CN107868821A - 检测人Wnt1基因突变的引物组及其试剂盒 - Google Patents

检测人Wnt1基因突变的引物组及其试剂盒 Download PDF

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鲁艳芹
任秀智
王延宙
张遥
代运章
翟乃祥
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Abstract

本发明涉及检测人Wnt1基因突变的引物组及其试剂盒，包括：上述用于检测Wnt1基因突变的由第1至第4外显子的PCR扩增引物组成的引物组；PCR扩增试剂；PCR产物纯化试剂；含有上述用于检测Wnt1基因突变的测序引物组的DNA测序试剂。本发明采用特异性引物组，针对Wnt1基因的第1到第4外显子进行突变检测，确保了测定结果的准确性与特异性。

Description

检测人Wnt1基因突变的引物组及其试剂盒
技术领域
本发明涉及检测人Wnt1基因突变的引物组及其试剂盒，具体涉及WNT1基因突变所导致的成骨不全XV型、骨质疏松以及神经系统疾病等的基因检测，属于遗传性骨病及复杂疾病基因检测技术领域。
背景技术
Wnt基因家族编码一类富含半胱氨酸残基的分泌型糖蛋白大家族，是Wnt信号途径的启动因子，广泛表达于多种组织，在进化上具有高度的保守性。从低等生物果蝇直至高等哺乳动物，其成员都具有高度的同源性。迄今在哺乳动物中已发现19个Wnt基因，按照参与的Wnt通路的不同分成两类：Wnt-1族和Wnt-5a族。Wnt-1族包括Wnt1，3a，7a，8a及WntlOb，它们都与经典的Wnt/β-catenin途径有关；Wnt-5a族包括Wnt4,5a,5b及Wntll，它们多与非经典的Wnt信号途径有关。目前对经典Wnt/β-catenin通路的研究较为透彻。Wnt信号通路参与了多种生物学过程的调控，包括胚胎的生长和形态发育、组织的稳定、能量代谢的平衡以及干细胞的维持等。另外，Wnt通路的失调与很多人类重大疾病有着密切的联系。
Wnt1基因由4个外显子组成，所编码的蛋白质具有疏水性，富含半胱氨酸。Wnt1蛋白与细胞表面基质及其特异性受体卷曲蛋白(Fz)相互作用，再经其下游散乱蛋白，完成Wnt信号的转导传递。Wnt1主要表达于大脑、股骨、脾脏、肝脏、骨髓等组织，在B细胞系和造血细胞中含量丰富。Wnt1参与了细胞分化、细胞迁移和增殖等诸多生物学过程。它在诸多肿瘤，如前列腺癌、直肠癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、头颈部肿瘤、黑素瘤、肉瘤、肺癌、间皮瘤、乳腺癌等组织中异常表达。大部分的前列腺癌中检到Wnt1基因表达上调。Wnt1为乳腺癌相关前癌基因，它在乳腺肿正常表达可调节乳腺的正常发育，异常表达时，干扰正常的Wnt信号，促进乳腺癌的发生。Wnt1基因的杂合突变与骨质疏松的发生相关，如果该基因发生纯合突变或是复合杂合突变，则会导致XV型成骨不全。Wnt1在中枢神经系统的发育中发挥至关重要的作用，它是神经嵴诱导和中脑多巴胺系统发育所必须的。它能维持人神经干细胞的多能性，并促进神经前体增殖和分化。多种神经疾病表现为Wnt1通路异常。Wnt1和Wnt3a对于脊髓神经发生发挥重要的作用，参与神经元亚型的决定。缺失Wnt1和Wnt3a会造成背侧中间神经元发育的缺陷，背侧D1、D2中间神经元的缺失，并伴随D3中间神经元数目的增加。总之，Wnt1它在调节骨形成和维持、胚胎发育、肿瘤发生等病理生理以及中枢神经系统疾病中发挥重要作用。
成骨不全(osteogenesis imperfecta，OI)是一种胶原合成代谢障碍所导致的遗传性结缔组织罕见疾病。主要临床表型包括骨质疏松和骨的脆性增加、蓝巩膜、牙本质不全，早熟性耳硬化等症状。成骨不全存在遗传异质性，有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传以及X-连锁遗传等三种遗传方式，其中约80％以上患者由I型胶原蛋白结构基因COLIAl或COLlA2的突变所致，属于常染色体显性遗传。成骨不全具有临床异质性，根据疾病的严重程度以及影像学特征，分为I-IV型。其中I型临床症状较轻，患者不骨折或有少数骨折史，肢体不变形。II型患者通常在围产期死亡，是最为严重的类型。III型患者因频繁骨折、肢体畸形、身材矮小。IV型为中等程度的成骨不全，介于I型与III型之间，骨折次数较少，通常不引起畸形。Wnt1基因突变是常染色体隐性遗传的XV型成骨不全致病基因。XV型成骨不全病人的临床特征主要为眼睑下垂、严重的精神抑郁、脖子短小、持续性骨折、四肢弯曲、椎体压缩、头围正常、颅骨畸形、张力减退等症状。部分患者可能还伴有自闭症。
目前XV型成骨不全Wnt1基因突变的报道很少，我们首次大规模发现该类患者新发突变及新发人群。扩大了该基因的突变谱系。这里针对该基因进行了突变引物设计及其相应基因突变检测试剂盒的研发。目前基因突变检测方法有荧光定量PCR、高通量测序分析、单链构象多态性变化、Sanger测序分析等等。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供检测人Wnt1基因突变的引物组及其试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测Wnt1基因突变的引物组，该引物组包括4对特异性扩增Wnt1基因第1至第4外显子的引物；
所述的Wnt1基因外显子1的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物FP1与核苷酸序如SEQ ID NO.2所示的引物RP1；
所述的Wnt1基因外显子2的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物FP2与核苷酸序如SEQ ID NO.4所示的引物RP2；
所述的Wnt1基因外显子3的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物FP3与核苷酸序如SEQ ID NO.6所示的引物RP3；
所述的Wnt1基因外显子4的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物FP4与核苷酸序如SEQ ID NO.8所示的引物RP4；
一种用于检测Wnt1基因突变的测序引物组，该引物组包括14条第1至第4外显子的测序引物引物；包括：
外显子1的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1的引物FP1；
外显子2的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3的引物FP2；
外显子3的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.5的引物FP3；
外显子4的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.7的引物FP4；
一种用于检测Wnt1基因突变的试剂盒，包括：
上述用于检测Wnt1基因突变的由第1至第4外显子的PCR扩增引物组成的引物组；
PCR扩增试剂；
PCR产物纯化试剂；
含有上述用于检测Wnt1基因突变的测序引物组的DNA测序试剂。
根据本发明优选的，所述PCR扩增试剂包括：2.5mM dNTP，含Mg2+的10×PCR缓冲液，5U/μl Taq DNA聚合酶，去RNase与DNase水；
所述PCR扩增体系中各组分的工作浓度为：200μM dNTP，1×PCR缓冲液，0.025U/μlTaq DNA聚合酶，上游引物和下游引物均为0.4μM，模板浓度为2.5～5ng/μl。
根据本发明优选的，所述PCR产物纯化试剂包括：1U/μl SAP酶、10U/μl ExoI酶、去RNase与DNase水；
PCR产物纯化体系中各组分的工作浓度为：0.05U/μl SAP酶、0.5U/μl ExoI酶。
根据本发明优选的，所述DNA测序试剂包括：上述用于检测Wnt1基因突变的测序引物组、BigDye 3.1混合液、0.125M EDTA溶液、无水乙醇、体积百分比75％乙醇溶液、Hi-Di甲酰胺溶液、去RNase酶与DNase酶水。
根据本发明进一步优选的，所述测序引物中的测序引物的工作浓度为0.64pMol/L。
有益效果
1、本发明采用特异性引物组，针对Wnt1基因的第1到第4外显子进行突变检测，确保了测定结果的准确性与特异性。与传统的单一突变位点的检测而言，扩大了检测突变范围至Wnt1外显子区所有位点，覆盖已报道的突变位点与可能的突变位点。与传统的通过荧光定量PCR采用探针法检测相比，降低了检测成本，同时PCR产物通过DNA序列测定以及后续序列比对完成，其准确性要高于荧光定量PCR。与高通量测序相比较，直接对Wnt1致病基因进行检测，避免了高通量测序中因原始数据筛选、阈值设定等问题而可能出现的假阳性与假阴性问题；同时节省了成本与人力。
2、本发明所涉及的每对引物的PCR扩增与DNA测序条件完全一致，可以同时进行扩增测序，极大降低了检测过程的工作量；
3、本发明提供的Wnt1基因突变组及其检测试剂盒可用于Wnt1基因突变所导致的XV型成骨不全、骨质疏松、相关神经系统疾病的基因突变检测，进而辅助临床确诊该类疾病，提供骨健康与神经健康保障。同时还为研究Wnt1基因突变与基因功能之间的关系以及基因型与表型之间的相互关系奠定基础。
附图说明
图1是全血基因组DNA不同引物对对Wnt1基因第1到第4外显子PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2是本发明实施例中12例成骨不全患者P1-P12血液样本Wnt1基因测序峰图；
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现的目的及效果，具体实施方式说明如下。
试剂来源
全血基因组DNA提取试剂盒购自Omega公司；
2.5mM dNTP混合物、5U/μl Taq DNA聚合酶、10×PCR反应缓冲液均来自TakaRa公司；
1U/μl SAP与10U/μlExoI购自NEB公司，BigDye 3.1测序溶液、Na2EDTA﹒2H20与Hi-Di甲酰胺均购自ThermoFisher Scientific公司；
无水乙醇购自国药集团；
去RNase与DNase水购自Life Technologies；
琼脂糖为西班牙进口，引物由华大基因合成。
实施例1
根据NCBI GeneBank数据库分析Wnt1基因序列(NG_033141.1)，进行第1到第4外显子扩增引物的设计。扩增区域包括Wnt1全部外显子及其外显子与内含子交界处不少于50bp的内含子序列。PCR扩增中所采用引物核苷酸序列如表1所示。
表1Wnt1基因外显子引物扩增序列
实施例2
一种用于检测Wnt1基因突变的试剂盒，包括：
上述用于检测Wnt1基因突变的由第1至第19外显子的PCR扩增引物组成的引物组；
所述PCR扩增试剂包括：2.5mM dNTP，含Mg2+的10×PCR缓冲液，5U/μl Taq DNA聚合酶，去RNase与DNase水；
所述PCR扩增体系中各组分的工作浓度为：200μM dNTP，1×PCR缓冲液，0.025U/μlTaq DNA聚合酶，上游引物和下游引物均为0.4μM，模板浓度为2.5～5ng/μl。
所述PCR产物纯化试剂包括：1U/μl SAP酶、10U/μl ExoI酶、去RNase与DNase水；
PCR产物纯化体系中各组分的工作浓度为：0.05U/μl SAP酶、0.5U/μl ExoI酶。
所述DNA测序试剂包括：上述用于检测Wnt1基因突变的测序引物组、BigDye 3.1混合液、0.125M EDTA溶液、无水乙醇、体积百分比75％乙醇溶液、Hi-Di甲酰胺溶液、去RNase与DNase水；
所述测序引物组中的测序引物工作浓度为0.64pMol/L。
本试剂盒于-20保存，尽量减少反复冻融。
实施例3
利用上述用于检测Wnt1基因突变的试剂盒进行人Wnt1基因突变检测方法，步骤如下：
(1)外周血基因组DNA的提取
采集患者外周血5ml，采用Omega公司DNA提取试剂盒(D3392-01)进行全血基因组DNA的提取，采用NanoDrop 2000/2000c分光光度计进行DNA浓度和纯度测定；具体操作步骤条件参见产品说明书；
(2)PCR扩增
PCR反应体系为20μl，其中包括：
10×PCR Buffer 2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，Taq DNA聚合酶0.1μl，上游引物1.6μl，下游引物1.6μl，DNA模板50ng-100ng，去RNase酶与DNase酶水补足至20μl。
采用BIO-RAD公司PIC-200型PCR仪，进行降落PCR，PCR反应条件如下：
94℃预变性5分钟；94℃变性20秒，62℃退火30秒，退火温度每一循环降低0.5℃，72℃延伸40秒，循环次数14；然后，94℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，循环次数21；72℃终延伸5分钟。
(3)PCR产物纯化
PCR纯化体系为20μl，其中包括：
PCR产物8μl，1U/μl SAP酶1μl，10U/μl ExoI酶1μl，H2O 10μl。
反应条件为：37℃消化60分钟，然后65℃灭活15分钟。产物纯化后经1％琼脂糖凝胶电泳或是微量核酸定量仪进行浓度测定。
(4)DNA测序反应及纯化
DNA测序反应的体系为10μl，包括4μl BigDye，3.2pMol/L测序引物2μl，5～20ng纯化的PCR产物，用去RNase酶与DNase酶水补足至10μl。
反应条件为：
96℃1分钟变性，96℃10秒，50℃5秒，60℃4分钟，共28个循环反应，PCR循环完并冷却到4℃，取下并马上进行短时间离心。
测序反应结束后将反应产物中加入2.5μl 0.125M的EDTA溶液,然后加入30μl无水乙醇，颠倒混匀后室温放置15分钟。在12000g离心10分钟后，移除上清。加入60μl70％乙醇，4℃12000g离心15分钟后，移除上清。重复一次后，待乙醇挥发干净后将沉淀溶于10μlHi-Di甲酰胺。95℃变性4分钟后采用ABI3130XL测序仪进行测序分析。
(5)测序结果分析
测序结果采用Mutation Survey软件进行突变位点的识别。采用PolyPhen2、SIFT与PhyloP对突变功能进行预测。ExAC数据库分析位点变异频率。
实验例
采用实施例1至实施例3所述方法，对来自天津市武清区人民医院以及山东省立医院的临床诊断为成骨不全不全的10个家庭共计12个患者临进行了Wnt1基因检测，基因突变结果以及患者基本信息与表型见表2。患者血液样本Wnt1基因测序峰图如图2所示。表2于图2表明患者P1-P4均属于纯合突变，患者P5-P12属于复合杂合突变，P8与P9为同一家庭来源的两患者、P10与P11亦同。c.538_560del与466del缺失均导致后续开放阅读框架的改变，进而导致其后编码氨基酸残基的变化及截短蛋白的产生。c.681C>A与c.774C>A碱
表2.Wnt1基因变异患者临床特征
基替代突变，分别导致227位半胱氨酸残基、258位酪氨酸残基后终止子的生成，产生截短蛋白。其它位点的突变均属于碱基替代。将所有检测到的位点进行突变效应预测。Polyphen2中，具体数值代表了损害的程度，分值越接近1，则损害可能越大。SIFT预测中，只要分值小于0.05，均认为可能影响到编码蛋白质的功能。PhyloP软件中，只要得分大于0.95则代表该区域保守性强，小于0.95则保守性较差。而发生在保守区的突变通常被认为是致病性的标记。根据三种不同功能效应预测软件可知，所有位点的碱基替代都可能影响到功能。除了c.385G>A碱基替代在ExAC数据库中检测到正常人群的0.00001的分布频率外，其它变异位点的频率均为0。根据临床诊断，结合临床表型以及本实验例的检测方法，能够成功的识别临床Wnt1基因突变的成骨不全患者，为该类疾病确诊与产前筛查奠定基础。
表3.Wnt1变异效应预测与人群中的分布频率
# 核酸变化 氨基酸变化 PolyPhen2 SIFT PhyloP ExAC
1 c.301C>T p.Arg101Cys 0.99 0 5.64 0
2 c.382T>G p.Phe128Val 0.504 0.002 3.09 0
3 c.385G>A p.Ala129Thr 0.945 0.001 5.64 0.00001
4 c.397G>A p.Ala133Thr 0.945 0.001 5.64 0
5 c.466del p.Arg156Glyfs*43 - - - 0
6 c.538_560del p.Phe180Argfs*129 - - - 0
7 c.677C>T p.Ser226Leu 0.998 0.001 3.64 0
8 c.681C>A p.Cys227* - - - 0
9 c.774C>A p.Tyr258* - - - 0
10 c.937C>T p.Arg313Cys 0.999 0 2.42 0
11 c.1010G>C p.Arg337Pro 0.424 0.045 3.52 0
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省医药生物技术研究中心
<120> 检测人Wnt1基因突变的引物组及其试剂盒
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
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gttgttaaag ccagactgcg 20
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<400> 3
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<212> DNA
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<400> 4
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<212> DNA
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actggaggta ctcgggtgg 19

Claims (7)

1.一种用于检测Wnt1基因突变的引物组，该引物组包括4对特异性扩增Wnt1基因第1至第19外显子的引物；
所述的Wnt1基因外显子1的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物FP1与核苷酸序如SEQ ID NO.2所示的引物RP1；
所述的Wnt1基因外显子2的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物FP2与核苷酸序如SEQ ID NO.4所示的引物RP2；
所述的Wnt1基因外显子3的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物FP3与核苷酸序如SEQ ID NO.6所示的引物RP3；
所述的Wnt1基因外显子4的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物FP4与核苷酸序如SEQ ID NO.8所示的引物RP4。
2.一种用于检测Wnt1基因突变的测序引物组，该引物组包括4条第1至第4外显子的测序引物引物；包括：
外显子1的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1的引物FP1；
外显子2的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3的引物FP2；
外显子3的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.5的引物FP3；
外显子4的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.7的引物FP4。
3.一种用于检测Wnt1基因突变的试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1所述用于检测Wnt1基因突变的由第1至第4外显子的PCR扩增引物组成的引物组；
PCR扩增试剂；
PCR产物纯化试剂；
含有权利要求2所述用于检测Wnt1基因突变的测序引物组的DNA测序试剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括：2.5mM dNTP，含Mg2+的10×PCR缓冲液，5U/μl Taq DNA聚合酶，去RNase与DNase水；
所述PCR扩增体系中各组分的工作浓度为：200μM dNTP，1×PCR缓冲液，0.025U/μl TaqDNA聚合酶，上游引物和下游引物均为0.4μM，模板浓度为2.5～5ng/μl。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR产物纯化试剂包括：1U/μl SAP酶、10U/μl ExoI酶、去RNase与DNase水；
PCR产物纯化体系中各组分的工作浓度为：0.05U/μl SAP酶、0.5U/μl ExoI酶。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA测序试剂包括：上述用于检测Wnt1基因突变的测序引物组、BigDye 3.1混合液、0.125M EDTA溶液、无水乙醇、体积百分比75％乙醇溶液、Hi-Di甲酰胺溶液、去RNase与DNase水。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述测序引物中的测序引物的工作浓度为0.64pMol/L。
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