CN1289669C - 复合扩增引物设计方法 - Google Patents

Abstract

一种复合扩增引物设计方法，其特征是在各个待扩增基因座的原始引物对中的每一引物的5′端分别加上一段非人类基因组的特殊序列YYP(5′-TTCTT-3′)，构成待扩增基因座的复合扩增引物对。与现有同类方法相比较，本发明的方法可以明显地提高扩增效率。

Description

复合扩增引物设计方法

技术领域

本发明涉及一种体外一次性扩增多个DNA目的片段的引物设计方法。

背景技术

复合扩增(multiplex PCR)又称为多重PCR，是在一个反应体系中同时扩增两个或两个以上的基因座。具有高效、快速、节约检材、减少成本的特点，特别是在法医学鉴定中可以用极少量的检材同时扩增出多个遗传标志而更显其优越性。自1988年Chambercian等首次提出这一概念，该技术在基因组结构与功能、病原体诊断、性别筛选、连锁分析、遗传疾病诊断、法医学鉴定等许多领域得到广泛应用。

复合扩增的最初几个循环对PCR的灵敏度和特异性有实质性的影响。在DNA模板充分变性的情况下，高效且特异性扩增的实现直接取决于引物与目标片段的结合速率和延伸速率。因此引物设计是复合扩增成功的的首要决定因素。

根据引物设计的不同可以将复合扩增分为以下几类

1、传统方法

传统的复合扩增是将多对原始引物混合于一个扩增体系，按照一个折衷的扩增条件扩增。由于人类基因组高度的复杂性，多重PCR反应中随着使用引物对数的增加，在扩增体系中存在有大量各种序列的背景模板，为非特异性扩增提供了机会，得到错误扩增产物的机会就增大，需经过调换产生不需要产物的引物，调整引物之间的比例才能产生高度特异性的目的片段。同时还需经过一系列的试验，优化复合扩增条件。因此，当复合扩增体系中的引物对达到一定数量时，PCR条件的优化会变得非常困难。

2、巢式PCR

巢式PCR是通过采用两套引物进行两次独立的扩增过程来达到提高灵敏度和特异性的目的。这种方法先将包含有目的序列的片段扩增，将扩增出的片段作为模板进行第二次扩增，可在一定程度上降低基因组DNA的影响，在大多数情况下，这种方法对于提高扩增的灵敏度和特异性无疑很有效，但其操作和应用较为复杂，不利于自动化操作，而且增加了交叉污染的机会。

3、GC钳复合扩增

GC钳的方法是将一段40个富含GC碱基的序列连在一对引物的一条上，通过PCR的方法引入扩增的片段，这段富含GC的序列称之为GC钳(GC-clamp)。这个方法虽然灵敏度高，但是复合的引物对数量比较多，操作要求两步扩增，且扩增的片段需在同一个基因内，最大的缺点是，扩增产物的检测必须用变性梯度凝胶电泳，对检测设备依赖性大。

4、同源加尾去二聚体系统

这种方法是在复合扩增的每一条引物5′端连接一条相同的序列，在反应体系中同时加入同这一序列相同的引物，并且其退火温度设计得高于特异引物，如果系统的特异引物之间可形成引物二聚体，在扩增反应的最初几个循环产生的引物二聚体的产物，在扩增反应体系转换为高的退火温度时会形成“平锅柄”结构，这种结构由于在每一个循环都不能进行扩增反应，可以有效地抑制引物二聚体，从而消除了对扩增系统的影响。在复合扩增引物对3′端有互补序列的情况下，这种方法无疑是最佳选择，但是对于非3′端的引物间相互作用，由于不能形成单链“平锅柄”结构，将起不到抑制二聚体的作用，所以这种方法的应用非常局限。

5、PCR抑制法

这种方法只用一条基因座特异性引物，另一条为公共引物。其做法是先将包含有目的片段的序列从整个基因组用限制性内切酶切下，在两端连上一段40个碱基长的富GC接头序列，这一序列与公共引物互补。扩增时，带有接头的单链片段首先形成发卡结构，退火后，与接头退火的引物延伸被抑制，只有特异引物可以延伸。此法的优点是具有极高的特异性，另外也可节省引物的费用，降低试验成本；缺点是效率低，操作繁琐，而且需要目的片段的侧翼序列存在酶切位点。

6、嵌合引物法

该方法每条引物的3′端序列是与基因组互补的特异序列，5′端是一段20个碱基的基因组无关序列，扩增体系中还加有一对公共引物，其序列与与嵌合引物的5′端序列一致。这种方法由于特异引物浓度低，引物间的相互作用减少，引物浓度比例容易调节，扩增条件易于优化，可提高扩增产物的特异性和灵敏度；缺点是原始引物和特异序列相加后长度过长，扩增目的片段的产物较原始片段增加了40个碱基，且操作较为烦琐。

根据分离检测系统的不同，可以将复合扩增分为聚丙烯酰胺凝胶电泳分离银染显色法和毛细管电泳激光荧光检测法两大类。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离银染显色法是对复合扩增后的产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、硝酸银显色。其中因分离目的不同，又分为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。前者是由于在凝胶中使用了变性剂，DNA以单链的形式在凝胶中运动，因此片段的分离是根据各自的长度和碱基的组成不同而彼此分开的；后者由于DNA是以双链的形式运动，片段的分离是根据长度和DNA二级结构的不同而分离的。两种方法各具特色，用途也不相同。总之此方法操作相对简单，易于掌握，试剂、设备成本都不高。但是分析检测无法自动化，通量不高，增加了人为因素，对复合扩增位点的片段大小限制多，对操作人员和环境也有一定污染，准确性、重复性也难以保证。

毛细管电泳激光荧光检测法是在普通的复合扩增每个引物对中一条引物的5′端加上荧光标记物，PCR扩增产物使用毛细管电泳自动激光荧光检测仪进行检测。PCR扩增产物在毛细管电泳的分离过程中是以单链形式运动的，因此运动的速度同片段的长度和碱基组成相关。由于毛细管电泳的快速分离效果，碱基组成相差一个的两个片段，也可以得到完全分离。加上不同荧光标记物的使用，可以使大小相近的片段由于荧光颜色的不同而彼此分开，增加了复合扩增基因座的选择范围和数量，充分发挥了复合扩增的优点。荧光检测法虽然对实验设备及附属耗材的要求较高，但是由于实现了全部操作自动化，包括自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析，数据更为客观、可靠，通量高；采用毛细管电泳技术，快速高效，分型准确、重复性好，系统灵敏度成倍提高，复合扩增的基因座的选择余地较大；大多数实验室进行荧光检测复合扩增都使用商品化试剂盒，结果易于比较和参考；总体成本同前者相差不多。因此应用复合扩增技术进行荧光检测分型是今后的发展方向。

目前在法医学应用实践中常用的商品化的试剂盒主要由AppliedBiosystems公司和Promega公司的生产。但这些试剂盒存在以下问题：(1)商品化试剂盒涵盖的基因座数量有限，以复合最多基因座的STRAmpFLSTR^Identifiler^TM PCR Amplification Kit(Applied Biosystems生产)为例，它包含了CSF1PO，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D2S1338和D19S433等15个STR基因座，采用它进行亲子鉴定时，在需要增加遗传标记时则遇到困难。其它公司的情况也相似。(2)这些STR基因座都是针对中国群体以外的群体(主要是白人群体)资料而开发的，其中有些基因座，比如TPOX，在中国群体的基因频率分布较差，个人识别能力较低。(3)国外商品化试剂盒价格昂贵，不符合实际应用的需求。

综上所述，以上不同种类的复合扩增方式，各有不同的优缺点。传统的复合扩增方法，由于操作简便，容易实现，适用范围广泛，仍为大多数的实验室所使用。

但是在实际应用中，DNA聚合酶，特别是Taq聚合酶在PCR反应过程中，除了依据碱基互补原则，将引物由5′端向3′端沿单链模板DNA向前延伸外，常常在PCR产物的3′末端加一个额外的碱基，这种非模板延伸的碱基通常是腺苷酸(腺苷酸简写为A)，我们把这种现象称为“加A”。非模板延伸的结果是PCR产物的双链DNA比目标序列长一个碱基或碱基对。但是这种“加A”现象并不是百分之百完成。对于银染检测方法，相同片段相差一个碱基(或碱基对)会表现为异常电泳行为，造成分型错误；而基于荧光检测平台，PCR扩增产物的检测灵敏度大大提高，“加A”不全而导致的“双尖峰”会造成分型的混乱。只有清晰尖锐的带型或峰型才能准确进行分型。因此，要使PCR产物要么全部“加A”，或者全部不加。

有两个途径可促进完全“加A”：在PCR循环后加一个步骤，60℃或72℃孵育30-45分钟，可以改善“加A”情况。

Magnuson等人(Substrate nucleotide-determined non-templated addition ofadenine by Taq DNA polymerase：implications for PCR-based genotyping and cloning，Biotechniques，1996年21期700-709页)研究发现PCR产物“加A”程度依赖于模板序列，也就是反向引物序列。这样每一个基因座由于反向引物序列的不同“加A”程度也不同。ABI310检测PCR产物时，实际检测的是由荧光标记引物延伸的PCR产物的单链，5′端标记荧光分子，3′末端延伸的模板就是反向引物序列。Brownstein等人(Modulation of non-templated nucleotideaddition by Taq DNA polymerase：primer modifications that facilitate genotyping，Biotechniques，1996年20期1004-1010页)发现，在反向引物5′端加一个鸟苷酸(简写为T)可有效增加“加A”程度；Butler等人(The development of reducedsize STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA，Journal of ForensicScience，2003年48期1054-1064页)采用在反向引物5′端加GTTTCTT的方法来促进PCR产物的完全“加A”；Hanson等人(A highly discriminating 21 locusY-STR“Megaplex”system designed to augment the minimal haplotype loci forforensic casework，Journal of Forensic Science，2004年49期40-51页)在循环完成后使用72℃孵育120分钟的方法促进“加A”。上述Brownstein和Butler等人的方法虽然可以促进单链PCR产物的“加A”，但是由于仅仅是在一对引物中的一条上增加特殊序列，两条引物的长度相差增大，引物与目标片段的结合速率和延伸速率不匹配，结果造成扩增效率的下降。

发明内容

鉴于TaqDNA聚合酶在PCR过程中的非模板扩增会引起PCR产物长短不一(一些加A而一些没有加A)，造成分型判断的错误，本发明特别地提出一种新的复合扩增引物设计方法。

本发明的复合扩增引物设计方法是在各个待扩增基因座的原始引物对中的每一引物的5′端分别加上一段非人类基因组的特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)，构成待扩增基因座的复合扩增引物对。

在本发明中，上述待扩增基因座的原始引物对是指可以通过互联网从GDB(The Genome Database)数据库( http：//www.gdb.org)中检索到的待扩增基因座寡核苷酸引物对，该原始引物对能够与人类基因组序列特异性结合，它们被现有的常规扩增方法所采用。同时，该原始引物对的序列由待扩增基因座的人类基因组序列所决定，且因待扩增基因座序列的不同而不同。

在本发明中，无论是在一个反应体系中同时扩增两个还是两个以上的基因座，都应该在各个待扩增基因座的原始引物对中的每一引物的5′端分别加上一段非人类基因组的特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)，以构成各个待扩增基因座的复合扩增引物对。由于每个待扩增基因座都具有一个原始引物对，即两个原始引物，因此，就每个待扩增基因座来说，都应该在其两个原始引物的5′端分别加上一段非人类基因组的特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)，从而构成用于该待扩增基因座的两个新的复合扩增引物，即复合扩增引物对。

若将本发明的引物设计方法应用于二个基因座的复合扩增体系中，而由互联网上得到的该二基因座的原始引物对假定为F1-R1和F2-R2，则应当以上述特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)与该二基因座的原始引物对F1-R1、F2-R2构成新的复合扩增引物对，即第一个基因座的复合扩增引物对为：

5′-GTTCTT-F1-3′

5′-GTTCTT-R1-3′

第二个基因座的复合扩增引物对为：

5′-GTTCTT-F2-3′

5′-GTTCTT-R2-3′

将上述新的复合扩增引物对用于复合扩增体系中，所得到的PCR产物可以采用银染方式检测。

若在上述复合扩增引物对中的引物之一的5′端上进一步标记与荧光检测仪配套的荧光标记物“YG”，就可以构成如下二对带荧光标记物的荧光复合扩增引物对：

5′-GTTCTT-F1-3′

5′-YG-GTTCTT-R1-3′

5′-GTTCTT-F2-3′

5′-YG-GTTCTT-R2-3′

当然，也可以构成如下二对带荧光标记物的荧光复合扩增引物对：

5′-YG-GTTCTT-F1-3′

5′-GTTCTT-R1-3′

5′-YG-GTTCTT-F2-3′

5′-GTTCTT-R2-3′

另外，还可以构成如下二对带荧光标记物的荧光复合扩增引物对：

5′-GTTCTT-F1-3′

5′-YG-GTTCTT-R1-3′

5′-YG-GTTCTT-F2-3′

5′-GTTCTT-R2-3′

或者构成如下二对带荧光标记物的荧光复合扩增引物对：

5′-YG-GTTCTT-F1-3′

5′-GTTCTT-R1-3′

5′-GTTCTT-F2-3′

5′-YG-GTTCTT-R2-3′

利用这种带荧光标记物的荧光复合扩增引物对进行复合扩增，所得到的PCR产物可以使用荧光检测方式进行检测。在上述带荧光标记物的荧光复合扩增引物对中，“YG”表示荧光标记物，它可以采用现有的市售荧光标记物，如FAM、HEX、VIC、NED、PET等。

本发明的引物设计方法也可应用于二个以上基因座的复合扩增体系中，如三个或四个、六个基因座的复合扩增体系中，其复合扩增引物对或荧光复合扩增引物对的产生方法与上面的方式完全相同。

如图1所示，在使用本发明设计的引物进行复合扩增时，每一个PCR反应实际包含两个连续的过程。

第一个过程：在开始的几个循环时，是5′端加有非人类基因组序列GTTCTT的位点特异性引物(即复合扩增引物对或荧光复合扩增引物对，图1中所示为采用荧光复合扩增引物对)在起作用，启动复合扩增反应，将目标靶序列扩增，同时将非人类基因组序列整合到所扩增的片段上。

第二个过程：整合了非人类基因组序列GTTCTT的扩增片段在经过第一个过程的逐渐成倍增加，做为PCR反应体系中的主要模板DNA，同新的荧光复合扩增引物对(或复合扩增引物对)完全匹配结合，使得扩增反应继续进行。这一过程中由于模板DNA同荧光复合扩增引物对(或复合扩增引物对)的匹配碱基数量的增加，引物同模板DNA的结合速率相应提高，从而提高了扩增效率。

在本发明中，使用特殊序列YYP(5′-GTTCTT-3′)同原始引物相加后，具有以下几个优点：(1)可以促进目的片段正反双链的完全加A，消除相同片段加A不全造成的分型错误。(2)引物对中的每条引物均加上特殊序列，两条引物的长度差距较原来减少或相同，两条引物同目标片段的结合速率和延伸速率更加匹配，提高了扩增效率。(3)在扩增进行几个周期后，新的复合扩增引物组合同待扩增片段的匹配碱基数较原始引物对增加了六个，可以提高复合扩增的特异性和效率。(4)本发明方案中的总引物数目没有新的增加，有利于扩增条件的优化和复合扩增的进行。(5)新的复合扩增引物组合的5′端结构相同，引物间相互反应的可能性相对较小，有利于复合PCR的进行。

与普通原始引物的PCR产物作比较，在采用原始引物进行复合扩增时，由于TaqDNA聚合酶的非模板扩增作用，产物中加A和不加A的两种片段在变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中会造成带型的模糊和混乱，如图2所示。

而采用本发明的复合扩增引物进行复合扩增时，PCR产物的所有片段完全加A，PCR产物在变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中不会造成带型的模糊和混乱，如图3所示。

如图4所示，应用毛细管电泳激光荧光检测法(用ABI310荧光检测仪)对原始引物的PCR产物进行分离检测时，加A不全的影响则更为明显，其PCR产物的峰型变宽，双尖峰型说明有两种不同的PCR产物。

如图5所示，应用毛细管电泳激光荧光检测法对本发明中复合扩增引物的PCR产物进行分离检测时可以看到，PCR产物的峰型尖锐，易于判读和分析。

需要说明的是：Butler等人使用在反向引物的5′端增加GTTTCTT序列的方法来促进荧光标记引物的3′端完全加A(其PCR反应的过程如图6、7所示)，这个方法从检测意义上可以满足分型准确的要求，但是却会影响复合扩增的效率。由于反向引物较原引物增加了GTTTCTT序列，根据Tm＝4(G+C)+2(A+T)的计算公式，反向引物的退火温度较原引物增加了18℃，造成两条引物退火温度的差异较原来也相应增加了18℃；同时标记荧光分子的正向引物和带有GTTTCTT序列的反向引物长度不相同，正向引物同基因组DNA、产物1和产物3的连接速率快，延伸效率高，而碱基数量长了7个的反向引物同基因组DNA、产物2和产物4的连接速率慢，延伸效率低，直接影响扩增效率。

因此，与Butler等人使用的方法相比较，本发明的方法可以明显地提高扩增效率。

本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。

附图说明

图1是使用本发明所设计引物进行复合扩增时的PCR反应过程图。

图2是使用原始引物的PCR产物使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3是使用本发明复合扩增引物的PCR产物使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图4是使用原始引物(带荧光标记物)的PCR产物荧光检测结果图。

图5是使用本发明荧光复合扩增引物的PCR产物荧光检测结果图。

图6是使用Butler等人所设计引物进行复合扩增时的PCR第一阶段反应过程图。

图7是使用Butler等人所设计引物进行复合扩增时的PCR第二阶段反应过程图。

图8是实施例1中采用荧光复合扩增引物的PCR产物荧光检测结果图。

具体实施方式

实施例1：在本实施例中，我们选用以下四个基因座：DYS510、DYS520、DYS542和DYS561。

通过互联网，从GDB(The Genome Database)数据库( http：//www.gdb.org)中检索到上述四个基因座的原始引物对为：

DYS510  Y4C113F′(5′--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)

        Y4C113R′(5′--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)

DYS520  Y4C16fF′(5′--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)

        Y4C16fR′(5′--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)

DYS542  Y4C37F′ (5′--TGTGAACCATFTGGCATGTT--3′)

        Y4C37R′ (5′--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)

DYS561  Y4C87F′ (5′--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)

        Y4C87R ′(5′--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)

依照本发明的引物设计方法，得到新的复合扩增引物对为：

NDP510  510F′(5′--GTTCTT--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)

        510R′(5′--GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)

NDP520  520F′(5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)

        520R′(5′--GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)

NDP542  542F′(5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)

        542R′(5′--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)

NDP561  561F′(5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)

        561R′(5′--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)

由于DYS520/DYS561与DYS542/DYS561的扩增片段大小彼此两两重叠，我们使用了市售的两种颜色的荧光标记物FAM和HEX标记每个基因座的引物对中的后引物。蓝色荧光标记物FAM标记DYS520和DYS542，绿色荧光标记物HEX标记DYS510和DYS561，得到带荧光标记物的荧光复合扩增引物对：

NDP510  510F′(5′--GTTCTT--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)

        510R′(5′--HEX--GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)

NDP520  520F′(5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)

        520R′(5′--FAM--GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)

NDP542  542F′(5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)

        542R′(5′--FAM--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)

NDP561  561F′(5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)

        561R′(5′--HEX--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)

为了进一步说明本实例中所设计引物的使用方法和使用效果，下面继续说明本实施例中所设计引物用于复合扩增反应时的具体过程及扩增产物的检测结果。

PCR反应体系：总体积37.5μl，DNA模板约10ng、dNTP 8.0μL(0.2mMol/l)、Taq酶(申能博采，国产)2u、10×buffer 3.75μl、Mg2+3μl(2.25mmol/L)、引物混合物2.3μMol(含有四条荧光标记引物，DYS510：1μMol，DYS520：0.42μMol，DYS542：0.36μMol，DYS561：0.52μMol)。

PCR扩增参数：

94℃          3分钟

94℃          30秒

58℃          50秒

72℃          30秒30个循环

72℃4         45分钟

4℃           保存

上述复合扩增后所得到的PCR产物使用ABI310遗传分析仪(PE美国)检测分析。PCR产物0.1μl，LS300 ROX size standard 0.2μl，Hi-Di^TMformamide13μl，混匀编号，放入自动进样盘。电进样15000V、5s。电泳15000v，24分钟。Date Collection软件收集数据，Genescan3.7分析数据，用修改过的4-Y-STR在Genetype3.7自动分型。等位基因的辨认通过与等位基因分型标准物比较来确认，窗口范围+/-0.5bp。

本实施例中的PCR产物荧光检测结果如图8所示。图中的蓝色标记(用标号1指示)的为DYS520和DYS542，绿色标记(用标号2指示)的为DYS510和DYS561，红色标记(用标号3指示)的为ROX内标，genescan软件分析结果显示：检测到FAM标记的181bp和250bp大小的两个片段，HEX标记的202bp和270bp两个片段。

采用本实施例设计的引物进行多基因座扩增后，其扩增产物生成量大，毛细管电泳荧光检测器检测到的荧光信号强，检测到的产物峰型细长高挑，为进一步的分型打下了良好的基础。同时，所得到的扩增产物经过测序，证实扩增产物的DNA序列与目的DNA片段序列一致。

实施例2：在本实施例中，我们选用以下六个基因座：DYS510，DYS520，DYS531，DYS533，DYS542，DYS561。

通过互联网，从GDB(The Genome Database)数据库( http：//www.gdb.org)中检索到上述六个基因座的原始引物对为：

DYS510  Y4C113F′(5′--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)

        Y4C113R′(5′--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)

DYS520  Y4C16fF′(5′--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)

        Y4C16fR′(5′--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)

DYS531  Y4C212f′(5′--GACCCACTGGCATTCAAATC--3′)

        Y4C212r′(5′--TGCTCCCTTTCTTTGTAGACG--3′)

DYS533  Y4C215f′(5′--CATCTAACATCTTTGTCATCTACC--3′)

        Y4C215r′(5′--TGATCAGTTCTTAACTCAACCA--3′)

DYS542  Y4C37F′(5′--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)

        Y4C37R′(5′--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)

DYS561  Y4C87F′(5′--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)

        Y4C87R′(5′--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)

依照本发明的引物设计方法，得到新的复合扩增引物对为：

NDP510  510F′(5′--GTTCTT--TYYYFCCTCCCTTACCACAGA--3′)

        510R′(5′--GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)

NDP520  520F′(5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)

        520R′(5′--GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)

NDP531  531F′(5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)

        531R′(5′--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)

NDP533  533F′(5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)

        533R′(5′--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)

NDP542  542F′(5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)

        542R′(5′--GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)

NDP561  561F′(5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)

        561R′(5′--GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)

由于DYS520/DYS561与DYS542/DYS561/DYS533的扩增片段大小彼此两两重叠，我们使用了三种颜色的荧光标记物TEMRA(黄色)、FAM(蓝色)和HEX(绿色)标记每个基因座的引物对中的后引物。FAM标记DYS531、DYS520和DYS542，HEX标记DYS510和DYS561，TEMRA标记DYS533，得到带荧光标记物的荧光复合扩增引物对：

NDP510  510F′(5′--GTTCTT--TTTTTCCTCCCTTACCACAGA--3′)

        510R′(5′--HEX-GTTCTT--TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA--3′)

NDP520  520F′(5′--GTTCTT--AACAGCCTGCCCAACATAGT--3′)

        520R′(5′--FAM-GTTCTT--ACCATCATGCCCTGCAATA--3′)

NDP531  531F′(5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)

        531R′(5′--FAM-GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)

NDP533  533F′(5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)

        533R′(5′-TEMRA-GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)

NDP542  542F′(5′--GTTCTT--TGTGAACCATTTGGCATGTT--3′)

        542R′(5′--FAM-GTTCTT--TCACGTTGTTCAAGGGTCAA--3′)

NDP561  561F′(5′--GTTCTT--GCCTGATGCCATCTGAAAAT--3′)

        561R′(5′--HEX-GTTCTT--TGATCCCAACAACTGCACTC--3′)

本实施例中所设计引物用于复合扩增反应时的具体过程及扩增产物的检测结果与实施例1相类似，此处不再赘述。

Claims (2)

1、一种复合扩增引物设计方法，其特征是在各个待扩增基因座的原始引物对中的每一引物的5′端分别加上一段非人类基因组的特殊序列

YYP 5′-GTTCTT-3′，构成待扩增基因座的复合扩增引物对。

2、如权利要求1所述的复合扩增引物设计方法，其特征是在所述复合扩增引物对中的引物之一的5′端上标记荧光标记物，构成带荧光标记物的荧光复合扩增引物对。

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