CN104894126B - 一种检测cpt-ⅱ基因突变的引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测CPT-Ⅱ基因突变的引物，包括扩增CPT-Ⅱ基因全部外显子及外显子/内含子交界区突变的引物，其引物序列如SEQ？ID？NO.1-SEQ？ID？NO.16所示。本发明还公开了一种检测CPT-Ⅱ基因突变的试剂盒，以及一种非诊断目的检测CPT-Ⅱ基因突变的方法。本发明克服了现有技术中仅对热点突变进行检测的局限性，通过设计特异的扩增引物即可对CPT-Ⅱ基因的全部外显子及外显子/内含子交界区进行捕获，一次性的将多个潜在的突变位点检测出来。

Description

一种检测CPT-Ⅱ基因突变的引物及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测CPT-Ⅱ基因突变的引物、方法和试剂盒。

背景技术

肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅱ(CarnitinePalmitoyltransferase-Ⅱ,CPT-Ⅱ)位于细胞线粒体内膜上，是脂肪酸氧化过程中起关键作用的酶之一，可逆地催化从酰基辅酶A将酰基转移至L-肉毒碱的反应，在长链脂肪酸从线粒体外膜转运到线粒体内膜过程中起重要作用。CPT-Ⅱ基因全长3090个核苷酸，定位于1p32染色体上，含有5个外显子及4个内含子，编码658个氨基酸肽链。CPT-Ⅱ基因突变引起CPT-Ⅱ功能缺陷，肉碱依赖的转运系统功能将遭到破坏，导致脂酰肉碱不能有效地转化成相应的脂酰辅酶A，故线粒体中长链酰基肉碱大量聚集，血中酰基肉碱明显增高，从而引起一系列生化紊乱。

目前已发现90多种与疾病相关的CPT-Ⅱ基因突变类型，其中大部分为错义突变，也包括含两种内含子与外显子交界区的剪切点突变。

对于CPT-Ⅱ基因突变的检测通常为针对某一个热点突变进行检测，尚未有关于利用多个特异性引物对CPT-Ⅱ基因多个突变同时进行测定的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测CPT-Ⅱ基因突变的引物和试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种非诊断目的检测CPT-Ⅱ基因的全部外显子及外显子/内含子交界区突变的方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种检测CPT-Ⅱ基因突变的引物，包括扩增CPT-Ⅱ基因5个外显子及外显子/内含子交界区的引物，其引物序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.16所示，具体如下：

CPT-Ⅱ-P1-F：5’–CACAGTCTCGCAAGGATGG-3’；(SEQIDNO.1)

CPT-Ⅱ-P1-R：5’–GCGGAAACGGGTTCACTAG-3’；(SEQIDNO.2)

CPT-Ⅱ-P2-F：5’–TTACACTGACCCTGCTTTCT-3’；(SEQIDNO.3)

CPT-Ⅱ-P2-R：5’–TTACATCTGCCACAACCCTA-3’；(SEQIDNO.4)

CPT-Ⅱ-P3-F：5’–TTTTAGGGCTATGCTGTTGG-3’；(SEQIDNO.5)

CPT-Ⅱ-P3-R：5’–TTAGCAGGAAGTATGTCAGG-3’；(SEQIDNO.6)

CPT-Ⅱ-P4-1-F：5’–GTGGAGGACGCCTGTAATC-3’；(SEQIDNO.7)

CPT-Ⅱ-P4-1-R：5’–ACGCATTGACCAGGTAGGC-3’；(SEQIDNO.8)

CPT-Ⅱ-P4-2-F：5’–CCGGTTTCTGAAGACACTCC-3’；(SEQIDNO.9)

CPT-Ⅱ-P4-2-R：5’–CCAGATGTCTCGGTTCTCAC-3’；(SEQIDNO.10)

CPT-Ⅱ-P4-3-F：5’–TCGGAAATCCAGGCACATC-3’；(SEQIDNO.11)

CPT-Ⅱ-P4-3-R：5’–AGAGCCATCCTTGGCGATA-3’；(SEQIDNO.12)

CPT-Ⅱ-P4-4-F：5’–AAGATGGGAACATTGTGAGC-3’；(SEQIDNO.13)

CPT-Ⅱ-P4-4-R：5’–GATTTAGGCTTGCTTACCCA-3’；(SEQIDNO.14)

CPT-Ⅱ-P5-F：5’–AGGTTAGTCAGTTGGTGGTG-3’；(SEQIDNO.15)

CPT-Ⅱ-P5-R：5’–CCTGGGTTCAAGCAATTCTG-3’；(SEQIDNO.16)

其中，F为正向引物，R为反向引物。

CPT-Ⅱ基因外显子4较大，有1305个碱基，且该外显子内含有105个基因多态性，进行引物设计比较困难。本发明通过对引物互补、发夹结构和引物交联等引物二级结构进行了精确的分析，将CPT-Ⅱ基因外显子4及外显子/内含子交界区分成四段，即4-1、4-2、4-3、4-4，然后为每一段分别设计一对引物，分别如SEQIDNO.7-SEQIDNO.14所示。

本发明还提供了一种检测CPT-Ⅱ基因突变的试剂盒，该试剂盒中含有扩增CPT-Ⅱ基因5个外显子及外显子/内含子交界区的引物。

本发明所述的试剂盒还包括用于PCR扩增反应的酶和试剂。

用于PCR扩增反应的酶和试剂包括Taq酶、dNTP、10×PCR缓冲液和双蒸水。

进一步的，所述试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试剂。

本发明还提供非诊断目的检测检测CPT-Ⅱ基因的全部外显子及外显子/内含子交界区突变的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)以样本DNA为模板，用扩增CPT-Ⅱ基因5个外显子及外显子/内含子交界区的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)采用测序引物对扩增产物进行测序扩增，得到测序扩增产物；

(4)对测序扩增产物进行测序，并与数据库中正常的CPT-Ⅱ基因序列进行比对，从而确定CPT-Ⅱ基因的突变位点。

步骤(2)中，PCR扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性35s，退火35s，特异性扩增引物的退火温度为52.8-57℃，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。

步骤(3)中，所述测序引物为PCR扩增引物对中的正向引物。

步骤(3)中，测序扩增反应的条件是：95℃预变性120s，95℃变性30s，50℃退火10s，60℃延伸120s，共25个循环。

测序扩增反应体系采用10ul,具体组成为：DNA模板1μL、引物(正、反向)各1μL、BDT2μL、双蒸水补足至总体积10μL。

步骤(4)中，测序的方法为Sanger法。

本发明的有益效果：

本发明克服了现有技术中仅对热点突变进行检测的局限性，通过设计特异的扩增引物即可对CPT-Ⅱ基因的全部外显子及外显子/内含子交界区进行捕获，一次性的将多个潜在的突变位点检测出来。

附图说明

图1为CPT-Ⅱ基因外显子及外显子/内含子交界区PCR扩增产物电泳图；其中，M泳道：DNAmarker，1～8泳道：分别为CPT-Ⅱ基因外显子及交界区1、2、3、4-1、4-2、4-3、4-4和5。

图2A为CPT-Ⅱ基因外显子4及外显子/内含子交界区4-3测序的部分结果，图的上方为NCBI数据库中标准CPT-Ⅱ基因序列，其下行为检测的样本CPT-Ⅱ基因序列；图2A显示：在cDNA1055位置，T突变为G。

图2B为CPT-Ⅱ基因外显子4及外显子/内含子交界区4-4测序的部分结果，图的上方为NCBI数据库中标准CPT-Ⅱ基因序列，其下行为检测的样本CPT-Ⅱ基因序列；图2B显示：在cDNA1102位置，G突变为A。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

下面实施例中所用一些材料和试剂均为进口分装或国产分析纯。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例1：特异性扩增引物的设计

根据NCBI数据库中CPT-Ⅱ正常基因的参考序列设计特异性扩增引物，该特异性扩增引物应满足以下条件：

(1)产物不能形成二级结构、碱基要随机分布，引物自身不能有连续4个碱基的互补；

(2)所有PCR片段正反向引物退火温度相差不超过5℃，各产物退火温度在52℃-58℃之间，保证扩增的特异性和稳定性；

(3)PCR扩增引物的正向扩增引物即为用于测序扩增的引物，长度在18-20bp之间。

本发明设计的特异性扩增引物如表1所示。

实施例2：样本DNA提取

本发明所用的阳性样本取自山东的受试者，经医院确诊为肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅱ缺乏症，经受试者同意，取其血液样本。

使用血液基因组提取试剂盒(天根生化科技[北京]有限公司)抽提基因组DNA，示例性的步骤如下：

(1)取红细胞裂解液900μl，置入1.5mL的EP管中；

(2)在上述EP管中加入全血300μL，上下颠倒混匀，室温下温育10min，以使红细胞裂解，注意温育期间至少上下颠倒混合一次；

(3)室温下13200×g离心20s，用吸头移弃大部分上清液(注意在管内留约20μL-30μl此左右的上清液)；

(4)旋涡器震荡上管，使细胞悬浮于残液中，以利于下一步的白细胞裂解；

(5)向上管中加入白细胞裂解液300μl，用吸头上下抽吸，使细胞裂解；

(6)室温下，加入蛋白质沉淀液100μL，旋涡器高速下震荡20s，以混合；

(7)4℃下13200×g离心3min，沉淀的蛋白质应该为致密的、黑褐色。如无蛋白质沉淀，需要重复上一步，并在冰上温育5min，再重复该步；

(8)取含DNA的上清液放入新的EP管中，加入100％异丙醇(2-propano1)300μL，轻轻上下颠倒50次，以混匀；

(9)4℃下13200×g离心1min，DNA会形成小的白色沉淀；

(10)移弃上清液，在吸干纸上短暂吸干EP管，加70％乙醇300μL，轻轻上下颠倒数次，以洗涤DNA沉淀；

(11)4℃下13200×g离心1min，仔细倒掉乙醇，由于DNA沉淀松软，故倒乙醇时要慢慢进行；

(12)倒置放置离心管于吸干纸，空气干燥10～15min：

(13)加入DNA溶解液50μL，65℃温育lh和/或室温过夜，如有可能轻弹EP管，以促进DNA溶解。

根据以上步骤可得出50μLDNA样品。

实施例3：PCR扩增

利用本实施例1中设计的特异性扩增引物，以样本DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系采用50μL,具体组成为：DNA模板3μL、引物(正、反向)各2μL、Taq酶0.4μL、dNTP4μL、10×PCR缓冲液5μL、双蒸水补足至总体积50μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性35s，退火35s，特异性扩增引物的退火温度为52.8-57℃，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。

对特异性扩增引物的退火温度进行考察和优化，优化得到的各特异性扩增引物的退火温度见表1。

表1.CPT-Ⅱ基因5个外显子及外显子/内含子交界区特异性扩增引物及退火温度

实施例4：凝胶电泳检测

对实施例3中PCR扩增后的产物进行凝胶电泳检测，检测扩增出的片段是否为需要的目的片段的大小，Marker采用MarkerⅡ(天根生化科技[北京]有限公司)，电泳采用的是2％琼脂糖凝胶，电泳条件：90V，40分钟。PCR扩增产物的电泳结果如图1所示。图1显示了CPT-Ⅱ基因5个外显子及外显子/内含子交界区扩增产物，根据Marker(MarkerⅡ,天根生化科技[北京]有限公司)的比对，可以确定8个条带的大小，分别是297bp～937bp，与预测结果一致。

实施例5：PCR扩增产物的切胶纯化

对实施例3中PCR扩增出的产物凝胶电泳后，在紫外灯下切取目的条带，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技[北京]有限公司)将切取得到的凝胶回收纯化，示例性的步骤如下：

(1)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。

(2)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(3)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μLPN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

(5)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

(6)重复操作步骤(5)。

(7)将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

(8)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。

根据以上步骤可得出30μL纯化PCR扩增产物样品。

实施例6：测序扩增产物的制备

采用测序引物对实施例5中纯化的PCR产物进行测序扩增，得到测序扩增产物。测序引物为表1中的正向引物。

测序扩增反应的条件是：95℃预变性120s，95℃变性30s，50℃退火10s，60℃延伸120s，共25个循环。

测序扩增反应体系采用10ul,具体组成为：DNA模板1μL、引物(正、反向)各1μL、BDT2μL、双蒸水补足至总体积10μL。

将测序扩增产物进行切胶回收纯化，示例性的步骤与实施例5相同。

实施例7：在ABI3730测序仪上进行扩测序

使用ABI3730测序仪对实施例6纯化的测序扩增产物进行测序。示例性的测序结果示于图2A和图2B。

图2A和图2B显示了CPT-Ⅱ基因外显子4及外显子/内含子交界区2段即4-3、4-4测序的部分结果，每个图的最上方为NCBI数据库中标准CPT-Ⅱ基因序列，其下行为为检测样本的CPT-Ⅱ基因序列。图2A显示：在cDNA1055位置，T突变为G(1055T-G,F352C,杂合子，exon4)。图2B显示：在cDNA1102位置，G突变为A(1102G-A,V368I,杂合子，exon4)。

Claims (9)

1.一种检测CPT-Ⅱ基因突变的引物，其特征在于，包括扩增CPT-Ⅱ基因5个外显子及外显子/内含子交界区的引物，其引物序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.16所示。

2.一种检测CPT-Ⅱ基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的检测CPT-Ⅱ基因突变的引物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：用于PCR扩增反应的酶和试剂。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述用于PCR扩增反应的酶和试剂，包括Taq酶、dNTP、10×PCR缓冲液和双蒸水。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试剂。

6.一种非诊断目的检测CPT-Ⅱ基因的全部外显子及外显子/内含子交界区突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取待测样本DNA；

（2）以样本DNA为模板，用扩增CPT-Ⅱ基因5个外显子及外显子/内含子交界区的引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述引物序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.16所示；

（3）采用测序引物对扩增产物进行测序扩增，得到测序扩增产物；

（4）对测序扩增产物进行测序，并与数据库中正常的CPT-Ⅱ基因序列进行比对，从而确定CPT-Ⅱ基因的突变位点。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性35s，退火35s，特异性扩增引物的退火温度为52.8-57℃，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述测序引物为PCR扩增引物对中的正向引物。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，测序的方法为Sanger法。