CN111304322B - 四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法，所述四个novel circRNA，其序列分别见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。检测四种novel circRNA_1、2、3和4四个基因在食管癌患者和正常人血液中的表达情况，并在组织中得以验证，通过荧光定量PCR最佳体系实现对novel circRNA_1、2、3和4基因的检测，结果显示novel circRNA_1、2、3、4的联合检测具有诊断意义，能够用于食管癌诊断、治疗效果评估或预后情况评估。

Description

四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法。
背景技术
食管癌(esophageal cancer,EC)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，是指原发于食管上皮的恶性肿瘤。我国是食管癌高发国家，发病率排全球前五，远高于亚洲和世界平均水平。虽然我国多年以来一直非常重视食管癌的诊治工作，但90％确诊的EC患者均为中晚期，5年生存率不足20％，相关研究表明，吸烟、饮酒、微量元素缺乏、遗传等因素都与食管癌发病有关。因此，深入了解肿瘤发生发展的分子机制，补充和完善现有的细胞癌变理论体系，有助于为食管癌的防、诊、治提供重要的理论依据。
环状RNA(circRNA)是继小RNA和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)后，RNA家族又一逐渐被人们认识的一种新的内源性非编码RNA，对基因表达的调控起重要作用，成为RNA领域的一个新的研究热点。circRNA的3’和5’末端连接形成共价闭合的环状结构，没有传统线性RNA的5’帽结构及3’多聚腺苷酸尾，该结构使其在细胞内表达较线性RNA更稳定。早在20世纪70年代，Sanger等就发现植物类病毒中存在单链环状RNA，随后又有研究者相继在酵母线粒体等多处中发现circRNA。但由于检测技术的局限性，当时circRNA被认为是外显子转录本发生错误剪接形成的实验干扰产物，并未引起人们重视。
circRNA在基因调控中发挥重要作用，如作为miRNA海绵吸附miRNA、调控相关基因表达、表达多肽等。这些功能使circRNA在肿瘤中的作用受到广泛关注，越来越多的学者致力于circRNA的研究，不断深入探讨其在肿瘤发生发展中的作用机制，力求在肿瘤的诊断和治疗中寻找新的突破。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法，其中：所述四个novel circRNA，其序列分别见SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。
作为本发明所述的四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述试剂盒包括所述四个novel circRNA的检测引物，所述四个novelcircRNA的检测引物分别为：novel circRNA_1：Forward5'-ctgaataacaagttgggactg-3'、Reverse 5'-agcatcatagtcatactccaca-3'；novel circRNA_2：Forward 5'-ggaagtgcagaccaatgagc-3'、Reverse 5'-atggccacagcttatgctcca-3'；novel circRNA_3：Forward 5'-gaccaaattaccctaatccag-3'、Reverse5'-caacttctttgactttcgtgtcat-3'；novel circRNA_4：Forward 5'-ctggataatggtgaatggaata-3'、Reverse 5'-gtataagtgttgtcagtcac-3'。
作为本发明所述的四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述检测，包括提取RNA、逆转录和PCR扩增。
作为本发明所述的四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述检测，包括提取人血液RNA。
作为本发明所述的四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法的一种优选方案：提取人血液RNA后，进行逆转录至cDNA，逆转录反应条件为37℃15min、85℃5s、4℃∞。
作为本发明所述的四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述PCR扩展，其反应体系为，阶段1：50℃2min，1次循环；阶段2：95℃10min，1次循环；阶段3：95℃15s，60℃1min，40次循环；阶段4：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s，1次循环。
作为本发明所述的四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述四个novel circRNA检测血液RNA的AUC分别为0.75、0.75、0.87和0.79，四个circRNA的联合检测的灵敏度达到92％以上。
作为本发明所述的四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述检测食管癌，包括食管癌诊断、治疗效果评估、预后情况评估。
本发明的有益效果：本发明同时检测新发现的四种novel circRNA_1、2、3和4四个基因在食管癌患者和正常人血液中的表达情况，并在组织中得以验证，通过荧光定量PCR最佳体系实现对novel circRNA_1、2、3和4基因的检测，结果显示novel circRNA_1、2、3、4的联合检测具有诊断意义，能够用于食管癌诊断、治疗效果评估或预后情况评估。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为novel circRNA_1、2、3和4基因融解曲线图。
图2为novel circRNA_1、2、3、4在食管癌患者及正常人血液表达情况。
图3为食管癌患者及正常人血液ROC曲线图。
图4为novel circRNA_1、2、3、4、5和6在食管癌病人癌组织与癌旁组织中的表达情况。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明novel circRNA_1、2、3、4基因在食管癌和正常人血液的表达情况，并在组织中进行验证。通过检测四个circRNA的表达，比较分析，能够用于食管癌早期发现的辅助诊断或评价食管癌进展及预后情况。
通过预先对食管癌病人癌组织和癌旁组织进行RNA测序，筛选与食管癌相关的差异表达的circRNA，发现了四个新的环状RNA在食管癌患者血清中呈现异常表达。四个新的环状RNA分别为：novel circRNA_1、2、3、4：
novel circRNA_1的序列为(SEQ ID NO：1)：
gatgagatccccactggaatgccatgcctggagtcagtgaccataggtgatgatatttgggatgagaactggttacctctacaggctaagatgggaaaaggaggtgatgctgcctcccatctatttactgcaagccttggtggaaagaatcagtattcatcatgtaaagaaatgccacagaaggactggtgtttttctacccctaaagatacatgggatgattcttggcagccttcaggccttgtaaatggaacgaaagtagaagttcataagccagaagtactgggtgctcaggaaaaaaatactggcacaaacaggactcaaaag
novel circRNA_1由TDRD5基因剪切而成，位于人1号染色体正链179662104-179663491区域。
novel circRNA_2的序列为(SEQ ID NO：2)：
aaactggtcgccactaatacgaaagcattcagggaaaacacatctgcacaacagcatttacgaaattctgcccatttccttaagctacacgaagtgttaccatctcagtcatcttcatgaacaaatacagtactttactcaaaagcttctcaatagaaatgttaatctcataacagttctggctgtagtcatggccagttttcattttattaagcatattctagaattacaaccttgtcaaataaattgtaactgtatcaacattcacaggtacagtataacacacatcctttcttcctctttaacaagaccaaacatatgcatacagagtggcccaaattttaaaaagtttaaaaaaagttttcaatccaggaaaagtattg
novel circRNA_2由NEK7基因剪切而成，位于人1号染色体负链198320588-198320970区域。
novel circRNA_3的序列为(SEQ ID NO：3)：
gtgaaaaggattcaatgatttttgattgtactgaatgctatgatccagttactaaacagtggacaactgtagcttcgatgaatcatccccgctgcggcttaggagtgtgtgtgtgttatggggctatctatgctttgggtggatgggttggagctgagatagggaacaccattgaacgatttgatcctgatgaaaataaatgggaagtagttggtaacatggctgtgtcacgctactactttgggtgctgtgaaatgcaaggtttaatttatgtaattgggggcatcagcaatgaaggaatagaacttcgttcttttgaagtctatgatccactttctaagcgttggtctccacttcctccaatgggaaccaggagagcatatcttggtgtggctgcactcaatgactgcatctattctgttggaggatggaatgagacccaagatgctcttcatactgtagaaaaatattcctttgaagag
novel circRNA_3由IPP基因剪切而成，位于人1号染色体负链45714246-45719340区域。
novel circRNA_4的序列为(SEQ ID NO：4)：
gataaatttatttaccatttggctccagttgaaaaatcacatggcagactgcaaaacagaacatcaagatcacaaaagaaaaaatccaagtcacctgagagaagtaaatactgtataaatgcaaaaaactacgaacagcctacaatttcttcaaaatcacactctccatctccctacacaaaaagacgcatgtgtgagctatctgaagacaccaggcggcggctggcccatttaaatctgggaccctatgagttcaaaaaagaaacagataaacctccatttgtgattagacatgttgatcccccaagtcccagggctgatactttattgggatcttctggaagagactgtgaaagagatggatggtcaagggtgcacaatgatcattctcatcttggctgctgccgacccaaggattataaggttatcaggacaccccatgggagagacttcgatgactctttagaaaaatgtgaagagtatttgagcccaaggtcgtgtagtaagccccggcattcagcgaggaccttgctagtccattcagcaccctcaacaatgccaaagcattctccaagccctgtgttaaatagagcttctctcagggaaagatttcattctgattggtgttcaccttcaaactgcgatgagatccatgaccgggtaaaaaatgtcttgaaatcacatcaggctcatcaaagacatttatat
novel circRNA_4由SPATA6基因剪切而成，位于人1号染色体负链48355670-48399644区域。
novel circRNA_5的序列为：
ctagaagaaagcagagtgccagggagtgagattgcatccctgggcttagaagtgacggagagaagacttgtttagtattttgccatcagcacaaggaaaaccaggagagagtctgcctccaggactctgagccttctgcctcgtatgttcagaaggtggataggtcttcccactccagcatggcttgaactcttaggggtctgcagtgctccatctccattggtggccccagctca
novel circRNA_5由SZRD1基因剪切而成，位于人1号染色体正链16396055-16396290区域。
novel circRNA_6的序列为：
ctgaaggtgttttgtggggctaaaagcccccaaaacatgaaatggacatgtaacaccacctggatcccccatagcaggccagaccactctggcgagcactgctggtctgcccaaatctgggtaatcagactgggtattcattggctgcatttcaaagcacagcactgctttcagccaggatgaagtgggagtgaacccagctgctagcagagctgccactccaggctgagagccaagtaccagccactgccagtgaagactggcccctttactgaagggagttgttcagagtccagccaccggccctggggagggagagaagtcagggtattctgctcggggatggtcagggctccgcagctccatcgccagcatcctttggaaagccgcctctggcggagacagccggctgggggggcgctccaggtttggctgagacgttctagttggaacagaaaggaaaaaagtgaggctgggaggcaaggccttggattaggccccacaaggatgtggccatttggcatttggatagtattaactttttcgaaacctctcaccagatcaaaggaggttagggataaagcggcggagacatacttcccccctccagggtaagctagggcttggccagcctagccagtgggcagaccccaccccaccccagcccagcccagggtgggcactaaccccgccaccagccggctccgggcgccggcggcccagctgccgtaac
novel circRNA_6由clorf122基因剪切而成，位于人1号染色体负链37808687-37809419区域。
Figure BDA0002326670270000051
Figure BDA0002326670270000061
检测novel circRNA_1、2、3、4基因，采用的实验方法包括提RNA、所述的引物、逆转录和定量PCR反应条件。
检测novel circRNA_1、2、3、4，分别使用食管癌和正常人血液提RNA，检测novelcircRNA_1、2、3、4的表达情况，并在组织中进行验证。血液/组织RNA提取时分别采用了TIANGEN公司RNAprep Pure Hi-Blood(tissue)Kit RNAprep Pure试剂盒。
检测novel circRNA_1、2、3、4，获得RNA浓度后，进行逆转录至cDNA，逆转录反应条件为37℃15min、85℃5s、4℃∞。
检测novel circRNA_1、2、3、4，逆转录后，获得的cDNA进行荧光定量PCR检测，通过PCR反应体系：阶段1：50℃2min，1次循环；阶段2：95℃10min，1次循环；阶段3：95℃15s，60℃1min，40次循环；阶段4：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s，1次循环，可获得较好的融解曲线，可获得较好的融解曲线。
novel circRNA_1、2、3、4具有诊断意义，能够用于食管癌诊断、治疗效果评估或预后情况评估。
为实现以上目的，进一步鉴定与食管癌进展相关的circRNA并探索其功能与机制，我们收集了30例食管癌患者和30例正常人血液，15例食管癌患者和15例正常人组织，见表1-6。其中食管癌患者的选择标准如下：(1)是病理上确诊的患者(所有患者都是通过镜检，活组织切片检查或手术得到的材料进行显微镜检查而确认的)；(2)患者没有其他的肿瘤病史。组织是在患者诊断过程中，且尚未接受任何治疗(手术或化疗)时采集的。本发明的实验方法为对30例食管癌患者和正常人血液进行RNA提取、逆转录、荧光定量PCR，并在组织中进行验证。对数据结果进行分析发现，与正常组相比，novel circRNA_1、2在食管癌患者血液中表达量显著上调(P＜0.05)，novel circRNA_3和4在食管癌患者血液中表达量显著下调(P＜0.01)，见图2，在组织中验证结果同样如此，与癌旁组相比，novel circRNA_1、2在食管癌患者癌组织中表达量显著上调(P＜0.05)，novel circRNA_3和4在食管癌患者血液中表达量显著下调(P＜0.01)。novel circRNA_5、6作为对照，也考察了其在食管癌患者癌组织和癌旁组织中的表达水平，novel circRNA_5、6在在食管癌患者癌组织和癌旁组织中的表达水平差异不显著(P>0.05)。见图4。对检测结果进行ROC曲线分析，结果显示血液中novelcircRNA_1、2、3和4基因诊断食管癌的曲线下面积(AUC)分别为0.75、0.75、0.87和0.79，其灵敏度和特异性分别均在75％以上(见图3)，四种circRNA的联合检测能够提高食管癌的检测灵敏度至92％以上，从而达到准确检测的目的，上述结果整体说明了novel circRNA_1、2、3和4基因在食管癌患者血液和组织中表达情况，并能够作为食管癌诊断及预后的指标。
实验材料：
30例食管癌患者及30例正常人血液样本；
15例食管癌患者及30例癌旁组织样本。
为了实现上述发明目的，本发明所采取的操作方法，其特征在于，
①获得待检血液和组织样本；
②从待检血液和组织样本中提取RNA；
③对于获得的RNA进行逆转录至cDNA；
④对于获得的cDNA通过qPCR法进行检测。
⑤四条novel circRNA_1、2、3、4为：
Figure BDA0002326670270000071
实施例1：
RNA提取：
待检血液和组织样本来自于癌症患者及正常人，所述的癌症为食管癌。血液(组织)RNA提取时采用了TIANGEN公司RNAprep Pure Hi-Blood(tissue)Kit RNAprep Pure试剂盒。
待检血液和组织样本中RNA提取步骤为：
(一)血液RNA提取：
(1)红细胞裂解液的稀释：根据处理血液样品的体积选取适当体积的10×红细胞裂解液H(例如待处理的血液样品体积为200μL，则取140μL 10×红细胞裂解液H)，用RNase-Free ddH2O稀释至1×红细胞裂解液H；
(2)向(1)体积人类全血中加5倍体积1×红细胞裂解液H(需自备合适的干净管子)；
(3)在冰上孵育10-15min，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次；
(4)4℃，2,100rpm(～400×g)离心10min，将上清完全去除；
(5)向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液H(加入1×红细胞裂解液H的体积是第1步中全血用量的2倍)，重悬细胞；
(6)4℃，2,100pm(400×g)离心10min，将上清完全去除；
向白细胞沉淀中加入裂解液RLH(使用前请加入β-巯基乙醇)涡旋或使用移液器混匀；
将溶液转移至过滤柱CS中(过滤柱CS放在收集管中)，12,000pm(-13,400×9)离心2min，弃去过滤柱CS，收集滤液；
向滤液中加入1倍体积70％乙醇(通常为350μL或600μL)，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR4中(吸附柱CR4放入收集管中)，12,000rpm(-13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
如果不进行DNase消化，可以直接向吸附柱CR4中加入700μL去蛋白液RW1H(使用前先检查是否已加入乙醇)，12,000pm(-13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，直接进行步骤(14)。
DNase I消化：向吸附柱CR4中加入350μL去蛋白RW1H，12,000rpm(-13400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中；
(11)DNase I工作液配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL的RDD溶液，轻柔混匀；
(12)向吸附柱CR4中加入80μL DNase I工作液，室温放置15min；
(13)向吸附柱CR4中加入350μL去蛋白液RW1H，12,000rpm离心30-60s，弃废液，将吸附柱CR4放回收集管中；
(14)向吸附柱CR4中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心30-60s，弃废液，将吸附柱CR4放回收集管中；
(15)重复(14)步骤；
(16)12,000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱CR4置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余漂洗液；
(17)将吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μLRNase-Free H2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液；(注：洗脱体积不少于30μL)。
(二)组织提取RNA：
(1)匀浆处理：每10-20mg组织加300μL裂解液RL，用研磨杵将组织研磨；随后向匀浆中加入590μLRNase-Free H2O和10μLProteinase K，混匀后56℃处理10-20min；
(2)12,000rpm离心2-5min，取上清进行一下操作；
(3)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀(可能出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放入收集管)，12,000rpm离心30-60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
(4)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(5)DNase I工作液配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL的RDD溶液，轻柔混匀；
(6)向吸附柱CR3中加入80μL DNase I工作液，室温放置15min；
(7)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(8)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(9)重复(8)步骤；
(10)12,000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余漂洗液；
(11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μL RNase-Free H2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液；(注：洗脱体积不少于30μL)。
实施例2：
逆转录反应体系
逆转录反应体系如下：
逆转录反应体系成分 使用量
RT mix 4.0μL
总RNA 1μg
无RNA酶的ddH2O 加ddH2O至总反应体系为16μL
实施例3：
qPCR操作反应体系
qPCR操作反应体系如下：
反应体系成分 使用量
Mix 5.0μL
F 0.5μL
R 0.5μL
H2O 2.0μL
无RNA酶的ddH2O 2.0μL
总体积 10.0μL
逆转录反应条件为：37℃15min、85℃5s、4℃∞；荧光定量PCR反应条件为阶段1：50℃2min，1次循环；阶段2：95℃10min，1次循环；阶段3：95℃15s，60℃1min，40次循环；阶段4：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s，1次循环。
实施例4：
结果验证与分析
本发明数据处理方法：使用7500PCR仪器最佳PCR程序扩增出目的基因并分析导出数据得到novel circRNA_1、2、3和4基因的融解曲线图。通过计算ROC曲线下面积(AUC)可以评估每个基因的诊断能力。利用GraphPad绘制基因表达情况图。所有的统计分析都是在R语言和统计计算环境下完成的(R version 2.15.1；R Foundation for StatisticalComputing)。
采用的本发明的操作方法，包括提RNA、所述的引物、逆转录和定量PCR反应条件，检测食管癌患者和正常人血液中novel circRNA_1、2、3、4的表达情况，可以获得较好的融解曲线。见图1。图1中A、B、C和D分别为novel circRNA_1、2、3和4在食管癌患者和正常人血液及组织中的融解曲线。
荧光定量PCR结果显示，与正常组相比，novel circRNA_1、2在食管癌患者血液中表达量显著升高(P＜0.05)，novel circRNA_3和4在食管癌患者血液中表达量显著降低(P＜0.01)。见图2。
novel circRNA_1、2、3和4在食管癌患者和正常人血液中的ROC曲线和曲线下面积(AUC)，其诊断值分别为0.75、0.75、0.87和0.79。见图3.
利用食管癌病人癌组织和癌旁组织中进行验证。与癌旁组织相比，novelcircRNA_1、2在食管癌患者癌组织中表达量显著升高(P＜0.05)，novel circRNA_3和4在食管癌患者血液中表达量显著降低(P＜0.01)。其结果与食管癌病人血清的一致。novelcircRNA_5、6作为对照，也考察了其在食管癌患者癌组织和癌旁组织中的表达水平，novelcircRNA_5、6在在食管癌患者癌组织和癌旁组织中的表达水平差异不显著(P>0.05)。见图4。novel circRNA_5的引物为Forward5'-gactgcctgtccctgatatc-3'，Reverse 5'-aatccgcagcctctgcagtg-3'；
novel circRNA_6的引物为Forward 5'-gagacttcaatagatgatgg-3'，Reverse5'-tctggctcaagatcgaaata-3'。进一步证明novel circRNA_1、2、3、4可以区分食管癌组织与癌旁组织，可用于食管癌的辅助诊断，并可评价食管癌的治疗效果和预后情况。
进一步分析novel circRNA_1、2、3、4、5和6与食管癌患者性别、年龄、TNM分期、组织分化程度、远处转移关系，结果发现，Novel circRNA_1、2、3、4在癌组织中表达水平与患者TNM分期、组织分化、远处转移相关(Novel circRNA_1P值分别为0.024，0.019和0.031；Novel circRNA_2P值分别为0.019，0.023和0.028；Novel circRNA_3P值分别为0.018，0.021和0.017；Novel circRNA_4P值分别为0.030，0.025和0.015)，而与其他临床参数无明显相关，NovelcircRNA_5、6与临床参数无明显相关，见表1-6。
表1 Novel circRNA_1临床分析结果
Figure BDA0002326670270000121
表2 Novel circRNA_2临床分析结果
Figure BDA0002326670270000122
表3 Novel circRNA_3临床分析结果
Figure BDA0002326670270000123
Figure BDA0002326670270000131
表4 Novel circRNA_4临床分析结果
Figure BDA0002326670270000132
表5 Novel circRNA_5临床分析结果
Figure BDA0002326670270000133
Figure BDA0002326670270000141
表6 Novel circRNA_6临床分析结果
Figure BDA0002326670270000142
本发明具有如下优点：本发明同时测定novel circRNA_1、2、3和4四个基因在食管癌患者和正常人血液中的表达情况，并在组织中得以验证，通过荧光定量PCR最佳体系实现对novel circRNA_1、2、3和4基因的检测，结果显示novel circRNA_1、2、3、4的联合检测具有诊断意义，能够用于食管癌诊断、治疗效果评估或预后情况评估。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 徐州市肿瘤医院
<120> 四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgagatcc ccactggaat gccatgcctg gagtcagtga ccataggtga tgatatttgg 60
gatgagaact ggttacctct acaggctaag atgggaaaag gaggtgatgc tgcctcccat 120
ctatttactg caagccttgg tggaaagaat cagtattcat catgtaaaga aatgccacag 180
aaggactggt gtttttctac ccctaaagat acatgggatg attcttggca gccttcaggc 240
cttgtaaatg gaacgaaagt agaagttcat aagccagaag tactgggtgc tcaggaaaaa 300
aatactggca caaacaggac tcaaaag 327
<210> 2
<211> 383
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaactggtcg ccactaatac gaaagcattc agggaaaaca catctgcaca acagcattta 60
cgaaattctg cccatttcct taagctacac gaagtgttac catctcagtc atcttcatga 120
acaaatacag tactttactc aaaagcttct caatagaaat gttaatctca taacagttct 180
ggctgtagtc atggccagtt ttcattttat taagcatatt ctagaattac aaccttgtca 240
aataaattgt aactgtatca acattcacag gtacagtata acacacatcc tttcttcctc 300
tttaacaaga ccaaacatat gcatacagag tggcccaaat tttaaaaagt ttaaaaaaag 360
ttttcaatcc aggaaaagta ttg 383
<210> 3
<211> 482
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaaaagga ttcaatgatt tttgattgta ctgaatgcta tgatccagtt actaaacagt 60
ggacaactgt agcttcgatg aatcatcccc gctgcggctt aggagtgtgt gtgtgttatg 120
gggctatcta tgctttgggt ggatgggttg gagctgagat agggaacacc attgaacgat 180
ttgatcctga tgaaaataaa tgggaagtag ttggtaacat ggctgtgtca cgctactact 240
ttgggtgctg tgaaatgcaa ggtttaattt atgtaattgg gggcatcagc aatgaaggaa 300
tagaacttcg ttcttttgaa gtctatgatc cactttctaa gcgttggtct ccacttcctc 360
caatgggaac caggagagca tatcttggtg tggctgcact caatgactgc atctattctg 420
ttggaggatg gaatgagacc caagatgctc ttcatactgt agaaaaatat tcctttgaag 480
ag 482
<210> 4
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gataaattta tttaccattt ggctccagtt gaaaaatcac atggcagact gcaaaacaga 60
acatcaagat cacaaaagaa aaaatccaag tcacctgaga gaagtaaata ctgtataaat 120
gcaaaaaact acgaacagcc tacaatttct tcaaaatcac actctccatc tccctacaca 180
aaaagacgca tgtgtgagct atctgaagac accaggcggc ggctggccca tttaaatctg 240
ggaccctatg agttcaaaaa agaaacagat aaacctccat ttgtgattag acatgttgat 300
cccccaagtc ccagggctga tactttattg ggatcttctg gaagagactg tgaaagagat 360
ggatggtcaa gggtgcacaa tgatcattct catcttggct gctgccgacc caaggattat 420
aaggttatca ggacacccca tgggagagac ttcgatgact ctttagaaaa atgtgaagag 480
tatttgagcc caaggtcgtg tagtaagccc cggcattcag cgaggacctt gctagtccat 540
tcagcaccct caacaatgcc aaagcattct ccaagccctg tgttaaatag agcttctctc 600
agggaaagat ttcattctga ttggtgttca ccttcaaact gcgatgagat ccatgaccgg 660
gtaaaaaatg tcttgaaatc acatcaggct catcaaagac atttatat 708

Claims (3)

1.一种四个novel circRNA的定量联合检测试剂在制备诊断食管癌的试剂盒中的应用，其特征在于：所述四个novel circRNA，其序列分别见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4所示；检测的样本为人血液。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测试剂，包括提取RNA、逆转录和PCR扩增的试剂。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述检测试剂，包括提取人血液RNA的试剂。
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