容

本发明的目的：为了弥补现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种可用于立体定 向放疗后迅速判断肝癌预后的分子标志物，并辅助确定后续治疗方案。

发明内容：本发明实验研究发现肝癌患者SBRT治疗后ADIPOR1基因表达升高，且升高 比例不高于0.5838时，患者预后较好。据此可认为ADIPOR1基因可作为肝癌SBRT治疗的预后 标志物，可以开发判断肝癌SBRT预后的工具。

通过使用上述定量检测血液样本中mRNAADIPOR1的方法，可分别采集肝癌患者SBRT 治疗前和治疗后的血样，检测ADIPOR1的表达水平。筛选出放疗后较放疗前ADIPOR1表达上 调，且变化比例高于0.5838的样本，可视为SBRT治疗后肝癌预后差的对象，建议改变SBRT 治疗策略，及时行进一步放疗疗程，或建议进行SBRT之外的其它治疗方案。若放疗后较放疗 前ADIPOR1升高比例低于0.5838，可认为SBRT疗效较好。

此方法方便简捷，通过对定量检测出的患病个体在SBRT治疗前后血液样本中上述mRNA 的表达量进行比较，利于在SBRT治疗后早期判断预后并予以积极预防和及时治疗，对提高肝 癌的生存率，降低死亡率有重要意义。

本发明所使用的肝癌血液样本有以下纳入标准：

1.小肝癌(≤5cm)或大肝癌(5-10cm)，肝功A级或B级；

2.未经任何治疗的首诊SBRT患者，80Gy＜BED＜100Gy；

3.无化疗等严重影响血液指标的其他综合治疗。

所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。

本发明包括下述技术方案：

第一方面的技术方案提供了一种mRNA，所述的mRNA具有如SEQ ID NO：1所示的序列。

另外，还提供了第一方面技术方案所述的mRNA的用途，用于制备用于定量检测血液样 本中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的mRNA的寡核苷酸引物对、mRNA芯片或试剂盒。

第二方面的技术方案提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸能转录成第一方面技术 方案所述的具有如SEQ ID NO：1所示的序列的mRNA。

第三方面的技术方案提供了寡核苷酸引物对，所述的寡核苷酸引物对特异性地结合于第 一方面技术方案所述的具有SEQ ID NO：1所示的序列的mRNA。

优选地，所述的寡核苷酸引物对具有如SEQ ID NO：3-4所示的序列。所述SEQ IDNO：3 -4分别对应为SEQ ID NO：1所示的mRNA的上游和下游引物的序列。

第四方面的技术方案提供了一种mRNA芯片，所述的mRNA芯片包括：固相载体；以及固定在所述固相载体上的第三方面技术方案所述的寡核苷酸引物对。优选地，所述的寡核苷 酸引物对具有如SEQ ID NO：3-4所示的序列。

另外，还提供了所述mRNA芯片的用途，用于制备用于定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的mRNA的试剂盒。

第五方面的技术方案提供了一种用于定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO：1所示的序 列的mRNA的试剂盒，所述的试剂盒中含有第三方面技术方案所述的寡核苷酸引物对或第四 方面技术方案所述的mRNA芯片。优选地，所述的寡核苷酸引物对具有如SEQ IDNO：3-4所 示的序列。

第六方面的技术方案提供了一种定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的 mRNA的方法，使用第三方面技术方案所述的寡核苷酸引物对、第四方面技术方案所述的 mRNA芯片、或第五方面技术方案所述的试剂盒。优选地，所述的寡核苷酸引物对具有如SEQ ID NO：3-4所示的序列。

在本发明中，筛选mRNA的研究步骤简述为在得到肝癌样本原始测序数据并预处理后， 筛选出肝癌SBRT治疗前后基因表达变化一致的mRNA，结合治疗后3个月的随访数据，从中 筛选SBRT治疗后差异表达且有治疗价值的mRNA，再通过绘制ROC曲线评价mRNA作为肝癌患者SBRT预后标志物的能力。

另外，本发明针对上述筛选出的mRNA ADIPOR1，设计了可与其特异性结合的具有SEQ ID NO：3-4的序列的寡核苷酸引物对，进而获得包括固相载体以及固定在所述固相载体上的 寡核苷酸引物对的mRNA芯片、含有上述寡核苷酸引物对或上述mRNA芯片的试剂盒。

通过使用上述的寡核苷酸引物对、mRNA芯片、或试剂盒，本发明通过对血液样本提取 的RNA进行逆转录PCR和PCR，提供了一种定量检测血液样本中ADIPOR1基因表达水平改变 的便捷方法。此方法可用于SBRT治疗后迅速检测肝癌预后以及后续治疗方案的辅助确定，具 体参见下文介绍。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护 范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护 范围之内。本发明属于分子生物学领域，在实施例中，包括了很多常用试剂、常规方法，故 实施例中出现的试剂不仅限于列出的试剂供应商品牌。下述实施例中所使用的实验方法如无 特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂商所建议的条件与实验步骤。

实施例1.筛选SBRT治疗前后具有共同变化特征的mRNA

通常地，采集临床血液样本用于RNA检测使用的是EDTA抗凝管。但由于RNA的不稳定性，在采血后的几分钟内，血液中RNA转录水平急剧降低，处理过程中的变异因素会导致试验结果不稳定。本研究中，我们使用了Paxgene Blood RNA Tube(Qiagen，No./ID：762165)(简 称BRT管)采集临床血样，该采血管中添加了特殊试剂，可以快速地保护细胞内的RNA不 被降解，在18～25℃可以保存3天，2～8℃可以保存5天，-20/-80℃条件下保存8年。因此， 可以为样本分析前处理提供准确的测试，并为实验使用提供有效性。此外，为保证实验结果 的准确性和可靠性，我们使用了与之配套的试剂盒(PAXgene Blood RNA Kit；Cat No./ID： 762174)进行后续实验研究，而非常规使用的Trizol法提取血液白细胞中的总RNA。

我们采集肝癌患者SBRT治疗前、治疗后1(出院前)和治疗后2(1.5-2个月)血样进行高通量测序，筛选出SBRT治疗后具有共同变化特征的mRNA，筛选标准为q value(即校 正后的p value)＜0.05且|log2FC|＞1。

一.高通量测序实验步骤：

1.样品采集和保存

1.1采血纳入标准：

(1)小肝癌(≤5cm)或大肝癌(5-10cm)，肝功A级或B级；

(2)未经任何治疗的首诊SBRT患者，80Gy＜BED＜100Gy；

(3)无化疗等严重影响血液指标的其他综合治疗。

1.2采血流程

(1)使用前，将BD公司的PAXgene Blood RNA Tube(货号：762165)正立放置于室温；

(2)采集血样，2管/人，2.5mL/管；

(3)血样采集后，立即将采血管上下颠倒混匀(十次)，将采血管正立置于塑料试管架 上，室温放置2h；

(4)室温放置2h后先于-20℃放置24h，然后转移至-80℃长期保存。

2.RNA分离和质控(由Novogene实验部完成)

2.1RNA分离

实验步骤：(试剂盒参考：PAXgene Blood RNA Kit；Cat No./ID：762174)

(1)离心收集，将全血转入BRT管中，3000-5000g，室温，离心10min(注意：确保全血在BRT管中室温下孵育至少2h，使其充分裂解)

(2)去上清，加入4mlRNase-free water到中心沉淀中，用新的BD Hemogardclosure盖 上盖子(注意：弃上清时不要破坏沉淀，并用干净纸干燥管壁)

(3)涡旋振荡直到沉淀完全溶解，3000-5000g，室温，离心10min，去上清(注意：上清清除不完全会抑制裂解并且会稀释裂解所得产物，因此会影响RNA与膜结合。)

(4)加350μl resuspension buffer(BR1)，涡旋振荡直至沉淀消失

(5)将样品转移到1.5ml离心管(MCT)，加300ulbindingbuffer(BR2)加40μlprotrninase K(PK)涡旋混匀5秒，在恒温振荡器中55度孵育10min，转数400-1400rpm，孵育完成后 提前准备65度金属浴为第20步做准备(注意：BR2和PK要分开加)

(6)将裂解产物转入PAXgene Shredder spin column(PSC)中，置于2mlprocessing tube (PT)，12000g离心3min(注意：产物因全部转移，并所用转速不要高于20000g)

(7)取上清到新1.5ml离心管中，不要吸到沉淀

(8)加350μl无水乙醇，涡旋混匀，微型离心机离心1-2秒使盖子管壁上液体落到底部。 (注意：离心不要超过1-2秒，不然会影响总产量)

(9)取700μl混合物到PAXgene RNA spin column(PRC，红色)装到2mlPT中，12000g离心1min，将PCR放到新PT中，弃掉旧管。

(10)重复9，将剩下的混合物都通过PRC

(11)取350μlwashbuffer 1(BR3)到PRC中，12000g离心1min，将PCR放到新PT 中，弃掉旧管。

(12)加10μl预先配置DNaseI(RNFD)和70ul DNAdigestion buffer(RDD)到1.5离心 管中，轻轻混匀(注意：DNaseI对物理损伤敏感，应轻轻混匀，避免涡旋振荡。此步骤可根据样品数做相应倍数混合母液)

(13)取上述混合液80μl到PRC中，室温孵育15min(注意：上述混合液应该完全加入到PRC管中心的膜上，避免加到管壁否则会影响DNA的消化)

(14)加350μl wash buffer1(BR3)到PRC中，12000g离心1min，将PCR放到新PT 中，弃掉旧管。

(15)加500μl wash buffer2(BR4)到PRC中，12000g离心1min，将PCR放到新PT 中，弃掉旧管。(注意：BR4使用前确保乙醇已经加入)

(16)加500μl wash buffer2(BR4)到PRC中，12000g离心3min

(17)弃掉有液体的PT旧管，将PCR放到新PT中12000g离心1min

(18)弃掉有液体的PT旧管，将PCR放到新1.5ml离心管MCT中，加入40μl elutionbuffer (BR5)到PRC管中心膜上，12000g离心1min洗脱RNA(注意：此步骤很关键，影响整个RNA产量，因此要确保buffer完全加到膜上)

(19)重复步骤18中的洗脱步骤，即再加入40ul的BR5离心到同一离心管中

(20)将洗脱下的产物在65℃下孵育5min后立即放冰上。(注意：此步骤将RNA变性为下游实验做准备，时间温度不要随意改变)

(21)如果RNA产物不立即使用须放置于-80℃保存。

2.2RNA定量和质控

(1)在1％琼脂糖凝胶上监测RNA降解和污染。

(2)使用分光光度计(IMPLEN，CA，USA)检查RNA纯度。

(3)使用QubitFlurometer(Life Technologies，CA，USA)中的 RNAAssay Kit测量RNA浓度。

(4)使用Bioanalyzer 2100系统的RNA Nano 6000 Assay Kit(AgilentTechnologies，CA， USA)评估RNA完整性。

3.文库制备和测序

3.1测序的文库制备

每个样品的总量为3μg RNA用作RNA样品制备的输入材料。首先，通过EpicenterRibo-zero TM rRNA去除试剂盒(Epicentre，USA)除去核糖体RNA，并通过乙醇沉淀清除 无rRNA残基。随后，按照制造商的推荐，使用 Ultra^TM Directional RNA LibraryPrep Kit (NEB，USA)，使用rRNA耗尽的RNA产生测序文库。简而言之，在NEBNext 第一链合成反应缓冲液(5X)中在升高的温度下使用二价阳离子进行断裂。使用随机六聚体 引物和M-MuLV逆转录酶(RNaseH-)合成第一链cDNA。随后使用DNA聚合酶I和RNase H进行第二链cDNA合成。在反应缓冲液中，用dUTP替换dTTP的dNTP。通过核酸外切酶/聚合酶活性将剩余的突出端转变为平端。在DNA片段的3′末端腺苷酸化后，连接具有发夹环结构的NEBNext衔接子以准备杂交。为了选择优选长度为150～200bp的cDNA片段，用AMPure XP系统(Beckman Coulter，Beverly，USA)纯化文库片段。然后使用3μlUSER 酶(NEB，USA)与大小选择的接头连接的cDNA在37℃下15分钟，然后在95℃下在PCR 之前5分钟。然后用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶，Universal PCR引物和Index(X) Primer进行PCR。最后，产品经过纯化(AMPure XP系统)，并在Agilent Bioanalyzer 2100 系统上评估了库质量。

3.2聚类和测序

根据制造商的说明，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumia)在cBotCluster Generation System上进行索引编码样本的聚类。在簇生成后，将文库在IlluminaHiseq 4000 平台上测序，并产生150bp的配对末端读数。

二.高通量测序数据分析(由Novogene基因调控部完成)

1.质量控制

fastq格式的原始数据(原始读取)首先通过内部perl脚本处理。在此步骤中，通过删 除包含适配器的读取，读取包含ploy-N和从原始数据读取的低质量读取来获得干净数据(干 净读取)。同时，计算了清洁数据的Q20，Q30和GC含量。所有下游分析均基于高质量的清洁数据。

2.比对到参考基因组

参考基因组和基因模型注释文件直接从基因组网站下载。使用bowtie2 v2.2.8构建参考 基因组的索引，并使用HISAT2(Langmead，B，et al.)v2.0.4将配对末端清洁读数与参考基 因组比对。HISAT2使用′--rna-strandness RF′运行，其他参数设置为默认值。

3.转录组装配

每个样品的映射读数由StringTie(v1.3.1)(Mihaela Pertea，et al.2016)在基于参考的方 法中组装。StringTie使用新的网络流算法以及可选的从头组装步骤来组装和定量代表每个基 因座的多个剪接变体的全长转录物。

4.编码潜力分析

4.1CNCI(编码-非编码-索引)(v2)描述邻接的核苷酸三联体，以有效区分蛋白质编码和非编码序列，而不依赖于已知的注释(Sun，et al.2013)。我们使用CNCI和默认参数。

4.2CPC(编码潜力计算器)(0.9-r2)主要通过评估转录物中ORF的范围和质量，并用 已知的蛋白质序列数据库搜索序列以阐明编码和非编码转录物(Kong，et al.2007)。我们使 用了NCBI真核生物的蛋白质数据库，并在我们的分析中设置了电子值′1e-10′。

4.3PFAM-SCA。在所有三个可能的框架中翻译了每个转录本并使用Pfam Scan(v1.3) 来识别Pfam数据库中记录的任何已知蛋白质家族域的出现(第27版；使用Pfam A和Pfam B) (Punta，et al.2012)。任何具有Pfam命中的抄本将在以下步骤中排除。Pfam搜索使用-E 0.001 --domE 0.001的默认参数(Bateman，et al.2002)。

4.4PhyloCSF(系统发育密码子替换频率)(v20121028)检查了保守编码区比对特征的进 化特征，例如同义密码子取代和保守氨基酸取代的高频率，以及其他错义和无意义取代的低 频率来区分蛋白质编码和非编码转录本(Lin，et al.2011)。构建多物种基因组序列比对，并 使用默认参数运行phyloCSF。

4.5Phast(v1.3)是一个包含大量统计程序的软件包，大多数用于系统发育分析(Siepel， et al.2005)，而phastCons是保守元素的保护评分和识别程序。我们使用phyloFit计算物种 间保守和非保守区域的系统发育模型，然后将模型和HMM转换参数提供给phyloP，以计算 编码基因的一组保守分数。

4.6基因表达水平的定量。使用Cuffdiff(v2.1.1)计算每个样品中编码基因的FPKM (Trapnell，C.et al.2010)。通过对每个基因组中转录物的FPKM求和来计算基因FPKM。 FPKM表示基于片段长度计算的每百万个外显子每百万个片段的片段，并且读取计数比对到 该片段。

4.7差异表达分析。Ballgown套件包括用于交互式探索转录组装配的功能，转录物结构 的可视化和每个基因座的特征特异性丰度，以及对注释特征的组装特征的事后注释(Alyssa C. Frazee，et al.2014)。具有P-adjust＜0.05的转录物被指定为差异表达的。Cuffdiff提供了统计 程序，用于使用基于负二项分布的模型确定数字转录物或基因表达数据中的差异表达(Trapnell，C.et al.2010)。具有P-adjust＜0.05的转录物被指定为差异表达的。

5.高通量测序差异基因筛选结果

筛选q value(即校正后的p value)＜0.05且SBRT治疗后|log2FC|＞1的差异表达的基因。 共得到28个放疗后1(出院前)升高/降低，并在放疗后2(1.5-2个月)仍保持升高/降低的 mRNA。其中，保持升高的mRNA共16个，保持降低的mRNA共12个。见表1。

表1.肝癌SBRT治疗后1(出院前)和治疗后2(1.5-2个月)较治疗前保持升高/降低的mRNA

实施例2.对SBRT治疗后血液样本的实时PCR定量检测

对接受SBRT治疗的肝癌患者(50％为大肝癌，50％为小肝癌)，取其SBRT治疗前、治疗后1(出院前)和治疗后2(1.5-2个月)的血样，采血纳入标准和采血流程同实施例一， 对血样进行实时PCR定量检测。

实验步骤具体为：

一.全血RNA的提取

因所有血样的采集均使用Paxgene Blood RNA Tube(货号：762165)，为保证实验结果的 准确性和可靠性，我们使用了与之配套的试剂盒(PAXgene Blood RNA Kit；CatNo./ID： 762174)进行全血RNA的提取，而非常规使用的Trizol法提取血液白细胞中的总RNA。

方法同实施例1。

二.逆转录反应：

1.按下列组份配制RT反应液(反应液配制请在冰上进行)。

2.轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下：

37℃ 15min(反转录反应)

85℃ 5sec(反转录酶的失活反应)

4℃ (保存)

三.高通量荧光定量QPCR检测

1.上机使用的模板稀释倍数：10倍

2.检测仪器：StepOnePlus^TM实时荧光定量PCR

3.QPCR检测试剂盒参考：TB Green^TM Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)(Takara， Code No.RR820A)

4.引物设计：根据Genbank中ADIPOR1基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR 扩增引物，由上海启因生物科技有限公司合成。具体引物序列如下：

ADIPOR1基因：

正向引物为5’-ACTTGTTGAACCAGAATGGTCTC-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-TCCACTTCTCTACCTGCTTGTC-3’(SEQ ID NO.4)，

GAPDH基因：

正向引物为5’-CAATGACCCCTTCATTGACC-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物为5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’(SEQ ID NO.6)。

5.PCR反应体系：

PCR反应条件：

95℃ 30s 1cycle

95℃ 5s 40cycles

60℃ 30s 40cycles

CT检测限：40个循环

6.结果计算：采用比较阈值法计算结果，即目的基因的量＝2-ΔΔCt，在该公式中，Ct 指的是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，首先将所有基因Ct值整理好，用每一 组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是ΔCt，然后将每一组样 本每一个目的基因的ΔCt减去对照组样本的ΔCt，并同时对所有结果取相反数(就是加一个 负运算)该步运算得到的结果就是-ΔΔCt，即目的基因的表达量。

本研究qPCR技术创新点在于我们未采用常规的“三步法”，而使用了“两步法”进行PCR反应：95℃预变性，酶激活30s；95℃变性，5s；60℃退火延伸，30s，变性退火延伸共 40个循环。这样既能节省PCR反应时间，又能降低引物错配率，提高引物特异性。

实施例3.结合临床病历，评价预后价值

1.收集临床采血的SBRT治疗的肝癌患者资料，随访3个月，复查经SBRT治疗后3个月的肝脏病灶大小，判断肝癌三个月转归情况(CR，PR，SD或PD)，将CR与PR归为SBRT 有效组，SD与PD归为SBRT无效组。

2.结合qPCR定量结果，将疗效分组与ADIPOR1变化差值倍数做关联性分析，观察SBRT 治疗后1(出院前)vs治疗前和治疗后2(1.5-2个月)vs出院前，ADIPOR1的比例变化在有 效组和无效组中是否有差异。计算公式为：治疗后vs治疗前的比例变化＝(SBRT治疗后1- 治疗前)/治疗前或(SBRT治疗后2-治疗前)/治疗前。(结果见表2)。

表2.ADIPOR1在SBRT治疗后两个不同阶段的有效组和无效组中的差值变化情况

结果显示ADIPOR1放疗后1(出院前)vs放疗前的差值变化比在有效组和无效组中存在 显著差异(P＜0.05)，而ADIPOR1在放疗后2(1.5-2个月)vs放疗前的变化比例在有效组和 无效组中差异无统计学意义(P＞0.05)。表明检测SBRT治疗后1(出院前)的血样和SBRT 治疗前的血样中ADIPOR1的变化比例，对判断肝癌SBRT治疗后3个月的转归情况，有一定的指导意义。

依据疗效分组和肝癌患者SBRT治疗前、治疗后1(出院前)的qPCR检测结果，使用Medcalc软件绘制ROC曲线，根据灵敏度、特异度、约登指数和ROC曲线下面积AUC值评 价ADIPOR1作为肝癌SBRT预后生物标志物的能力。ROC分析结果显示：SBRT治疗后1 (出院前)vs治疗前的变化比例在有效组无效组的区分中，ADIPOR1的曲线下面积AUC为 0.896，灵敏度100％，特异度为83.33％，约登指数0.83。(结果见表3)。

上述结果提示肝癌患者SBRT治疗后1(出院前)血样中的mRNA ADIPOR1作为肝癌患者SBRT三个月转归情况预后标志物的能力较强，提示，ADIPOR1可用作SBRT治疗后出院 前血液检测用的mRNA以预测肝癌SBRT治疗后转归情况。

表3 ADIPOR1在肝癌SBRT治疗后1vs治疗前的ROC分析

结合表2和表3可知，ADIPOR1在肝癌患者SBRT治疗完成后出院前较治疗前表达上调，且在无效组中上调比例高于有效组，使用ADIPOR1，区分SBRT治疗后有效组无效组的 最佳阈值是0.5838，其意义在于，患者SBRT治疗后出院前血样检查若提示ADIPOR1升高， 且升高比例高于0.5838，则SBRT治疗后三个月转归情况较差；若升高比例低于0.5838，则 疗效较好。

另外，患者出院前医院会例行抽血做出院前检查，监测SBRT治疗后出院前这个时间点 上ADIPOR1的变化情况可及时有利地帮助确定是否患者预后较好，并且辅助判断患者是否 需要进一步放疗疗程，为临床总体治疗方案的确定提供可靠的辅助参考。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰， 皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (9)

1.mRNA ADIPOR1作为分子标记物以及在肝癌立体定向放疗疗效评价中应用。

2.权利要求1所述的mRNA ADIPOR1，其特征在于mRNA ADIPOR1序列为SEQ ID NO：1，用于制备定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的mRNA寡核苷酸引物对、mRNA芯片或试剂盒。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸能转录成权利要求1所述的具有如SEQ ID NO：1所示的序列的mRNA。

4.寡核苷酸引物对，其特征在于，所述的寡核苷酸引物对特异性地结合于权利要求1所述的具有SEQ ID NO：1所示的序列的mRNA。

5.权利要求4所述的寡核苷酸引物对，其特征在于，所述的寡核苷酸引物具有如SEQ IDNO：3-4所示的序列。

6.一种mRNA芯片，其特征在于，所述的mRNA芯片包括：

固相载体；以及固定在所述固相载体上的权利要求4所述的寡核苷酸引物对。

7.权利要求6所述的mRNA芯片的用途，其特征在于，用于制备用于定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的mRNA的试剂盒。

8.一种用于定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的mRNA的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求4所述的寡核苷酸引物对或权利要求6所述的mRNA芯片。

9.一种定量检测血液样本中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的mRNA的方法，其特征在于，使用权利要求4所述的寡核苷酸引物对或权利要求6所述的mRNA芯片或权利要求8所述的试剂盒进行PCR定量检测。