CN104878120A - 一种检测cpt1b基因突变的引物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测CPT1B基因突变的引物,包括扩增CPT1B基因全部编码外显子及外显子/内含子交界区突变的引物,其引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.26所示。本发明还公开了一种检测CPT1B基因突变的试剂盒,以及一种非诊断目的检测CPT1B基因突变的方法。本发明克服了现有技术中仅对热点突变进行检测的局限性,通过设计特异的扩增引物即可对CPT1B基因的全部编码外显子及外显子/内含子交界区进行捕获,一次性的将多个潜在的突变位点检测出来。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种检测CPT1B基因突变的引物、方法和试剂盒。
背景技术
肉毒碱棕榈酰转移酶1B(Carnitine Palmitoyltransferase 1B,CPT1B)位于骨骼肌细胞线粒体外膜上,是脂肪酸氧化的第1个限速酶,能够催化从酰基辅酶A将酰基转移至L-肉毒碱而形成酰基肉毒碱的反应,在长链脂肪酸从细胞浆转运到线粒体进行氧化的过程中起重要作用。CPT1B基因全长10610个核苷酸,定位于22q13.33染色体上,含有18个编码外显子,编码772个氨基酸肽链。CPT-1B基因突变引起CPT-1B功能缺陷,肉碱依赖的转运系统功能将遭到破坏,从肌肉细胞浆转运到线粒体的长链脂肪酸减少,长链脂肪酸不能被氧化,故血清游离脂肪酸增高,肌肉组织中大量脂肪聚集,从而引起一系列生化紊乱。
目前仅发现3种与疾病相关的CPT1B基因突变,主要为错义突变,也包括1种内含子与外显子交界区的剪切点突变。
对于CPT1B基因突变的检测通常为针对某一个突变进行检测,尚未有关于利用多个特异性引物对CPT1B基因多个突变同时进行测定的报道。
发明内容
针对上述现有技术,本发明的目的是提供一种检测CPT1B基因突变的引物和试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种非诊断目的检测CPT1B基因的全部编码外显子及外显子/内含子交界区突变的方法。
为实现上述目的,本发明采用下述技术方案:
一种检测CPT1B基因突变的引物,包括扩增CPT1B基因18个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物,其引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.26所示,具体如下:
CPT1B-P1-F:5’–ACGCACGGACAGGAGTGAAC-3’;(SEQ ID NO.1)
CPT1B-P1-R:5’–CTCTCCTGATGCCCTGCTGT-3’;(SEQ ID NO.2)
CPT1B-P2-F:5’–AGGAGCCAGTTCCCAAGACT-3’;(SEQ ID NO.3)
CPT1B-P2-R:5’–TGGCTGCTGTCCTGTATCTG-3’;(SEQ ID NO.4)
CPT1B-P3-F:5’–TTGTCTTAGCCCTACATCCG-3’;(SEQ ID NO.5)
CPT1B-P3-R:5’–GAAACCAACCAGCAACTCC-3’;(SEQ ID NO.6)
CPT1B-P4-F:5’–AGGGTCTCAGGGAGTTGCT-3’;(SEQ ID NO.7)
CPT1B-P4-R:5’–CCACCATGACTTGAGCACC-3’;(SEQ ID NO.8)
CPT1B-P5/6-F:5’–TAAGGGCTTGAGAATAATGG-3’;(SEQ ID NO.9)
CPT1B-P5/6-R:5’–GACAATTCCCTGGTTATGGT-3’;(SEQ ID NO.10)
CPT1B-P7/8-F:5’–AGATTGGTCCTTGGGTCAGC-3’;(SEQ ID NO.11)
CPT1B-P7/8-R:5’–AGCAGGACTCCCTTCACCAT-3’;(SEQ ID NO.12)
CPT1B-P9-F:5’–CTTCCCTGCTTCTGACACTG-3’;(SEQ ID NO.13)
CPT1B-P9-R:5’–CCCGTCAGAGGTAGGTTATG-3’;(SEQ ID NO.14)
CPT1B-P10-F:5’–GCAGCAGGACAGCCAGCATA-3’;(SEQ ID NO.15)
CPT1B-P10-R:5’–TGCGTCAGCCTTCCGACTAG-3’;(SEQ ID NO.16)
CPT1B-P11/12-F:5’–GGGCAACAGAGCAAGATTC-3’;(SEQ ID NO.17)
CPT1B-P11/12-R:5’–GAAGCCAGTTTGGACTCTAC-3’;(SEQ ID NO.18)
CPT1B-P13/14-F:5’–GGCTTCAGGGAGGACAGAG-3’;(SEQ ID NO.19)
CPT1B-P13/14-R:5’–CAGGCAGACAGGAGGCAGA-3’;(SEQ ID NO.20)
CPT1B-P15-F:5’–GCCAGGGCTACTCTTCACC-3’;(SEQ ID NO.21)
CPT1B-P15-R:5’–GTAGGAGGGCAGTGGGACA-3’;(SEQ ID NO.22)
CPT1B-P16-F:5’–TTTGTCCCACTGCCCTCCTA-3’;(SEQ ID NO.23)
CPT1B-P16-R:5’–CAGGGAGGTATTTGGGATGG-3’;(SEQ ID NO.24)
CPT1B-P17/18-F:5’–TTCTTCACCCTTCTTGTTGC-3’;(SEQ ID NO.25)
CPT1B-P17/18-R:5’–GAAGGTTCTGAGGCAAGTAT-3’;(SEQ ID NO.26)
其中,F为正向引物,R为反向引物。
CPT1B基因编码外显子5和6、7和8、11和12、13和14、17和18位置较近,故分别设计一对引物即P5/6、P7/8、P11/12、P13/14、P17/18,分别如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.26所示。
本发明还提供了一种检测CPT1B基因突变的试剂盒,该试剂盒中含有扩增CPT1B基因18个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物。
本发明所述的试剂盒还包括用于PCR扩增反应的酶和试剂。
用于PCR扩增反应的酶和试剂包括Taq酶、dNTP、10×PCR缓冲液和双蒸水。
进一步的,所述试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试剂。
本发明还提供非诊断目的检测检测CPT1B基因的全部编码外显子及外显子/内含子交界区突变的方法,包括如下步骤:
(1)提取待测样本DNA;
(2)以样本DNA为模板,用扩增CPT1B基因18个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物进行PCR扩增,得到扩增产物;
(3)采用测序引物对扩增产物进行测序扩增,得到测序扩增产物;
(4)对测序扩增产物进行测序,并与数据库中正常的CPT1B基因序列进行比对,从而确定CPT1B基因的突变位点。
步骤(2)中,PCR扩增的条件为:94℃预变性3min 20s,94℃变性35s,退火35s,特异性扩增引物的退火温度为52℃-59℃,72℃延伸50s,共30个循环;最后72℃延伸5min。
步骤(3)中,所述测序引物为PCR扩增引物对中的正向引物。
步骤(3)中,测序扩增反应的条件是:95℃预变性120s,95℃变性30s,50℃退火10s,60℃延伸120s,共25个循环。
测序扩增反应体系采用10μL,具体组成为:DNA模板1μL、引物(正、反向)各1μL、BDT2μL、双蒸水补足至总体积10μL。
步骤(4)中,测序的方法为Sanger法。
本发明的有益效果:
本发明克服了现有技术中仅对一个突变进行检测的局限性,通过设计特异的扩增引物即可对CPT1B基因的全部编码外显子及外显子/内含子交界区进行捕获,一次性的将多个潜在的突变位点检测出来。
附图说明
图1为CPT1B基因编码外显子及外显子/内含子交界区PCR扩增产物电泳图;其中,M泳道:DNA marker,1~13泳道:分别为CPT1B基因编码外显子及交界区1、2、3、4、5/6、7/8、9、10、11/12、13/14、15、16和17/18。
图2A为CPT1B基因编码外显子2及外显子/内含子交界区测序的部分结果,图的上方为NCBI数据库中标准CPT1B基因序列,其下行为检测的样本CPT1B基因序列;图2A显示:在cDNA 196位置,A突变为G。
图2B为CPT1B基因编码外显子10及外显子/内含子交界区测序的部分结果,图的上方为NCBI数据库中标准CPT1B基因序列,其下行为检测的样本CPT1B基因序列;图2B显示:在cDNA 1280位置,C突变为G。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,应该说明的是,下述说明仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。
下面实施例中所用一些材料和试剂均为进口分装或国产分析纯。
实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规的条件,例如Sambrook等的《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件,或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
实施例1:特异性扩增引物的设计
根据NCBI数据库中CPT1B正常基因的参考序列设计特异性扩增引物,该特异性扩增引物应满足以下条件:
(1)产物不能形成二级结构、碱基要随机分布,引物自身不能有连续4个碱基的互补;
(2)所有PCR片段正反向引物退火温度相差不超过5℃,各产物退火温度在52℃-60℃之间,保证扩增的特异性和稳定性;
(3)PCR扩增引物的正向扩增引物即为用于测序扩增的引物,长度在18-21bp之间。
本发明设计的特异性扩增引物如表1所示。
实施例2:样本DNA提取
本发明所用的阳性样本取自山东的受试者,经医院确诊为肉毒碱棕榈酰转移酶1缺乏症,经受试者同意,取其血液样本。
使用血液基因组提取试剂盒(天根生化科技[北京]有限公司)抽提基因组DNA,示例性的步骤如下:
(1)取红细胞裂解液900μl,置入1.5mL的EP管中;
(2)在上述EP管中加入全血300μL,上下颠倒混匀,室温下温育10min,以使红细胞裂解,注意温育期间至少上下颠倒混合一次;
(3)室温下13200×g离心20s,用吸头移弃大部分上清液(注意在管内留约20μL-30μL此左右的上清液);
(4)旋涡器震荡上管,使细胞悬浮于残液中,以利于下一步的白细胞裂解;
(5)向上管中加入白细胞裂解液300μL,用吸头上下抽吸,使细胞裂解;
(6)室温下,加入蛋白质沉淀液100μL,旋涡器高速下震荡20s,以混合;
(7)4℃下13200×g离心3min,沉淀的蛋白质应该为致密的、黑褐色。如无蛋白质沉淀,需要重复上一步,并在冰上温育5min,再重复该步;
(8)取含DNA的上清液放入新的EP管中,加入100%异丙醇(2-propano1)300μL,轻轻上下颠倒50次,以混匀;
(9)4℃下13200×g离心1min,DNA会形成小的白色沉淀;
(10)移弃上清液,在吸干纸上短暂吸干EP管,加70%乙醇300μL,轻轻上下颠倒数次,以洗涤DNA沉淀;
(11)4℃下13200×g离心1min,仔细倒掉乙醇,由于DNA沉淀松软,故倒乙醇时要慢慢进行;
(12)倒置放置离心管于吸干纸,空气干燥10~15min:
(13)加入DNA溶解液50μL,65℃温育lh和/或室温过夜,如有可能轻弹EP管,以促进DNA溶解。
根据以上步骤可得出50μL DNA样品。
实施例3:PCR扩增
利用本实施例1中设计的特异性扩增引物,以样本DNA为模板,进行PCR扩增,PCR扩增的反应体系采用50μL,具体组成为:DNA模板3μL、引物(正、反向)各2μL、Taq酶0.4μL、dNTP4μL、10×PCR缓冲液5μL、双蒸水补足至总体积50μL。
PCR扩增条件为:94℃预变性3min 20s,94℃变性35s,退火35s,特异性扩增引物的退火温度为52℃-59℃,72℃延伸50s,共30个循环;最后72℃延伸5min。
对特异性扩增引物的退火温度进行考察和优化,优化得到的各特异性扩增引物的退火温度见表1。
表1. CPT1B基因18个编码外显子及外显子/内含子交界区特异性扩增引物及退火温度
实施例4:凝胶电泳检测
对实施例3中PCR扩增后的产物进行凝胶电泳检测,检测扩增出的片段是否为需要的目的片段的大小,Marker采用MarkerⅠ(天根生化科技[北京]有限公司),电泳采用的是2%琼脂糖凝胶,电泳条件:90V,40分钟。PCR扩增产物的电泳结果如图1所示。图1显示了CPT1B基因18个编码外显子及外显子/内含子交界区扩增产物,根据Marker(MarkerⅠ,天根生化科技[北京]有限公司)的比对,可以确定13个条带的大小,分别是238bp~861bp,与预测结果一致。
实施例5:PCR扩增产物的切胶纯化
对实施例3中PCR扩增出的产物凝胶电泳后,在紫外灯下切取目的条带,采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技[北京]有限公司)将切取得到的凝胶回收纯化,示例性的步骤如下:
(1)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中,称取重量。
(2)柱平衡步骤:向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL,12,000rpm(~13,400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
(3)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100μL,则加入100μL PN溶液),50℃水浴放置,其间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。
(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中),室温放置2min,12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CA2放入收集管中。
(5)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CA2放入收集管中。
(6)重复操作步骤(5)。
(7)将吸附柱CA2放回收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟,彻底地晾干,以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
(8)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加30μL洗脱缓冲液EB,室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。
根据以上步骤可得出30μL纯化PCR扩增产物样品。
实施例6:测序扩增产物的制备
采用测序引物对实施例5中纯化的PCR产物进行测序扩增,得到测序扩增产物。测序引物为表1中的正向引物。
测序扩增反应的条件是:95℃预变性120s,95℃变性30s,50℃退火10s,60℃延伸120s,共25个循环。
测序扩增反应体系采用10ul,具体组成为:DNA模板1μL、引物(正、反向)各1μL、BDT 2μL、双蒸水补足至总体积10μL。
将测序扩增产物进行切胶回收纯化,示例性的步骤与实施例5相同。
实施例7:在ABI3730测序仪上进行扩测序
使用ABI3730测序仪对实施例6纯化的测序扩增产物进行测序。示例性的测序结果示于图2A和图2B。
图2A和图2B显示了CPT1B基因编码外显子2和10及外显子/内含子交界区测序的部分结果,每个图的最上方为NCBI数据库中标准CPT1B基因序列,其下行为为检测样本的CPT1B基因序列。图2A显示:在cDNA 196位置,A突变为G(196A-G,I66V,杂合子,exon 2)。图2B显示:在cDNA 1280位置,C突变为G(1280C-G,S427C,杂合子,exon 10)。
Claims (9)
1.一种检测CPT1B基因突变的引物,其特征在于,包括扩增CPT1B基因18个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物,其引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.26所示。
2.一种检测CPT1B基因突变的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包含权利要求1所述的检测CPT1B基因突变的引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,试剂盒中还包括有:用于PCR扩增反应的酶和试剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,用于PCR扩增反应的酶和试剂,包括Taq酶、dNTP、10×PCR缓冲液和双蒸水。
5.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试剂。
6.一种非诊断目的检测检测CPT1B基因的全部编码外显子及外显子/内含子交界区突变的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)提取待测样本DNA;
(2)以样本DNA为模板,用扩增CPT1B基因18个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物进行PCR扩增,得到扩增产物;
(3)采用测序引物对扩增产物进行测序扩增,得到测序扩增产物;
(4)对测序扩增产物进行测序,并与数据库中正常的CPT1B基因序列进行比对,从而确定CPT1B基因的突变位点。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,PCR扩增的条件为:94℃预变性3min 20s,94℃变性35s,退火35s,特异性扩增引物的退火温度为52℃-59℃,72℃延伸50s,共30个循环;最后72℃延伸5min。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述测序引物为PCR扩增引物对中的正向引物。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,测序的方法为Sanger法。
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