CN1763196A

CN1763196A - 基因突变类型及基因测序方法

Info

Publication number: CN1763196A
Application number: CN 200510098513
Authority: CN
Inventors: 陈彪; 唐晓梅; 杨静芳
Original assignee: Xuanwu Hospital
Current assignee: Xuanwu Hospital
Priority date: 2004-09-13
Filing date: 2005-08-31
Publication date: 2006-04-26
Anticipated expiration: 2025-08-31
Also published as: CN1763196B

Abstract

本发明涉及与CADASIL相关的基因突变类型及其检测方法，其中，几种基因突变类型分别为：在外显子Exon4中的密码子134的TGC突变为TAC；在Exon4中的密码子141的CGC突变为TGC；在Exon3中的密码子90的CGT突变为TGT；在Exon4中的密码子117的TGC突变为CGC；在Exon4中的密码子169的CGC突变为TGC；在Exon4中的密码子182的CGC突变为TGC。该基因测序方法包括：提取DNA样本；对22个外显子设计引物；选择10个突变热点外显子进行PCR扩增；运用DHPLC技术进行核苷酸分析；对DHPLC阳性的样本进行基因测序，以确定其基因类型；对DHPLC阴性的样本进行其他外显子PCR扩增，进行DHPLC检测，对DHPLC检测阳性的样本进行基因测序。

Description

基因突变类型及基因测序方法

技术领域

本发明涉及到基因及其检测方法，特别涉及伴皮质下梗死及白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(cerebral autosomaldominant arteriopathy with subcortical infarcts andleukoencephalopathy CADASIL)基因突变类型及突变位点的检测方法，尤其涉及对中国人CADASIL病的基因突变类型及突变位点的检测方法。

背景技术

脑血管病是神经系统的常见病及多发病，是目前人类疾病的三大死亡原因之一，存活者中50％～70％病人遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来沉重的负担。近年来，脑卒中发病有年轻化的趋势，遗传因素在脑卒中的作用越来越受到人们的重视，CADASIL作为中、青年脑梗死的病因之一，逐渐成为人们研究的重点。其临床特点为中年起病，具有家族遗传性，反复缺血发作，认知功能障碍，偏头痛发作。

Notch3单基因突变是CADASIL的分子遗传学基础。诊断的主要手段为基因突变检测和皮肤肌肉组织活检。目前，全世界已经有超过400个相关CADASIL家系报道。曾有报道，CADASIL在英国发病率至少为十万分之一。CADASIL作为中风、痴呆、偏头痛、癫痫的病因，越来越受到人们的重视，但多数报道为白种人，黄色人种的相关报道较少，中国在2000年报道了首例家系。

1993年，Tournier-Lasserve等人通过对两个无关联家庭的基因连锁分析的方法，将疾病的致病基因定位于19号常染色体，1996年Joutel A等人将致病基因进一步定位为Notch3(Joutel A，et al，Notch3 Mutations in CADASIL，a Hereditary Adult-onset ConditionCausing Stroke and Dementia.Nature 383：707-710，1996)，并进一步证实Notch3基因的表达高度局限于血管平滑肌细胞，Notch3属于高度保守的Notch/LIN-12受体家族，编码含有2321氨基酸的跨膜受体蛋白，它包括细胞外包含34个表皮样生长因子重复序列(epidermal growth factor like repeats，EGF-like repeats)，富含3个半胱氨酸Notch/LIN-12的重复序列，跨膜区和细胞内含有6个锚蛋白的重复序列。研究发现，细胞外区EGF-like重复序列与相关配体结合有关。EGF-like重复序列中包含40-50个氨基酸，并大量存在于细胞外蛋白的不同功能区，每个EGF序列包含6个高度保守的半胱氨酸残基，并形成3个二硫键，研究者认为二硫键对于蛋白稳定及蛋白与蛋白的相互作用起着非常重要的作用，Notch3突变导致奇数半胱氨酸残基的产生，推测破坏了规范的二硫键的配对。CADASIL患者Notch细胞外区不能与细胞外肽结合的结果，造成细胞外区不能被正常的重摄取入细胞内，引起异常堆积。MarieMagdeleine Ruchoux等人使用SM22α增强子驱动(Marie MagdeleineRuchoux，et.al，Transgenic Mice Expressing Mutant Notch3 DevelopVascular Alterations Characteristic of Cerebral Autosomal DominantArteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy.Am.J.Pathol.162：329-342，2003.)，在鼠血管平滑肌细胞上表达全长带有Arg90Cys突变体的人类Notch3基因，从而建立了CADASIL转基因鼠动物模型，并发现了Notch3受体的堆积，再一次证实了Notch3基因的缺陷是CADASIL疾病的分子遗传学的基础。

Notch3包含33个外显子，目前发现的所有突变均存在于EGF-like重复序列中，主要的突变类型包括错意突变、缺失突变及RNA剪切缺陷。任何一种突变类型均导致Notch的EGF重复序列中的半胱氨酸残基数目的改变，引起半胱氨酸数量的奇数化，奇数半胱氨酸的不恰当配对或与其他蛋白的交叉联系，可导致在Notch3受体细胞外主要组成部分的EGF重复区域内形成异常蛋白二级结构。研究表明，Notch3的N末端与Notch家族的其他同源蛋白相比较缺乏保守性，是突变好发部位(Joutel A，Tournier-Lasserve E.Molecular Basis and Physiopathogenic Mechanisms of CADASIL：AModel of Small Vessel Diseases of the Brain.J Soc Biol 196(1)：109-15，2002)。Joutel研究发现在编码前5个EGF-like重复序列的exon3和exon4中存在丛集性突变，据统计可占到所有突变的65％，Dong Yanbin等人研究发现在exon3、exon4、exon5和exon6中存在的突变占所有突变的90％，所以对于基因突变的检测策略，研究者建议先检测上述4个外显子，如未发现突变，再检测剩余的编码EGF-like重复序列的外显子，直至找到致病性突变，尽管如此，仍有6％-10％的突变无法检测到。

目前对于未知基因突变的筛查技术包括：直接测序(directsequence，DS)、蛋白截断实验(protein truncation test，PTT)、单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)、异源双链分析、限制性内切酶法及变性梯度凝胶电泳(denaturinggradient gel electrophoresis，DGGE)等。但是，这些技术均存在一定的局限性，如广泛应用的SSCP方法虽然简单，但敏感性较低，检测成功率只有60％-90％。通过病理试验发现嗜锇颗粒物质(granular osmiophilic material，GOM)沉积是CADASIL疾病诊断的另一个重要手段(Mayer M，Straube A，Bruening R，et al：Muscleand Skin Biopsies Are a Sensitive Diagnostic Tool in the Diagnosis ofCADASIL.J.Neurol.246：526-532，1999)，但是有创检查被人们接受的程度低，并且病理改变在疾病的中期才出现，CADASIL动脉病的显著性特征，即在脑和周围动脉的GOM沉积及Notch3受体堆积的表现晚于患者动脉平滑肌内膜的损害，因此，对于CADASIL动脉病的早期诊断无价值。

变性高效液相色谱分析(denaturing high-performance liquidchromatography DHPLC)是一种新近发展起来的对突变DNA进行检测的方法，这种方法的原理是通过离子对转换阶段液体层析法，把杂合二倍体从纯合二倍体DNA分子中分离出来，DHPLC已被报道是一种高度灵敏或特异的检测基因突变的手段，Joutel等人使用DHPLC对5个被怀疑为CADASIL的患者进行检测发现了新的突变，但以往使用SSCP与异源双链分析均未发现致病性突变。

所有基因组DNA的单拷贝，均可通过PCR反应大量扩增，杂合子个体的DNA经PCR扩增后产生杂合二倍体，它与纯合子个体的DNA扩增产物完全匹配的纯合二倍体的解链特征不同，在部分加热变性的条件下，通过杂合二倍体与纯合二倍体在柱中的保留时间(retention time)差异，而发现DNA的突变，即所述DNA通过疏水作用与柱子结合的能力随温度的升高而变化，在乙腈梯度增加时，DNA将从柱子中被洗脱出来，杂合二倍体将先于纯合二倍体被洗脱出来，据此可用于检测反向柱中单个碱基置换、插入或缺失杂合二倍体的片段。在绝大多数情况下，杂合二倍体的存在表现为峰数目的变化，由野生型的单峰变为2、3或4个峰，不过大多数变异呈双峰。

目前，共发现Notch3基因突变52种，其中错意突变49种，小片段缺失2种，RNA剪切位点突变1种。多数为白种人CADASIL家系报道及相关缺陷基因突变位点报道，亚洲人种相关报道较少，而相应的基因检测的手段多为直接测序或限制性内切酶检测。

中国在2000年才报道了首例CADASIL家系，目前对于中国人CADASIL病仅有一例家系研究，缺乏对多个中国CADASIL家系患者的分子生物学方面的研究。

由于CADASIL病是一种家系遗传病，提供一种针对CADASIL进行早期基因测序的方法有利于临床前期患者的发现，并且有利于发现新的CADASIL基因突变类型，有助于对CADASIL患者，尤其是针对中国人CADASIL患者的自然病程的了解和观察，为药物治疗，基因治疗争取时间。同时，可以对中国人CADASIL患者婚育提供指导，并可以早期进行产前诊断，做到优生优育，降低此类遗传性疾病的发生率。为此，需要提供一种对CADASIL进行早期基因研究的方法，尤其需要提供一种针对中国人CADASIL进行早期基因研究的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明目的之一在于提供一种CADASIL的基因突变类型，其特征在于，在CADASIL基因的Notch3的外显子Exon3或Exon4至少之一中发生基因突变。

该CADASIL的基因突变类型为，在Exon4中的密码子134的TGC突变为TAC；在Exon4中的密码子141的CGC突变为TGC；在Exon3中的密码子90的CGT突变为TGT；在Exon4中的密码子117的TGC突变为CGC；在Exon4中的密码子169的CGC突变为TGC；在Exon4中的密码子182的CGC突变为TGC。

本发明特别提供了几种新的CADASIL的基因突变类型。本发明新的CADASIL的基因突变类型分别为：在外显子Exon4中的密码子134的TGC突变为TAC，在外显子Exon4中的密码子117的TGC突变为CGC，在外显子Exon4中的密码子169的CGC突变为TGC，以及在外显子Exon4中的密码子182的CGC突变为TGC；上述新的CADASIL的基因突变类型的DNA基因样本选自中国人CADASIL先证者或其亲属。

本发明提供的新的CADASIL的基因突变类型分别为：(1)外显子Exon4中的密码子134的TGC突变为TAC，使密码子134的半胱氨酸(Cys)突变为酪氨酸(Tyr)，(2)外显子Exon4中的密码子117的TGC突变为CGC，使密码子117的半胱氨酸(Cys)突变为精氨酸(Arg)，(3)外显子Exon4中的密码子169的CGC突变为TGC，使密码子169的精氨酸(Arg)突变为半胱氨酸(Cys)，以及(4)外显子Exon4中的密码子182的CGC突变为TGC，使密码子169的精氨酸(Arg)突变为半胱氨酸(Cys)，上述的基因突变引起半胱氨酸数量的奇数化，奇数半胱氨酸的不恰当配对或与其他蛋白的交叉联系，可导致在Notch3受体细胞外主要组成部分的EGF重复区域内形成异常蛋白二级结构。本发明提供的上述类型的中国人CADASIL的基因突变类型在现有技术中对于其他人种均没有报道，是全新的CADASIL的基因突变类型。

在本发明中还提供了另外两种中国人CADASIL的基因突变类型为：第二种为外显子Exon4中的密码子141的CGC突变为TGC，使密码子141的精氨酸(Arg)突变为半胱氨酸(Cys)；或第三种为外显子Exon3中的密码子90的CGT突变为TGT，使密码子90的精氨酸(Arg)突变为半胱氨酸(Cys)，上述两种基因突变类型在现有技术中对外国人CADASIL的基因研究中已有报道。

利用本发明的CADASIL基因突变类型，可以检测中国人CADASIL家系的未发病人员在相关位点是否已发生基因突变，有利于临床前期患者的发现，有助于对中国人CADASIL患者的自然病程的了解和观察，为药物治疗，基因治疗争取时间。同时对于中国人CADASIL患者的婚育提供指导，并可以早期进行产前诊断，做到优生优育，降低此类遗传性疾病的发生率。

本发明另一目的在于提供一种检测CADASIL基因突变位点的方法，尤其提供一种利用DHPLC用于CADASIL病的基因测序方法，更进一步提供一种利用DHPLC用于中国人CADASIL的基因测序的方法，包括以下步骤：

步骤1：提取DNA样本；

步骤2：根据Notch3基因细胞外34个EGF-like重复序列的22个外显子Exon2、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8、Exon9、Exon10、Exon11、Exon12、Exon13、Exon14、Exon15、Exon16、Exon17、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21、Exon22及Exon23基因序列进行引物设计；

步骤3：选择10个热点突变的外显子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23进行该外显子的PCR扩增；

步骤4：运用DHPLC技术对该PCR扩增产物进行核苷酸分析；

步骤5：对DHPLC检测阳性的样本进行重新PCR扩增，对重新PCR扩增的原液进行基因测序，以确定其基因类型，明确基因突变类型或基因多态类型；

步骤6：对DHPLC检测阴性的样本进行剩余的12个外显子的PCR扩增并对PCR扩增产物进行DHPLC检测，对DHPLC检测阳性的样本进行基因测序。

该方法还可以在该利用DHPLC用于CADASIL的基因测序方法中包括对提取的DNA样本进行含量及纯度测定；或进一步包括对提取的DNA样本进行纯化。

该方法还可以在该DHPLC方法中包括对外显子Exon2、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8、Exon9、Exon10、Exon11、Exon12、Exon13、Exon14、Exon15、Exon16、Exon17、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21、Exon22或Exon23选择各自合适的DNA解链的柱温及合适的Buffer A与Buffer B的比例；更进一步在该DHPLC方法中对外显子Exon3选择合适的DNA解链柱温为66℃，Buffer A与Buffer B的比例为Buffer A为49％及BufferB为51％；或对外显子Exon4选择合适的DNA解链柱温为66℃，BufferA与Buffer B的比例为BufferA为43％及Buffer B为57％。

采用本发明的利用DHPLC用于CADASIL的基因测序方法，可以准确、快速地检测CADASIL基因的突变位点。该方法适用于大样本及多外显子检测，使用DHPLC对CADASIL进行筛查加快了实验进度；自动化程度高，提高检测效率；灵敏度和特异度均较高，与直接测序结果相当，尤其在变异等位基因频率较低的情况下，DHPLC的检出率更高，大大降低了实验成本。

利用本发明提供的利用DHPLC用于CADASIL的基因测序方法，可以用来发现新的CADASIL的基因突变类型，为CADASIL的早期诊断提供依据。

本发明通过利用DHPLC用于CADASIL的基因测序方法，对中国CADASIL家系中先证病人的一级亲属进行相同位点基因检测，发现了两名来自不同家系的临床前期的CADASIL患者，目前两名患者均无卒中样发作，神经系统查体无阳性定位体征，智能评定均正常，但其中一例头颅核磁检查已出现多发皮层下梗塞。

利用本发明提供的利用DHPLC用于CADASIL的基因测序方法，有助于我们对中国人CADASIL临床前期患者的发现，有助于对前期患者的自然病程的了解和观察，为药物治疗，基因治疗争取时间。同时，对于CADASIL患者婚育提供指导，可早期进行产前诊断，做到优生优育，降低此类疾病的发生率。

附图说明

图1为利用DHPLC用于CADASIL的基因测序的技术路线。

图2为家系1的CADASIL患者及其家系成员。

图3为家系2的CADASIL患者及其家系成员。

图4为家系3的CADASIL患者及其家系成员。

图5、图6分别为外显子Exon3的致病性基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果。

图7、图8，图9、图10，图41、图42，图43、图44及图45、图46分别为外显子Exon4的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果。

图11至图40分别为15种多态类型的DHPLC检测结果及相应的测序结果。

具体实施方式

图1所示为本发明对临床诊断为CADASIL先证病人及部分家系成员进行基因研究的技术路线，本发明的检测CADASIL基因突变类型及基因多态类型的方法包括以下步骤：

步骤1：提取DNA样本；

步骤3：选择10个热点突变的外显子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23进行外显子的PCR扩增；

步骤4：运用DHPLC技术对PCR扩增产物进行核苷酸分析；

步骤6：对DHPLC检测阴性的样本进行所述剩余的12个外显子的PCR扩增并对PCR扩增产物进行DHPLC检测，直至找到致病性基因突变类型。

可选的，在步骤4或步骤6中的DHPLC检测过程中，通过改变DHPLC检测的柱温，对DHPLC检测阴性的样本进行重复的DHPLC检测，直至找到致病性DNA突变类型或排除致病性DNA突变类型。

可选的，在步骤1进行DNA提取过程中，对提取的DNA进行含量及纯度的测定。

可选的，在步骤1进行DNA提取过程中，对提取的DNA进行纯化。

本发明首先选取两组人群为研究对象，一组为CADASIL患者及其家系成员，另一组为正常对照组，无神经系统变性病、精神病、无脑血管病高危因素及家族史。本发明利用DHPLC通过对上述两组人群的Notch3基因进行检测，确定中国人CADASIL家系患者Notch3基因的突变类型，并确定中国CADASIL患者的突变热点区，同时提供一种用于中国人伴皮质下梗死及白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)的利用DHPLC的基因测序方法。

为了便于理解，下面的实施例对CADAIL的DHPLC的基因测序方法及基因突变类型及多态类型进行了具体描述，应该注意到它不是对发明的限制。

实施例1

本发明的研究对象包括两组人群，分别为：

1.CADASIL患者：CADASIL患者及其家系成员来自于如图2至图4所示的CADASIL家系，临床诊断为CADASIL，既往无高血压、糖尿病、淀粉样变性疾病。CADASIL患者的临床资料如表1所示：

表1CADASIL患者的临床资料

患者	年龄	血压	血糖	血脂	偏头痛	卒中	痴呆	病理	影像	突变
患者	年龄	血压	血糖	血脂	偏头痛	卒中	痴呆	病理	影像	突变	家系1IIaIIbIIcIIfIIIaIIIbIIIcIIIgIIIm家系2IbIIbIIfIIjIIiIImIIIbIIIfIIIgIIIh家系3IIaIIg家系4A	5249死亡死亡3836353635死亡666463死亡6240343843393434	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN不详	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN不详	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN不详	-+--+--++------------不详	-++++--+++++++++--++-不详	-+++-----++++++----+-不详	ND+NDND+NDNDNDNDNDNDNDNDND+NDNDNDNDNDND不详	ND+NDND+NDND++ND++++++-+++ND不详	-+NDND+-++NDNDND+ND++ND-+ND+-+

注：N：正常；ND：未做检查；病理-：未见GOM沉积；

病理+：可见GOM沉积；影像学-：无皮层下白质梗塞；

影像学+：可见多皮层下白质梗塞；基因检测-：无致病性突变；

基因检测+：发现致病性突变。

2.正常对照组：50例健康对照组均来自于健康查体者，无神经系统变性病、精神病、无脑血管病高危因素及家族史，年龄为56-72岁，平均为63±8.2岁，其中男性32例，女性28例。

利用DHPLC的基因测序方法对上述两组人群的Notch3基因进行检测，确定中国人CADASIL家系患者Notch3基因的突变类型，并确定中国CADASIL患者的突变热点区。

下面详细说明各个步骤的具体内容：

步骤1：DNA样本的提取。DNA样本的提取采用现有技术的标准方法，采用《分子克隆》第二版(J.萨姆布鲁克等，1999年，科学出版社，北京)从血液白细胞中提取DNA的方法提取DNA。本发明中可选的可以包括对上述提取的DNA的含量及纯度进行测定，可选的还可以包括对上述DNA的纯化。

步骤2：根据Notch3基因细胞外34个EGF-like重复序列的22个外显子Exon2、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8、Exon9、Exon10、Exon11、Exon12、Exon13、Exon14、Exon15、Exon16、Exon17、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21、Exon22及Exon23的外显子区基因组序列设计引物。本发明的方法是对于已知基因序列的检测方法，该基因的突变位点可以是现有的，也可以是本发明提供的，本发明提供的这些中国人CADASIL基因突变的位点是本申请的发明人首次披露的。

步骤3：选择10个热点突变的外显子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23进行外显子的PCR扩增。本发明的PCR扩增的方法采用传统方法，采用PCR产物电泳的方法评价PCR扩增是否成功，采用PCR产物直接测序的方法确定最终扩增产物。对于PCR扩增成功的样本，进行以下步骤：

步骤4：运用DHPLC技术对PCR扩增产物进行核苷酸分析；

步骤5：对DHPLC检测阳性(出现杂合的异常多峰)的样本进行重新PCR扩增，对重新PCR扩增的原液进行基因测序，以确定其基因类型，明确基因突变类型或基因多态类型；

步骤6：对DHPLC检测阴性的样本进行剩余的12个外显子的PCR扩增并对该PCR扩增产物进行DHPLC检测，直至找到致病性基因突变类型。

可选的，在步骤4或步骤6中的DHPLC检测过程中，改变DHPLC检测的柱温，对DHPLC检测阴性的样本进行重复的DHPLC检测，直至找到致病性DNA突变类型或排除致病性DNA突变类型。

步骤7：(可选的)可以同时收集该CADASIL患者的临床、影像及病理资料并与其基因测序结果进行对照。

其中在步骤4与6中进行了DNA的DHPLC检测，在DHPLC检测中，合适柱温的选择是检测基因突变类型的关键。

本发明还提供了中国人CADASIL的基因突变类型，该CADASIL基因突变类型至少存在于Notch3的外显子Exon3或外显子Exon4之一发生基因突变。

本发明的中国人CADASIL的基因突变类型分别为：(1)Notch3的外显子Exon4中的密码子134的

突变为

使密码子134的半胱氨酸(Cys)突变为酪氨酸(Tyr)；(2)外显子Exon4中的密码子117的突变为

使密码子117的半胱氨酸(Cys)突变为精氨酸(Arg)；(3)外显子Exon4中的密码子169的突变为使密码子169的精氨酸(Arg)突变为半胱氨酸(Cys)；以及(4)外显子Exon4中的密码子182的突变为

使密码子169的精氨酸(Arg)突变为半胱氨酸(Cys)。上述的基因突变引起半胱氨酸数量的奇数化，奇数半胱氨酸的不恰当配对或与其他蛋白的交叉联系，可导致在Notch3受体细胞外主要组成部分的EGF重复区域内形成异常蛋白二级结构。上述基因突变类型在现有技术中对于其他人种的CADASIL基因研究中没有报道，为新的CADASIL基因突变类型。上述新的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果分别示于图7、图8，图41、图42，图43、图44及图45、图46中。

在本发明中还提供了中国人CADASIL的基因突变类型为Notch3的外显子Exon4中的密码子141的

突变为

使密码子141的精氨酸(Arg)突变为半胱氨酸(Cys)；或外显子Exon3中的密码子90的突变为

使密码子90的精氨酸(Arg)突变为半胱氨酸(Cys)，上述两种基因突变类型在现有技术中对于其他人种的CADASIL基因研究中已经有报道，上述两种基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果分别示于图5、图5和图9、图10中。

本申请的发明人提供了中国人CADASIL基因在上述位点的基因突变类型，并且这些基因突变类型与中国人CADASIL密切相关。利用正常的CADASIL基因，本领域普通技术人员利用定点突变技术，可以获得上述在特定位点发生突变的全基因序列。由于“定点突变”方法是现有的，这里不再赘述。请参见《分子克隆》第三版(中文版)，下册，p1105页，“大引物PCR定点诱变”。

本发明的DHPLC检测方法可以用于检测上述已知基因的突变位点，该方法也可以用于对CADASIL基因的未知突变进行检测，该方法还可以用于对CADASIL基因的多态类型进行检测，只是引物的设计会有所不同。本发明的检测方法的具体步骤如下：

步骤1提取DNA样本

标本采集与处理

对被检测者采取肘静脉血10ml(枸橼酸钠抗凝)，4℃保存，两周内用以下方法提取DNA备用。

DNA提取

采用《分子克隆》第二版从血液白细胞中提取DNA的方法提取DNA，具体步骤如下：

1)肘静脉血10ml，加入装有1.75ml酸性柠檬酸葡萄糖溶液B(ACD)的试管中混匀；

2)将试管放置高速离心机中，3000转/分，离心15分钟后弃去血浆；

3)试管内加入两倍体积红细胞裂解液，混匀静置20分钟后将试管放置高速离心机中，3000转/分，离心15分钟后弃去上清液；

4)重复第三步2次；

5)加入白细胞裂解液3ml、SDS 200μl、蛋白酶K200μl，55℃过夜；

6)加入饱和NaCl 1ml，混匀后置高速离心机中，3000转/分，离心15分钟后，取出上清液；

7)加入两倍体积的无水乙醇，轻摇数次后可见DNA析出，吸出DNA；

8)75％乙醇清洗人重组DNA两次后，放置烘箱中烘烤30分钟；

9)加500μl去离子水，将DNA充分溶解；

10)加入500μl酚氯仿，混匀后放置高速离心机中，10000转/分，15分钟后吸出上清液，加入2倍体积无水乙醇，轻摇后吸出DNA；

11)加入TE 500μl充分溶解后放置-80℃保存。

12)DNA浓度测定：取15μl DNA样本加1485μl三蒸水，充分混匀后，用紫外分光光度计测定波长分别为260nm、280nm、330nm时的OD值，计为OD260、OD280、OD330，根据下面的计算公式计算DNA浓度及纯度。

DNA浓度＝(OD260-OD330)×50μg/ml×稀释倍数(100)式1

DNA纯度＝(OD260-OD330)/(OD280-OD330) 式2

若DNA纯度＜1.6，表明有残存酚或蛋白质含量太高，再用酚/氯仿抽提纯化。若DNA纯度＞2.0，表明混有核苷酸或RNA，可用RNA酶对标本进行处理。本发明中对部分DNA样本进行了纯化处理，所述纯化处理不是必须的。

13)DNA的纯化(可选的)：加20μl蛋白酶K(10mg/ml)于DNA溶液中，42℃水浴震荡4小时，加等体积酚混匀5分钟，于12,000转/分离心5分钟，取上清液加等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提5分钟，12,000转/分离心5分钟，吸取上清液加等体积氯仿-异戊醇(24∶1)抽提5分钟，12,000转/分离心10分钟，吸取上清液于另一离心管中，加1/12体积3M的乙酸钠及2倍体积的冰冻无水乙醇混匀。用吸管将白色絮状DNA吸入1.5ml Eppendorf管内，70％乙醇洗涤2次，10,000转/分离心30秒，弃去上清液，于室温使沉淀的DNA干燥，加适当体积的TE(pH7.6)重新溶解DNA。采取紫外分光光度法测定吸光度(A)值：利用D260值与D330值将DNA稀释至0.5μg/ml。

步骤2引物设计

对于Notch3基因的第3、4、18、20外显子的引物来自文献报道，其余第2、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、21、22、23外显子引物使用DNASTAR及OLIGO软件自行设计，由上海生工生物技术服务有限公司合成，上述外显子的上游引物P-F与下游引物P-R的序列如下所示，其中P-F为上游引物、P-R为下游引物，对于不同的外显子的具体引物设计如下：

Exon2上游引物P-F：5’CCAATGGGGAAACACGAGAGGTT3’；下游引物P-R：5’ACTGACCACACCCCCGACTA 3’；

Exon3上游引物P-F：5’TGTGCTGCCCAACCAAGCCA 3’；下游引物P-R：5’ACTGACCACACCCCCGACTA 3；

Exon4上游引物P-F：5’TAGTCGGGGGTGTGGTCAGT 3’；下游引物P-R：5’CCTCTGACTCTCCTGAGTAG 3’；

Exon5上游引物P-F：5’CAGCCACCTGGCGCATGTCCA 3’；下游引物P-R：5’CCTCCTGGTGAGTGAGCCCTACTC 3’；

Exon6上游引物P-F：5’TGGATGGCGTCA ACACCTAT 3’；下游引物P-R：5’CAGACTTCTTATTTGCCCTCAC 3’；

Exon7上游引物P-F：5’CAACGACAAAACAATACTCAAGGG3’；下游引物P-R：5’ACAGCGAGGTCCAGTGTAGC 3’；

Exon8上游引物P-F：5’CAGGATGTGGACGAGTGCTCTA 3’；下游引物P-R：5’TCCAGGCTTCAGTCTCTAAGGG 3’；

Exon9上游引物P-F：5’ACCCCGTTCACACCATAGG 3’；下游引物P-R：5’TGTAAGTTATCCGCTAACGTGGTT 3’；

Exon10上游引物P-F：5’GCTGGAGAGGGGTGTACTGC 3’；下游引物P-R：5’GCCTCCTGATTCTTGTCGG 3’；

Exon11上游引物P-F：5’CGCCTCCTGACAGCTTGATG 3’；下游引物P-R：5’CGTCAATGTTCACTTCGCAGTT 3’；

Exon12上游引物P-F：5’GTTTGGGAATGGTGCATCTAGTG3’；下游引物P-R：5’CGAAACAACCTTATGCCAATG 3’；

Exon13上游引物P-F：5’CACAAGAGCTGATGCGTTATGA 3’；下游引物P-R：5’CTGGGACTCACAGGCGTCT 3’；

Exon14上游引物P-F：5’GTCCCCACCTTGATACCCAC 3’；下游引物P-R：5’CAGTCACGGCATCTGCTATG 3’；

Exon15上游引物P-F：5’TCCTCTACTCTCTCCTCCCGCTAT3’；下游引物P-R：5’GACCCACACAGGCTGCATATC 3’；

Exon16上游引物P-F：5’CAAAATGCCCAGACACGA 3’；下游引物P-R：5’GGCTTGCACAAGAAGTCACT 3’；

Exon17上游引物P-F：5’TTCTCAATCCAAGGCATATCCC 3’；下游引物P-R：5’GAGGACTCCCCCAAGTCGTT 3’；

Exon18上游引物P-F：5’GATCCTCCCTCCCACTCCTT 3’；下游引物P-R：5’AGGTCCCCAGTAACTCCA 3’；

Exon19上游引物P-F：5’GGCACCCCCATTCGGCTCACAC 3’；下游引物P-R：5’CCAAGTCGGGGCACAGTTTCTCC 3’；

Exon20上游引物P-F：5’TGTTCCTGTGCCACTCTCCT 3’；下游引物P-R：5’ACCTCCTCTTCCCTCTCCT 3’；

Exon21上游引物P-F：5’TGGGGGAAGAAACGAGGGGTGGTC3’；下游引物P-R：5’TGTGCTGGGGTTCTTTGCGTCTTC 3’；

Exon22上游引物P-F：5’CCCTCTTGACCACCCCTCGTTT 3’；下游引物P-R：5’GAGCGGGAGCATGTAGATCAG 3’；

Exon23上游引物P-F：5’AGACGCCACGCCCCTACTACTCCA3；下游引物P-R：5’CCCGCCTGTCATTCCCCCATTGTG 3’。

这里设计的引物可用于对上述CADASIL的已知基因突变位点的检测。对于其它未知的CADASIL基因突变类型，也可以采用本发明的方法和上述引物进行检测。

步骤3进行PCR扩增

1)选择10个热点突变的外显子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23进行外显子的聚合酶链反应(PCR)：

a)PCR扩增体系：总反应体积为约25μl(20μl去离子水、2.5μl的15mM的Mg²⁺Buffer、2μl的2.5mM dNTP、0.5μl的引物F、0.5μl的引物R、0.5μl的模板DNA及0.3μl的Taq酶)；

b)PCR反应的试剂：

H₂O：使用法国Millipore公司的纯水机制作的电阻为18.2兆欧的去离子水；

dNTP：由上海博亚生物技术有限公司提供。浓度10mmol/μl，使用时稀释为2.5mmol/μl；

Taq酶：由北京大学医学部第一附属医院提供5IU/μl；

Mg²⁺Buffer：由北京大学医学部第一附属医院提供，镁离子浓度为15mmol/μl。

c)PCR反应条件：其中各外显子PCR扩增的热循环条件如下：

i.95℃预变性5min；

ii.95℃，30sec，[Exon2(60℃，45sec)；Exon3(57℃，45sec)；Exon4(58℃，45sec)；Exon5～Exon22(60℃，45sec)；Exon23(59℃，45sec)]，72℃，70sec，35个循环；72℃延伸10min。

iii.引物序列：见前述。

2)凝胶电泳：上述PCR反应结束后，取5μl PCR产物加入0.5μl上样缓冲液，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，电泳电压130mV，30分钟后在紫外分析仪(美国KODAK 120凝胶成像分析系统)上检测PCR扩增产物的特异性。如为相应长度的单一PCR扩增条带，即认为扩增成功，待DHPLC检测。含外显子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23的PCR扩增条带长度分别为：224bp、420bp、285bp、434bp、497bp、256bp、309bp、249bp、303bp及242bp。

步骤4进行DHPLC检测

DHPLC所用设备及试剂

仪器：WAVE^TMDNA片段分析系统7200(美国Transgenomic公司)；

试剂：

Buffer A：0.1TEAA(三乙胺醋酸盐)溶液(50ml 2MTEAA+250μl乙腈定容至1L)；

Buffer B：0.1TEAA溶液(50ml 2M TEAA+250ml乙腈定容至1L)；

Buffer C：洗液(8％乙腈：80ml乙腈定容至1L)；

Buffer D：贮藏液(75％乙腈：750ml乙腈定容至1L)；

DNA分子量标准：100bp DNA ladder(100bp至600bp的标记)，北京天为时代生物有限技术公司产品，参照片段为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp及100bp。

主要溶液的配置：

红细胞裂解液：氯化铵78g

碳酸氢铵8g

EDTA 18g

溶解至1000ml蒸馏水中，pH调定至7.8，使用时稀释10倍，4℃保存。

白细胞裂解液：Tris-Cl 10mmol/L

EDTA 2mmol/L

NaCl 400mmol/L；

TE(10mM Tris+1mM EDTA)；

饱和NaCl 5M

146.2g溶解至500ml蒸馏水中；

6M凝胶加样缓冲液 0.25％溴酚蓝

0.25％二甲苯青FF

50％甘油水溶液；

5M电泳缓冲液(TBE)Tris 30.25g

EDTA-2Na 1.6g

硼酸 13.35g。

CADASIL基因突变位点的检测

1)DHPLC检测：以Exon3为例详述DHPLC检测的步骤：

a)95℃变性5min后以1℃/min速率缓慢降至65℃复性，然后在WAVEMAKER软件推荐的对外显子Exon3的PCR扩增产物的DNA解链溶解温度下，将2～3μl的Exon3的PCR扩增产物由一定比例的Buffer A及Buffer B组成的流动相(Buffer A为49％及BufferB为51％)以一定速度带至DNA分离柱进行分离；

b)(可选的)对在一定保留时间检测为正常或野生型单峰的该PCR扩增样品，改变柱温±1～3℃，优选为2℃，即柱温为66℃继续上述操作，检测是否出现了杂合的异常多峰；

c)对出现了杂合的异常多峰进行基因测序，对未出现杂合异常多峰的样品继续重复步骤b)的检测，直至排除杂合的异常多峰。对含其他外显子的DHPLC突变检测的优选条件如表2所示：

表2对Notch3基因的含不同外显子的DHPLC突变检测条件

含外显子	柱温	Buffer A％	Buffer B％
含外显子	柱温	Buffer A％	Buffer B％	Exon2Exon3Exon4Exon5Exon6Exon7Exon8Exon9Exon10Exon11Exon12Exon13Exon14Exon15Exon16Exon17Exon18Exon19Exon20Exon21Exon22Exon23	65℃66℃66℃64℃64℃66℃65℃63℃67℃64℃63℃64℃64℃63℃62℃65℃66℃65℃65℃61℃65℃65℃	45494346434343474942454243434243474648464448	55515754575757535158555857575857535452545652

一般认为：当双链DNA在待测样品中所占比例为70％-85％时，分离效果最好。一般情况下，大多数DHPLC基因突变检测推荐在比WAVEMAKER软件推荐的待测DNA片段的柱温约低1℃的柱温下进行。

本申请的发明人对于DHPLC检测中柱温的选择，是根据所要检测基因片段的范围以及柱温预测时提供的DNA解链的溶解曲线，针对不同基因片段大小及范围进行了相应柱温的选择，尤其对于与野生型相一致的单峰出现时，进行了多柱温的调整，提高了CADASIL基因突变的检出率，同时提供了DHPLC检测中最佳的Buffer A与Buffer B的比例。

本发明在WAVEMAKER软件推荐柱温上下各浮动1～3℃检测突变，发现数个不同的阳性结果，如在进行Exon11、Exon16、Exon4检测时，使用WAVEMAKER软件推荐柱温进行检测时，所述DHPLC峰型均为与野生型一致的单峰，更换柱温后(对于Exon4为柱温为66℃，且Buffer A为43％及Buffer B为57％；对于Exon11为柱温64℃，且Buffer A为42％及Buffer B为58％；对于Exon16为柱温为62℃，且Buffer A为42％及Buffer B为58％)，所述DHPLC检测出现了杂合的异常双峰。

同时本发明在进行柱温调整时，温度调整优选为2℃。柱温变化为1℃时，所述DHPLC检测图形不会有明显区别，柱温变化为3℃时，温度变化过大，易造成温度过高，使DNA过度解链，形成无法判读的峰型，故温度调整以2℃最佳。

本发明针对含不同外显子的PCR扩增产物建立了适宜的筛查柱温并提供了适宜的Buffer A与Buffer B的比例，如表2中所示，为相应病例缺陷基因的DHPLC检测提供了依据。

将DHPLC分析后的杂合的异常多峰进行下一步骤。

步骤5基因测序

对所述DHPLC检测阳性(出现杂合的异常多峰)的样本进行重新PCR扩增，对重新PCR扩增的原液进行基因测序，以确定其基因类型，明确基因突变类型或基因多态类型。

测序验证突变：对每类杂合的异常多峰随机取一样品进行双向测序(利用美国ABI Prism 377自动基因检测仪)以验证其基因型。

步骤6剩余外显子的PCR扩增并进行DHPLC检测

对DHPLC检测阴性的样本进行剩余的12个外显子Exon2、Exon7、Exon8、Exon9、Exon10、Exon12、Exon13、Exon14、Exon15、Exon16、Exon17及Exon22进行PCR扩增，上述12个外显子的扩增产物长度分别为314bp、431bp、439bp、270bp、218bp、337bp、483bp、416bp、458bp、468bp、406bp及367bp，并对PCR扩增产物进行DHPLC检测，直至找到致病性基因突变类型或排除致病性基因突变类型。

本发明的检测CADASIL基因突变类型的方法将DHPLC方法与直接测序结合起来，首先运用DHPLC方法对受检验者进行检测，然后只对DHPLC阳性(有杂合的异常多峰)的样本进行基因测序，以最终确定致病性基因突变、多态及野生型基因序列的基因类型。这样，就大大降低了检测的成本，而且检测的效率大为提高。

对图5、图7及图9中经DHPLC检测为异常多峰的样品进行基因测序，从对应的基因测序图图6、图8及图10发现了对应于含外显子Exon3或外显子Exon4的不同密码子的突变基因类型如下：

对图11、图13、图15、图17、图19、图21、图23、图25、图27、图29、图31、图33、图35、图37及图39中经DHPLC检测为异常单峰或多峰的样品进行基因测序，从对应的基因测序图图12、图14、图16、图18、图20、图22、图24、图26、图28、图30、图32、图34、图36、图38及图40中发现了如下对应不同外显子的不同密码子或内含子的15种多态类型：

通过上述DHPLC基因测序方法检测到中国人CADASIL家系患者Notch3基因的几种类型的致病性基因突变类型分别为：

外显子Exon3的密码子

突变为使Arg(精氨酸)突变为Cys(半胱氨酸)；

外显子Exon4的密码子134

突变为使Cys(半胱氨酸)突变为Tyr(酪氨酸)；

外显子Exon4的密码子141

突变为

使Arg(精氨酸)突变为Cys(半胱氨酸)；

外显子Exon4的密码子117

突变为使Cys(半胱氨酸)突变为Arg(精氨酸)；

外显子Exon4的密码子169

突变为使Arg(精氨酸)突变为Cys(半胱氨酸)；

外显子Exon4的密码子182

突变为

使Arg(精氨酸)突变为Cys(半胱氨酸)。

上述几种类型的基因突变分别造成膜外区第2、3 EGF-1ike区半胱氨酸数量的奇数化，为杂合错意突变，奇数半胱氨酸的不恰当配对或与其他蛋白的交叉联系，可导致在Notch3受体细胞外主要组成部分的EGF重复区域内形成异常的蛋白二级结构。上述几种基因突变类型均未在100条正常对照的健康染色体中发现。

其中中国人CADASIL家系患者Notch3基因的突变类型Cys134Tyr[外显子Exon4的密码子134

突变为使Cys(半胱氨酸)突变为Tyr(酪氨酸)]；Cys117Arg[外显子Exon4的密码子117

突变为

使Cys(半胱氨酸)突变为Arg(精氨酸)]；Arg169Cys[外显子Exon4的密码子169

突变为

使Arg(精氨酸)突变为Cys(半胱氨酸)]；以及Arg182Cys[外显子Exon4的密码子182 突变为

使Arg(精氨酸)突变为Cys(半胱氨酸)]目前在国内外尚无人报道，为新的致病性DNA基因突变类型。

上述几种基因突变类型均存在于Notch3的外显子Exon3及Exon4中，为杂合错意突变，其中一种类型为高度保守的半胱氨酸被其他氨基酸替换，另外一种类型为半胱氨酸替代其他氨基酸，提示Notch3的外显子Exon3及Exon4两个位点同样是中国CADASIL家系的热点突变区。

基于上述结果，建议在对中国CADASIL患者进行基因检测时，同样首先检测Notch3的外显子Exon3及Exon4两个突变位点，如未发现致病性突变，再进行其他的外显子检测。

CADASIL的整个病程是千变万化的，即使在同一个家系，有的患者直至70岁才出现临床症状，而另一些家庭成员在50岁时已存在严重的认知功能障碍，所以对于家庭成员的早期基因检测，可及时发现临床前期的患者。

本发明通过利用DHPLC技术对中国CADASIL家系中先证者的一级亲属进行相同位点的基因检测，发现了两名来自不同家系的临床前期的CADASIL患者(其中一名患者是外显子Exon3的密码子突变为

使Arg(精氨酸)突变为Cys(半胱氨酸)，来自于家系1，另一名患者是外显子Exon4的密码子141 突变为使Arg(精氨酸)突变为Cys(半胱氨酸)，来自于家系2，目前两名患者均无卒中样发作，神经系统查体无阳性定位体征，智能评定均正常(但其中一例头颅核磁检查出现多发皮层下梗塞)。

临床前期患者的发现有助于我们对中国人CADASIL患者的自然病程的了解和观察，为药物治疗，基因治疗争取时间。同时，对于CADASIL患者婚育指导具有重要意义，可早期进行产前诊断，做到优生优育，并可降低此类疾病的发生率。

以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种CADASIL基因突变类型，其特征在于，在CADASIL基因的Notch3的外显子Exon3或Exon4至少之一中发生基因突变。

2.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon4中的密码子134的TGC突变为TAC。

3.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon4中的密码子141的CGC突变为TGC。

4.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon3中的密码子90的CGT突变为TGT。

5.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon4中的密码子117的TGC突变为CGC。

6.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon4中的密码子169的CGC突变为TGC。

7.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon4中的密码子182的CGC突变为TGC。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的基因突变类型，其特征在于所述CADASIL基因样本选自中国人CADASIL先证者或其亲属。

9.一种检测CADASIL基因突变位点的方法，包括以下步骤：

步骤1：提取DNA样本；

步骤3：选择10个热点突变的外显子Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon11、Exon18、Exon19、Exon20、Exon21及Exon23进行所述外显子的PCR扩增；

步骤4：运用DHPLC技术对所述PCR扩增产物进行核苷酸分析；

步骤5：对所述DHPLC检测阳性的样本进行重新PCR扩增，对所述重新PCR扩增的原液进行基因测序，以确定其基因类型，明确基因突变类型或基因多态类型；

步骤6：对所述DHPLC检测阴性的样本进行所述剩余的12个外显子的PCR扩增并对所述PCR扩增产物进行DHPLC检测，对所述DHPLC检测阳性的样本进行基因测序。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的CADASIL基因在外显子Exon4中的密码子134的TGC突变为TAC。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述的CADASIL基因在外显子Exon4中的密码子141的CGC突变为TGC。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述的CADASIL基因在外显子Exon3中的密码子90的CGT突变为TGT。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中对于Exon5设计上游引物P-F为：5’CAGCCACCTGGCGCATGTCCA3’；下游引物P-R为：5’CCTCCTGGTGAGTGAGCCCTACTC3’。