CN105063216A - 用于检测表皮生长因子基因突变的引物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测EGF基因突变的引物，包括扩增EGF基因全部编码外显子及外显子/内含子交界区突变的引物，其引物序列如SEQ？ID？NO.1-？SEQ？ID？NO.46所示。本发明还公开了一种检测EGF基因突变的试剂盒，以及一种非诊断目的检测EGF基因突变的方法。本发明克服了现有技术中仅对热点突变进行检测的局限性，通过设计特异的扩增引物即可对EGF基因的全部编码外显子及外显子/内含子交界区进行捕获，一次性的将多个潜在的突变位点检测出来。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测表皮生长因子基因突变的引物、方法和试剂盒。
背景技术
表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)是一种由53个氨基酸残基组成的小肽，分子量6201Da，分子内有6个半胱氨酸组成的二硫键，形成3个分子内环型结构，组成生物活性所必须的受体结合区域。人的EGF主要由唾液腺、肾脏及十二指肠的Brunner氏腺等合成和分泌，广泛存在于血液、唾液、胃液、尿液、乳汁、羊水等体液中。EGF通过与靶细胞膜上高亲和细胞表面受体即表皮生长因子受体结合而发挥作用，参与多种细胞的生长、增殖和分化。EGF基因定位于4q25染色体上，全长约110kb，含有23个编码外显子。EGF基因突变引起EGF功能缺陷，导致低镁血症4型的发生。另外，该基因的功能失调还与某些癌症的发生、发展有关。目前仅发现3种与疾病相关的EGF基因突变类型。
对于EGF基因突变的检测通常为针对某一个热点突变进行检测，尚未有关于利用多个特异性引物对EGF基因多个突变同时进行测定的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测EGF基因突变的引物和试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种非诊断目的检测EGF基因的全部编码外显子及外显子/内含子交界区突变的方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种检测EGF基因突变的引物，包括扩增EGF基因23个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物，其引物序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.46所示，具体如下：
EGF-P1-F：5’–CAGTGAAGTCAGCCAGAGCA-3’；(SEQIDNO.1)
EGF-P1-R：5’–CCAAGCAATTAGCCAGGTGT-3’；(SEQIDNO.2)
EGF-P2-F：5’–GTTGGTTGTCATTGGGAAGT-3’；(SEQIDNO.3)
EGF-P2-R：5’–CTATATTTGGCAGACACGCA-3’；(SEQIDNO.4)
EGF-P3-F：5’–GGGTCAGAGGAGGTAAATGC-3’；(SEQIDNO.5)
EGF-P3-R：5’–CAAAAGAGGGCTTTGGTCTC-3’；(SEQIDNO.6)
EGF-P4-F：5’–AAACTTGCCCTGTGAAGGAG-3’；(SEQIDNO.7)
EGF-P4-R：5’–ACAGACGGTAAATCTGGAGC-3’；(SEQIDNO.8)
EGF-P5-F：5’–TCTTCCCCATTTTCATCACA-3’；(SEQIDNO.9)
EGF-P5-R：5’–TGAATGGGTGGGAACTATGT-3’；(SEQIDNO.10)
EGF-P6-F：5’–GACTTATTTTACCCTTTGCT-3’；(SEQIDNO.11)
EGF-P6-R：5’–TCATAGCCACCTTAGAAACA-3’；(SEQIDNO.12)
EGF-P7-F：5’–AATTTTCAGGCATAACCACA-3’；(SEQIDNO.13)
EGF-P7-R：5’–CTCAAAGCCCTTGCTCATA-3’；(SEQIDNO.14)
EGF-P8-F：5’–AGCCTGGGTGAAAGAGTGA-3’；(SEQIDNO.15)
EGF-P8-R：5’–AGTTCCAGACAACCACAGCA-3’；(SEQIDNO.16)
EGF-P9-F：5’–CATCCTCTTGCCTGTCTTCA-3’；(SEQIDNO.17)
EGF-P9-R：5’–AGTCTCCCATCCTCATCTCC-3’；(SEQIDNO.18)
EGF-P10-F：5’–CAAGCTCTTAACACCCTGTA-3’；(SEQIDNO.19)
EGF-P10-R：5’–TTGTTCAACTCCCACTTATG-3’；(SEQIDNO.20)
EGF-P11-F：5’–TGGGCTTATTGCTGCTACT-3’；(SEQIDNO.21)
EGF-P11-R：5’–GGTTTCTGGTTTTGGACACT-3’；(SEQIDNO.22)
EGF-P12-F：5’–TTACTCAAGCCTATTTACTC-3’；(SEQIDNO.23)
EGF-P12-R：5’–TGTCTCTATTCCATATTCAC-3’；(SEQIDNO.24)
EGF-P13-F：5’–TTCCACCTTTCTCCTTCATG-3’；(SEQIDNO.25)
EGF-P13-R：5’–GAGGTGAAATTGGAGGGATA-3’；(SEQIDNO.26)
EGF-P14-F：5’–TTCATCTTCAAACCCACTTG-3’；(SEQIDNO.27)
EGF-P14-R：5’–TTGCCTGTAATAAGGAACTCA-3’；(SEQIDNO.28)
EGF-P15-F：5’–TAGCAGGGTGAGGTTTACTA-3’；(SEQIDNO.29)
EGF-P15-R：5’–CTTTCTCAGGCACATCATTC-3’；(SEQIDNO.30)
EGF-P16-F：5’–CAACCTCCTGATTCTCCTAC-3’；(SEQIDNO.31)
EGF-P16-R：5’–AATTCTTCCCCTTAATGACA-3’；(SEQIDNO.32)
EGF-P17-F：5’–TAATCGGATAGGTGGGAACT-3’；(SEQIDNO.33)
EGF-P17-R：5’–ATCCTGTCTTCCCTCTGCT-3’；(SEQIDNO.34)
EGF-P18-F：5’–CTCCTCTTCCAAAGGCTGTC-3’；(SEQIDNO.35)
EGF-P18-R：5’–TAGACCACCCACCAACCTAC-3’；(SEQIDNO.36)
EGF-P19-F：5’–AATACTGAGCCCAAAGGAAG-3’；(SEQIDNO.37)
EGF-P19-R：5’–CCAGAAACAGATCACGGATG-3’；(SEQIDNO.38)
EGF-P20-F：5’–ATCCCAGAGCAAACAGACGA-3’；(SEQIDNO.39)
EGF-P20-R：5’–ACACGGAGTCTCGCTCTATC-3’；(SEQIDNO.40)
EGF-P21-F：5’–ACACCCTCTACCTCACAGAA-3’；(SEQIDNO.41)
EGF-P21-R：5’–ACTTGGCTAACACTGACACC-3’；(SEQIDNO.42)
EGF-P22-F：5’–GCCTTTCTTCTGACTTTCAC-3’；(SEQIDNO.43)
EGF-P22-R：5’–ACAGCCCAGCTATTCACATA-3’；(SEQIDNO.44)
EGF-P23-F：5’–ACCGTTTAGGGTCTGTCTTG-3’；(SEQIDNO.45)
EGF-P23-R：5’–CCAGGCATTGAGTAGGTGAT-3’；(SEQIDNO.46)
其中，F为正向引物，R为反向引物。
EGF基因外显子较多。本发明通过对引物互补、发夹结构和引物交联等引物二级结构进行了精确的分析，将EGF基因23个编码外显子及外显子/内含子交界区分别设计二对引物，根据PCR扩增结果分别择优选取一对引物，分别如SEQIDNO.1-SEQIDNO.46所示。
本发明还提供了一种检测EGF基因突变的试剂盒，该试剂盒中含有扩增EGF基因23个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物。
本发明所述的试剂盒还包括用于PCR扩增反应的酶和试剂。
用于PCR扩增反应的酶和试剂包括Taq酶、dNTP、10×PCR缓冲液和双蒸水。
进一步的，所述试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试剂。
本发明还提供非诊断目的检测检测EGF基因的全部编码外显子及外显子/内含子交界区突变的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样本DNA；
（2）以样本DNA为模板，用扩增EGF基因23个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
（3）采用测序引物对扩增产物进行测序扩增，得到测序扩增产物；
（4）对测序扩增产物进行测序，并与数据库中正常的EGF基因序列进行比对，从而确定EGF基因的突变位点。
步骤（2）中，PCR扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性35s，退火35s，特异性扩增引物的退火温度为49℃-57℃，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。
步骤（3）中，所述测序引物为PCR扩增引物对中的正向引物。
步骤（3）中，测序扩增反应的条件是：95℃预变性120s，95℃变性30s，50℃退火10s，60℃延伸120s，共25个循环。
测序扩增反应体系采用10ul,具体组成为：DNA模板1μL、引物（正、反向）各1μL、BDT2μL、双蒸水补足至总体积10μL。
步骤（4）中，测序的方法为Sanger法。
本发明的有益效果：
本发明克服了现有技术中仅对热点突变进行检测的局限性，通过设计特异的扩增引物即可对EGF基因的全部编码外显子及外显子/内含子交界区进行捕获，一次性的将多个潜在的突变位点检测出来。
附图说明
图1A为EGF基因1~17编码外显子及外显子/内含子交界区PCR扩增产物电泳图；其中，M泳道：DNAmarker，1~17泳道：分别为EGF基因1~17编码外显子及外显子/内含子交界区。
图1B为EGF基因18~23编码外显子及外显子/内含子交界区PCR扩增产物电泳图；其中，M泳道：DNAmarker，18~23泳道：分别为EGF基因18~23编码外显子及外显子/内含子交界区。
图2A为EGF基因编码外显子13及外显子/内含子交界区测序的部分结果，图的上方为NCBI数据库中标准EGF基因序列，其下行为检测的样本EGF基因序列；图2A显示：在cDNA2525位置，A突变为G。
图2B为EGF基因编码外显子23及外显子/内含子交界区测序的部分结果，图的上方为NCBI数据库中标准EGF基因序列，其下行为检测的样本EGF基因序列；图2B显示：在cDNA3859位置插入C。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
下面实施例中所用一些材料和试剂均为进口分装或国产分析纯。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001）中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
实施例1：特异性扩增引物的设计
根据NCBI数据库中EGF正常基因的参考序列设计特异性扩增引物，该特异性扩增引物应满足以下条件：
（1）产物不能形成二级结构、碱基要随机分布，引物自身不能有连续4个碱基的互补；
（2）所有PCR片段正反向引物退火温度相差不超过5℃，各产物退火温度在48℃-58℃之间，保证扩增的特异性和稳定性；
（3）PCR扩增引物的正向扩增引物即为用于测序扩增的引物，长度在18-22bp之间。
本发明设计的特异性扩增引物如表1所示。
实施例2：样本DNA提取
本发明所用的阳性样本取自山东的受试者，经医院确诊为低镁血症4型，经受试者同意，取其血液样本。
采用GentraPuregene血液DNA抽提试剂盒（Qiagen，德国），按照说明书的要求提取血液基因组DNA,具体步骤如下：
（1）取红细胞裂解液900μL，置入1.5mL的EP管中；
（2）在上述EP管中加入全血300μL，上下颠倒混匀，室温下温育10min，以使红细胞裂解，注意温育期间至少上下颠倒混合一次；
（3）室温下13200×g离心20s，用吸头移弃大部分上清液（注意在管内留约20μL~30μL左右的上清液）；
（4）旋涡器震荡上管，使细胞悬浮于残液中，以利于下一步的白细胞裂解；
（5）向上管中加入白细胞裂解液300μL，用吸头上下抽吸，使细胞裂解；
（6）室温下，加入蛋白质沉淀液100μL，旋涡器高速下震荡20s，以混合；
（7）4℃下13200×g离心3min，沉淀的蛋白质为致密的、黑褐色。如无蛋白质沉淀，需重复上一步，并在冰上温育5min，再重复该步；
（8）取含DNA的上清液放入新的EP管中，加入100%异丙醇(2-propanol)300μL，轻轻上下颠倒50次，以混匀；
（9）4℃下13200×g离心1min，DNA会形成小的白色沉淀；
（10）移弃上清液，在吸干纸上短暂吸干EP管，加70%乙醇300μL，轻轻上下颠倒数次，以洗涤DNA沉淀；
（11）4℃下13200×g离心1min，仔细倒掉乙醇，由于DNA沉淀松软，故倒乙醇时要慢慢进行；
（12）倒置放置离心管于吸干纸，空气干燥10~15min；
（13）加入DNA溶解液50μL，65℃温育1h和/或室温过夜，如有可能轻弹EP管，以促进DNA溶解；
根据以上步骤可得出50μLDNA样品。
实施例3：PCR扩增
利用本实施例1中设计的特异性扩增引物，以样本DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系采用50μL,具体组成为：DNA模板3μL、引物（正、反向）各2μL、Taq酶0.4μL、dNTP4μL、10×PCR缓冲液5μL、双蒸水补足至总体积50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性35s，退火35s，特异性扩增引物的退火温度为49℃-57℃，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。
对特异性扩增引物的退火温度进行考察和优化，优化得到的各特异性扩增引物的退火温度见表1。
表1.EGF基因23个编码外显子及外显子/内含子交界区特异性扩增引物及退火温度
| 外显子 | 正向引物(5’→3’) | 反向引物(5’→3’) | 片段大小（bp） | 退火温度（℃） |
| 1 | CAGTGAAGTCAGCCAGAGCA | CCAAGCAATTAGCCAGGTGT | 770 | 56 |
| 2 | GTTGGTTGTCATTGGGAAGT | CTATATTTGGCAGACACGCA | 410 | 53 |
| 3 | GGGTCAGAGGAGGTAAATGC | CAAAAGAGGGCTTTGGTCTC | 490 | 57 |
| 4 | AAACTTGCCCTGTGAAGGAG | ACAGACGGTAAATCTGGAGC | 737 | 55 |
| 5 | TCTTCCCCATTTTCATCACA | TGAATGGGTGGGAACTATGT | 520 | 53 |
| 6 | GACTTATTTTACCCTTTGCT | TCATAGCCACCTTAGAAACA | 357 | 50 |
| 7 | AATTTTCAGGCATAACCACA | CTCAAAGCCCTTGCTCATA | 547 | 51 |
| 8 | AGCCTGGGTGAAAGAGTGA | AGTTCCAGACAACCACAGCA | 289 | 55 |
| 9 | CATCCTCTTGCCTGTCTTCA | AGTCTCCCATCCTCATCTCC | 594 | 55 |
| 10 | CAAGCTCTTAACACCCTGTA | TTGTTCAACTCCCACTTATG | 534 | 52 |
| 11 | TGGGCTTATTGCTGCTACT | GGTTTCTGGTTTTGGACACT | 379 | 53 |
| 12 | TTACTCAAGCCTATTTACTC | TGTCTCTATTCCATATTCAC | 657 | 49 |
| 13 | TTCCACCTTTCTCCTTCATG | GAGGTGAAATTGGAGGGATA | 682 | 53 |
| 14 | TTCATCTTCAAACCCACTTG | TTGCCTGTAATAAGGAACTCA | 383 | 52 |
| 15 | TAGCAGGGTGAGGTTTACTA | CTTTCTCAGGCACATCATTC | 463 | 53 |
| 16 | CAACCTCCTGATTCTCCTAC | AATTCTTCCCCTTAATGACA | 730 | 52 |
| 17 | TAATCGGATAGGTGGGAACT | ATCCTGTCTTCCCTCTGCT | 426 | 54 |
| 18 | CTCCTCTTCCAAAGGCTGTC | TAGACCACCCACCAACCTAC | 227 | 56 |
| 19 | AATACTGAGCCCAAAGGAAG | CCAGAAACAGATCACGGATG | 750 | 54 |
| 20 | ATCCCAGAGCAAACAGACGA | ACACGGAGTCTCGCTCTATC | 784 | 56 |
| 21 | ACACCCTCTACCTCACAGAA | ACTTGGCTAACACTGACACC | 494 | 55 |
| 22 | GCCTTTCTTCTGACTTTCAC | ACAGCCCAGCTATTCACATA | 349 | 53 |
| 23 | ACCGTTTAGGGTCTGTCTTG | CCAGGCATTGAGTAGGTGAT | 459 | 55 |
实施例4：凝胶电泳检测
对实施例3中PCR扩增后的产物进行凝胶电泳检测，检测扩增出的片段是否为需要的目的片段的大小，Marker采用MarkerⅡ(天根生化科技[北京]有限公司)，电泳采用的是2%琼脂糖凝胶，电泳条件：90V，40分钟。PCR扩增产物的电泳结果如图1A、图1B所示。图1A、图1B显示了EGF基因23个编码外显子及外显子/内含子交界区扩增产物，根据Marker(MarkerⅡ,天根生化科技[北京]有限公司)的比对，可以确定23个条带的大小，分别是227bp~784bp，与预测结果一致。
实施例5：PCR扩增产物的切胶纯化
对实施例3中PCR扩增出的产物凝胶电泳后，在紫外灯下切取目的条带，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技[北京]有限公司)将切取得到的凝胶回收纯化，示例性的步骤如下：(1)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
(2)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(3)向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μLPN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
(5)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW（使用前加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
(6)重复操作步骤（5）。
(7)将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
(8)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。
根据以上步骤可得出30μL纯化PCR扩增产物样品。
实施例6：测序扩增产物的制备
采用测序引物对实施例5中纯化的PCR产物进行测序扩增，得到测序扩增产物。测序引物为表1中的正向引物。
测序扩增反应的条件是：95℃预变性120s，95℃变性30s，50℃退火10s，60℃延伸120s，共25个循环。
测序扩增反应体系采用10ul,具体组成为：DNA模板1μL、引物（正、反向）各1μL、BDT2μL、双蒸水补足至总体积10μL。
将测序扩增产物进行切胶回收纯化，示例性的步骤与实施例5相同。
实施例7：在ABI3730测序仪上进行扩测序
使用ABI3730测序仪对实施例6纯化的测序扩增产物进行测序。示例性的测序结果示于图2A和图2B。
图2A和图2B显示了EGF基因编码外显子13及外显子/内含子交界区、编码外显子23及外显子/内含子交界区测序的部分结果，每个图的最上方为NCBI数据库中标准EGF基因序列，其下行为为检测样本的EGF基因序列。图2A显示：在cDNA2525位置，A突变为G（2525A-G,A691A,杂合子，exon13）。图2B显示：在cDNA3859位置插入C（3859inC,Q1136fs/1153X,杂合子，exon23）。
SEQUENCELISTING
<110>济南市儿童医院
<120>用于检测表皮生长因子基因突变的引物及试剂盒
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<213>人工序列
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<211>20
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<400>39
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<400>45
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
ccaggcattgagtaggtgat20
Claims (9)
1.一种检测EGF基因突变的引物，其特征在于，包括扩增EGF基因23个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物，其引物序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.46所示。
2.一种检测EGF基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的检测EGF基因突变的引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：用于PCR扩增反应的酶和试剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，用于PCR扩增反应的酶和试剂，包括Taq酶、dNTP、10×PCR缓冲液和双蒸水。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试剂。
6.一种非诊断目的检测检测EGF基因的全部编码外显子及外显子/内含子交界区突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取待测样本DNA；
（2）以样本DNA为模板，用扩增EGF基因23个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
（3）采用测序引物对扩增产物进行测序扩增，得到测序扩增产物；
（4）对测序扩增产物进行测序，并与数据库中正常的EGF基因序列进行比对，从而确定EGF基因的突变位点。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增的条件为：94℃预变性3min，94℃变性35s，退火35s，特异性扩增引物的退火温度为49℃-57℃，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述测序引物为PCR扩增引物对中的正向引物。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，测序的方法为Sanger法。
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| Title |
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| GENEBANK: "《Homo sapiens epidermal growth factor（EGF），RefSeqGene on chromosome 4 》", 《GENEBANK，NG_011441.1》 * |
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