CN114717303B - 基于多重pcr及高通量测序技术检测成骨不全症相关基因的引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测领域，特别涉及基于多重PCR及高通量测序技术检测成骨不全症相关基因的引物组、试剂盒及应用。本发明提供的基于高通量测序技术检测成骨不全基因的多重PCR特异性引物，检测基因范围包含IFITM5、WNT1、FKBP10、CRTAP、COL1A1和COL1A2基因全部外显子检测；能够同时检测多个样本、多个成骨不全易感基因，有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤等。

Description

基于多重PCR及高通量测序技术检测成骨不全症相关基因的 引物组、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及基于多重PCR及高通量测序技术检测成骨不全症相关基因的引物组、试剂盒及应用。

背景技术

成骨不全症(osteogenesis imperfecta，OI)又名脆骨病，是最常见的单基因遗传性骨病，是由于多种致病基因突变导致骨基质蛋白数量减少或质量异常，从而引起以骨量低下、骨骼脆性增加和反复骨折为主要特征的骨骼疾病。多数呈常染色体显性遗传，少数呈常染色体隐性遗传，罕有X染色体伴性遗传。

骨骼主要由有机质和无机质组成。Ⅰ型胶原蛋白(type I collagen，COL1)是骨有机质中含量最多的成分，占骨有机质的90％以上，对于维持骨结构的完整性和骨生物力学性能至关重要。OI的发病机制是多种致病基因突变导致Ⅰ型胶原代谢异常，其数量减少或结构异常，引起皮质骨变薄、骨小梁纤细、骨小梁呈现不规则状、网格状或鱼鳞状，从而导致骨密度显著降低、骨微结构损害、骨生物力学性能异常，最终引发反复骨折和进行性骨骼畸形。目前已报道的OI致病基因有21种，其中Ⅰ型胶原的α1链和α2链编码基因COL1A1或COL1A2突变是导致OI的最主要原因，呈常染色体显性遗传。新生儿OI患病率约为1/20 000～1/15000，但我国OI的患病率尚有待进一步的流行病学调查。

由于OI的致病基因及其突变谱复杂多样，导致疾病的临床表型轻重不一。患者的主要临床表现是自幼起病的轻微外力下反复骨折、骨骼畸形，不同程度活动受限。患者可有蓝巩膜、韧带松弛、牙本质发育不良、听力下降、心脏瓣膜病变等骨骼外表现。OI的影像学特征主要包括：全身多部位骨质稀疏；颅板变薄，囟门和颅缝增宽，枕骨可有缝间骨，颅底扁平；脊柱可有侧弯或后凸畸形，椎体呈变形，可有多椎体压缩性骨折；胸廓可扭曲、变形，甚至塌陷；四肢长骨纤细、骨皮质菲薄，骨髓腔相对较大，干骺端增宽，多发长骨骨折，骨骼弯曲畸形等。根据临床病情轻重，OI分成Ⅰ～Ⅴ型：Ⅰ型最轻，最常见；Ⅱ型最重，通常围生期死亡；Ⅲ型是存活者中最严重的，常有身材矮小和骨骼畸形；Ⅳ型严重度介于Ⅰ型与Ⅲ型之间。Ⅴ型OI具有独特的临床特征，包括肥厚性骨痂、桡骨头脱位、前臂骨间膜钙化、桡骨干骺端下密集骺线等表现。临床上可依据骨折严重度、发病时间、巩膜颜色、是否有牙本质发育不全等进行判定。近年来，随着分子生物学的研究进展，又发现了多种新型OI。

OI患者可以进行骨密度、骨骼X线及骨代谢生化指标检查来评估疾病的严重程度，并有助于鉴别诊断。必要时可以进行基因突变检测，进一步明确分子诊断。基因诊断为OI精准诊疗的重要手段，有利于基因突变的鉴定、疾病的准确分型、揭示发病机制、促进遗传咨询。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了基于多重PCR及高通量测序技术检测成骨不全症相关基因的引物组、试剂盒及应用，可以高效率、低成本的诊断或鉴别诊断成骨不全症，及时的进行治疗干预。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了引物组合，包括但不限于：

(I)、具有如SEQ ID No.1～SEQ ID No.316所示核苷酸序列的引物；或

(II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括如下组合中的一种或两者以上：

组合X：

(1)、上游引物具有如SEQ ID No.(2X-1)所示的核苷酸序列；和

(2)、下游引物具有如SEQ ID No.(2X)所示的核苷酸序列；和

(3)、如(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(4)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；

其中，X选自1～158中的任意整数。

在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。

第二方面，本发明还提供了所述的引物组合在制备扩增、检测或筛选成骨不全症相关基因或其突变的试剂、试剂盒、系统和/或装置中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述成骨不全症相关基因包括但不限于IFITM5、WNT1、FKBP10、CRTAP、COL1A1或COL1A2中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增、检测或筛选包括第一步骤和第二步骤；

所述第一步骤的反应体系包括：

所述第二步骤的反应体系包括：

在本发明的一些具体实施方案中，所述第一步骤的扩增程序包括：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火3min，72℃延伸90s，进行18个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存；

所述第二步骤的扩增程序包括：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行12个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。

第三方面，本发明还提供了扩增、检测或筛选成骨不全症相关基因或其突变的试剂、试剂盒、系统和/或装置，包括本发明所述引物组合，以及可接受的辅料、助剂、载体、模块或部件。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂、试剂盒、系统和/或装置检测的所述成骨不全症相关基因包括但不限于IFITM5、WNT1、FKBP10、CRTAP、COL1A1或COL1A2中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂，如通用引物、Index、dNTPs、高保真DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等；还可以含有标准品和/或对照品。

第四方面，本发明还提供了成骨不全症相关基因或其突变的扩增、检测或筛选方法，取待测样本与所述引物组合或所述试剂、试剂盒、系统和/或装置中的引物组合混合后扩增，检测。

在本发明的一些具体实施方案中，基于多重PCR及高通量测序技术检测成骨不全基因致病变异的检测方法，包括以下步骤：

1)使用磁珠法核酸自动提取仪对待测样本进行核酸提取，然后使用Nanodrop进行浓度及纯度的测定，所得的每个标本基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀均位于1.7-2.0之间，浓度要求大于20ng/ul，体积大于50ul，备用；DNA短期可2-8℃保存，长期可在-20℃保存，避免反复冻融。

2)目标基因富集PCR：

用所述特异性引物及试剂盒中的其他相关试剂配制如下反应体系，按照如下PCR反应程序对所提取的DNA的目标区域进行PCR扩增，备用；

反应体系：

PCR扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火3min，72℃延伸90s，进行18个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。

3)第二轮index标记PCR:

将第一轮PCR中的Pool1、Pool2和Pool3的扩增产物等量混合，用所述index引物及试剂盒中的其他相关试剂配制如下反应体系，按照如下PCR反应程序进行indexPCR扩增，备用；

反应体系：

PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行12个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。

4)纯化及定量质控

使用磁珠法对第二轮PCR中扩增产物进行纯化，将纯化后的扩增子文库使用Qubit4.0进行浓度测定，记录文库浓度。Bioptic公司Standard Cartridge Kit(S2)试剂盒进行片段长度测定，若片段长度主要分布在300-500bp，质检合格，定量混样，上机测序；若长度分布不是主要集中在300-500bp，质控不合格，重复建库并质检，空白质控组(BC)应为不合格，无需测序上机，否则代表有核酸污染。

5)上机测序平台

上述检测方法中的检测样本包含但不限于血液、石蜡包埋组织和冰冻切片组织等。高通量测序平台包含但不限于Illumina NovaSEQ、Life的PGM/S5平台、华大基因的MGI2000/DNBT7等测序平台。

本发明提供的基于高通量测序技术检测成骨不全基因的多重PCR特异性引物，检测基因范围包含IFITM5、WNT1、FKBP10、CRTAP、COL1A1和COL1A2基因全部外显子检测；能够同时检测多个样本、多个成骨不全易感基因，有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤等。

本发明利用高通量基因测序技术突破传统检测技术的限制，提高检测灵敏度；同时还能检测包括已知突变和未知突变位点的变异情况，得到全面准确的检测结果，通过对成骨不全致病基因及其突变位点进行测序，可得到具体的基因序列信息，进而评估成骨不全的遗传风险，指导成骨不全患者或高风险人群的干预和治疗，同时通过对基因检测结果的分析，确定遗传方式，对患者家庭成员的患病风险，携带着风险，子代患病风险等作出科学评估，指导科学婚育，从源头上预防成骨不全出生缺陷。

本发明采用磁珠法核酸自动提取仪提取和纯化核酸的方式，省去了传统离心柱式纯化，操作简单，可以同时处理批量样本，大大提升了检测通量；其次，本发明针对高通量测序平台设计的引物通过选取温度梯度、时间梯度、循环数经过大量正交实验，优化PCR反应程序，保证了引物的特异性和检测准确性；而且本发明方法用引物直接在目标基因链中捕获目标区域并进行扩增，传统对目标基因的高通量测序，需要进行基因组DNA打断，修复加尾，连接接头构建基因组文库，同时还需要通过生物素探针设计和杂交捕获富集目标区域等一系列复杂流程处理，处理周期大约需要2-3天时间，本发明从DNA提取到目的基因富集建库仅需3个小时，相比较杂交捕获富集脱靶率(通常在30-50％之间)，本发明通过特异性引物扩增富集目标基因，富集比例更高，脱靶率低于20％，节省了检测时间和成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示样本1的结果注释位点Sanger验证结果；

图2示样本2的结果注释位点Sanger验证结果：其中，a示FKBP10基因Chr17：41819527位置的验证结果；b示FKBP10基因Chr17：41817155位置的验证结果；

图3示样本3的结果注释位点Sanger验证结果；

图4示样本4的结果注释位点Sanger验证结果；

图5示样本5的结果注释位点Sanger验证结果；

图6示样本6的结果注释位点Sanger验证结果；

图7示引物组合Pool-1对8个质控品DNA的扩增电泳检测结果：M为Marker；泳道1～8依次为样品1～8；

图8示引物组合Pool-2对8个质控品DNA的扩增电泳检测结果：M为Marker；泳道1～8依次为样品1～8；

图9示引物组合Pool-3对8个质控品DNA的扩增电泳检测结果：M为Marker；泳道1～8依次为样品1～8。

具体实施方式

本发明公开了引物组合及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的多重PCR特异性引物包括158对特异性引物，分成三个Pool，Pool-1包含54对引物(SEQ ID NO.1～108)，Pool-2包含55对引物(SEQ ID NO.109～218)，Pool-3包含49对引物(SEQ ID NO.219～316)，具体序列如表1所示。

所述特异性引物对是按照Primer Premier 5.0引物设计软件或NCBI数据库提供的在线引物设计软件设计的引物对，本发明选用的引物对特异性强，引物之间退火维度差异小于3摄氏度，扩增效果好，所有的特异性引物均为修饰引物(如硫代修饰，间臂修饰等)，引物之间不易形成二聚体，不形成发夹结构，通用引物与模板之间不发生错配。

本发明提供的检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1试剂盒及检测方法

本发明提供了基于多重PCR及高通量测序技术检测成骨不全基因致病变异的试剂盒，检测成骨不全基因包括IFITM5、WNT1、FKBP10、CRTAP、COL1A1和COL1A2。

试剂盒包括如表1所示的特异性引物。

本发明提供的试剂盒除了表1所示引物之外，还包括PCR反应常用的酶和试剂，如通用引物、Index、dNTPs、高保真DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等；还可以含有标准品和/或对照品。

所述的特异性引物对信息如下表1所示。

表1引物信息

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当表1中序列与序列表中不一致时，以表1中记载的序列为准。

本发明还提供了基于多重PCR及高通量测序技术检测成骨不全基因致病变异的检测方法，包括以下步骤：

1)使用磁珠法核酸自动提取仪对待测样本进行核酸提取，然后使用Nanodrop进行浓度及纯度的测定，所得的每个标本基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀均位于1.7-2.0之间，浓度要求大于20ng/uL，体积大于50uL，备用；DNA短期可2-8℃保存，长期可在-20℃保存，避免反复冻融。

2)目标基因富集PCR

用所述特异性引物及试剂盒中的其他相关试剂配制如下反应体系，按照如下PCR反应程序对所提取的DNA的目标区域进行PCR扩增，备用；

表2反应体系

PCR扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火3min，72℃延伸90s，进行18个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。

3)第二轮index标记PCR

将第一轮PCR中的Pool-1、Pool-2和Pool-3的扩增产物等量混合，用所述index引物及试剂盒中的其他相关试剂配制如下反应体系，按照如下PCR反应程序进行indexPCR扩增，备用；

表3反应体系

PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行12个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。

Index F引物序列为：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[XXXXXXXX]ACACTCTTTCCCTACACGACGC

其中XXXXXXX为I5端8碱基标签序列。

Index R引物序列为：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[XXXXXXXX]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT

其中XXXXXXX为I7端8碱基标签序列。

通用正向引物序列为CCTACACGACGCTCTTCCGATCT。

通用反向引物序列为TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。

4)纯化及定量质控

使用磁珠法对第二轮PCR中扩增产物进行纯化，将纯化后的扩增子文库使用Qubit4.0进行浓度测定，记录文库浓度。Bioptic公司Standard Cartridge Kit(S2)试剂盒进行片段长度测定，若片段长度主要分布在300-500bp，质检合格，定量混样，上机测序；若长度分布不是主要集中在300-500bp，质控不合格，重复建库并质检，空白质控组(BC)应为不合格，无需测序上机，否则代表有核酸污染。

5)上机测序平台

上述检测方法中的检测样本包含但不限于血液、石蜡包埋组织和冰冻切片组织等。高通量测序平台包含但不限于Illumina NovaSEQ、Life的PGM/S5平台、华大基因的MGI2000/DNBT7等测序平台。

实施例2

1、获取生物样品及核酸提取

对从医院或其他研究机构获得的血样、唾液或其他组织样本，利用磁珠法提取各血液样本中基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀均位于1.7-2.0之间，浓度不少于20ng/微升，总量不少于1微克。

2、目标基因富集PCR:

由于158对引物所扩增的区域有距离太近或者相互重叠的干扰，将引物对分成三组，分别以Pool-1、Pool-2、Pool-3为引物进行PCR扩增，按照表4的PCR反应体系进行第一步PCR扩增试剂配置，先将所需试剂加入到一个新的离心管中，试剂配置完成后混匀离心分装到96孔PCR版中，备用。

表4反应体系

PCR扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火3min，72℃延伸90s，进行18个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。

PCR结束后分别将每个样本的Pool-1、Pool-2和Pool-3扩增产物等体积混合，混匀离心后备用。

3、第二轮index标记PCR:

按照表5的PCR反应体系进行第二步PCR扩增试剂配置，先将Amplification mix与灭菌水按照实际用量加入到离心管中，混匀离心后分装到96孔PCR版中，再加入index F和R引物，混匀离心后备用。

表5反应体系

PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行12个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。

4、纯化

1)第二步PCR扩增结束后，向每个样本的PCR反应液中加入45uL纯化磁珠，室温孵育5min。

2)将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，小心移除上清。

3)PCR管保持在磁力架上，加入150μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，放置30s后，移除上清。

4)重复步骤5一次。

5)PCR管保持在磁力架上，开盖室温静置5min。

6)将PCR管从磁力架中取出，加入25uL TE溶液，涡旋振荡混匀，室温静置5min。

7)将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置2min，移取上清至新PCR管中。

5、文库质检

文库使用Qubit 4.0进行浓度测定，记录文库浓度。使用Bioptic公司StandardCartridge Kit(S2)试剂盒按照标准操作流程进行片段长度分析。

6、文库pooling上机测序

将所用index引物不同的样本(即所包含的index序列是唯一的)按照文库浓度结果，将各样本按照总质量相等的比例进行混合，混匀离心后对pooling文库再次质检，然后按照高通量测序仪上样量要求和仪器标准测序流程进行测序。

7、数据分析及结果注释

通过数据分析和结果注释，筛选出在1000g、Exac以及Gnomad数据库中频率小于5％的位点(频率的筛选主要依据疾病在人群中的发病率)，并通过一代测序验证其准确性(图1～6)。

表6结果注释位点

样本

基因

染色体

位置

参考序列碱基

突变碱基

基因型

样本1

COL1A1

Chr17

50190553

C

G

C/G

样本2

FKBP10

Chr17

41819527

C

G

C/G

样本2

FKBP10

Chr17

41817155

C

T

C/T

样本3

COL1A2

Chr7

94425625

G

A

G/A

样本4

COL1A1

Chr17

50191450

G

A

G/A

样本5

IFITM5

Chr11

299405

G

A

G/A

样本6

CRTAP

Chr3

33114391

A

G

A/G

8、引物稳定性和准确性验证

为了验证体系的稳定性以及分型结果的准确性，我们对6例随机成骨不全病人血液样本提取的DNA，分别采用市场上比较常见和认可的IDT外显子测序试剂盒与本发明实施例1所述的检测试剂盒分别进行建库测序，然后对其进行突变位点检测分析。最后结果表明，利用该试剂盒得到的目标区域的基因型与IDT外显子测序试剂盒中该区域的基因型完全相同。说明该方法针对该区域的的准确性检测与安捷伦等全外显子测序相当。以下仅展示检测到的突变位点。

表7样本1

基因

染色体

位置

Ref

Alt

本发明扩增子测序结果

IDT外显子测序结果

IFITM5

chr11

299411

C

G

C/G

C/G

COL1A1

chr17

50185660

C

T

C/T

C/T

COL1A1

chr17

50189930

G

C

G/C

G/C

COL1A1

chr17

50190553

C

G

C/G

C/G

COL1A1

chr17

50190862

A

G

G/G

G/G

COL1A1

chr17

50192542

A

G

A/G

A/G

COL1A1

chr17

50199610

G

C

C/C

C/C

CRTAP

chr3

33114290

G

A

G/A

G/A

CRTAP

chr3

33120406

C

T

C/T

C/T

COL1A2

chr7

94409622

C

T

C/T

C/T

COL1A2

chr7

94409720

C

T

C/T

C/T

COL1A2

chr7

94412625

A

C

A/C

A/C

COL1A2

chr7

94413927

C

G

C/G

C/G

表8样本2

基因

染色体

位置

Ref

Alt

本发明扩增子测序结果

IDT外显子测序结果

IFITM5

chr11

299411

C

G

G/G

G/G

FKBP10

chr17

41817155

C

T

C/T

C/T

FKBP10

chr17

41819527

C

G

C/G

C/G

COL1A1

chr17

50185660

C

T

C/T

C/T

COL1A1

chr17

50189930

G

C

G/C

G/C

COL1A1

chr17

50190862

A

G

G/G

G/G

COL1A1

chr17

50192542

A

G

A/G

A/G

CRTAP

chr3

33114290

G

A

G/A

G/A

CRTAP

chr3

33120406

C

T

T/T

T/T

COL1A2

chr7

94398387

T

C

C/C

C/C

COL1A2

chr7

94401587

T

C

C/C

C/C

COL1A2

chr7

94409622

C

T

T/T

T/T

COL1A2

chr7

94409720

C

T

T/T

T/T

COL1A2

chr7

94413927

C

G

G/G

G/G

COL1A2

chr7

94417738

G

T

T/T

T/T

表9样本3

表10样本4

基因

染色体

位置

Ref

Alt

本发明扩增子测序结果

IDT外显子测序结果

FKBP10

chr17

41820469

-

G

-/G

-/G

COL1A1

chr17

50185660

C

T

T/T

T/T

COL1A1

chr17

50189930

G

C

C/C

C/C

COL1A1

chr17

50190862

A

G

G/G

G/G

COL1A1

chr17

50191450

G

A

G/A

G/A

COL1A1

chr17

50199610

G

C

C/C

C/C

CRTAP

chr3

33114290

G

A

G/A

G/A

CRTAP

chr3

33120406

C

T

C/T

C/T

COL1A2

chr7

94398387

T

C

T/C

T/C

COL1A2

chr7

94401587

T

C

T/C

T/C

COL1A2

chr7

94409622

C

T

T/T

T/T

COL1A2

chr7

94409720

C

T

T/T

T/T

COL1A2

chr7

94413927

C

G

G/G

G/G

COL1A2

chr7

94417738

G

T

G/T

G/T

表11样本5

表12样本6

基因

染色体

位置

Ref

Alt

本发明扩增子测序结果

IDT外显子测序结果

IFITM5

chr11

299286

C

T

C/T

C/T

IFITM5

chr11

299411

C

G

G/G

G/G

COL1A1

chr17

50185660

C

T

C/T

C/T

COL1A1

chr17

50189930

G

C

G/C

G/C

COL1A1

chr17

50190862

A

G

G/G

G/G

COL1A1

chr17

50192542

A

G

A/G

A/G

COL1A1

chr17

50199610

G

C

G/C

G/C

CRTAP

chr3

33114290

G

A

G/A

G/A

CRTAP

chr3

33120406

C

T

C/T

C/T

COL1A2

chr7

94398387

T

C

T/C

T/C

COL1A2

chr7

94401587

T

C

T/C

T/C

COL1A2

chr7

94409622

C

T

T/T

T/T

COL1A2

chr7

94409720

C

T

T/T

T/T

COL1A2

chr7

94412625

A

C

A/C

A/C

COL1A2

chr7

94413927

C

G

G/G

G/G

COL1A2

chr7

94417738

G

T

G/T

G/T

9、引物特异性验证

取8个质控品使用无核酸酶水稀释至5ng/uL，使用三个Pool引物按照上述步骤分别对8个质控品进行扩增，扩增后产物纯化后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。对照试验，检测方法与实施例1中所述方法相同，电泳检测结果见图7～9；二代测序统计结果见表13。

表13二代测序统计结果

电泳检测结果表示，引物Pool扩增条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常，且引物二聚体含量少。测序结果表示，有效数据比例都＞80％，引物二聚体及非特异性产物对结果结果影响极少，平均测序深度都大于1000X，且20％覆盖率大于85％，由此可以看出，本发明的PCR扩增引物及检测方法大大增强了引物特异性和均一性。

10、引物重复性验证

取3个阳性参考品稀释至满足检测要求的5个浓度梯度，按照实施例1中的富集方法进行富集，各两次重复，并进行富集文库质量检测，合格后行高通量测序和生物信息学分析。结果显示，文库质检合格，测序深度均达到要求，每个重复性参考品携带变异结果与一代测序结果一致，说明引物重复性良好。阳性参考品阳性突变结果如表14所示。

表14阳性参考品阳性突变结果

样本

基因

染色体

位置

参考序列碱基

突变碱基

基因型

重复样本1

COL1A1

Chr17

50190553

C

G

C/G

重复样本2

FKBP10

Chr17

41819527

C

G

C/G

重复样本2

FKBP10

Chr17

41817155

C

T

C/T

重复样本3

COL1A2

Chr7

94425625

G

A

G/A

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.引物组合，其特征在于，包含如SEQ ID No.1~316所示的158对引物；

所述引物组合分成三个Pool，Pool-1包含54对引物（SEQ ID NO.1~108），Pool-2包含55对引物（SEQ ID NO.109~218），Pool-3包含49对引物（SEQ ID NO.219~316）。

2.如权利要求1所述的引物组合在制备扩增、检测或筛选成骨不全症相关基因或其突变的试剂、试剂盒和/或装置中的应用；

所述成骨不全症相关基因为IFITM5、FKBP10、CRTAP、COL1A1或COL1A2中的一种或多种。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述扩增、检测或筛选包括第一步骤和第二步骤；

所述第一步骤的反应体系包括：

组分 加入量 2X PCR mix 10μL 如权利要求1所述的引物组合 3μL DNA 模板 2μL 灭菌双蒸水 5μL

所述第二步骤的反应体系包括：

组分 加入量 Amplification mix 25μL 所述第一步骤的PCR产物 6μL Index F引物 2.5μL Index R引物 2.5μL 灭菌双蒸水 14μL

。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述第一步骤的扩增程序包括：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火3min，72℃延伸90s，进行18个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存；

所述第二步骤的扩增程序包括：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行12个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。

5.扩增、检测或筛选成骨不全症相关基因或其突变的试剂、试剂盒和/或装置，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合，以及可接受的辅料、助剂、载体、模块或部件；

所述成骨不全症相关基因为IFITM5、FKBP10、CRTAP、COL1A1或COL1A2中的一种或多种。