CN1291038C - 一种21号染色体数目的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

一种21号染色体数目的快速检测方法，其特征是按以下步骤进行：a、从待检样本中提取样本DNA；b、对样本DNA中的21号染色体上特异性STR位点LFG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34及STR位点D21S1409、D21S1435、D21S1436、D21S2052、D21S2054进行PCR扩增；c、根据对上述位点PCR扩增产物的检测结果确定样本中21号染色体的数目。

Description

一种21号染色体数目的快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种可迅速检测21号染色体数目的分子生物学方法。

背景技术

大多数的真核生物为二倍体，即一个正常体细胞内的染色体数为2的倍数，即2N，如人类正常体细胞中有2*23条染色体。当人类染色体偏离正常的数目，将导致相应的染色体疾病。若个别一条或几条染色体的数目改变，体细胞的染色体数目不是23的整倍数，称为非整倍体。人类最常见的染色体数目异常是出现了一条额外的21号染色体，即21号染色体三体性。这种21号染色体的数目异常会导致严重的染色体疾病——21三体，由于该病首先由英国医生Langdon Down进行了描述，故又称为唐氏综合征。唐氏综合征的临床特征主要为生长发育迟缓、不同程度的智力低下和包括头面部特征在内的一系列异常体征，这使得该病在过去又不幸被称为先天愚型。新生儿中21三体的发病率约为1/600-900，是新生儿中最为常见的染色体异常。95％唐氏综合征患者的染色体基础都是继发于减数分裂时染色体不分离所致的21三体，即全身体细胞均多了一条21号染色体，这类核型称为游离型，通常临床症状典型而且显著。通过DNA多态性分析，能够在大部分的家庭中判定不分离发生在双亲中的哪一方以及减数分裂的哪一步。额外的21号染色体多来自母亲的第一次减数分裂。大约4％的唐氏综合征是非平衡易位的结果，这种核型为易位型，患者虽然只有46条染色体，但因一条21号易位到另一条D组或G组的染色体上，加上正常的两条21号染色体，仍多了一条额外的21号长臂，而决定本病的关键区带为21号长臂，故临床上仍表现出21三体的症状。最后，不到3％的唐氏综合征患者是嵌合体，同时具有正常的和异常的两种细胞系，症状取决于异常细胞所占的比例，但一般较轻。目前，除了加强护理和训练，延长患者的寿命，增强其生活自理能力外，人类对于唐氏综合征并没有有效的治疗措施。此病的发生给患者家庭和社会都带来极大的负担。因此，提高染色体数目的检测水平，尤其在产前进行检测的水平，减少唐氏综合征患儿的出生，非常重要。

对胎儿细胞进行核型分析是已有的染色体数目的检测方法，这个过程包括胎儿细胞的体外培养和中期胎儿细胞的核型分析。细胞的体外培养需要一定数量的存活细胞和相当的专业技术知识，在下列几种情况下都可能无法实施核型分析：1、细胞培养失败。据统计，细胞培养失败的发生率约为1-2％。2、收集的细胞数目有限，不能得出明确的结论。为确保足够的培养物用于核型分析，必须获得大于5ml的羊水。当一次羊水穿刺抽出的羊水量少于5ml时，就不得不进行反复的羊水穿刺，从而增加了感染和损伤的风险。3、培养物被污染。有文献报道，即使在经验丰富的试验室，母体细胞的污染率也可达10-14％。4、由于细胞培养仅限于存活细胞，因此某些特殊的样本无法进行核型分析，如一些妊娠产物以及福尔马林固定或石蜡包埋样本。此外，传统的生物非整倍体的检测方法最为显著的缺点是细胞培养过程耗时太长，大致需要两周左右的时间，这就易于造成处理上的延误。因此，迅速、准确的检测技术非常有价值。

近年来，荧光原位杂交(fluorecent in situ hybridization，FISH)和定量荧光PCR(quantitative fluorecent polymerase chain reaction，QF-PCR)已经应用于染色体数目的检测。就荧光原位杂交检测生物非整倍体的方法而言，间期细胞的荧光原位杂交可不必进行细胞培养，大大缩短了诊断所需的时间；商业化探针的应用提高了FISH的敏感性和特异性。但另一方面，这项诊断技术仍然具有一定的局限性：1、在未培养的羊水中，荧光标记的探针会与细胞骨架非特异性地结合，使背景不清晰，FISH的有效性大大降低。2、必须要有完整的细胞用于分析。3、对实验人员的专业技能要求较高。4、母体细胞的污染会导致对实验结果的错误解释。5、相较QF-PCR，FISH分析耗时长、成本高，限制了其对样本的高通量检测。

定量荧光PCR方法利用了基因组中广泛分布的短串联重复序列(shorttandem repeats，以下简称STR)。STR通常由2～6bp的核心序列串联重复而成，具有高度的多态性，易于采用复合扩增方式进行扩增。而荧光复合扩增是目前世界上应用最普遍的复合扩增方法，通常是在各个靶序列其中一条引物的一端标记上荧光物质，利用自动激光荧光遗传分析仪对产物进行检测。STR的扩增产物在电泳时按片段大小分离，根据荧光峰的数目和强度确定每个等位基因的拷贝数，从而反映特定染色体的拷贝数。正常的杂合子个体会产生高度相近的两个峰，纯合子则表现为单独的一个STR峰。当染色体数目异常时，所检测的荧光峰将会观察到数目和强度的异常，或者出现峰高相近的三个峰或者出现高度比值接近2∶1的两个峰。由于PCR(聚合酶链式反应)扩增方法和荧光检测的应用，这种检测方法非常灵敏，可用于少量样本的检测，如母体血液中收集的胎儿细胞或胎儿DNA，也可确定母体细胞的污染。尤为重要的是，这种方法非常迅速，DNA的提取和扩增仅需5个小时左右，每个荧光产物的分析会在半小时内完成。加之易于实现自动化，有可能对36～96个样本同时进行检测，因此几十个，甚至几百个样本的检测结果可在一天内得到。对于定量荧光PCR检测方法的检测结果的认定目前还很有争议，因为这种方法本身尚存在一些问题。首先，目前的定量荧光PCR检测方法仅选取了每条染色体上的2-4个STR位点进行复合扩增。对一个特定的染色体来说，仅由2-4个STR位点构成的检测系统通常不能保证检测出所有的非整倍体，尤其当STR位点的杂合度不高时。在许多运用定量荧光PCR检测方法的检测中，总有部分样本不能提供信息，即一条染色体上的几个位点均表现为一个STR峰，无法分辨是正常还是非整倍体的纯合子。尤为重要的是，定量荧光PCR检测方法在检测到两个峰时，将峰高或峰面积的比值与事先建立的正常参考值范围对照，作为判断是否是非整倍体的依据之一，这使该方法的有效性大大降低。PCR是个复杂的反应过程，扩增产物量和模板量并不是简单的线性关系，当出现两个等位基因峰时，对结果的判断在实际操作中比较复杂。若两个峰的高度或面积的比值接近正常参考值范围的界值，对结果的判断就会模棱两可；多个靶位点的复合扩增，由于荧光峰的重叠，其位置和强度有时也难以解释；某些位点存在优势扩增现象，很容易导致误诊，尤其是在模板量少时。当出现优势扩增时，或是由于片段小的等位基因过度扩增而将染色体的非整倍体误判为正常的二倍体，或是由于正常二倍体个体的一个等位基因扩增效率低而被误判为非整倍体。在实践中，定量荧光PCR通常是作为一种辅助的检测方法而与传统的细胞遗传学方法联合使用，最后的确诊结果仍需通过细胞遗传学的方法获得。

但是，近期的研究结果表明，如果采用一种新的生物非整倍体检测方法，对用于非整倍体检测的STR位点进行优选，严格选择多态性好的四核苷酸或五核苷酸重复的STR位点，并增加位点个数至6个或6个以上，保证检测系统的效能，使检测更有统计学的意义，同时，采用更严格的检测判定方法，即仅仅在观察到特定染色体上两个以上的特异性STR位点具有三个等位基因峰时，才认定该染色体为非整倍体，就可以使检测结果的判定更加直观而明确，能够真正准确、快速、高通量地进行生物非整倍体检测。这种方法对特定染色体上STR位点的数量和多态性提出了更高的要求。然而，据我们所知，在目前的公共数据库中，某些染色体上现有的微卫星位点并不能满足上述的要求，如21号染色体。因此，要运用该方法对特定的染色体非整倍体进行快速检测，面临的首要问题将是新的微卫星位点的开发。

开发新的、具有高度多态性的21号染色体特异性微卫星位点，将上述生物非整倍体的检测方法应用于21号染色体数目的检测，将对快速确诊临床上最为常见的染色体病——唐氏综合征提供客观的诊断依据。

发明内容

本发明的目的即是提供一种可迅速、准确地对21号染色体的数目进行检测的分子生物学方法。

本发明的21号染色体数目的快速检测方法是按以下步骤进行：

a、从待检样本中提取样本DNA；

b、对样本DNA中的21号染色体上由我们定义的特异性STR位点LFG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34及STR位点D21S1409、D21S1435、D21S1436、D21S2052、D21S2054进行PCR扩增，其中：

序列

ATTTATGAGGTAGGTTCCTTAGCCCCATTTCACAGGCTGAGAACCTGAGA

CTGTCAACACTAAGCTGATTTTACTGTGATTACATCTTAGTGAGTGACAG

ATCTAGCAATCATGGAATTGAGAAGGCCCCACCTATGTTATGTTATAA(CA

TAA)n(CATAG)mCATGGCAACATAACATAACACAGGGGGCCTTCTCAATTA

TTTATAACATAACATAGGGGAGGCCTTATAAT

被我们命名为LFG20位点，该位点为一五核苷酸重复的微卫星，核心序列为(CATAAxCATAG)，核心序列的不同重复次数以n，m表示。

序列

ATTGGCGAATCATGACACTAATTTTGGCCAGCATTTAC(GAATA)nGAATG

GATCAGAGTAATATTAAAGAGTATCTAGATATTCATCCACATTATAAAGTTT

TAGTTCAGGCCTCTTTTTCTTCTCCATCAAGTTATTCCTTGAGGCTTCCCTG

AACTTTTTATTTTATGCCTTTCT，

被我们命名为LFG21位点，该位点为一五核苷酸重复的微卫星，核心序列为(GAATA)，核心序列的不同重复次数以n表示。

序列

TTAAAAGTTACAGGTTCTAGGAAACATGGCTGGTGAATACAATAATAAT

TTATTAATTTTAATGTCAGCTTCAAATTTTTGGTTCTTTGGAAAATTGT

TTAGGCCCCCAAATATATAGGTC(TATG)n(CATG)mTATG(CATG)k

(TATG)p(TATC)qTATAGCTGCATTGATGCTGTAAGT，

被我们命名为LFG24位点，该位点为一四核苷酸重复的微卫星，核心序列为(TATGxCATGxTATC)，核心序列的不同重复次数以n，m，k，p，q表示。

序列

ACCACTTTAGAGTTGACAAACTCCATGTTGGAACAGAGTATTCTT

AAACAGAACCCTTAAAACCATATTTTTCACCTCTCTGTTTT(TATC)n

TATTGAGACAGGGTCTTGCTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTCGT

GTGATCACGGTTCTCTGCAGCCTCGATCTCCTGGGCTCTAGCTATCCT

CCCAACTAGCTCAGATTACA，

被我们命名为LFG26位点，该位点为一四核苷酸重复的微卫星，核心序列为(TATC)，核心序列的不同重复次数以n表示。

序列

ACTTTCTGGTTTGGAAAATTTGCTTGAGAGGTAAAAAGAAAATTT(ACTT)n

(ATTT)mAGTAGAGACAGAATCTCGCTCTGTTGGTCAGGCTGGAGTGCAGTA

GCACGATCCTGGCTCACTGCAAACTGACTCCTGGGTTCAGGTG，

被我们命名为LFG29位点，该位点为一四核苷酸重复的微卫星，核心序列为(ACTTxATTT)，核心序列的不同重复次数以n，m表示。

序列

CAGGTGTGAGCCACCATACCCAGCCTTACTGTATC(ATAG)nATG(ATAG)m

AATATAGTTGCCTACAATATTCAGCAGAGTAACAGCTATATAGGTCTGTAG

CTTGGGAGCAATAGGC，

被我们命名为LFG33位点，该位点为一四核苷酸重复的微卫星，核心序列为(ATAG)，核心序列的不同重复次数以n，m表示。

序列

CTATTTGGTACACAAGGCAGAATAAAGGGATTATTGCTTGA(TAGG)n

(TAGA)mAGA(TAGA)kTGAGACAAGACAAGACAGACTATGAATAAAT

TAATCATACTGCTG；

被我们命名为LFG34位点，该位点为一四核苷酸重复的微卫星，核心序列为(TAGGxTAGA)，核心序列的不同重复次数以n，m，k表示。

c、根据对上述位点PCR扩增产物的检测结果确定样本中21号染色体的数目。

例如，用荧光标记引物扩增后，以等位基因相应荧光峰的数目确定样本中21号染色体的数目。

在本发明中，上述STR位点D21S1435，D21S1436，D21S2052，D21S2054均为现有的STR位点，它们的核心序列、参考序列等信息可以从互联网上公共的人类基因组数据库中得到。

以下对本发明的技术构思作进一步的说明。

在本发明的步骤a中，待检样本可以是羊水、绒毛膜、外周血，甚至福尔马林固定或石蜡包埋的组织，可以采用常规的酚-氯仿法或Chelex法提取样本DNA。

上述21号染色体特异性STR位点的选择极为关键。特定STR位点的选取是基于以下考虑：1、选择多态性好的STR位点。所谓多态性是指同一群体中一个基因座存在两个或两个以上等位基因的现象。一个基因座的多态性程度越高，应用该基因座进行进行遗传学分析的效能就越高。多数STR位点都具有高度的多态性，其多态性源于核心序列重复次数的个体差异。通常认为复制滑脱是这种差异形成的机制。多态性好的STR位点会在正常群体的大部分个体中产生长度不同的PCR扩增产物，即对每个多态性好的位点来说，大部分的正常个体都会是杂合子，因此PCR产物的荧光定量分析会表现为两个荧光峰，相应于该位点的两个等位基因。在染色体的非整倍体中，额外的染色体多来自母体。位点多态性越好，母体具有不同等位基因的可能性就越大。同时，与父体等位基因不同的可能性也大，染色体的非整倍体在该位点表现为三个荧光峰的可能性也就越大。在群体遗传学中常用杂合度对位点的多态性进行定量评估。因此，在建立检测系统时，应选用杂合度大于0.6的STR位点。2、增加所选用的STR位点个数。对特定染色体三体的检测系统来说，其效能不仅取决于STR位点的多态性，也与STR位点的数目有关。毫无疑问，当分析的STR位点数目增多时，系统的效能就会增加，因此在两个以上的STR位点观察到染色体的非整倍体具有三个不同等位基因的可能性就会增加，对非整倍体的确定也就更有统计学上的意义。根据我们的研究，至少应选用6个以上的STR位点。3、选择四核苷酸或五核苷酸重复的STR位点，即位点的核心序列由4bp或5bp核苷酸构成。这两类微卫星不仅具有高度的多态性，而且扩增更忠实，分型也更准确。

基于上述原则，我们选择了所述12个21号染色体特异性STR位点，其中有2个五核苷酸重复的STR位点，10个四核苷酸重复的STR位点，群体调查证实这些位点的杂合度在中国汉族群体中均大于0.6。由于目前的公共数据库缺乏21号染色体特异性的五核苷酸重复的微卫星位点，多态性好的、四核苷酸重复的21号染色体特异性微卫星位点也不多，因此我们开发了7个新的21号染色体特异性微卫星位点，其中包括2个五核苷酸重复的微卫星位点，5个四核苷酸重复的微卫星位点，分别命名为LFG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34。

通常STR基因座的结构分为两部分，中间为重复区，由核心序列串联重复构成，重复次数的个体差异是多态性产生的基础；两侧为非重复性的侧翼序列。若在侧翼序列选择一对特异性的寡核苷酸片段作为引物，可对相应的STR位点进行PCR扩增，根据大小不同的扩增产物电泳时迁移距离的不同，即可检测出重复区内核心序列重复次数的差异。

对所述12个21号染色体特异性位点的扩增，本发明可以采用现有的复合扩增技术，如本申请人在中国发明专利申请200310104034.7号中所提及的多色荧光复合扩增方法的原理。荧光复合扩增技术所需检材量少，结果准确、灵敏度高，自动化程度高、可重复性强。用一种颜色的荧光素可标记一组扩增片段大小不同的STR位点，多种荧光素则可以标记多组不同的STR位点。这样利用荧光素的不同颜色和扩增片段的不同长度，目前已经可以同时检测多达20个STR位点。基于以上几个原因，荧光复合扩增已广泛应用于分子生物学的各个领域。同样，若本发明中采用该荧光复合扩增技术，就可大幅度地简化操作程序，节省时间，达到用少量检材对21号染色体的数目异常进行快速检测的目的。

在本发明中，所检测的21号染色体特异性STR位点数达到了12个，保证了检测系统的效能，使检测更有统计学的意义，这样，如果采用特定的检测判定方法，即仅仅在观察到特定染色体上两个以上的特异性STR位点具有三个等位基因峰时，才认定21号染色体数目异常，这就可以使检测结果的判定更加直观而明确。另外，如果采用荧光复合扩增方法，就能够更为快速、高通量地对21号染色体数目进行检测。

本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。

具体实施方式

实施例1：本实施例对21号染色体数目异常的检测按以下步骤进行：

a、采用酚-氯仿法从待检样本中提取DNA。本实施例中的样本来自羊水的胎儿细胞。

b、采用荧光复合扩增方式对样本DNA中的上述12个21号染色体特异性STR位点进行扩增，即对STR位点LFG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34及STR位点D21S1409、D21S1435、D21S1436、D21S2052、D21S2054进行扩增。对于7个新开发的STR位点LFG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34，我们自行设计了相应的原始引物。

位点LFG20的原始引物为

    P1：5’-TGAGGTAGGTTCCTTAGCCC-3’

    P2：5’-AAGGCCTCCCCTATGTTATG-3’

位点LFG21的原始引物为

    P1：5’-TTGGCGAATCATGACACTAA-3’

    P2：5’-GGGAAGCCTCAAGGAATAAC-3’

位点LFG24的原始引物为

    P1：5’-AGGTTCTAGGAAACATGGCTG-3’

    P2：5’-TGCAAAACTGCTCTGGACTT-3’

位点LFG26的原始引物

    P1：5’-TTAGAGTTGACAAACTCCATGTTG-3’

    P2：5’-TCTGAGCTAGTTGGGAGGATAG-3’

位点LFG29的原始引物为

    P1：5’-TGGAAAATTTGCTTGAGAGG-3’

    P2：5’-TGAACCCAGGAGTCAGTTTG-3’

位点LFG33的原始引物为

    P1：5’-CACCATACCCAGCCTTACTG-3’

    P2：5’-GCTCCCAAGCTACAGACCTA-3’

位点LFG34的原始引物为

    P1：5’-CACAAGGCAGAATAAAGGGA-3’

    P2：5’-AGCATGTGTCCTGAATCTTTG-3’

另外，5个现有STR位点及其原始引物可以通过互联网上公开的人类基因组数据库检索获得。网上GDB基因数据库中公布的D21S1409基因座的原始引物为

    P1：5’-GGAGGGGAATACATTTGTG-3’

    P2：5’-TTGCCTCTGAATATCCCTAT-3’

D21S1435基因座的原始引物：

    P1：5’-CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC-3’

    P2：5’-GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3’

D21S1436基因座的原始引物：

    P1：5’-AGGAAAGAGAAAGAAAGGAAGG-3’

    P2：5’-TATATGATGAAAGTATATTGGGGG-3’

D21S2052基因座的原始引物：

    P1：5’-GCACCCTTTATACTTGGGTG-3’

    P2：5’-TAGTACTCTACCATCCATCTATCCC-3’

D21S2054基因座的原始引物：

    P1：5’-GCAGTAAATGTCTATGAAACAAGG-3’

    P2：5’-ATGATAGGTAGATGGATCAATTAGA-3’

对所述12个21号染色体特异性STR基因座采用本申请人在中国发明专利申请200310104034.7号中所涉及的多色荧光复合扩增的引物设计原理。将上述12个STR位点分别在两次复合扩增反应中进行扩增。

位点LFG21、LFG24、LFG26、D21S1409、D21S2052和D21S2054在一次复合扩增反应中进行扩增。复合扩增反应涉及三对不同的短序列对。在公共序列SA

            SA(5′--TGTTCTT-3′)的5’端加上3种成分及颜色各不相同的荧光标记物F1、F2、F3，就可以得到3个荧光标记序列

            SB1(5’--F1-TGTTCTT-3’)

            SB2(5’--F2-TGTTCTT-3’)

            SB3(5’--F3-TGTTCTT-3’)

这3个荧光标记序列分别与上述公共序列SA相配合，即构成短序列对“SA、SB1”、短序列对“SA、SB2”和短序列对“SA、SB3”。

位点LFG24、D21S2054为一组，标记一种颜色的荧光。非人类基因组的短序列对为：

            SA(5’--GTTCTT-3’)

            SB1(5’--F1-GTTCTT-3’)，

在SB1中，荧光物质F1为市售的蓝色荧光标记物FAM。

在能够与人类基因组序列特异性结合的原始引物P1、P2的5’端分别加上这对短序列对后，即构成位点LFG24、D21S2054的长序列引物。

    LFG24基因座的长序列引物：

            SA-P1：5′-GTTCTT-AGGTTCTAGGAAACATGGCTG-3’

            SB1-P2：5′-F1-GTTCTT-TGCAAAACTGCTCTGGACT-3’，

    D21S2054基因座的长序列引物：

            SA-P1：5′-GTTCTT-GCAGTAAATGTCTATGAAACAAGG-3’

            SB1-P2：5′-F1-GTTCTT-ATGATAGGTAGATGGATCAATTAGA-3’，

位点LFG26、D21S1409为一组，标记一种颜色的荧光。非人类基因组的短序列对为：

            SA(5’--GTTCTT-3’)

            SB2(5’-F2-GTTCTT-3’)，

在SB2中，荧光物质F2为市售的现有黄色荧光标记物NED。

在能够与人类基因组序列特异性结合的原始引物P1、P2的5’端分别加上这对短序列对后，即构成位点LFG26、D21S1409的长序列引物。

    LFG26基因座的长序列引物：

            SA-P1：5′-GTTCTT-TTAGAGTTGACAAACTCCATGTTG-3′

            SB2-P2：5′-F2-GTTCTT-TCTGAGCTAGTTGGGAGGATAG-3’，

    D21S1409基因座的长序列引物：

            SA-P1：5′-GTTCTT-GGAGGGGAATACATTTGTG-3’

            SB2-P2：5′-F2-GTTCTT-TTGCCTCTGAATATCCCTAT-3’，

位点LFG21、D21S2052为一组，标记一种颜色的荧光。非人类基因组的短序列对为：

            SA(5’--GTTCTT-3’)

            SB3(5’-F3-GTTCTT-3’)，

在SB3中，荧光物质F3为市售的现有绿色荧光标记物JOE。

在能够与人类基因组序列特异性结合的原始引物P1、P2的5’端分别加上这对短序列对后，即构成位点LFG21、D21S2052的长序列引物。

    LFG21基因座的长序列引物：

            SA-P1：5′-GTTCTT-TTGGCGAATCATGACACTAA-3′

            SB3-P2：5′-F3-GTTCTT-GGGAAGCCTCAAGGAATAAC-3′，

    D21S2052基因座的长序列引物：

    SA-P1：5′-GTTCTT-GCACCCTTTATACTTGGGTG-3′

    SB3-P2：5′-F3-GTTCTT-TAGTACTCTACCATCCATCTATCCC-3′；

复合扩增反应在PE-9600扩增仪中进行，反应体系中各成分的用量如下：

            DDH₂O：              12.4μL

            dNTP：                7.5μl

            10Xbuffer             3.75μL、

            6对长序列引物         各0.3μl

            Taq酶                 1μl(3u)

            BSA                   3.75μL

            MgCl2                 3μl

            DNA模板：             2.5μL(约3ng)

            总体积：              37.5μL

复合扩增反应采用热启动技术，共循环28轮，循环参数如下：

            预变性：94℃          3分钟

            变性：94℃            50秒

            复性：54℃            50秒

            延伸：72℃            30秒        4个循环

            变性：94℃            50秒

            复性：54℃            30秒

            延伸：72℃            30秒        24个循环

            延伸：72℃            10分钟

位点LFG20、LFG29、LFG33、LFG34 D21S1435和D21S1436在另一次复合扩增反应中同时扩增，同样涉及这三对不同的短序列对。

位点LFG20、D21S1436为一组，标记一种颜色的荧光。非人类基因组的短序列对为：

            SA(5’--GTTCTT-3’)

            SB1(5’--F1-GTTCTT-3’)，

在SB1中，荧光物质F1为市售的蓝色荧光标记物FAM。

在能够与人类基因组序列特异性结合的原始引物P1、P2的5’端分别加上这对短序列对后，即构成位点LFG20、D21S1436的长序列引物。

LFG20基因座的长序列引物：

        SA-P1：5′-GTTCTT-TGAGGTAGGTTCCTTAGCCC-3′

        SB1-P2：5′-F1-GTTCTT-AAGGCCTCCCCTATGTTATG-3′，

D21S1436基因座的长序列引物：

        SA-P1：5′-GTTCTT-AGGAAAGAGAAAGAAAGGAAGG-3′

        SB1-P2：5′-F1-GTTCTT-TATATGATGAAAGTATATTGGGGG-3′，

位点LFG29、LFG33为一组，标记一种颜色的荧光。非人类基因组的短序列对为：

            SA(5’--GTTCTT-3’)

            SB2(5’-F2-GTTCTT-3’)，

在SB2中，荧光物质F2为市售的现有黄色荧光标记物NED。

在能够与人类基因组序列特异性结合的原始引物P1、P2的5’端分别加上这对短序列对后，即构成位点LFG29、LFG33的长序列引物。

    LFG29基因座的长序列引物：

            SA-P1：5′-GTTCTT-TGGAAAATTTGCTTGAGAGG-3′

            SB2-P2：5′-F2-GTTCTT-TGAACCCAGGAGTCAGTTTG-3′，

    LFG33基因座的长序列引物：

            SA-P1：5′-GTTCTT-CACCATACCCAGCCTTACTG-3′

            SB2-P2：5′-F2-GTTCTT-GCTCCCAAGCTACAGACCTA-3′，

位点LFG34、D21S1435为一组，标记一种颜色的荧光。非人类基因组的短序列对为：

            SA(5’--GTTCTT-3’)

            SB3(5’F3-GTTCTT-3’)，

在SB3中，荧光物质F3为市售的现有绿色荧光标记物JOE。

在能够与人类基因组序列特异性结合的原始引物P1、P2的5’端分别加上这对短序列对后，即构成位点LFG34、D21S1435的长序列引物。

    LFG34基因座的长序列引物：

            SA-P1：5′-GTTCTT-CACAAGGCAGAATAAAGGGA-3′

            SB3-P2：5′-F3-GTTCTT-AGCATGTGTCCTGAATCTTTG-3′，

    D21S1435基因座的长序列引物：

            SA-P1：5′-GTTCTT-CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC-3′

            SB3-P2：5/-F3-GTTCTT-GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3′；

本次复合扩增的反应体系和扩增条件与前次相类似，故从略。

c、根据等位基因相应荧光峰的数目确定样本中21号染色体的数目。在本实施例中，当观察到两个以上的21号染色体特异性STR位点具有三个等位基因峰时，认定该样本的21号染色体为三体性。具体操作时，利用ABI310遗传分析仪(PE，美国)对上述复合扩增过程所得到的PCR扩增产物进行检测分析。用PCR产物0.4μl与分型标准物GS500 ROX size standard 0.2μl、变性剂Hi-DiTMformamide3μl混匀编号，放入自动进样盘。电进样15000V、5s.电泳15000V，24分钟。用Date Collection软件收集数据，Genescan3.7软件分析数据，用修改过的AmpFISTR PLUS kit Kazam macro文件在Genetype3.7软件自动分型。等位基因的辨认通过与等位基因分型标准物比较来确认，窗口范围+/-0.5bp。

Claims (1)

1、一种21号染色体数目的快速检测方法，其特征是按以下步骤进行：

a、从待检样本中提取样本DNA；

b、对样本DNA中的21号染色体特异性STR位点LFG20、LFG21、LFG24、LFG26、LFG29、LFG33、LFG34及STR位点D21S1409、D21S1435、D21S1436、D21S2052、D21S2054进行PCR扩增，其中：

序列

ATTTATGAGGTAGGTTCCTTAGCCCCATTTCACAGGCTGAGAACCTGAGA

CTGTCAACACTAAGCTGATTTTACTGTGATTACATCTTAGTGAGTGACAG

ATCTAGCAATCATGGAATTGAGAAGGCCCCACCTATGTTATGTTATAA(CA

TAA)n(CATAG)mCATGGCAACATAACATAAGACAGGGGGCCTTCTCAATTA

TTTATAACATAACATAGGGGAGGCCTTATAAT

为LFG20位点，该位点为一五核苷酸重复的微卫星，核心序列为(CATAAxCATAG)，核心序列的不同重复次数以n，m表示；

序列

ATTGGCGAATCATGACACTAATTTTGGCCAGCATTTAC(GAATA)nGAATG

GATCAGAGTAATATTAAAGAGTATCTAGATATTCATCCACATTATAAAGTTT

TAGTTCAGGCCTCTTTTTCTTCTCCATCAAGTTATTCCTTGAGGCTTCCCTG

AACTTTTTATTTTATGCCTTTCT，

为LFG21位点，该位点为一五核苷酸重复的微卫星，核心序列为(GAATA)，核心序列的不同重复次数以n表示；

序列

TTAAAAGTTACAGGTTCTAGGAAACATGGCTGGTGAATACAATAATAAT

TTATTAATTTTAATGTCAGCTTCAAATTTTTGGTTCTTTGGAAAATTGT

TTAGGCCCCCAAATATATAGGTC(TATG)n(CATG)mTATG(CATG)k

(TATG)p(TATC)qTATAGCTGCATTGATGCTGTAAGT，

为LFG24位点，该位点为一四核苷酸重复的微卫星，核心序列为(TATGxCATGxTATC)，核心序列的不同重复次数以n，m，k，p，q表示；

序列

ACCACTTTAGAGTTGACAAACTCCATGTTGGAACAGAGTATTCTT

AAACAGAACCCTTAAAACCATATTTTTCACCTCTCTGTTTT(TATC)n

TATTGAGACAGGGTCTTGCTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTCGT

GTGATCACGGTTCTCTGCAGCCTCGATCTCCTGGGCTCTAGCTATCCT

CCCAACTAGCTCAGATTACA，

为LFG26位点，该位点为一四核苷酸重复的微卫星，核心序列为(TATC)，核心序列的不同重复次数以n表示；

序列

ACTTTCTGGTTTGGAAAATTTGCTTGAGAGGTAAAAAGAAAATTT(ACTT)n

(ATTT)mAGTAGAGACAGAATCTCGCTCTGTTGCTCAGGCTGGAGTGCAGTA

GCACGATCCTGGCTCACTGCAAACTGACTCCTGGGTTCAGGTG，

为LFG29位点，该位点为一四核苷酸重复的微卫星，核心序列为(ACTTxATTT)，核心序列的不同重复次数以n，m表示；

序列

CAGGTGTGAGCCACCATACCCAGCCTTACTGTATC(ATAG)nATG(ATAG)m

AATATAGTTGCCTACAATATTCAGCACAGTAACAGCTATATAGGTCTGTAG

CTTGGGAGCAATAGGC，

为LFG33位点，该位点为一四核苷酸重复的微卫星，核心序列为(ATAG)，核心序列的不同重复次数以n，m表示；

序列

CTATTTGGTACACAAGGCAGAATAAAGGGATTATTGCTTGA(TAGG)n

(TAGA)mAGA(TAGA)kTGAGACAAGACAAGACAGACTATGAATAAAT

TAATCATACTGCTG；

为LFG34位点，该位点为一四核苷酸重复的微卫星，核心序列为(TAGGxTAGA)，核心序列的不同重复次数以n，m，k表示；

c、根据对上述位点PCR扩增产物的检测结果确定样本中21号染色体的数目。