CN105420365A - 一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法 - Google Patents

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CN105420365A CN201510948572.7A CN201510948572A CN105420365A CN 105420365 A CN105420365 A CN 105420365A CN 201510948572 A CN201510948572 A CN 201510948572A CN 105420365 A CN105420365 A CN 105420365A
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朱香镇
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Abstract

本发明提供鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，包括如下步骤：1)提取待鉴定样品的DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，使用上述引物对进行PCR扩增，并纯化扩增产物；3)对步骤2)的纯化后的PCR扩增产物进行测序，通过碱基变异位点、遗传距离、系统发育树对两个种进行准确区分。本发明提供了通过分子生物学鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，操作简单，鉴定准确，可广泛推广。

Description

一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，特别是涉及一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法。
背景技术
榕母管蓟马(Gynaikothripsficorum)与榕管蓟马(Gynaikothripsuzeli)均属于缨翅目(Thysanoptera)管蓟马科(Phlaeothripidae)母管蓟马属(Gynaikothrips)，是我国热带和亚热带地区榕树上的重要经济害虫。两种蓟马锉吸危害榕树新梢及嫩叶，初期导致叶片卷曲形成“饺子”状或“疙瘩”状虫瘿，整个虫体藏匿于其中栖息、生活与繁殖，后期叶片逐渐出现变硬及枯死症状，危害严重时会导致整株叶片变黄枯死脱落，特别是盆景榕树受害后，无论观赏价值还是经济价值都大大降低。此外，近年来，随着榕树苗木、盆景在不同地区间的调运，两种蓟马已经传播至我国东北的黑龙江、辽宁，西北的内蒙古及华北地区的河南、河北和山东地区的温室内及园林景区。综上所述，尽快找到一种快速准确鉴定这两个种的方法从而采用合理的方法对它们进行防治就显得尤为重要。然而，大量蓟马方面的分类专家发现，榕母管蓟马和榕管蓟马无论体型、体色还是其它鉴定特征方面都非常相似，即使是专业技术人员也常常将它们弄混淆。由于这两种蓟马个体较小并且非常相似，仅通过形态特征对这两个种进行鉴别非常困难。
随着DNA分子标记技术的发展和成熟，DNA条形码技术在物种鉴定中的应用越来越广泛，为我们提供了一种经济、简单、快捷并且准确的物种鉴定方法。DNA条形码技术在鸟类，鱼类中的应用已有大量的研究报道，然而在缨翅目昆虫中的报道相对较少，仅有关于田间蓟马种类鉴定的报道，而关于榕树上的主要害虫—管蓟马鉴定方面未见有报道。因此，本发明的目的是通过标准DNA条形码分子标记，实现榕母管蓟马和榕管蓟马快速准确鉴别。
发明内容
为了解决传统形态学很难准确鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的问题，本发明提供一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法。
发明人利用DNA条形码通用型引物对提取的榕母管蓟马和榕管蓟马线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I(mitochondrialcytochromecoxidasesubunitIgene,mtDNACOI)基因(646bp)或核糖体DNA第二内部转录间隔区(internaltranscribedspacer2,ITS2)分子标记进行PCR扩增及双向测序，并对序列进行拼接比对、数据处理，采用邻接法(NJ法)构建系统发育树，并以K2P(Kimuratwo-parameter)模型计算种内种间遗传距离，鉴别开了榕母管蓟马和榕管蓟马。
本发明提供的一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法，包括如下步骤：
1)提取待鉴定样品的总基因组DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，使用引物对进行PCR扩增，并纯化PCR扩增产物；
3)对步骤2)的纯化后的PCR扩增产物进行测序，依据特定位点的测序结果判断样品为榕母管蓟马还是榕管蓟马。
其中，所述引物对为COI基因引物对和/或ITS2分子标记引物对。
所述COI基因引物对如下：
上游引物：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
下游引物：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
所述ITS2分子标记引物对如下：
上游引物：5'-AGACTCCTTGGTCCGTGTTTC-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
下游引物：5'-ATCACTCGGCTCGTGGATCG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
当使用COI基因引物对时，依据扩增产物的第28、78、82、88、92、97、103、151、166、172、214、235、265、271、328、337、347、355、364、370、445、457、470、472、503、525、538、610、616、619、622bp处碱基进行判断：
如上述位点的碱基依次为G、C、G/T、A、A/T、C、G、T、G、C、G、T、A、C、G、A、T、T、A、A、A、C、G、C、G、T/G、G、A、A、G、T的则为榕母管蓟马；
如上述位点的碱基依次为A、T、G、G、A、T、A、C、A、T、A、C、G、T、A、G、C、C、G、G、A、T、A、T、T、T、A、G、G、A、C的则为榕管蓟马。
当使用ITS2分子标记引物对时，依据扩增产物的第54、61、135、136、179、344、348、374、376、377、378、606、633、661、662、709、790、841、906、966、978、979、1116、1144、1217、1226、1227、1228、1250、1255、1258、1259、1325、1327、1331、1332bp处碱基进行判断：
如上述位点的碱基依次为C、C、C/T、G、T、T/C、T、A、T、T、T、A、A、T、T、A/G、G/A、T、C/T、T、G、A、T、T/C、A、A、A、G、T、T、T、C、G、A/G、A、C的为榕母管蓟马；
如上述位点的碱基依次为T、C/T、T、A、T/C、C、C、C/T/A、C/T、A/T、G/T、G、G、A、A、A/G、A、A、C、T/A、T、A/C、T/C、T、G、G、A/G、C/A、C、C、C、T、A、A、G/A、C/T的为榕管蓟马。
其中，步骤1)所述提取待鉴定样品的总基因组DNA，具体步骤如下：
①挑取待测样品单头的成虫，去除腹部后其余组织置于离心管中加入液氮研磨至匀浆状态，加入200μLGA缓冲液；
②加入20～40μL蛋白酶K溶液；
③56℃震荡2～4h直至组织完全溶解；
④加入200μL缓冲液GB，70℃震荡10min，离心使离心管壁的水珠沉入离心管底部；
⑤加入200μL无水乙醇，震荡混匀，离心以除去离心管盖内壁的水珠；
⑥将⑤所得溶液及沉淀加入吸附柱CB3中，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
⑦向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
⑧向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；再次重复该步骤；
⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心3min，倒掉废液，将吸附柱CB3开盖置于无菌条件下室温放置20～30min，彻底晾干残存的漂洗液及无水乙醇；
⑩将吸附柱CB3转入离心管中，向吸附膜的中间部位滴加70～200μL洗脱液TE或无菌水，室温放置2～5min，12000rpm离心3min，收集DNA，将上清液再次加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm离心2min，再次收集DNA，收集的DNA置于-20℃保存。
其中，步骤2)所述PCR的反应体系为25μl体系：
其中，步骤2)所述PCR的反应条件为94℃预变性3min，随后进行35个循环；
每个循环包括：94℃变性1min，57℃退火1min、72℃延伸1min10s，末次循环72℃延伸5min；
产物4℃保存。
其中，步骤2)所述纯化PCR扩增产物，具体步骤如下：
a向吸附柱CA2中加入500μ平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2重新放回收集管中；
b从琼脂糖凝胶中切下有单一的目的DNA条带的胶块放入离心管中并称重；
c加入与切下的胶块等体积的溶液PN，50℃震荡至胶块彻底溶解；
d将步骤c所得溶液加入组装好的吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
e向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
f重复操作步骤e；
g将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心5min，以除尽漂洗液，将吸附柱CA2置于无菌条件下室温晾干；
h将吸附柱CA2放入离心管中，向吸附膜的中间位置滴加50～200洗脱缓冲液EB，室温放置2～5min，12000rpm离心5min收集DNA溶液。
本发明还提供所述方法在榕母管蓟马和榕管蓟马鉴别中的应用。
本发明采用DNA条形码技术对榕母管蓟马和榕管蓟马的快速鉴定方法与传统的形态学特征鉴定相比，降低了人为鉴定误差，克服了两种蓟马体型小、形态特征相似的干扰，能够快速准确的对两种蓟马进行鉴别。
打破了缨翅目昆虫分类专业人员较少的局限，降低了鉴定的技术门槛，只要掌握基本的PCR扩增、测序、遗传分析软件便可以采用该发明介绍的方法进行种类的鉴别。
附图说明
图1为实施例1中四省9个种群的榕母管蓟马和榕管蓟马线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I基因单倍型序列的比对结果；其中，*表示相同的碱基位点。
图2为实施例1中四省9个种群的榕母管蓟马和榕管蓟马核糖体DNA第二内部转录间隔区单倍型序列中用于区分两种类的变异位点示意图，其中数字表示变异位点所在的位置。
图3为实施例1中对47条榕母管蓟马和54条榕管蓟马的COI基因序列进行遗传距离的分析所得的种内遗传距离和种间遗传距离示意图；其中，黑色柱形图显示的是两种蓟马的种内遗传距离，灰色柱形图显示两种蓟马的种间遗传距离。
图4为实施例1中对26条榕母管蓟马和18条榕管蓟马的ITS2序列进行遗传距离的分析获得的种内遗传距离和种间遗传距离示意图；其中，黑色柱形图显示的是两种蓟马的种内遗传距离，灰色柱形图显示两种蓟马的种间遗传距离。
图5为实施例1中邻接法构建的榕母管蓟马和榕管蓟马COI基因的系统发育树。
图6为实施例1中邻接法构建的榕母管蓟马和榕管蓟马ITS2分子标记的系统发育树。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1样品来源
本实施例采用的榕母管蓟马和榕管蓟马来自收集的四省9个种群的样品，具体收集信息见表1。
表1用于研究的榕母管蓟马和榕管蓟马收集信息
2DNA提取
提取DNA具体步骤参考天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，并对部分步骤进行改进，具体如下：
①挑取单头的榕母管蓟马和榕管蓟马成虫，去除腹部，将其余组织结构置于1.5mL离心管中，加入液氮将肌肉研磨充分使其呈均匀匀浆状态，然后加入200μLGA缓冲液；
②加入20～40μL蛋白酶K溶液，震荡混合均匀，视昆虫肌肉量而定；
③放入56℃水浴震荡器中2～4h，直至组织完全溶解；
④加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃水浴震荡器中放置10min，简短离心使管壁的水珠沉入管底部；
⑤加入200μL无水乙醇，来回混匀震荡，简短离心以除去管盖内壁的水珠；
⑥将上一步所得溶液及沉淀加入组装好的吸附柱CB3中，12000rpm离心1min(视情况而定)，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中
⑦向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前需确认已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
⑧向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前需确认已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；再次重复该步骤；
⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心3min，倒掉废液。将吸附柱CB3开盖置于超净工作台中，打开通风按钮，室温放置20～30min，以彻底晾干吸附材料中残存的漂洗液及无水乙醇；
⑩将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加70～200μL洗脱液TE或无菌水，室温放置2～5min，12000rpm离心3min，将溶液收集到离心管中，然后将DNA产物保存于-20℃冰箱中；最后，为了增加基因组DNA的获得率，可将离心得到的溶液再次加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液再次收集到离心管中。
3PCR扩增
利用DNA条形码通用型引物，以榕母管蓟马和榕管蓟马为靶标生物，分别以COI基因引物对扩增其线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I基因(mtDNACOI，约646bp)，以ITS2分子标记引物对扩增其核糖体第二内部转录间隔区(ITS2，1306～1321bp)。
PCR反应引物为：
COI基因引物对：
上游引物，5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
下游引物，5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
ITS2分子标记引物对：
上游引物：5'-AGACTCCTTGGTCCGTGTTTC-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
下游引物：5'-ATCACTCGGCTCGTGGATCG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
PCR反应体系均为25μL，包括5×PCR反应缓冲液5μL，10mMdNTPs0.5μL，5U/μlTaqDNA聚合酶0.5μL，10μM上、下游引物各1μL，模板DNA2μL，无菌水定容至25μL。
PCR扩增反应程序均为：94℃预变性3min；随后进行35个循环，每个循环包括：94℃变性1min，57℃退火1min、72℃延伸1min10s，末次循环72℃延伸5min，最后4℃保存。
PCR扩增产物纯化
采用天根生化科技有限公司(北京)生产的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，具体操作步骤参考试剂盒说明书，部分步骤有改进，具体操作步骤如下：
a向组装好的吸附柱CA2中加入500μ平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中；
b从琼脂糖凝胶中切下单一的目的DNA条带放入干净的离心管中并称重；
c向胶块所在的离心管中加入等体积溶液PN，50℃水浴震荡器中放置数分钟直至胶块彻底溶解；
d将上一步所得溶液加入组装好的吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
e向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液(使用前需先加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
f重复操作步骤e；
g将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心5min，以除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于超净工作台中，打开通风按钮，以彻底晾干，以防止残存的漂洗液影响下一步的实验。
h将吸附柱CA2放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间位置悬空加50～200洗脱缓冲液EB，室温放置2～5min，12000rpm离心5min收集DNA溶液。
4测序及序列比对
将纯化的PCR产物送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序，采用双向测序方法，测序反应在3730XLDNAGeneticAnalyser(ABI)测序仪上进行。测序获得的原始序列峰图通过Chromas软件打开，后续分析仅使用测序质量高的碱基序列信息。通过ContigExpress(VectorNTIsuite6.0)软件进行双向测序结果的拼接及序列的校对。利用ClustalX2软件进行序列比对，从而得到榕母管蓟马和榕管蓟马间保守碱基位点和变异碱基位点，变异碱基位点比对结果见图1(COI基因)和图2(ITS2分子标记)，通过碱基变异位点可对以上两个种进行鉴别。序列比对结果显示榕母管蓟马和榕管蓟马线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I的9个种群四条单倍型序列存在31个变异位点，其中3个为单一变异位点，即第82、92、525碱基位点分别为G/T—G，A/T—A，T/G—T；28个为简约信息位点，其中，第88、265、337、364、370、610、616碱基位点为A—G转换，第28、103、166、214、328、445、470、538、619碱基位点为G—A转换，第78、97、172、271、457、472碱基位点为C—T转换，第151、235、347、355、622bp处碱基依次为T—C转换，第503bp处碱基为G—T颠换。核糖体DNA第二内部转录间隔区的12条单倍型序列存在36个变异位点，5个为单一变异位点，即第374、906、966、1144、1227碱基位点分别为A—C/T/A、C/T—C、T—T/A、T/C—T、A—A/G转换；31个为简约信息位点，其中，第179、376、1116为T—T/C转换，第606、633、1217、1226碱基位点为A—G转换，第136、1325碱基位点为G—A转换，第348、1250、1255、1258为T—C转换，第54、1259碱基位点为C—T转换，第61、1332碱基位点为C—C/T转换，第135、1144碱基位点为C/T—T转换，第790、1327碱基位点为G/A—A转换，第344、377、378、709、979、1228、1331碱基位点分别为C/T—C转换、T—A/T颠换、T—G/T颠换、A/G—G/A转换、A—C/A颠换、G—C/A颠换、A—G/A转换。通过上述碱基变异位点对两个种进行准确区分。
采用K2P(Kimuratwo-parameter)模型邻接法(NJ法)利用本研究中获得的序列和从GenBank、BLOD数据库中下载的序列构建系统发育树，采用K2P(Kimuratwo-parameter)模型计算种内种间遗传距离，从而达到快速区分两个物种的目的。邻接法构建系统发育树，其中分支的置信度采用自展法(Bootstrap)重复检测1000次；采用距离法计算种内和种间遗传距离，依据相关研究报道遗传距离小于2％时为同一个种，遗传距离大于2％时为不同的种，同时种内和种间遗传距离不应有重叠区域出现。
COI基因在构建系统树的过程中使用GenBank和BLOD数据库中下载序列号分别为：澳大利亚地区的EF468721、RFTHY078–10、RFTHY067–10，美国地区的RFTHY069–10、KC513156，摩洛哥地区的RDBAB805–07。
遗传距离的分析所得的种内遗传距离和种间遗传距离示意图见图3和图4。由图3可以看出榕母管蓟马和榕管蓟马COI基因的种内遗传距离为0.00-0.006，平均遗传距离为0.001；种间遗传距离为0.044-0.048，平均遗传距离为0.0444；种间遗传距离为种内遗传距离的44倍；种内遗传距离与种间遗传距离没有重叠区域。图4显示榕母管蓟马和榕管蓟马ITS2基因的种内遗传距离为0.00-0.007，平均遗传距离为0.0017；种间遗传距离为0.017-0.022，平均遗传距离为0.0186；种间遗传距离为种内遗传距离的11倍；种内遗传距离与种间遗传距离没有重叠区域。
图5和图6为基于K2P距离法建立的榕母管蓟马和榕管蓟马COI基因和ITS2分子标记的NJ系统发育树，可明显看出榕母管蓟马和榕管蓟马两物种间分支较长，而种内的遗传分支则较短，每个单系分支对应一个物种，支持率达均到100％。结合从GenBank和BOLD数据库下载的已有的榕母管蓟马的序列，共同构建的COI基因系统发育树显示已经公开的榕母管蓟马序列与本研究中的榕母管蓟马聚在一起形成一个大的分支，更进一步证明了利用这2对DNA引物对中的任一种扩增的分子标记均能够很好的鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马，两者的结果相互验证。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取待鉴定样品的总基因组DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，使用引物对进行PCR扩增，并纯化PCR扩增产物；
3)对步骤2)的纯化后的PCR扩增产物进行测序，依据特定位点的测序结果判断样品为榕母管蓟马还是榕管蓟马。
2.根据权利要求1所述鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，其特征在于，所述引物对为COI基因引物对和/或ITS2分子标记引物对。
3.根据权利要求2所述鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，其特征在于，所述COI基因引物对如下：
上游引物：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
下游引物：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
4.根据权利要求3所述鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，其特征在于，当使用COI基因引物对时，依据扩增产物的第28、78、82、88、92、97、103、151、166、172、214、235、265、271、328、337、347、355、364、370、445、457、470、472、503、525、538、610、616、619、622bp处碱基进行判断：
如上述位点的碱基依次为G、C、G/T、A、A/T、C、G、T、G、C、G、T、A、C、G、A、T、T、A、A、A、C、G、C、G、T/G、G、A、A、G、T的则为榕母管蓟马；
如上述位点的碱基依次为A、T、G、G、A、T、A、C、A、T、A、C、G、T、A、G、C、C、G、G、A、T、A、T、T、T、A、G、G、A、C的则为榕管蓟马。
5.根据权利要求2所述鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，其特征在于，所述ITS2分子标记引物对如下：
上游引物：5'-AGACTCCTTGGTCCGTGTTTC-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
下游引物：5'-ATCACTCGGCTCGTGGATCG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
6.根据权利要求5所述鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，其特征在于，当使用ITS2分子标记引物对时，依据扩增产物的第54、61、135、136、179、344、348、374、376、377、378、606、633、661、662、709、790、841、906、966、978、979、1116、1144、1217、1226、1227、1228、1250、1255、1258、1259、1325、1327、1331、1332bp处碱基进行判断：
如上述位点的碱基依次为C、C、C/T、G、T、T/C、T、A、T、T、T、A、A、T、T、A/G、G/A、T、C/T、T、G、A、T、T/C、A、A、A、G、T、T、T、C、G、A/G、A、C的为榕母管蓟马；
如上述位点的碱基依次为T、C/T、T、A、T/C、C、C、C/T/A、C/T、A/T、G/T、G、G、A、A、A/G、A、A、C、T/A、T、A/C、T/C、T、G、G、A/G、C/A、C、C、C、T、A、A、G/A、C/T的为榕管蓟马。
7.根据权利要求1所述鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，其特征在于，步骤1)所述提取待鉴定样品的总基因组DNA，具体步骤如下：
①挑取待测样品单头的成虫，去除腹部后其余组织置于离心管中加入液氮研磨至匀浆状态，加入200μLGA缓冲液；
②加入20～40μL蛋白酶K溶液；
③56℃震荡2～4h直至组织完全溶解；
④加入200μL缓冲液GB，70℃震荡10min，离心使离心管壁的水珠沉入离心管底部；
⑤加入200μL无水乙醇，震荡混匀，离心以除去离心管盖内壁的水珠；
⑥将⑤所得溶液及沉淀加入吸附柱CB3中，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
⑦向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
⑧向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；再次重复该步骤；
⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心3min，倒掉废液，将吸附柱CB3开盖置于无菌条件下室温放置20～30min，彻底晾干残存的漂洗液及无水乙醇；
⑩将吸附柱CB3转入离心管中，向吸附膜的中间部位滴加70～200μL洗脱液TE或无菌水，室温放置2～5min，12000rpm离心3min，收集DNA，将上清液再次加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm离心2min，再次收集DNA，收集的DNA置于-20℃保存。
8.根据权利要求1所述鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，其特征在于，步骤2)所述PCR，其反应体系为25μl体系：
无菌水余量；
PCR的反应条件为94℃预变性3min，随后进行35个循环；
每个循环包括：94℃变性1min，57℃退火1min、72℃延伸1min10s，末次循环72℃延伸5min；
产物4℃保存。
9.根据权利要求1所述鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法，其特征在于，步骤2)所述纯化PCR扩增产物，具体步骤如下：
a向吸附柱CA2中加入500μ平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2重新放回收集管中；
b从琼脂糖凝胶中切下有单一的目的DNA条带的胶块放入离心管中并称重；
c加入与切下的胶块等体积的溶液PN，50℃震荡至胶块彻底溶解；
d将步骤c所得溶液加入组装好的吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
e向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
f重复操作步骤e；
g将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心5min，以除尽漂洗液，将吸附柱CA2置于无菌条件下室温晾干；
h将吸附柱CA2放入离心管中，向吸附膜的中间位置滴加50～200洗脱缓冲液EB，室温放置2～5min，12000rpm离心5min收集DNA溶液。
10.权利要求1-9任一项所述鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的方法在榕母管蓟马和榕管蓟马鉴别中的应用。
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